本發(fā)明涉及一種東方鈴蟾(Bombina orientalis)生物活性肽Bombinin-8及其基因和在制藥中的應用，屬于生物醫(yī)學領域。

背景技術：

惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康和生命的疾病。傳統(tǒng)的化學治療雖然能抑制惡性腫瘤的發(fā)展，但在化療過程中使用的抗腫瘤藥物，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有較大的殺傷性毒副作用。在臨床使用中，還可能產(chǎn)生腫瘤耐藥性現(xiàn)象。因此，研究高效、低毒的新型抗腫瘤藥物，已經(jīng)成為當今腫瘤治療中一個亟待解決的重要問題。肝癌是世界十大惡性腫瘤之一，我國肝癌人群發(fā)病率在惡性腫瘤中為第二位。肝癌復發(fā)率高，傳統(tǒng)化療藥物對肝癌治療及愈后效果差，尋求新型高效的抗腫瘤藥物是肝癌綜合治療的重要環(huán)節(jié)。

抗腫瘤活性多肽是一類新型的抗癌藥物，以相對分子量小、低毒性、高活性、易于穿透腫瘤細胞等特點，受到醫(yī)藥研究者的廣泛關注。與傳統(tǒng)化學藥物相比，抗腫瘤多肽對腫瘤細胞具有更高的選擇性，能夠以多種方式給藥、易于多途徑吸收、且不易產(chǎn)生耐藥性。

抗生素廣泛用于治療敏感菌所致的感染。但是，由于人們對抗生素的不合理使用，導致許多細菌產(chǎn)生了耐藥性，甚至有產(chǎn)生超級細菌感染的風險，最終無藥可治。所以人們一直在尋找可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的藥物。多肽類抗生素具有分子量小，理化性質(zhì)穩(wěn)定，抗菌譜廣等優(yōu)點，在較低的濃度下可以快速殺死多種細菌，不易產(chǎn)生耐藥性，非常有希望成為新一代抗生素。

兩棲動物相對于其他物種具有特殊的生態(tài)地位。特殊的生存環(huán)境使得其皮膚及相應腺體進化為該物種特有的代謝系統(tǒng)和機體防御系統(tǒng)，這與其分泌物中所蘊含的許多結構新穎、功能獨特的天然活性物質(zhì)不無關系。在眾多針對兩棲動物的研究中，以蟾蜍作為生物原料資源，提取天然活性產(chǎn)物的研究最為活躍。蛋白和多肽是蟾蜍毒素中富含的一類天然活性產(chǎn)物，主要包括：抗菌肽、鈴蟾肽、緩激肽、血管緊張素樣肽等。除了以往關注的抗菌消炎的功能之外，近些年研究發(fā)現(xiàn)，蟾蜍毒素活性多肽物質(zhì)，還具有抗腫瘤的特性，可以選擇性殺傷腫瘤細胞。

東方鈴蟾(Bombina orientalis)為盤舌蟾科鈴蟾屬的兩棲動物，廣泛分布于我國東北三省及河北、內(nèi)蒙、山東等地，并于2000年被中國國家林業(yè)局列入國家保護有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄。由于東方鈴蟾地域分布的局限性，國際上對東方鈴蟾分泌物中的活性物質(zhì)的及其功能性研究的報道尚未多見。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的同時具有抗菌抗腫瘤活性的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8及其在制藥中的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

本發(fā)明的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8是東方鈴蟾(Bombina orientalis)皮膚分泌多肽基因編碼的一直鏈多肽，分子量2437.93道爾頓，等電點10.5，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且該氨基端序列末端氨基酸的羧基被酰胺化，即該氨基酸序列可具體體現(xiàn)為：

Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe-NH₂(GIGSAILSAGKSIIKGLAKGLAEHF-NH₂)

氨基酸序列酰胺化是部分抗菌肽的典型特征，對其抗菌活性具有重要作用。

編碼東方鈴蟾生物活性肽的基因由560個核苷酸組成，其5’端至3’端序列具體見SEQ ID NO:2，其中，編碼東方鈴蟾生物活性肽成熟肽的基因為第130-204位核苷酸。

本發(fā)明的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8具有廣譜抗菌活性和抑制三種肝癌細胞生長增殖的作用，可以用于制備抗腫瘤及抗病原微生物感染藥物。

本發(fā)明同時運用基因克隆和氨基酸測序兩種方法得到東方鈴蟾生物活性肽的全序列，使結果更具有準確性和科學性；東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8為單鏈多肽，由25個氨基酸組成，結構簡單，方便化學合成及基因工程制備；該多肽具有廣譜抑菌活性，能夠抑制革蘭氏陰性菌Escherichia coli，革蘭氏陽性菌Staphylococcus aureus和真菌Candida albicans的生長；該多肽還具有顯著的抗腫瘤活性，在微摩爾劑量下即可抑制三種人體肝癌細胞的生長增殖。

附圖說明：

圖1為利用半制備液相對東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8分離純化的色譜圖，箭頭所示為分離的Bombinin-8；

圖2為不同濃度東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8對人體肝癌細胞(Hep G2)的生長抑制作用圖；

圖3為不同濃度東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8對人體肝癌細胞(SK-HEP-1)的生長抑制作用圖；

圖4為不同濃度東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8對人體肝癌細胞(Huh7)的生長抑制作用圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面對本發(fā)明的具體實施方式作進一步說明，但不限定本發(fā)明的保護范圍。

下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容,但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實施例1

東方鈴蟾皮膚分泌物的獲?。?/p>

選取成年東方鈴蟾(4-6cm長，雌雄各半，n＝10)，使用超純水將其沖洗干凈后輕輕按摩鈴蟾背部皮膚表面。施加溫和按摩持續(xù)數(shù)分鐘，從背部皮膚腺體分泌出大量白色粘稠泡沫狀滲出物，用超純水將皮膚分泌物沖洗至干凈容器中，將其在液氮中速凍，在冷凍干燥器中凍干后儲存于-20℃。

實施例2

東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8的分子克隆

1.東方鈴蟾分泌物中RNA的提取

兩棲類動物在分泌防御性分泌物時，背部腺體處皮膚會發(fā)生輕微破損，皮膚細胞中的RNA會同時釋放到分泌物中，多次實驗證明在分泌物中可檢測到兩棲動物的RNA，因此我們采用在分泌物中分離RNA的方法提取東方鈴蟾皮膚總RNA，具體步驟如下：(1)東方鈴蟾分泌物中RNA的提取采用TaKaRa公司的MiniBEST Universal RNA

Extraction試劑盒。

(2)首先稱取5mg凍干東方鈴蟾皮膚分泌物，加至含有500μL裂解液Buffer RL的1.5mL滅菌tube中，用移液器反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀。將裂解液在12000rpm，4℃離心5分鐘，小心吸取上清液到新的1.5mL RNase Free Tube中。

(3)將上清液轉移入到gDNA Eraser Spin Column中。12000rpm，離心1分鐘。保留濾液，加入與液體等體積的70％乙醇，使用移液槍將溶液混合均勻。

(4)將混合液全部轉入RNA Spin Column中，12000rpm，離心1分鐘，棄濾液。分別使用500μL的Buffer RWA和600μL的Buffer RWB洗滌RNA Spin Column。

(5)將RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column膜中央處加入50-200μL的RNase Free H₂O，室溫靜置5分鐘，12000rpm離心2分鐘洗脫RNA。

2.東方鈴蟾皮膚cDNA文庫第一鏈的合成

(1)采用CLONTECH公司的 RACE 5’/3’Kit合成東方鈴蟾皮膚cDNA文庫的第一鏈。

(2)在PCR管中加入3μL步驟1中提取的RNA和1μL 3’CDS引物，將試劑混勻并短暫離心，在70℃加熱3分鐘，42℃加熱2分鐘，12000rpm離心10秒。

(3)向上述PCR管加入以下試劑：4μL 5×First-Strand Buffer、0.5μL 100mM DTT、1μL dNTPs(20mM),0.5μL 40U/μL RNase Inhibitor、2μL 100U SMART Reverse Transcriptase,將試劑混勻并短暫離心，在42℃加熱90分鐘，70℃加熱10分鐘。合成的單鏈cDNA用一定體積的Tricine-EDTA Buffer稀釋后，保存于-20℃。

3.通過RACE技術克隆東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8

(1)引物設計：根據(jù)已報道編碼鈴蟾類多肽cDNA的5’端非翻譯區(qū)保守序列設計正向引物，其序列為5’-GATGAWKTTTAAGTACATARTTGCRGT-3’(W＝A/T；K＝T/G；R＝A/G)，另一擴增引物為CLONTECH公司的Advantage^TM 2PCR Kit提供的通用引物(UMP)。

(2)PCR擴增：向PCR管中加入下列試劑：2.6μL PCR-Grade Water、1μL 10X Advantage 2PCR Buffer、0.2μL 10mM 50×dNTP Mix、0.5μL NUP、0.5μL 20μM 3’/5’Primer Mix、0.2μL 50×Advantage 2Polymerase Mix以及5μL單鏈cDNA模板。在PCR儀中按以下程序進行擴增：94℃1分鐘；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94℃30秒，56℃30秒，72℃3分鐘；72℃10分鐘，反應完成后PCR產(chǎn)物保存于4℃。

(3)PCR產(chǎn)物純化：取2μL PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，擴增成功的PCR產(chǎn)物使用CLONTECH公司Gel Extraction with the NuceloSpin Gel and PCR Clean-Up試劑盒進行純化。

4.PCR產(chǎn)物的連接和轉化

(1)采用Promega公司的-T Easy Vector System將PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒載體中。

(2)將下列試劑加入到PCR管中：2.5μL 2×Rapid Ligation Buffer、0.5μL-T Easy Vector(50ng)、1.5μL PCR products、0.5μL T4DNA Ligase。用移液槍將反應試劑混勻，在室溫放置1小時，然后4℃過夜孵育，連接產(chǎn)物保存在4℃。

(3)50μL JM109高效感受肽細胞轉移至含有2μL ligation產(chǎn)物的EP管中，混勻后冰浴2分鐘。在42℃加熱47秒，然后立即在冰上放置2分鐘。

(4)加入SOC培基(950μL)，在37℃恒溫搖床中振搖培養(yǎng)2.5小時。

(5)取130μL細菌培基涂布于含有氨芐青霉素、IPTG和X-Gal的LB培基上，在37℃過夜培養(yǎng)。挑選出培養(yǎng)基上生長的白色菌落繼續(xù)涂布在新的LB/ampicillin/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基上，在37℃過夜培養(yǎng)。

(6)用滅菌槍頭將白色單菌落挑出，溶解在20μL超純水中，100℃加熱5分鐘，再冰浴5分鐘。離心去除細胞碎片后的上清液即為含有目的片段的質(zhì)粒DNA。

5.擴增質(zhì)粒DNA

以質(zhì)粒DNA為模板，采用Promega公司的Taq DNA聚合酶對質(zhì)粒中插入的DNA片段進行擴增。步驟如下：

(1)將以下試劑加入到PCR管中：12.5μL Green Master Mix、2.5μL M13F引物(20μM)、2.5μL M13R引物(20μM)、2.5μL質(zhì)粒DNA模板，5μL無核酶水。

(2)按照如下參數(shù)進行PCR擴增：94℃1分鐘；30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94℃30秒，55℃30秒，72℃3分鐘；72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物儲存于4℃。

6.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，挑取含有目的片段的PCR產(chǎn)物送到基因測序公司測序，將測序結構與GeneBank數(shù)據(jù)庫中序列進行比對。利用軟件Chromas和Vector-NTI，將獲得的DNA序列轉換成氨基酸序列，根據(jù)開放閱讀框(ORF)序列保守區(qū)的特點推斷成熟肽區(qū)。

基因測序結果表明編碼東方鈴蟾生物活性肽的基因由560個核苷酸組成，從5’端至3’端序列具體見SEQ ID NO:2。

編碼東方鈴蟾生物活性肽成熟肽的基因為第130-204位核苷酸，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

綜上可得，東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8編碼的基因序列表為：序列長度560個核苷酸堿基，序列類型：核酸，鏈數(shù)：單鏈，拓撲學：鏈狀結構，序列種類：cDNA，來源：東方鈴蟾(Bombina orientalis)皮膚組織。

實施例3

東方鈴蟾生物活性肽的分離純化和氨基酸序列測定：

1.東方鈴蟾生物活性肽的分離純化

將實施例1中東方鈴蟾凍干皮膚分泌物溶解于一定體積的Buffer A(TFA/water(0.05/99.95,V/V))中，3000g離心10分鐘去除不溶物。通過反相半制備HPLC配置C5色譜柱對上清液進行分離純化，以0-70％乙腈為梯度進行洗脫，由Frac-920餾分自動收集器收集樣品洗脫液，間隔時間1分鐘。結果如圖1所示，箭頭所指為東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8。

2.東方鈴蟾生物活性肽的結構測定

采用快原子轟擊質(zhì)譜法測定多肽分子量，等電聚焦電泳測定等電點，氨基酸自動測序儀測定氨基酸序列結構。

測序結果表明東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8為直鏈多肽，分子量2437.93道爾頓，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1，且其羧基末端氨基酸酰胺化，即該氨基酸序列可具體表現(xiàn)為：

Gly Ile Gly Ser Ala Ile Leu Ser Ala Gly Lys Ser Ile Ile Lys Gly Leu Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe-NH₂(GIGSAILSAGKSIIKGLAKGLAEHF-NH₂)

實施例4

東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8的功能性研究

1.東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8抑制細菌生長的作用

本發(fā)明采用微量肉湯稀釋法測定多肽抑菌活性。使用接種環(huán)從Muellar-Hinton Agar(MHA)固體培養(yǎng)基上挑取已復蘇的單個帶檢菌落，接種于Muellar-Hinton Broth(MHB)液體培養(yǎng)基中，37℃孵育16-20h。擴增后的菌液用MHB培基進行稀釋，制備出相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液。再將上述菌液以1：500稀釋，加至滅菌96孔板中，每孔100μL。將提前配制好的一系列濃度的Bombinin-8加至菌液中，密封后置生化培養(yǎng)箱中孵育24h，于550nm波長處測定吸光度。能完全抑制受試菌生長的最低多肽濃度即為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)。取10μL多肽處理后的菌液涂布于MHA固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，第二天觀察培養(yǎng)基上細菌的生長情況，細菌無明顯生長的給藥濃度被認定為最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC)。供試菌株來源于中國藥用微生物菌種保藏管理中心，實驗重復三次，取平均值，結果見表1。

表1東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8的抑菌作用

由表1可知，東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用。

2.東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8的抗腫瘤作用

將指數(shù)生長期的人體肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7細胞分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入不同濃度(0.1、0.5、1、2.5、5、10、20μM)的東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8，繼續(xù)培養(yǎng)6，24及48h，再加入20μL MTT溶液，共同孵育4h，然后除去MTT溶液，加入150μL DMSO溶解藍紫色結晶，用酶標儀在490nm波長處測定各孔OD值，計算各給藥濃度的抑制率及IC50，以評價Bombinin-8對不同肝癌細胞體外增殖的抑制作用。實驗重復三次，取平均值，結果見圖2、圖3和圖4。

實驗結果顯示東方鈴蟾生物活性肽Bombinin-8可顯著抑制三種人體肝癌細胞的生長增殖，且呈劑量依賴性。經(jīng)統(tǒng)計學計算后，得到Bombinin-8在48h對肝癌Hep G2、SK-HEP-1和Huh7細胞增殖活性的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3.75μM、0.76μM以及3.91μM。其中，對肝癌SK-HEP-1細胞的抑制作用最為明顯。

以上內(nèi)容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。在不脫離本發(fā)明構思的前提下，本發(fā)明所述技術領域的技術人員可以做出若干推演或替換，都應視為本發(fā)明的保護范圍。