專利名稱：具有pH敏感特性的抗酸納米口服DNA抗腫瘤疫苗及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的具有pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗，以及用其進行治療方法。屬于基因工程制藥技術領域。
背景技術：
乳腺癌已經成為女性中常見的一種腫瘤。根據(jù)美國國家癌癥研究所(National Cancer Institute, NCI)統(tǒng)計，2004-2008年間，確診患有乳腺癌的患者平均年齡為61歲， 女性中的年發(fā)病率約為0. 0122%，其中亞裔/太平洋島裔發(fā)病率約為0. 0937%；2003-2007 年間，乳腺癌患者平均死亡年齡為68歲，女性中的年死亡率為0. 024%，其中亞裔/太平洋島裔的年死亡率為0. 0122% ;其發(fā)病率和死亡率分別在女性中占第一和第二位。目前對乳腺癌的治療主要是傳統(tǒng)療法，即手術切除、放療和化療。隨著基礎研究的發(fā)展和進步，更多的新型療法正在不斷涌現(xiàn)，例如免疫療法和分子靶向療法。免疫療法包括制備腫瘤疫苗和使用免疫調節(jié)劑。分子靶向療法主要以表皮生長因子受體和腫瘤新生血管生成為靶標。但是總體而言，無論是傳統(tǒng)療法還是新型免疫療法，目前的治療效果都不甚理想，這也是乳腺癌治愈率始終很低的主要原因，所以目前的療法還有很大的改進空間。找到一種能夠靶向多發(fā)的腫瘤病灶部位的載體，將抗癌藥物或基因特異性運輸?shù)侥[瘤病灶，而不對周圍的正常組織造成影響將顯著提高治療效果，減低副作用。DNA疫苗能引起強而持久的細胞免疫及體液免疫。它能誘導⑶8+T細胞的CTL反應及⑶4+T細胞的Thl反應，并能激活B細胞產生中和抗體。DNA疫苗即可用于預防，亦可用于治療，目前主要應用于感染性疾病、變態(tài)反應及腫瘤的防治。抗腫瘤DNA疫苗由于其具有如下優(yōu)點(I)產生免疫專一性好；(2)導入的質粒在體內可持續(xù)表達2個月；(3)構建雙基因表達質粒可提高疫苗的免疫作用，使得DNA疫苗在各方面有了很大的發(fā)展。殼聚糖是一種由甲殼素脫乙酰反應后的產品，分子量和聚合程度有關，不同分子量的殼聚糖制成的納米顆粒進入體內會在不同的器官或組織富集，因此可以根據(jù)殼聚糖的這一特性有針對性的合成殼聚糖分子，使其特異性的將所負載的DNA或RNA運送的特定的器官或組織，如果再在殼聚糖納米微球表明標記上組織特異性蛋白的配體或抗體，其靶向功能更佳。因此我們認為，以殼聚糖為微球骨架制成的納米顆粒是良好的DNA疫苗載體，但由于殼聚糖分子鏈上游離的氨基會吸收大量的胃酸中的H+，成為一種溶脹結構，從而使攜帶的DNA片段遭到胃酸的降解，降低DNA疫苗的穩(wěn)定性。這個問題是導致殼聚糖納米DNA 載體一直難以用于口服的重要影響因素。目前絕大多數(shù)納米顆粒都無法經受消化道特別是胃中的胃酸的消化作用，對其中被包裹的藥物或者基因不能起到保護作用，因而無法通過口服途徑進入人體發(fā)揮作用，給患者使用帶來極大的不便
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于解決目前應用于試驗性腫瘤免疫治療的納米顆粒載體毒副作用大、口服給藥途徑不穩(wěn)定、表達效率低難以攜帶DNA通過胃酸環(huán)境并進入腸道高效表達腫瘤抗原的問題，提供一種新的具有PH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗。本發(fā)明提供的具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗，是通過利用海藻酸對殼聚糖納米顆粒進行修飾，使殼聚糖納米顆粒具有PH敏感性，然后將編碼腫瘤特異性抗原Legumain蛋白的DNA質粒裝載到修飾后的殼聚糖納米顆粒而制成；該疫苗能夠在口服給藥后激活宿主自身的免疫應答，對腫瘤細胞進行殺傷；在疫苗通過胃液時保護 DNA質粒不被降解，并在腸道中形成松散的結構，利于樹突細胞及巨噬細胞吞噬，高效表達編碼的基因；同時有效激發(fā)CD8+T細胞介導的免疫反應，降低調節(jié)T細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用，對腫瘤細胞進行殺傷，延緩腫瘤細胞的生長與轉移。本發(fā)明同時提供了一種具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的制備方法，具體步驟為第I、殼聚糖納米顆粒的制備第I. I、將分子量在28000至32000的長鏈殼聚糖溶解于雙蒸水中，并調節(jié)pH值到5. 2，在55°C下攪拌30分鐘，形成A液；第I. 2、同時將25mM Na2SO4溶液與DNA質粒混合加熱至55°C，勻速攪拌30分鐘，形成B液；第1.3、隨后將A液與B液以體積比I : I混合兩種溶液，并馬上進行混合，5分鐘后將制備好的殼聚糖納米顆粒保存在4 C ；第2、海藻酸側鏈上的羧基的活化將海藻酸粉末溶解到雙蒸水中，將海藻酸溶液與加入的N-羥基琥珀酰亞胺和I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽按摩爾比I : 5 5混合，并將pH值調節(jié)到9. 0，室溫攪拌過夜，活化后的海藻酸置于4°C保存待用；第3、將第2步中活化的海藻酸與第I步中的殼聚糖納米顆粒按I : I的體積比混合，并調節(jié)PH值到6. 0，室溫20rpm，攪拌4 6小時，得到的產物放置4 7°C保存；第4、將第3步中制備的納米顆粒進行離心，12000rpm, 10分鐘，所得到的納米顆粒將沉于離心管的底部，棄上清，并將納米顆粒重懸于PBS緩沖液中，4 7°C保存，即得到具有PH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明所述的DNA 口服疫苗是一種由海藻酸進行表面修飾的殼聚糖結合編碼腫瘤特異性抗原Legumain蛋白DNA質粒的納米顆粒,粒徑范圍在300-400nm,能夠高效在小腸派氏淋巴結中被樹突狀細胞及巨噬細胞吞噬，并表達編碼的腫瘤抗原，激活宿主對腫瘤細胞的免疫殺傷。本發(fā)明所構建的納米顆粒毒副作用小，且具有強烈的抗原呈遞作用，具體說是將DNA質粒與殼聚糖進行靜電負交聯(lián)后，利用海藻酸對殼聚糖納米顆粒的表面進行修飾。借助免疫熒光染色及流式細胞檢測，對小鼠乳腺癌的生長及轉移情況進行評估，并對小鼠的免疫應答進行分析，確定PH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA疫苗的抗原呈遞能力及抗腫瘤效果。本發(fā)明提供的經過化學修飾的殼聚糖納米顆粒的一個重要優(yōu)點就是，可以抵抗胃腸道環(huán)境(pH、核酸酶)對藥物的破壞，因而可以作為DNA 口服疫苗的載體，這是殼聚糖納米顆粒在應用上的重要意義。


圖IpH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗制備示意圖；圖2pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗的粒徑分布結果圖；圖3pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗的投射電鏡形態(tài)圖；圖4pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的表面電位圖；圖5經pHl. 5的人工胃液消化后的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗及其他DNA載體抗酸降解的瓊脂凝膠分析；圖6在不同pH條件下pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的粒徑分布；圖7經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗免疫后在荷瘤小鼠小腸淋巴結巨噬細胞中的綠色熒光表達情況(免疫熒光結果)；圖8經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗免疫后在荷瘤小鼠小腸淋巴結巨噬細胞及樹突狀細胞中的綠色熒光表達情況(流式細胞儀檢測結果)；圖9經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線；圖10經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的腫瘤生長及腫瘤體重比；圖11經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的脾細胞中的CD8+T的激活情況；圖12經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的脾細胞中的調節(jié)T細胞的的抑制作用。 本發(fā)明結合附圖和具體實施方式
做進一步詳細說明。
具體實施例方式一、具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的制備具體步驟為第I、殼聚糖納米顆粒的制備第I. I、將分子量在28000至32000的長鏈殼聚糖溶解于雙蒸水中，并調節(jié)pH值到5. 2，在55°C下攪拌30分鐘，形成A液；第I. 2、同時將25mM Na2SO4溶液與需要的DNA質?；旌霞訜嶂?5°C，勻速攪拌30分鐘，形成B液；第1.3、隨后將A液與B液以體積比I : I混合兩種溶液，并馬上進行混合，5分鐘后將制備好的殼聚糖納米顆粒保存在4 C ；第2、海藻酸側鏈上的羧基的活化將海藻酸粉末溶解到雙蒸水中，將海藻酸溶液與加入的N-羥基琥珀酰亞胺和I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽按摩爾比I : 5 5混合，并將pH值調節(jié)到9. 0，室溫攪拌過夜，活化后的海藻酸置于4°C保存待用；
第3、將第2步中活化的海藻酸與第I步中的殼聚糖納米顆粒按I : I的體積比混合，并調節(jié)PH值到6. 0，室溫20rpm，攪拌4 6小時，得到的產物放置4 7°C保存；第4、將第3步中制備的納米顆粒進行離心，12000rpm, 10分鐘，所得到的納米顆粒將沉于離心管的底部，棄上清，并將納米顆粒重懸于PBS緩沖液中，4 7°C保存，即得到具有PH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗。二、體內腫瘤免疫治療 (I)對6-8周齡雌性BALB/c小鼠4號脂肪墊下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，待一周后，在小鼠4號脂肪墊處會形成原位小鼠乳腺癌腫瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；(2)通過灌胃的方法對BALB/c小鼠荷瘤小鼠進行治療，共分為5組，第一組為陰性對照PBS組；第二組為空納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗載體組；第三組為未經海藻酸修飾的納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗；第四組為本發(fā)明經海藻酸修飾的具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗組；第五組為陽性對照,傳統(tǒng)沙門氏菌載體口服DNA抗腫瘤疫
苗組;(3)灌胃及給藥劑量為每只BALB/c小鼠施以合150 U g DNA質粒的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗或IO8CFU的沙門氏菌，每天一次；(4)重復上述步驟5次。二、體內表達編碼的基因(I)對口服免疫后的BALB/c荷瘤小鼠進行體內熒光表達檢測處死荷瘤小鼠,取其小腸派氏淋巴結，觀察編碼綠色熒光蛋白的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的表達情況，并與其他對照組進行比較。(2)具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的抗腫瘤效果的評估①流式細胞儀分析CD8+T細胞在體內的激活情況處死荷瘤小鼠，取其脾臟，分離出脾細胞，與4T1小鼠乳腺癌細胞共培養(yǎng)24小鼠后，進行ra3\ra4\ra8\ra25\F4/80\raiic等染色，后立即利用流式細胞儀進行檢測，記錄并采集IXio6個細胞的數(shù)據(jù)；②對荷瘤小鼠的腫瘤生長進行評估每天測量荷瘤小鼠的腫瘤大小，并在處死小鼠時，精確測量腫瘤的大小以及重量，以評估pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗對小鼠乳腺癌生長的抑制作用。四、體外免疫熒光成像(I)處死小鼠，取出腫瘤或小腸派氏淋巴結組織，用OCT包埋，切成5毫米冰凍切片;(2)用預冷丙酮_20°C固定20分鐘；(3)用10%山羊血清室溫封閉I小時；(4)傾去多余液體，滴加F4/80\CDllc等抗體(I 100)，4°C孵育過夜；(5) TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘；(6)滴加熒光二抗(I 200)，室溫避光孵育0. 5小時；(7) TBST緩沖液洗3次，每次5分鐘；(8) DAPI (I 1000)復染細胞核，室溫避光孵育5分鐘；(9) TBST緩沖液洗5分鐘；
(10)封片,突光顯微鏡下觀察。實施例II.具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的制備
(I)殼聚糖納米顆粒的制備將分子量在28000至32000的長鏈殼聚糖溶解于雙蒸水中，并調節(jié)PH值到5. 2，在55°C下攪拌30分鐘。(2)同時，將25mM Na2SO4溶液與Legumain DNA質?；旌霞訜嶂?5 °C，勻速攪拌30分鐘。隨后以體積比I : I混合兩種溶液，并馬上進行混合，5分鐘后將制備好的殼聚糖納米顆粒保存在4 C ；(3)海藻酸側鏈上的羧基的活化將海藻酸粉末溶解到雙蒸水中，將海藻酸溶液與加入的N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽按摩爾比1:5: 5混合，并將pH值調節(jié)到9.0，室溫攪拌過夜，活化后的海藻酸置于4°C保存待用；(4)將步驟⑵中活化的海藻酸與殼聚糖納米顆粒按I : I的體積比混合，并調節(jié)pH值到6. 0，室溫20rpm，攪拌4 6小時，得到的產物放置4 7°C保存；(5)可將⑷中制備的納米顆粒進行離心，12000rpm，10分鐘，所得到的納米顆粒將沉于離心管的底部，棄上清，并將納米顆粒重懸于PBS緩沖液中，4 7°C保存；利用DLS分析pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗的制備在中性溶液中粒徑分布的結果如圖2所示，可見合成的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗的制備粒徑分布統(tǒng)一在371±27nm ;電鏡分析結果如圖3所不,可見經海藻酸包被的殼聚糖納米顆粒在表面有可見的包被層。且表面電位也可以明顯看出經修飾后的殼聚糖納米顆粒的表面電位被封閉如圖4所示。將200 Ul的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗在體外進行pHl. 5的人工胃液進行消化后，結果如圖5所示，只有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗有明顯的抗酸降解能力。在不同的PH值條件下，海藻酸包被及不包被的殼聚糖納米顆粒的粒徑分布結果如圖6所示。實施例2pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗在正常BALB/c小鼠的體內表達編碼蛋白。(I)灌胃及給藥劑量為每只BALB/c小鼠施以合150 U g DNA質粒的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗或IO8CFU的沙門氏菌，每天一次；(2)重復上述步驟5次；(3)對口服免疫后的BALB/c荷瘤小鼠進行體內熒光表達檢測處死荷瘤小鼠，取其小腸派氏淋巴結，觀察編碼綠色熒光蛋白的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的表達情況，并與其他對照組進行比較。結果如圖7所示，在小鼠派氏淋巴結中的巨噬細胞中綠色熒光蛋白被高表達。圖8的流式細胞儀檢測分析結果顯示，在小鼠派氏淋巴結中的巨噬細胞以及樹突狀細胞中綠色熒光蛋白較空白對照組的表達量高。實施例3pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗在體內的抗腫瘤效果(I)對6-8周齡雌性BALB/c小鼠4號脂肪墊下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，待一周后，在小鼠4號脂肪墊處會形成原位小鼠乳腺癌腫瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；(2)按步驟I.中的方法制備具有pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗；
(3)通過灌胃的方法對BALB/c小鼠荷瘤小鼠進行治療，共分為5組，第一組為陰性對照PBS組；第二組為空納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗載體組；第三組為未經海藻酸修飾的納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗；第四組為經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗組；第五組為陽性對照,傳統(tǒng)沙門氏菌載體口服DNA抗腫瘤疫苗組；結果如圖9所示，較其他組別經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗組腫瘤生長被延緩，與傳統(tǒng)沙門氏菌載體口服DNA抗腫瘤疫苗組相仿。最終的腫瘤體重比亦可說明pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗對腫瘤的生長有明顯的抑制作用。如圖10所示。實施例4經pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的脾細胞中的⑶8+T的激活情況。(I)對6-8周齡雌性BALB/c小鼠4號脂肪墊下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，待一周后，在小鼠4號脂肪墊處會形成原位小鼠乳腺癌腫瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；(2)按步驟I.中的方法制備具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗；(3)通過灌胃的方法對BALB/c小鼠荷瘤小鼠進行治療，共分為5組，第一組為陰性對照PBS組；第二組為空納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗載體組；第三組為未經海藻酸修飾的納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗；第四組為經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗組；第五組為陽性對照,傳統(tǒng)沙門氏菌載體口服DNA抗腫瘤疫苗組；(4)流式細胞儀分析CD8+T細胞在體內的激活情況處死荷瘤小鼠，取其脾臟，分離出脾細胞，與4T1小鼠乳腺癌細胞共培養(yǎng)24小鼠后，進行CD3\CD4\CD8\CD25等染色，后立即利用流式細胞儀進行檢測，記錄并采集IXlO6個細胞的數(shù)據(jù)；結果如圖11所示，經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗組可以有效地激活機體⑶8+T細胞的激活。實施例5經pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗及不同組別免疫后在荷瘤小鼠的脾細胞中的調節(jié)T細胞的的抑制作用(I)對6-8周齡雌性BALB/c小鼠4號脂肪墊下原位注射1X1054T1小鼠乳腺癌腫瘤細胞，待一周后，在小鼠4號脂肪墊處會形成原位小鼠乳腺癌腫瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；(2)按步驟I.中的方法制備具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗；(3)通過灌胃的方法對BALB/c小鼠荷瘤小鼠進行治療，共分為5組，第一組為陰性對照PBS組；第二組為空納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗載體組；第三組為未經海藻酸修飾的納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗；第四組為經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗組；第五組為陽性對照,傳統(tǒng)沙門氏菌載體口服DNA抗腫瘤疫苗組；(4)流式細胞儀分析調節(jié)T細胞在體內的激活情況處死荷瘤小鼠，取其脾臟，分離出脾細胞，與4T1小鼠乳腺癌細胞共培養(yǎng)24小鼠后，進行CD3\CD4\CD8\CD25等染色，后立即利用流式細胞儀進行檢測，記錄并采集IXlO6個細胞的數(shù)據(jù)；結果如圖12所示，經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤 疫苗，以及經海藻酸修飾的pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗空載體，都可以有效的抑制調節(jié)T細胞的比例，從而達到對免疫抑制的調節(jié)。
權利要求
1.具有PH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA抗腫瘤疫苗，其特征在于該疫苗是通過利用海藻酸對殼聚糖納米顆粒進行修飾，使殼聚糖納米顆粒具有PH敏感性，然后將編碼腫瘤特異性抗原Legumain蛋白的DNA質粒裝載到修飾后的殼聚糖納米顆粒而制成；在疫苗通過胃液時保護DNA質粒不被降解，并在腸道中形成松散的結構，利于樹突細胞及巨噬細胞吞噬，高效表達編碼的基因；同時有效激發(fā)CD8+T細胞介導的免疫反應，降低調節(jié)T細胞對免疫系統(tǒng)的抑制作用，對腫瘤細胞進行殺傷，延緩腫瘤細胞的生長與轉移。
2.如權利要求I所述的具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗的制備方法，其特征是具體步驟為第1、殼聚糖納米顆粒的制備第I. 1、將分子量在28000至32000的長鏈殼聚糖溶解于雙蒸水中，并調節(jié)pH值到5. 2， 在55°C下攪拌30分鐘，形成A液；第I. 2、同時將25mM Na2SO4溶液與DNA質粒混合加熱至55°C，勻速攪拌30分鐘，形成 B液；第1.3、隨后將A液與B液以體積比I : I混合兩種溶液，并馬上進行混合，5分鐘后將制備好的殼聚糖納米顆粒保存在4°C ；第2、海藻酸側鏈上的羧基的活化將海藻酸粉末溶解到雙蒸水中，并且將海藻酸溶液與加入的N-羥基琥珀酰亞胺和I-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽按摩爾比I : 5 5混合，并將pH值調節(jié)到9.0，室溫攪拌過夜，活化后的海藻酸置于4°C保存待用；第3、將第2步中活化的海藻酸與第I步中的殼聚糖納米顆粒按I : I的體積比混合， 并調節(jié)PH值到6. 0，室溫20rpm，攪拌4 6小時，得到的產物放置4 7°C保存；第4、將第3步中制備的納米顆粒進行離心，12000rpm, 10分鐘，所得到的納米顆粒將沉于離心管的底部，棄上清，并將納米顆粒重懸于PBS緩沖液中，4 TC保存，即得到具有pH 敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗。
全文摘要
一種具有pH敏感特性的抗酸納米顆?？诜﨑NA抗腫瘤疫苗及制備方法。所述的DNA口服疫苗是一種由海藻酸進行表面修飾的殼聚糖結合編碼腫瘤特異性抗原Legumain蛋白DNA質粒的納米顆粒，能夠高效在小腸派氏淋巴結中被樹突狀細胞及巨噬細胞吞噬，并表達編碼的腫瘤抗原，激活宿主對腫瘤細胞的免疫殺傷。本發(fā)明所構建的納米顆粒毒副作用小，且具有強烈的抗原呈遞作用。具體說是將DNA質粒與殼聚糖進行靜電負交聯(lián)，后利用海藻酸對殼聚糖納米顆粒的表面進行修飾。借助免疫熒光染色及流式細胞檢測，對小鼠乳腺癌的生長及轉移情況進行評估，并對小鼠的免疫應答進行分析，確定pH敏感特性的抗酸納米顆粒口服DNA疫苗的抗原呈遞能力及抗腫瘤效果。
文檔編號A61K47/36GK102614527SQ201210109630
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月14日 優(yōu)先權日2012年4月14日
發(fā)明者劉淑, 劉賾, 向榮, 呂丹, 熊敏, 譚小月 申請人:南開大學