一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，采用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCNo.3145作為生產(chǎn)菌株，在發(fā)酵0-48h，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5-5.0g/L的L-蘇氨酸。本發(fā)明中涉及到的在發(fā)酵液中添加L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸不同于其他氨基酸的添加來提高ε-PL產(chǎn)量，而是通過抑制支路代謝改變代謝流分布來實現(xiàn)提高ε-PL產(chǎn)量的，是相同原料投入獲得更高的產(chǎn)物濃度，副產(chǎn)物濃度降低，純化簡單。
【專利說明】一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及ε -聚賴氨酸(ε -PL)的生產(chǎn)方法，尤其是一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法。
【背景技術】
[0002]ε -PL是由放線菌產(chǎn)生的含有25-35個L-Lys殘基的同聚物，這些L-Lys殘基通過α -羧基和ε -氨基連接。ε _PL抑菌譜較為廣泛，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌以及霉菌等均有不同程度的抑制作用。對于大部分細菌，其最小抑菌濃度(MIC)為l_8g/L(核實數(shù)據(jù))；而對于酵母菌和真菌，其MIC稍微偏高一些。500mg/L可使非收縮性長尾噬菌體失活。ε _PL能在人體內分解為L-Lys (八種必需氨基酸之一)，而后者也是各國允許在食品中強化的氨基酸之一。因此，ε-PL是一種營養(yǎng)型抑菌劑,安全性高于化學防腐劑，同時，考慮其安全性和生物可降解性，1989年日本批準其用于加工食品中，隨后韓國和美國也允許其作為食品添加劑使用。2004年I月，美國食品和藥品管理局(FDA)認定ε-PL是“一般認為安全的”(Generally RecognizedasSafe, GRAS)。2010 年，F(xiàn)DA 發(fā)布了關于 ε-PL 通過GRAS認證的公告，公告中指出，在特定的條件下ε -PL可作為食品防腐劑應用于各類傳統(tǒng)食品。
[0003]早在1977 年，日本的 Shima and Sakai 發(fā)現(xiàn)了 S.albulus NBRC 14147 能夠合成ε -PL0之后，有很多關于提高ε-PL產(chǎn)量的報道。Hirohara等人在2006年發(fā)表的文章中報道，在USE-51發(fā)酵過程中，以恒定的速率向培養(yǎng)基中補充甘油，可以提高產(chǎn)酸水平，并且維持PH的穩(wěn)定性。他們對菌株USE-1l和USE-51產(chǎn)ε -PL的過程進行研究，添加TCA循環(huán)中的有機酸，檸檬酸、琥珀酸、α -酮戊二酸和蘋果酸，發(fā)現(xiàn)檸檬酸能大幅提高ε -PL的產(chǎn)量，琥珀酸則完全抑制ε -PL的合成，α -酮戊二酸和蘋果酸對USE-1l和USE-51產(chǎn)酸的影響介于兩者之間。這種現(xiàn)象可能是由于檸檬酸鹽能促進草酰乙酸轉化生成L-天冬氨酸，而L-天冬氨酸的積累導致L-賴氨酸的大量合成。α -酮戊二酸對發(fā)酵過程中的影響表明，TCA循環(huán)可能會分形成L-谷氨酸鹽，以致于這些物質能與L-天冬氨酸-β -半乳糖結合，生成二氨基庚二酸中間體(圖1)。蘋果酸對發(fā)酵的影響表明，這種有機酸能夠提高L-天冬氨酸和L-谷氨酸的合成。Shima等認為L-Lys分子能夠直接被ε -PL生物合成所利用。因此，Hirohara等人在USE-51的發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基成分包含有檸檬酸、甘油和(NH4)2SO4時，向培養(yǎng)基中添加IlmM的L-lysine，能夠大幅度提高ε -PL的產(chǎn)量。
[0004]經(jīng)檢索，找到如下關于ε -PL生產(chǎn)的專利文獻，具體公開內容為:
[0005]1、大量生產(chǎn)ε -聚-L-賴氨酸的菌株和生產(chǎn)方法(CN1260004)公開了一種較常規(guī)的提高菌株產(chǎn)ε-PL的生產(chǎn)能力以及大規(guī)模生產(chǎn)ε-PL的方法。
[0006]2、一種誘 變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε-聚賴氨酸及其鹽的方法(CN101285046)公開了一種用紫外誘變、紫外和化學誘變相結合，以及N離子注入誘變等手段誘變白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε -聚賴氨酸及其鹽的方法。
[0007]3、一種利用甘油為單一碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法(CN102352385A)公開了采用甘油作碳源，結合兩階段PH值調控策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε -聚賴氨酸。
[0008]4、一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法(CN102352386A)公開了采用葡萄糖和甘油共同作為碳源，結合流加發(fā)酵方法和pH控制策略生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。
[0009]5、一種提高ε-聚-L-賴氨酸產(chǎn)量的新方法(CN101671703)公開了利用葡萄糖作碳源并流加L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。
[0010]6、一種ε -聚-L-賴氨酸的生產(chǎn)方法(CN102363797A)公開了通過在發(fā)酵過程中添加甘氨酸，甘氨酸可進入葉酸代謝途徑，為生物合成過程提供充足的一碳基團，提高菌株合成代謝活力，增加前體L-賴氨酸及ε -聚-L-賴氨酸的合成，使ε-聚-L-賴氨酸積累量比原有工藝提高了 20~50%。
[0011]7、一種促進ε -聚賴氨酸合成的方法(CN103333926A)公開了通過在ε -聚賴氨酸發(fā)酵過程中分批或連續(xù)流加所述L-谷氨酸和/或L-谷氨酸鈉固體或溶液，實現(xiàn)ε -聚
賴氨酸產(chǎn)量顯著提高。
[0012]8、一種利用北里孢菌PL6-3制備ε -聚賴氨酸及其鹽的方法(CN1696279)公開了一種通過篩選獲得的北里孢菌PL6-3即CCTCCN0.Μ205012制備ε -聚賴氨酸及其鹽的方法。
[0013]在之前的報道和 專利文獻中，關于提高ε-PL方面，是通過添加TCA循環(huán)中的有機酸或是添加L-賴氨酸、L-甘氨酸、L谷氨酸和/或L-谷氨酸鈉來實現(xiàn)，這些有機酸或是氨基酸均是鏈霉菌合成ε -PL的直接或是間接前體物質，L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸不同于上述幾種氨基酸。從圖2可以看出，ε -聚賴氨酸合成途徑也涉及到其他氨基酸的合成(如L-蛋氨酸，L-亮氨酸和L-蘇氨酸)，途徑中的天冬氨酸激酶(Ask，催化L-天冬氨酸生成L-天冬氨酰磷酸)和高絲氨酸脫氫酶(Hsd，在NAD或NADP的參與下將天冬氨酸-β -半醛還原為高絲氨酸)會受到終產(chǎn)物氨基酸的調控。相對于L-賴氨酸，L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸的合成屬于支路代謝。

【發(fā)明內容】

[0014]本發(fā)明的目的是提供一種積累高絲氨酸的ε -聚賴氨酸的發(fā)酵方法，本發(fā)明在ε -聚賴氨酸發(fā)酵過程中添加L-蘇氨酸，來調控ε -聚賴氨酸產(chǎn)生菌代謝，提高產(chǎn)量的方法。
[0015]本發(fā)明實現(xiàn)的技術方案是:
[0016]一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，采用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CGMCCN0.3145 作為生產(chǎn)菌株，菌株發(fā)酵 0_48h,向發(fā)酵液中添加L-蘇氨酸，提高ε -聚賴氨酸的產(chǎn)量；
[0017]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為M3G培養(yǎng)基g/L:葡萄糖50，酵母粉5，(NH4) 2S0410，KH2PO4L 36，K2HPO40.8，MgSO4.7H200.5，ZnSO4.7H200.04, FeSO4.7H200.03 ；
[0018]將種子液按體積分數(shù)6-10%的接種量，轉接種子液至裝有M3G培養(yǎng)基容器中進行發(fā)酵，在發(fā)酵0-48h，向培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5-5.0g/L的L-蘇氨酸。
[0019]而且，所述淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的種子液的制備方法為:將斜面菌種活化后，取1-3環(huán)，接種至裝有M3G培養(yǎng)基的三角瓶中，28-37°C，150-200rpm/min，培養(yǎng)24_48h，得到種子液。
[0020]而且，所述發(fā)酵方法為搖瓶發(fā)酵或通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵。
[0021]而且，所述通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵在發(fā)酵過程中，pH控制分為兩個階段，在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量高于10g/L，pH值維持在6.0-6.5 ;在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量低于10g/L后，pH值維持在3.5-4.0。
[0022]而且，當所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于10g/L時，通過自動加料泵流加葡萄糖400g/L、硫酸銨80g/L，葡萄糖的終濃度維持在8-13g/L。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0024]1、本發(fā)明中涉及到的在發(fā)酵液中添加L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸不同于其他氨基酸的添加來提高ε -PL產(chǎn)量，而是通過抑制支路代謝改變代謝流分布來實現(xiàn)提高ε-PL產(chǎn)量的，是相同原料投入獲得更高的產(chǎn)物濃度，副產(chǎn)物濃度降低，純化簡單。
[0025]2、本發(fā)明根據(jù)發(fā)酵液中的L-蘇氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸的過量會引起L-高絲氨酸的積累，從而代謝流流向發(fā)生變化，更多的流向合成L-賴氨酸途徑，從而提高ε -PL廣量，最大提聞188%。
[0026]3、本發(fā)明在生產(chǎn)步驟中嚴格控制pH值與葡萄糖的關系，使菌種的發(fā)酵能力發(fā)揮到最大值，獲得了最大的ε-聚賴氨酸產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明中鏈霉菌中ε -PL可能的合成途徑，從葡萄糖開始；
[0028]圖2為本發(fā)明中鏈霉菌中ε-PL可能的合成途徑，從天冬氨酸開始。
【具體實施方式】
[0029]下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0030]一種積累高絲氨酸的ε -聚賴氨酸的發(fā)酵方法，所示用的菌種為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes) CGMCCN0.3145,該菌株已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCCN0.3145，保藏日期為2009年6月29日。
[0031]所使用的培養(yǎng)基為:
[0032]斜面培養(yǎng)基:稱取20g黃豆餅粉，溶于IL自來水中，121°C加熱30min。然后，用8層紗布進行過濾；所得濾液中加入20g甘露醇，用2MNa0H調節(jié)至pH7.0 ;最后，加入2%瓊脂粉，并用自來水定容至1L，121°C滅菌20min。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，酵母粉 5，(NH4)2S045, KH2P041.36，K2HP040.8，F(xiàn)eSO4.7Η200.03，用氨水調節(jié)至 ρΗ7.2，121°C滅菌 20min。
[0034]一種積累高絲氨酸的ε -聚賴氨酸的發(fā)酵方法，具體如下:
[0035]⑴斜面菌種制備:將淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145在制備好的斜面培養(yǎng)基上劃線接種，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)基表面生成灰色孢子，放入冰箱4°C保減，備用。
[0036]⑵種子液的制備:將冰箱4 °C保藏的斜面菌種在30 V活化3_4h，接種環(huán)取1-3環(huán)，接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中(裝液量為三角瓶體積的10-20%)，28-37°C，150-200rpm/min,培養(yǎng) 24_48h。
[0037]⑶搖瓶發(fā)酵:將培養(yǎng)好的種子液按照6%_10% (v/v)的接種量，接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中(裝液量為三角瓶體積的10-20%)，在發(fā)酵0-48h添加2.5-5g/L的L-蘇氨酸，28-370C，150-200rpm/min,培養(yǎng) 72_120h。
[0038]⑷通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵:通風攪拌式發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量6%_10%(V/V)，攪拌轉速300-750rpm/min，通氣量3.0±0.5vvm,使溶解氧濃度控制30%，溫度30-37°C，培養(yǎng)120-188h，pH采用pH電極進行在線檢測，通過自動加料泵流加50%的氨水來控制pH (具體是多少)。L-蘇氨酸的添加通過配置成一定濃度的母液，在發(fā)酵0-48h，利用自動加料泵流加到發(fā)酵罐中，L-蘇氨酸的終濃度為2.5-5g/L。
[0039]在發(fā)酵過程中，pH控制分為兩個階段，在第一階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量高于10g/L)，pH值維持在6.5，以積累大量的菌體；在第二階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量低于10g/L后)，pH值維持在3.0-3.5，以產(chǎn)生大量的ε -PL,每2h取一次樣，在第二階段中，當培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于10g/L時，通過自動加料泵流加葡萄糖(400g/L)、硫酸銨(80g/L),葡萄糖的終濃度維持在8-13g/L。
[0040](5)發(fā)酵過程中，胞內L-高絲氨酸的檢測:發(fā)酵結束后，取一定量菌體，離心洗滌，使用液氮破碎細胞，冷甲醇提取胞內代謝物，用于GC-MS檢測。其中，草酰乙酸(0.14g/L)作為內標物作為L-高絲氨酸的定量參照物質，檢測到的L-高絲氨酸為相對濃度。
[0041 ] 為了詳細說明上述方法，提供以下實施例。
[0042]實施例1
[0043]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145搖瓶發(fā)酵
[0044]將種子液按照接種量6% (V/V)轉接至裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵初始0h，向培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5g/L的L-蘇氨酸，30°C，180rpm/min,發(fā)酵72h，發(fā)酵液中ε -PL產(chǎn)量為0.750g/L，較未添加L-蘇氨酸對照組的產(chǎn)量(0.463g/L)提高了 61%，胞內L-高絲氨酸的含量為2.93mg/L，較未添加L-蘇氨酸對照組提聞(1.51mg/L)提聞 94%ο
[0045]實施例2
[0046]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145搖瓶發(fā)酵
[0047]將種子液按照接種量10% (V/V)轉接至裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1000mL三角瓶中進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵0h，向培養(yǎng)基中添加終濃度為5g/L的L-蘇氨酸，發(fā)酵72h，發(fā)酵液中ε -PL產(chǎn)量為0.992g/L，較未添加L-蘇氨酸對照組的產(chǎn)量(0.463g/L)提高了 114%，胞內
L-高絲氨酸的含量為2.83mg/L，較未添加L-蘇氨酸對照組提高(1.58mg/L)提高79%。
[0048]實施例3
[0049]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145搖瓶發(fā)酵
[0050] 將種子液按照接種量6% (V/V)轉接至裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵24h，向培養(yǎng)基中添加終濃度為5g/L的L-蘇氨酸，發(fā)酵72h，發(fā)酵液中
ε -PL產(chǎn)量為0.886g/L，較未添加L-蘇氨酸對照組的產(chǎn)量(0.463g/L)提高了 91%，胞內L-高絲氨酸的含量為2.70mg/L，較未添加L-蘇氨酸對照組提高(1.66mg/L)提高63%。
[0051]實施例4[0052]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵
[0053]將種子液按照接種量10% (V/V)轉接至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L通風攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵Oh,向培養(yǎng)基中添加終濃度為5g/L的L-蘇氨酸,攪拌轉速300-750rpm/min,通氣量3.0±0.5vvm，使溶解氧濃度控制30%,溫度30°C，pH采用pH電極進行在線檢測，通過自動加料泵流加50%的氨水來控制pH。在發(fā)酵過程中，pH控制分為兩個階段，在第一階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量高于10g/L)，pH值維持在6.0-6.5，以積累大量的菌體；在第二階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量低于10g/L后)，pH值維持在3.0-3.5，以產(chǎn)生大量的ε -PL0每2h取一次樣。在第二階段中，通過自動加料泵流加葡萄糖(400g/L)、硫酸銨(80g/L)，葡萄糖的終濃度維持在8-13g/L，發(fā)酵至188h。
[0054]經(jīng)檢測，發(fā)酵液中的ε -PL產(chǎn)量為34.63g/L，在相同培養(yǎng)條件下，較未添加L-蘇氨酸對照組的產(chǎn)量(11.99g/L)提高了 188%，胞內L-高絲氨酸的含量為2.60mg/L，較未添加L-蘇氨酸對照組提高(1.37mg/L)提高89%。
[0055]實施例5
[0056]淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌CGMCCN0.3145通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵
[0057]將種子液按照接種量10% (V/V)轉接至裝有13L發(fā)酵培養(yǎng)基的20L通風攪拌式發(fā)酵罐中，發(fā)酵48h,向培養(yǎng)基中添加終濃度為5g/L的L-蘇氨酸,攪拌轉速300-750rpm/min,通氣量3.0±0.5vvm，使溶解氧濃度控制30%,溫度30°C，pH采用pH電極進行在線檢測，通過自動加料泵流加50%的氨水來控制pH。
[0058]在發(fā)酵過程中，pH控制分為兩個階段，在第一階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量高于10g/L)，pH值維持在6.3-6.6，以積累大量的菌體；在第二階段(培養(yǎng)基中的葡萄糖含量低于10g/L后)，pH值維持在3.0-3.5，以產(chǎn)生大量的ε -PL0 [0059]每2h取一次樣。在第二階段中，通過自動加料泵流加葡萄糖(400g/L)、硫酸銨(80g/L)，葡萄糖的終濃度維持在8-13g/L，發(fā)酵至164h。
[0060]經(jīng)檢測，發(fā)酵液中的ε -PL產(chǎn)量為25.47g/L，在相同發(fā)酵條件下，較未添加L-蘇氨酸對照組的產(chǎn)量(11.99g/L)提高了 112%，胞內L-高絲氨酸的含量為2.13mg/L，較未添加L-蘇氨酸對照組提高(1.12mg/L)提高90%。
【權利要求】
1.一種積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:采用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)CGMCCN0.3145 作為生產(chǎn)菌株，菌株發(fā)酵 0_48h,向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加L-蘇氨酸，提高聚賴氨酸的產(chǎn)量； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 50，酵母粉 5，(NH4)2S045, KH2PO4L 36，K2HPO40.8，F(xiàn)eSO4.7H200.03 ； 將種子液按體積分數(shù)6-10%的接種量，轉接種子液至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基容器中進行發(fā)酵，在發(fā)酵0-48h，向培養(yǎng)基中添加終濃度為2.5-5.0g/L的L-蘇氨酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的種子液的制備方法為:將斜面菌種活化后，取1-3環(huán)，接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，28-37°C，150-200rpm/min，培養(yǎng)24_48h，得到種子液。
3.根據(jù)權利要求1所述的積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述發(fā)酵方法為搖瓶發(fā)酵或通風攪 拌式發(fā)酵罐發(fā)酵。
4.根據(jù)權利要求3所述的積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述通風攪拌式發(fā)酵罐發(fā)酵在發(fā)酵過程中，PH控制分為兩個階段，在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量高于10g/L，pH值維持在6.5 ;在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量低于10g/L后，pH值維持在3.0_3.5 ο
5.根據(jù)權利要求4所述的積累高絲氨酸的ε-聚賴氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:當所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度低于10g/L時，通過自動加料泵流加葡萄糖400g/L、硫酸銨80g/L，葡萄糖的終濃度維持在8-13g/L。
【文檔編號】C12P13/02GK104004796SQ201410156360
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】賈士儒, 宋慶超, 郭鳳柱, 譚之磊, 馮伏龍, 薄濤 申請人:天津科技大學