專利名稱：樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于阿霉素靶向運(yùn)輸領(lǐng)域，特別涉及一種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法。
背景技術(shù)：
碳納米管(CNTs)是由單層或 層碳石墨片層卷曲而成的ー種新型納米碳材料，分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。CNTs特殊的管狀結(jié)構(gòu)使其具有獨(dú)特的力學(xué)、光學(xué)、電磁特性、場(chǎng)發(fā)射性和熱學(xué)特性，并在高強(qiáng)度復(fù)合材料、場(chǎng)發(fā)射裝置、傳感器、探測(cè)器等諸多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用前景。研究表明，CNTs可通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞而不產(chǎn)生毒性(Yang ff. , Thordarson P. , Gooding J. J. , Ringer S. P. , BraetR ,Carbon nanotubes for biological and biomedical applications. Nanotechnology,2007. 18 :412001.),而且CNTs中碳原子以SP2雜化作用為主，其表面由大量芳香結(jié)構(gòu)構(gòu)成，能與多種無(wú)機(jī)和有機(jī)分子以共價(jià)或非共價(jià)形式結(jié)合。CNTs獨(dú)特的中空結(jié)構(gòu)使其比球形納米載體有更大的比表面積，更高的藥物裝載量(李杉杉，何華，焦慶才，碳納米管在藥物和基因轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域的應(yīng)用.化學(xué)進(jìn)展，2008. 20(11) :1798-1803)。經(jīng)功能改性后的CNTs親水性好，生物相容性好，并具有較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，可通過(guò)代謝安全清除(Bianco A. ,KostarelosK.，Partiaos C. D.，Prato M.，Biomeaical applications of functionalisea carbonnanotubes. Chemical Communications, 2005 (5) :571-577)。因此 CNTs 作為載體可以裝載藥物、固定化酶、輸送DNA等，在功能材料、生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。阿霉素(DOX)是臨床常用抗腫瘤藥物，廣泛用于白血病、肺癌、惡性淋巴癌、軟組織腫瘤、骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌、甲狀腺癌等的化療。由于DOX可以嵌入DNA而抑制核酸的合成，因此其可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。但是在傳統(tǒng)化療過(guò)程中，由于缺乏選擇性，在殺死癌細(xì)胞的同吋，它也對(duì)正常組織產(chǎn)生很大的毒害，其臨床最常見的毒副作用就是心臟毒性。最近的研究表明，CNTs可以通過(guò)JI-Ji堆積作用負(fù)載阿霉素，而且這種負(fù)載是PH依賴性的，可以在pH值低的環(huán)境下釋放藥物分子。而腫瘤組織與正常組織相比具有微弱的酸性，因此，CNTs的這種負(fù)載作用可以有效地將藥物分子釋放在腫瘤部位，從而減少藥物對(duì)正常組織和器官的毒副作用(Liu Z. , Sun X.，NaKayama-Ratchiord N.，Dai H.，Supramolecular chemistry on water-soluble carbonnanotubes for drug loading and delivery. ACS Nano, 2007. I (I) :50-56) 另外結(jié)合CNTs在近紅外激光的照射下可引發(fā)藥物的控制釋放以及其自身產(chǎn)熱的特性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的革巴向化療和熱療(Chakravarty P. ,Marches R. ,Zimmerman N. S. , Swafford A. D. E.，Bajaj P.，Musselman I. H.，Pantano P.，Draper R. K.，Vitetta E. S.，Thermal ablationof tumor cells with antibody-functionalized single-walled carbon nanotubes.Proceedings of the National Academy of Sciences，2008. 105(25) :8697-8702)。PAMAM樹狀大分子所具備的單分散性、內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)和經(jīng)修飾后具有的良好生物相容性等特點(diǎn)，使其可以有效地修飾、組裝及生物功能化無(wú)機(jī)納米材料，廣泛應(yīng)用于多功能分子成像，以及腫瘤的早期診斷和治療。Shi等(Shi X.，Wang S. H.，Shen M.，Antwerp M. E. , Chen X. ,Li C. , Petersen E. J. , Huang Q. , Weber Jr ff. J. , BakerJr J.R. , Multifunctional dendrimer-modified multiwalled carbon nanotubes Synthesis, characterization, and in vitro cancer cell targeting and imaging.Biomacromolecules, 2009. 10(7) :1744-1750)利用多功能化第五代PAMAM樹狀大分子修飾MWCNTs，不僅提高了 MWCNTs的分散性和生物相容性，同時(shí)還可以連接熒光基團(tuán)以及靶向基團(tuán)，以實(shí)現(xiàn)熒光示蹤和增加組織特異性，并成功地用于相關(guān)癌細(xì)胞的靶向成像。
然而，檢索國(guó)內(nèi)外有關(guān)DOX靶向運(yùn)輸方面的文獻(xiàn)和專利表明以多功能化樹狀大分子修飾的MWCNTs為載體材料，通過(guò)JI-Ji堆積作用負(fù)載阿霉素，達(dá)到靶向、pH控釋和熒光成像的多重功效方面的研究還沒(méi)有報(bào)道。它不僅可以實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的成像，還可以選擇性地殺死癌細(xì)胞，而對(duì)正常組織和細(xì)胞不產(chǎn)生毒害。因此這一方法將拓展DOX在臨床醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹狀大分子的制備，具有很好的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明的一種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，包括(I)將11. 92-17. 88mg的末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5_NH2溶解于4-6mL的DMSO溶液中，并逐滴加入2_3mL含0. 893-1. 340mg的異硫氰酸熒光素FI的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)12-24h得到G5-FI ；(2)將I. 012-1. 653mg的葉酸FA溶解在5-7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入
4.393-6. 590mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽，在室溫下攪拌反應(yīng)2_4h后，逐滴加入到上述G5-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)1-3天，透析反應(yīng)液，將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到G5-FI-FA ；(3)將40. 00-60. OOmg的羧基化的多壁碳納米管MWCNTs溶解在20_30mL水中，然后加入32. 39-48. 59mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽，在室溫下攪拌反應(yīng)2-4h后，然后加入5-7. 5mL含上述9. 17-13. 76mg的G5-FI-FA的水溶液，攪拌反應(yīng)1_3天得到 MWCNT-G5-FI-FA ；(4)在步驟(3)的反應(yīng)液中加入20-30ii L三こ胺，攪拌混合20_40min后，再加入13. 44-20. 16 ii L的こ酸酐，室溫下攪拌反應(yīng)12-24h，透析反應(yīng)液，將過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；(5)稱取16-24mg上述MWCNT-G5-FI-FA_Ac并分散在超純水中，配成2mg/mL的分散液，放在超聲波清洗儀中超聲分散均勻；然后加入等體積的2mg/mL的鹽酸阿霉素DOX的水溶液；然后調(diào)節(jié)混合溶液PH至9. 5，在避光的條件下，持續(xù)攪拌12-24h，使DOX與MWCNT-G5-FI-FA-Ac充分結(jié)合；離心，移去上清液，再用pH為9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液為無(wú)色，即得載藥復(fù)合物D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。
所述步驟(2)和(4)中的透析具體エ藝為采用透析袋，先在pH為7. 4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析。所述步驟(5)中MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 DOX 的質(zhì)量比為 I : 1，MWCNT-G5-FI_FA-Ac和DOX的濃度均為lmg/mL。所述步驟(5)中采用0. IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9. 5。本發(fā)明中將FI接枝到末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子表面，F(xiàn)I采用在快速攪拌下逐滴滴加的方式加入到樹狀大分子溶液中，以保證樹狀大分子接枝FI的均一性。本發(fā)明中使用5-10倍量EDC活化羧基和氨基的反應(yīng)，增強(qiáng)反應(yīng)活性。以こ?；瘶錉畲蠓肿颖砻鎰徲嗟陌被越档推浔砻骐妱?shì)，提高材料的生物相容性。以三こ胺保持溶液的堿性環(huán)境保證こ?；磻?yīng)的順利進(jìn)行。對(duì)多功能樹狀大分子修飾的MWCNTs負(fù)載DOX的制備、藥物緩釋及腫瘤靶向治療研究，進(jìn)行了 UV-Vis(紫外可見光譜)、TEM(透射電子顯微鏡)、TGA(熱失重分析)、MTT(細(xì)胞活力分析)和激光共聚焦顯微鏡分析(I)1H NMR 測(cè)試結(jié)果以1H NMR測(cè)試表征多功能化樹狀大分子的修飾，結(jié)果表明已經(jīng)成功合成了多功能樹狀大分子G5-FI-FA和G5-FI。平均每個(gè)樹狀大分子表面健合的FI和FA的數(shù)量分別為5.0和4. 6。參見


I。(2) UV-Vis 測(cè)試結(jié)果FA在280nm處有較強(qiáng)的吸收峰，F(xiàn)I在501nm處有較強(qiáng)的吸收峰，UV-Vis圖譜驗(yàn)證了這些基團(tuán)修飾在了樹狀大分子上，參見附圖2和3。從圖2中可以看出，G5-FI在501nm處有吸收峰，同時(shí)在280nm有一個(gè)較小的吸收，而G5-FI-FA在280nm和501nm處都有較強(qiáng)的吸收峰，與G5-FI相比，280nm處的吸收更加高，表明FI和FA分子已經(jīng)成功的連接到了樹狀大分子上。從圖3可以看出，MWCNT-G5-FI-Ac在501nm處有吸收峰，MWCNT-G5-FI-FA_Ac在280nm和501nm處都有較強(qiáng)的吸收峰，與MWCNT-G5-FI_Ac相比280nm處的吸收更加高，表明G5-FI-FA分子已經(jīng)成功的連接到了 MWCNTs上。(3) TGA測(cè)試結(jié)果用TGA分析對(duì)功能化樹狀大分子在MWCNTs上的接枝量進(jìn)行了分析，參見附圖4。以566 °C作為計(jì)算熱重?fù)p失的溫度，在此溫度下，MWCNTs僅有5 %的重量損失，而MWCNT-G5-FI-Ac和MWCNT-G5-FI-FA_Ac的熱重?fù)p失分別為22%和22. 2 %。所以大約有17%的重量損失來(lái)自于修飾在MWCNTs表面的G5-FI-Ac和G5_FI-FA_Ac。(4) TEM 表征為了驗(yàn)證樹狀大分子的修飾化作用對(duì)MWCNTs結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響，對(duì)MWCNT-G5-FI-FA-Ac的形貌做了 TEM表征，參見附圖5。從圖中可以看出，MWCNTs經(jīng)過(guò)多功能化樹狀大分子修飾后仍然是中空的管狀結(jié)構(gòu)，即修飾化作用對(duì)MWCNTs的形貌不產(chǎn)生影響。(5)藥物釋放結(jié)果分別在pH 5. 4的醋酸鹽緩沖液和pH 7. 4的磷酸鹽緩沖液中研究DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac復(fù)合物中DOX的釋放行為，其釋放曲線參見附圖6。結(jié)果表明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac載藥復(fù)合材料都表現(xiàn)出明顯的pH控釋效果。對(duì)于D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac來(lái)說(shuō)，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的緩釋液中12h后藥物的釋放量分別為66. 7%和12. I %。緩釋24h后，前者有77. 4%的DOX釋放，而后者只有13. 5%的釋放。因此pH值對(duì)DOX的釋放存在較大的影響，pH值比較低吋，DOX水溶性好，更容易從多功能化樹狀大分子修飾的MWCNTs上脫離下來(lái)，可以達(dá)到pH控制釋放的目的(6) MTT細(xì)胞毒性分析用KB 細(xì)胞來(lái)研究 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 的藥效。將不同 DOX 濃度(0. 5，1，2，4 ii M)的自由藥物 DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 復(fù)合物和 DOX/MWCNT-G5-FI-Ac復(fù)合物與KB細(xì)胞共培養(yǎng)48h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力，參見附圖7。從圖中可以看出，相對(duì)于未處理的KB細(xì)胞，自由藥物D0X、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac復(fù)合物和DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac復(fù)合物對(duì)KB細(xì)胞都具有很大的毒性，且它們之間DOX的藥效并沒(méi)有太大的差別。同時(shí)所得到的未載藥MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac載體材料的細(xì)胞毒性MTT分析發(fā)現(xiàn)(參見附圖8，其中多功能化MWCNTs的濃度取的是當(dāng)DOX濃度達(dá)到1，2，
4ii M時(shí)MWCNTs的濃度)，這兩個(gè)材料本身是無(wú)毒的(和對(duì)照相比，p值> 0. 05)，表明DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI_Ac對(duì)KB細(xì)胞的藥效只與DOX藥物有夫，而與載體材料無(wú)關(guān)。(7) MTT藥物靶向分析將D0X/MWCNT-G5-FI-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac (D0X 濃度為 I y M)與KB-HFAR (高葉酸受體表達(dá))和KB-LFAR (低葉酸受體表達(dá))細(xì)胞共培養(yǎng)Ih后，倒掉含有材料的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗三次后再加入對(duì)應(yīng)的不含材料的培養(yǎng)基接著培養(yǎng)48h，用MTT方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的活力，參見附圖9。用D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac處理過(guò)的KB-HFAR細(xì)胞的細(xì)胞活力大大減少(大約是對(duì)照細(xì)胞活力的67% ) (p值< 0. 05)。相反地,不含F(xiàn)A的D0X/MWCNT-G5-FI-Ac復(fù)合物處理過(guò)的KB-HFAR細(xì)胞大約仍有90%存活。同時(shí)，大約96%的KB-LFAR細(xì)胞在D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 處理后仍然存活。這表明 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac可以靶向地抑制表面高表達(dá)葉酸受體的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。(8)激光共聚焦顯微鏡分析異硫氰酸熒光素連接到第五代樹狀大分子表面，是為了當(dāng)DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac被細(xì)胞攝入時(shí)，可以通過(guò)熒光成像進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，觀察藥物和載體分子的細(xì)胞內(nèi)吞作用。由于藥物分子DOX本身可以發(fā)紅色熒光，而我們的載體材料上含有熒光素(FI)可以發(fā)綠色熒光，因此我們進(jìn)ー步用激光共聚焦顯微鏡觀察載藥材料在不同細(xì)胞(KB-HFAR 和 KB-LFAR)中的內(nèi)吞情況。將 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac (D0X 濃度為 I U M)與KB-HFAR和KB-LFAR細(xì)胞共培養(yǎng)后Ih后，倒掉含有材料的培養(yǎng)基，用PBS洗三次后再加入對(duì)應(yīng)的不含材料的培養(yǎng)基接著培養(yǎng)4h，用激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞對(duì)藥物的內(nèi)吞效果，只有那些KB-HFAR有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，這說(shuō)明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac復(fù)合物已經(jīng)靶向進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。相反地，在相同條件下，KB-LFAR卻沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)。這說(shuō)明，DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac具有很好的靶向效果。本發(fā)明充分利用PAMAM樹狀大分子表面眾多的功能基團(tuán)，通過(guò)共價(jià)鍵對(duì)其進(jìn)行修飾與功能化，連接熒光成像分子和靶向分子，再修飾到MWCNTs表面，不僅提高碳納米管的水溶液分散性和生物相容性，還賦予碳納米管熒光成像和靶向性。通過(guò)熒光分子成像可以進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，觀察藥物和載體分子的細(xì)胞內(nèi)吞作用。通過(guò)靶向分子，可以將藥物定向輸送到癌細(xì)胞。同時(shí)利用MWCNTs與DOX的JI-Ji堆積作用實(shí)現(xiàn)DOX的高效負(fù)載和腫瘤微酸性環(huán)境釋放的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)ー步實(shí)現(xiàn)藥物的癌細(xì)胞靶向輸送和治療。有益.效果(I)本發(fā)明的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹狀大分子的制備，具有很好的實(shí)用價(jià)值；(2)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了 DOX藥物的癌細(xì)胞靶向輸送，可以有效的減少其毒副作用；同時(shí)利用MWCNTs與DOX的JI-Ji堆積作用實(shí)現(xiàn)DOX的高效負(fù)載和腫瘤微酸性環(huán)境釋放，具有很好的實(shí)用價(jià)值；(3)本發(fā)明利用熒光素為熒光標(biāo)記分子，進(jìn)而觀察藥物和載體材料的細(xì)胞內(nèi)吞作 用。

圖I為本發(fā)明制備的多功能樹狀大分子G5-FI (a)和G5_FI_FA(b)的1H NMR圖譜；圖2為本發(fā)明制備的多功能樹狀大分子G5-FI (曲線a)和G5_FI_FA(曲線b)的UV-Vis 圖譜；圖3 為 MWCNTs (曲線 a)、MWCNT-G5-FI_Ac (曲線 b)和 MWCNT-G5-FI-FA_Ac (曲線c)的UV-Vis圖譜；圖4 為 MWCNTs (曲線 a)、MWCNT-G5-FI-FA-Ac (曲線 b)和 MWCNT-G5-FI_Ac (曲線c)的TGA分析；圖5 為 MWCNT-G5-FI-FA-Ac 的 TEM 圖片；圖6為在不同pH值條件下，DOX在樹狀大分子修飾化MWCNTs上的緩釋曲線；圖7為不同濃度DOX以及DOX多功能化碳納米管復(fù)合物處理的KB細(xì)胞活力的MTT分析；圖8為未載藥的多功能化碳納米管的KB細(xì)胞活力MTT分析；圖9 為對(duì)照 KB-HFAR 細(xì)胞(a)，用 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 處理過(guò)的 KB-HFAR 細(xì)胞(b)和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 處理過(guò)的 KB-LFAR 細(xì)胞(c)以及 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 處理過(guò)的KB-HFAR細(xì)胞(d)的活力圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I 將G5-NH2 (11. 92mg)溶解于4mL的DMSO溶液中，在攪拌的情況下，逐滴加入2mL含F(xiàn)I (0. 893mg)的DMSO溶液。該反應(yīng)在室溫下攪拌12_24h后，得到未純化的G5-FI的DMSO溶液。將FA(I. 012mg)溶解在5mL的DMSO溶液中，然后加入EDC(4. 393mg)，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2h后，將混合溶液逐滴加入到未純化的G5-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)I天，最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWCO= 14，000)中，通過(guò)透析法將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析3次，毎次2L，再用蒸餾水透析5次，毎次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到G5-FI-FA ；將羧基化的MWCNTs (40. OOmg)溶解在20mL水中，然后加入EDC(32. 39mg)，在室溫條件下攪拌反應(yīng)2h后，加入5mL含G5-FI-FA(9. 17mg)的水溶液，攪拌反應(yīng)2天。再加入2011し三こ胺，攪拌混合301^11后，再加入13. 44 ii Lこ酸酐，室溫下攪拌反應(yīng)15h。最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通過(guò)透析法將過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析3次，毎次2L，再用蒸餾水透析5次，毎次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；
產(chǎn)物G5-FI-FA的1H NMR圖譜如附圖lb，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子表面接枝5.0個(gè)FI分子和4. 6個(gè)FA分子。同時(shí)UV-Vis圖譜(見附圖2，曲線b)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，F(xiàn)A的特征吸收峰在280nm，說(shuō)明FI和FA成功接枝在了樹狀大分子表面。從產(chǎn)物MWCNT-G5-FI-FA-Ac的UV-Vis圖譜(見附圖3，曲線c)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，F(xiàn)A的特征吸收峰在280nm，說(shuō)明G5-FI-FA成功地接枝到多壁碳納米管表面。用TGA對(duì)多功能化樹狀大分子在MWCNTs表面的接枝量進(jìn)行了分析，參見附圖4b。以566°C作為計(jì)算熱重?fù)p失的溫度，在此溫度下，MWCNTs僅有5%的重量損失，而MWCNT-G5-FI-FA-Ac的熱重?fù)p失為22.2%。所以大約有17 %的重量損失來(lái)自于修飾在MWCNTs 表面的 G5-FI-FA-Ac。進(jìn)ー步對(duì)MWCNT-G5-FI-FA-Ac做了 TEM表征，參見附圖5。從圖中可以看出，MWCNTs經(jīng)過(guò)多功能化樹狀大分子修飾后仍然是中空的管狀結(jié)構(gòu)，即修飾化作用沒(méi)有改變MWCNTs的形貌。實(shí)施例2將G5-NH2 (17. 88mg)溶解于6mL的DMSO溶液中，在攪拌的情況下，逐滴加入3mL含F(xiàn)I (I. 340mg)的DMSO溶液。該反應(yīng)在室溫下攪拌24h后，得到未純化的G5-FI的DMSO溶液。將FA(I. 653mg)溶解在7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入EDC(6. 590mg)，在室溫條件下攪拌反應(yīng)4h后，將混合溶液逐滴加入到未純化的G5-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)3天，最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWCO= 14，000)中，通過(guò)透析法將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析3次，毎次2L，再用蒸餾水透析5次，毎次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到G5-FI-FA ；將羧基化的MWCNTs (60. OOmg)溶解在30mL水中，然后加入EDC(48. 59mg)，在室溫條件下攪拌反應(yīng)3h后，加入7. 5mL含G5-FI-FA(9. 17-13. 76mg)的水溶液，攪拌反應(yīng)3天。再加入30 ii L三こ胺，攪拌混合40min后，再加入20. 16 u Lこ酸酐，室溫下攪拌反應(yīng)24h。最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通過(guò)透析法將過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析3次，毎次2L，再用蒸餾水透析5次，毎次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT-G5-FI-FA-Ac ；產(chǎn)物G5-FI-FA的1H NMR圖譜(附圖Ib)結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子表面接枝
5.OfFI分子和4. 6個(gè)FA分子。同時(shí)UV-Vis圖譜也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，F(xiàn)A的特征吸收峰在280nm(見附圖2，曲線b)。同時(shí)，產(chǎn)物MWCNT-G5-FI-FA_Ac的UV-Vis圖譜(見附圖3,曲線c)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm,FA的特征吸收峰在280nm,說(shuō)明G5-FI-FA成功地接枝到多壁碳納米管表面。 實(shí)施例3 分別稱取MWCNT-G5-FI-Ac 和 MWCNT-G5-FI-FA_Ac (20. Omg)并分散在超純水中，配成2mg/mL的分散液,放在超聲波清洗儀中超聲分散均勻。然后加入等體積的2mg/mL的DOX的水溶液，使DOX和MWCNTs的質(zhì)量比為I : 1，濃度均為lmg/mL。然后用0. IM氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH為9. 5。在避光的條件下，持續(xù)攪拌混合溶液24h，使DOX與MWCNT-G5-FI_Ac或MWCNT-G5-FI-FA-Ac充分結(jié)合。之后，將混合溶液離心，移去上清液，再用pH = 9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液為無(wú)色，收集所有的洗脫的上清液，通過(guò)計(jì)算洗掉的DOX的量來(lái)推算上載到多功能化碳納米管上的DOX的百分比，其包封率和載藥量均為98%。實(shí)施例4分別選擇pH = 5. 4的醋酸鹽緩沖液和pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液作為緩釋媒介，分析DOX在兩種pH環(huán)境下的釋放性能。首先分別稱取MWCNT-G5-FI-Ac和MWCNT-G5-FI-FA-Ac (2. Omg)，分別加入2mL的醋酸鹽緩沖液(pH = 5. 4)或PBS緩沖液(pH= 7.4)。將分散好的溶液置入透析袋中(分子截留量為14，000)，然后把裝有樣品的透析袋置入裝有13mL對(duì)應(yīng)緩沖液的小瓶子中，瓶子中溶液總體積為15mL，每個(gè)樣品三個(gè)平行。在恒溫(37°C )搖床，90轉(zhuǎn)每分鐘下測(cè)試其釋放性能。對(duì)于所有的緩釋樣品，根據(jù)設(shè)計(jì)好的時(shí)間間隔(0. 5，1，2，4，6，9，12，24，48和7211)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從樣品瓶中取出5111し緩釋液，再加入5mL新的緩沖液，保持溶液的體積不變。根據(jù)釋放出來(lái)的DOX在481nm處的吸光值以及DOX在兩種緩沖液下的濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出DOX在不同的時(shí)間點(diǎn)累計(jì)釋放的總量，分析藥物的釋放動(dòng)力學(xué)特征。其釋放曲線參見附圖6。從圖中可以看出，無(wú)論是帶葉酸的DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac還是不帶葉酸的D0X/MWCNT-G5-FI_Ac的載藥復(fù)合材料都表現(xiàn)出明顯的pH控釋效果。對(duì)于D0X/MWCNT-G5-FI-Ac來(lái)說(shuō)，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的緩釋液中，12h后藥物的釋放量分別為68. 5%和13. I %。緩釋24h后，前者有80. 4%的DOX釋放，而后者只有14. 3%的釋放。對(duì)于D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac來(lái)說(shuō)，在pH = 5. 4和pH = 7. 4的緩釋液中12h后藥物的釋放量分別為66. 7%和12. I %。緩釋24h后，前者有77. 4%的DOX釋放，而后者只有13. 5%的釋放。因此pH值對(duì)DOX的釋放存在較大的影響，pH值比較低吋，DOX水溶性好，更容易從多功能化樹狀大分子修飾的MWCNTs上脫離下來(lái)，可以達(dá)到pH控制釋放的目的，實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的微酸性環(huán)境定向釋放。實(shí)施例5先收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200 U L含細(xì)胞的培養(yǎng)基使細(xì)胞密度至8000/孔，邊緣孔用無(wú)菌PBS緩沖液填充；然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2, 370C )中孵育24h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)；第二天倒掉培養(yǎng)基，然后加入180 UL培養(yǎng)基，再加入含有不同濃度的DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac或D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac的20 u LPBS緩沖液(各個(gè)材料以DOX為基準(zhǔn)設(shè)為4個(gè)濃度，即0. 5，1，2，4 y M)。同時(shí)設(shè)計(jì)未載藥MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac材料對(duì)照組，每孔加含有相應(yīng)濃度的材料的PBS緩沖液20 u L，再加培養(yǎng)基180 u L，以驗(yàn)證材料本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。所有的試驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)孔為ー個(gè)平行組；在培養(yǎng)箱中孵育48h后，用倒置相差顯微鏡對(duì)各組細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。然后每孔加入20 ii L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使細(xì)胞與MTT充分反應(yīng)。最后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔加入200 ii L DMSO，置搖床上避光低速振蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm處測(cè)量各孔的MTT甲臜溶液吸光值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析借助于ANOVA方法實(shí)施。在所有的評(píng)估中，認(rèn)為P < 0. 05時(shí)，樣品之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。分析結(jié)果以細(xì)胞存活率來(lái)顯示D0X、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac和D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac對(duì)KB細(xì)胞的毒性作用。 MTT法檢測(cè)處理后細(xì)胞的活力，參見附圖7。從圖中可以看出，相對(duì)于未處理的 KB 細(xì)胞，純藥 DOX、D0X/MWCNT-G5-FI-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 對(duì) KB 細(xì)胞都具有很大的毒性，且它們之間DOX的藥效并沒(méi)有大大的差別。同時(shí)我們所得到的未載藥MWCNT-G5-FI-FA-Ac和MWCNT-G5-FI_Ac材料的MTT分析可知(參見附圖8，其中多功能化MWCNTs的濃度取的是當(dāng)DOX濃度達(dá)到1，2，4 ii M時(shí)MWCNTs的濃度)，這兩個(gè)材料本身是無(wú)毒的(和對(duì)照相比，P 值> 0. 05)，表明 D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 D0X/MWCNT-G5-FI_Ac 對(duì)KB細(xì)胞的藥效只與其負(fù)載的DOX有夫。實(shí)施例6收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入200 U L含細(xì)胞的培養(yǎng)基(細(xì)胞8000/孔)，其中KB-HFAR組使用正常不含有葉酸的培養(yǎng)基，KB-LFAR組使用含有葉酸的培養(yǎng)基(在細(xì)胞培養(yǎng)板中葉酸終濃度為2. 5iiM);然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱(5% CO2, 37 0C )中孵育24h，倒掉原有的培養(yǎng)基后，加入180 u L對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，再加入含有10 ii M DOX的DOX/MWCNT-G5-FI-Ac 或 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 的 20 y L PBS 緩沖液(以 DOX 為基準(zhǔn)的終濃度為lyM)。同時(shí)設(shè)計(jì)培養(yǎng)PBS緩沖液對(duì)照組，其培養(yǎng)基為不含葉酸的培養(yǎng)基。所有的試驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)孔為ー個(gè)平行組；在培養(yǎng)箱中孵育Ih后，倒掉含有材料的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗三次后再加入對(duì)應(yīng)的不含材料的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后每孔加入20 ii L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，做MTT測(cè)試，以PBS緩沖液處理的細(xì)胞為對(duì)照，測(cè)試材料組細(xì)胞的成活率。附圖9為未處理的KB-HFAR細(xì)胞和用D0X/MWCNT-G5-FI_Ac和DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac 處理過(guò)的 KB-HFAR 細(xì)胞以及 D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac 處理過(guò)的KB-LFAR細(xì)胞的細(xì)胞活力MTT分析。從圖中可以清楚地看到，用D0X/MWCNT-G5-FI_Ac處理過(guò)的KB-HFAR細(xì)胞的細(xì)胞活力大大減少(大約是對(duì)照細(xì)胞活力的67% ) (p值< 0. 05)。相反地，大約90 %的D0X/MWCNT-G5-FI-Ac處理過(guò)的KB-HFAR細(xì)胞仍然存活。同時(shí)，大約96 %的KB-LFAR細(xì)胞在D0X/MWCNT-G5-FI-FA_Ac處理后仍然存活。這個(gè)結(jié)果表明，DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac可以靶向地抑制表面表達(dá)葉酸受體的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而這種靶向作用是由癌細(xì)胞表面的葉酸受體介導(dǎo)的。用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物在不同細(xì)胞(KB-HFAR和KB-LFAR)中的內(nèi)吞情況實(shí)驗(yàn)使用直徑為6cm共聚焦顯微鏡培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞。即取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，每個(gè)培養(yǎng)皿加入2000 u L含細(xì)胞的培養(yǎng)基(細(xì)胞20000/培養(yǎng)皿)，其中KB-HFAR組使用不含有葉酸的培養(yǎng)基，KB-LFAR組使用含有葉酸的培養(yǎng)基(在細(xì)胞培養(yǎng)皿中葉酸終濃度為2. 5 PM);然后在5%C02，37°C下孵育24h，倒掉原有的培養(yǎng)基后，加入1800ii L對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基，再加入含有IOyMDOX的D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac的200 u L PBS溶液(以DOX為基準(zhǔn)的終濃度為I y M)。在培養(yǎng)箱中孵育Ih后，倒掉含有材料的培養(yǎng)基，用PBS洗三次后再加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基接著培養(yǎng)4 h，然后用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物在各組細(xì)胞中的內(nèi)吞情況，只有那些KB-HFAR有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，這說(shuō)明D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac復(fù)合物已經(jīng)靶向進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。相反地，在相同條件下，KB-LFAR卻沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)。這說(shuō)明，D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac具有很好的靶向效果。對(duì)比例I將G5-NH2 (11. 82mg)溶解于4mL的DMSO溶液中，在攪拌的情況下，逐滴地加入2mL含F(xiàn)I (0. 885mg)的DMSO溶液。該反應(yīng)在室溫下攪拌24h。最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWC0=14, 000)中，通過(guò)透析法將反應(yīng)溶劑DMS0、過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，先用PBS緩沖液透析4次，毎次2L，再用蒸餾水透析4次，毎次2L，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到 G5-FI。將羧基化的MWCNTs (40. OOmg)溶解在20mL水中，然后加入EDC(32. 39mg)，在室溫條件下攪拌反應(yīng)3h后，加入5mL含G5-FI(8. 5mg)的水溶液，攪拌反應(yīng)3天。之后，在反應(yīng)混和液中加入20 ii L三こ胺，攪拌混合30min后，再加入13. 44 u Lこ酸酐，室溫下攪拌反應(yīng)24h。最后將反應(yīng)溶液放入透析袋(MWC0 = 50，000)中，通過(guò)透析法將過(guò)量的反應(yīng)物以及反應(yīng)副產(chǎn)物除去，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到MWCNT-G5-FI-Ac。產(chǎn)物G5-FI的1H NMR圖譜如附圖la，結(jié)果表明平均每個(gè)樹狀大分子表面接枝5. 0個(gè)FI分子。同時(shí)UV-Vis圖譜(見附圖2a)也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，說(shuō)明FI成功接枝在了樹狀大分子表面。產(chǎn)物MWCNT-G5-FI-Ac的UV-Vis圖譜也可以看到FI的特征吸收峰在501nm，說(shuō)明G5-FI成功接枝到MWCNTs表面。用TGA對(duì)多功能化樹狀大分子在MWCNTs表面的接枝量進(jìn)行 了分析，參見附圖4c。以566°C作為計(jì)算熱重?fù)p失的溫度，在此溫度下，MWCNTs僅有5%的重量損失，而MWCNT-G5-FI-Ac的熱重?fù)p失為22%。所以大約有17%的重量損失來(lái)自于修飾在MWCNTs表面的 G5-FI-Ac。
權(quán)利要求
1.一種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，包括 (1)將11.92-17. 88mg的末端為氨基的第五代聚酰胺-胺樹狀大分子G5_NH2溶解于4-6mL的DMSO溶液中，并逐滴加入2_3mL含0. 893-1. 340mg的異硫氰酸熒光素FI的DMSO溶液，在室溫下攪拌反應(yīng)12-24h得到G5-FI ； (2)將I.012-1. 653mg的葉酸FA溶解在5_7. 5mL的DMSO溶液中，然后加入4. 393-6. 590mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽，在室溫下攪拌反應(yīng)2_4h后，逐滴加入到上述G5-FI的DMSO溶液當(dāng)中，攪拌反應(yīng)1-3天，透析反應(yīng)液，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到G5-FI-FA ； (3)將40.00-60. OOmg的羧基化的MWCNTs溶解在20_30mL水中，然后加入32. 39-48. 59mg的I-こ基-(3- ニ甲基氨基丙基)碳ニ亞胺鹽酸鹽，在室溫下攪拌反應(yīng)2_4h后，然后加入5-7. 5mL含上述9. 17-13. 76mg的G5-FI-FA的水溶液，攪拌反應(yīng)1_3天得到MWCNT-G5-FI-FA ； (4)在步驟(3)的反應(yīng)液中加入20-30iiL三こ胺，攪拌混合20-40min后，再加入13. 44-20. 16 u L的こ酸酐，室溫下攪拌反應(yīng)12_24h，透析反應(yīng)液，最后將產(chǎn)物的水溶液冷凍干燥得到 MWCNT-G5-FI-FA-Ac ； (5)稱取16-24mg上述MWCNT-G5-FI-FA-Ac并分散在超純水中，配成2mg/mL的分散液，然后加入等體積的2mg/mL的鹽酸阿霉素DOX的水溶液；然后調(diào)節(jié)混合溶液pH至9. 5,在避光的條件下，持續(xù)攪拌12_24h ;離心，移去上清液，再用pH為9. 5的水清洗沉淀物，直至上清液為無(wú)色，即得載藥復(fù)合物D0X/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，其特征在干所述步驟(2)和(4)中的透析具體エ藝為采用透析袋，先在pH為7.4的PBS緩沖液中透析，再在蒸餾水中透析。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中MWCNT-G5-FI-FA-Ac和DOX的質(zhì)量比為I : 1，MWCNT-G5-FI-FA-Ac 和 DOX 的濃度均為 lmg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，其特征在干所述步驟(5)中采用0. IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樹狀大分子修飾多壁碳納米管復(fù)合材料負(fù)載阿霉素的制備方法，包括(1)制備G5-FI；(2)制備G5-FI-FA；(3)制備MWCNT-G5-FI-FA；(4)制備MWCNT-G5-FI-FA-Ac；(5)制備載藥復(fù)合物DOX/MWCNT-G5-FI-FA-Ac。本發(fā)明制備過(guò)程簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于制備其它功能化樹狀大分子的制備，具有很好的實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K47/04GK102614522SQ20121010934
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者史向陽(yáng), 溫詩(shī)輝 申請(qǐng)人:東華大學(xué)