海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，具體的說是一種海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白及其制備和應用。肽聚糖識別蛋白（AiPGRP）基因的重組蛋白為序列表SEQ?ID?NO.1中氨基酸序列所示。具體是利用體外重組表達技術獲得了海灣扇貝AiPGRP重組蛋白，公開了所述海灣扇貝AiPGRP基因重組蛋白的凝菌和抗菌活性。利用本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于抗菌的飼料添加劑和新型免疫增強劑的開發(fā)。
【專利說明】海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，具體的說是一種海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]伴隨長期的進化過程，在病原生物的壓力下，動物界產生了兩套免疫系統(tǒng)，即獲得性免疫和固有免疫，目前普遍認為無脊椎動物只擁有固有免疫系統(tǒng)。固有免疫應答包括免疫識別、免疫信號的調整與放大、免疫信號傳導并轉錄激活產生效應分子等幾個基本的過程。其中，對“自己”與“非己”的識別過程，是誘導免疫應答反應的起始階段，是動物體對病原微生物實現有效防御的基礎。1997年，模式識別受體和模式識別理論的提出，揭示了免疫識別作用的本質。目前，無脊椎動物中已發(fā)現了 10余類模式識別受體，如肽聚糖識別蛋白(PGRP)和Toll樣受體等，它們通過結合不同的病原相關分子模式完成對各種病原微生物的識別，在誘導細胞因子和炎癥的產生、抗菌肽的表達、激活酚氧化酶級聯反應、吞噬等一系列固有免疫應答中發(fā)揮重要作用。
[0003]肽聚糖識別蛋白是一類能特異性識別肽聚糖及含肽聚糖的細菌，在固有免疫應答中發(fā)揮重要作用的模式識別受體蛋白。1996年，肽聚糖識別蛋白首次于家蠶的血淋巴中發(fā)現。對昆蟲及哺乳動物等模式動物PGRPs的研究發(fā)現，PGRPs在固有免疫應答中起著模式識別、信號調控和效應分子的三重作用。在海洋無脊椎動物中，雖然PGRPs的研究也取得了一定的進展，但研究的廣泛性和深入性不足，至今仍有許多問題沒有解決。
[0004]海洋無脊椎動物具有進化地位原始、基因結構和功能多樣化等優(yōu)點，研究海洋無脊椎動物基因組及功能基因，能深層次地探究海洋生命的奧秘；發(fā)掘海洋無脊椎動物基因，有利于保護海洋生物資源；從海洋無脊椎動物的功能基因入手，有助于培育出優(yōu)質、高產、抗逆的養(yǎng)殖新品種，從根`本上解決海水養(yǎng)殖無脊椎動物的質量和病害問題，同時還有助于開發(fā)具有我國自主知識產權的海洋基因工程新藥，部分解決海洋藥源問題。因此闡明海洋無脊椎動物PGRPs的結構和功能具有十分重要的理論和實踐意義。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白及其制備和應用。
[0006]為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
[0007]—種海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白，肽聚糖識別蛋白(AiPGRP)基因的重組蛋白為序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列所示。
[0008]海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白的制備方法:
[0009](I)以海灣扇貝AiPGRP編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2引物進行PCR擴增，待用；
[0010](2)PCR擴增產物與將pEASY-El載體通過T4連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子；
[0011](3)將上述構建載體轉入Transl-Tl表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，而后純化、復性，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP ；[0012]所述引物Pl 和 P2 分別為 Pl:5’ -GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’ ；P2:5’ -AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3’。
[0013]海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白的應用，所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP用于制備廣譜抗菌類制劑。
[0014]所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP用于制備免疫增強劑或飼料添加劑。
[0015]本發(fā)明所具有的優(yōu)點:涉及海灣扇貝肽聚糖識別蛋白(AiPGRP)基因的體外重組表達技術及其功能鑒定。本發(fā)明利用體外重組表達技術獲得了海灣扇貝肽聚糖識別蛋白AiPGRP，該重組蛋白對鰻弧菌、藤黃微球菌和畢赤酵母具有凝集作用，并能抑制鰻弧菌和藤黃微球菌的生長，在開發(fā)廣譜抗菌類藥物和新型免疫增強劑、飼料添加劑等方面具有潛在應用價值。
[0016]本發(fā)明中的海灣扇貝AiPGRP為短型肽聚糖識別蛋白，進而利用體外重組表達技術獲得了海灣扇貝肽聚糖識別蛋白AiPGRP，該重組蛋白對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌具有凝集作用，同時能夠殺滅革蘭氏陰性菌，并抑制革蘭氏陽性菌的生長，在開發(fā)廣譜抗菌類藥物和新型免疫增強劑、飼料添加劑等方面具有潛在應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0017]圖1為本發(fā)明實施例提供的海灣扇貝AiPGRP基因重組蛋白對鰻弧菌、藤黃微球菌和畢赤酵母的凝集作用圖。
[0018]圖2為本發(fā)明實施例提供的海灣扇貝AiPGRP基因重組蛋白對鰻弧菌和藤黃微球菌生長的抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0019]下面的實驗例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0020]實施例1海灣扇貝AiPGRP基因編碼區(qū)的體外原核重組表達，包括下列步驟:
[0021]1、重組載體的構建
[0022]本發(fā)明中采用的重組載體為北京全式金公司的pEASY-El原核表達載體。通過PCR技術，使用基因特異性引物Pl和P2擴增海灣扇貝AiPGRP基因除去信號肽的編碼區(qū)片段。反應條件為:首先94°C預變性5分鐘，然后進入下列循環(huán):94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，共進行35個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。將PCR產物純化回收，與pEASY-El載體連接。轉化后菌落PCR篩選并測序，提取陽性克隆質粒，完成載體的構建。
[0023]所述引物Pl 為 5’ -GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’ ；
[0024]引物P2 為 5 ’ -AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3，。
[0025]2、重組蛋白的表達
[0026]以北京全式金公司的Transl-Tl為重組表達菌株，將上述構建的重組載體轉化到表達宿主菌中，挑取單克隆，提取質粒，測序驗證讀碼框正確。挑取單克隆，接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時，然后將此培養(yǎng)液以體積比1:100的比例接種200mL新的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600=0.5-0.7。加入IPTG，使終濃度達到ImM ml/1，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4°C，5000rpm，離心10min，收集菌體，于-20°C凍存?zhèn)溆?。取ImL菌液離心，棄去上清后，加入80 μ L水和20 μ L5X蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮沸10分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測表達產物。
[0027]3、重組蛋白的純化與復性
[0028]將上述所得蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了變性重組蛋白，用透析緩沖液透析復性。
[0029]具體操作步驟如下:
[0030]鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標簽的重組蛋白
[0031 ] (I)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1.6 X 20cm,柱床體積為IOmL ；
[0032](2)用緩沖液 I (1.14g L^1NaH2PO4,14.5g L^1Na2HPO4, 29.3g L-1NaCL, 480g 1 尿素平衡2-5個床體積,流速為2mL mirT1 ；
[0033](3)將 20ml 細胞破碎液(50mM PBS，ρΗ7.4，0.5Μ NaCl) 0.45 μ m 濾膜過濾，上樣，流速為ImL mirT1 ；
[0034](4)用緩沖液I再洗2-5個床體積，流速為mL mirT1 ；
[0035](5)用分別含10、20、50、100、200、300、400禮咪唑的緩沖液3進行階段洗脫，流速為2mL min—1，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達；
[0036](6)用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗3個柱床體積，流速為2mLmin—1，柱子置于4°C環(huán)境中保存變性狀態(tài)下提純的重組蛋白需要在適當的復性緩沖液中通過透析除去尿素，使蛋白重新正確折疊，恢復正確構象。變性純化產物經2mM的還原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HCl、IOOmM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析復性，尿素濃度從起始的6M逐漸替換到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至無尿素的透析液時不加甘油。每次在4°C透析12h，即得到SEQ ID N0.1氨基酸所示的海灣扇貝AiPGRP基因重組蛋白。
[0037]SEQ ID N0.1
[0038]MRGSHHHHHHGMASELALDRICDNIHVISRDDWGARSPTTRSGLSDPVNMFLVHHTATDTCDDVSSCSSILRGIQNYHINNKEWSDIGYSFLIGGDGQVYEGRGWGVVGAHTYNYNRRGYAVSFIGNFETTLPSTRARNAARALIQCGVDKGHINEDYTLHGHRDADRRVHPTVCPGQRLYDEISTWPHFDSNVPR
[0039]序列特征:
[0040]長度:196個氨基酸
[0041]類型:氨基酸
[0042]鏈型:單鏈
[0043]拓撲結構:線型
[0044]特性:分子量為22.03kDa，等電點為6.58，其中編碼序列的1-18位為信號肽序列，成熟肽分子量為20.01kDa，等電點為6.36，具有一個保守的PGRP結構域。
[0045]來源:海灣扇貝 [0046]實施例2:海灣扇貝AiPGRP原核重組蛋白的凝菌活性分析
[0047]對鰻弧菌、藤黃微球菌和畢赤酵母的凝集實驗:
[0048]將過夜培養(yǎng)的鰻弧菌、藤黃微球菌和畢赤酵母離心，收集離心管底的菌體沉淀,收集的沉淀分別用TBS (50mM L^lTris-HCl, 50mM PNaCl)洗滌三次后分別重懸于含有FITC(終濃度0.1mg 111171)的0.0現NaHCO3溶液中，而后在分別于暗處標記30min。標記后的微生物分別于TBS中洗滌三次，然后再分別重懸于含有IOmM ZnCl2的TBS緩沖液中，使其濃度達到2.5X IO9Cell mL'再分別取10 μ L的上述微生物懸液分別與25 μ L上述實施例獲得的重組蛋白溶液(重組蛋白濃度根據具體情況調整)混勻，室溫下孵育Ih后，取10μ I涂于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。SrTrx (pET-32a空載體表達蛋白)蛋白對照組和TBS空白對照組(參見圖1)。
[0049]實驗結果表明，重組AiPGRP蛋白能夠有效凝集鰻弧菌、藤黃微球菌和畢赤酵母。
[0050]實施例3:海灣扇貝AiPGRP原核重組蛋白的抑菌活性分析
[0051]對鰻弧菌和藤黃微球菌的生長抑制實驗:
[0052]在平底96孔板(Costar，Fisher)中每孔加入200 μ L LB液體培養(yǎng)基和10 μ L對數生長期的鰻弧菌或藤黃微球菌菌液，再加入終濃度為100 μ g mr1的重組蛋白rAiPGRP，另設rTrx蛋白對照組和TBS空白對照組，所有孔中均含有IOmM ZnCl20 220rpm，37°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih用酶標儀分別檢測記錄各孔0D600值。每個樣品設四個重復，根據4次測定結果取平均值作圖(參見圖2)。
[0053]實驗表明重組AiPGRP蛋白能夠殺滅革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌的繁殖存在抑制作用。`
【權利要求】
1.一種海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白，其特征在于:肽聚糖識別蛋白(AiPGRP)基因的重組蛋白為序列表SEQ ID N0.1中氣基酸序列所不。
2.—種權利要求1所述的海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白的制備方法，其特征在于: (O以海灣扇貝AiPGRP編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2引物進行PCR擴增，待用； (2)PCR擴增產物與將pEASY-El載體通過T4連接酶連接，轉化，測序鑒定重組子； (3)將上述構建載體轉入Transl-Tl表達菌株中進行誘導培養(yǎng)，而后純化、復性，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP ； 所述引物 Pl 和 P2 分別為 Pl:5’-GATCGAATCTGCGACAACATACATG-3’ ；P2:5’ -AATCATCGCGGCACATTGCTGTC-3’。
3.—種權利要求1所述的海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白的應用，其特征在于:所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP用于制備廣譜抗菌類制劑。
4.一種權利要求1所述的海灣扇貝肽聚糖識別蛋白的重組蛋白的應用，其特征在于:所述序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重組蛋白AiPGRP用于制備免疫增強劑或飼料添加劑?！?br> 【文檔編號】A61K38/17GK103848912SQ201410120631
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權日:2014年3月27日
【發(fā)明者】宋林生, 楊傳燕, 王雷雷, 王玲玲, 張峘, 邱麗梅 申請人:中國科學院海洋研究所