專利名稱：一種多靶點抑制腫瘤生長的新基因工程藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用真核和原核細胞表達的血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白，作為一種新抗腫瘤基因工程藥。
背景技術：
膠原IV是血管基底膜的主要大分子，能促進細胞的粘附，遷移，分化和生長。組成膠原IV的核苷酸編碼六條不同的α鏈，即α1～α6，膠原IV的每條α鏈由三個部分組成N-端的7 S區(qū)域，中間的三股螺旋區(qū)域，C-端的非膠原區(qū)域1(NC1)。腫瘤抑素(Tumstatin)由膠原IVα3鏈的中間三股螺旋區(qū)域C-端12氨基酸和非膠原區(qū)域1(NC1)共244氨基酸組成。它的兩個功能區(qū)域(74～98氨基酸)和(197～215氨基酸)功能多肽分別具有抑制血管內皮細胞增殖、誘導內皮細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖的活性，然而，197～215氨基酸功能肽作為Tumstatin整體的一部分時，沒有直接抑制腫瘤細胞增殖的功能。這是受空間結構影響，tumstatin(197～215氨基酸)活性區(qū)域受體結合部位被掩蓋，阻礙了與受體的結合，影響了功能的發(fā)揮。
實體瘤的生長和轉移取決于腫瘤細胞和血管內皮細胞這兩類細胞的數量，兩者相互依存。任何一種細胞群的增減必然導致另一類細胞的相應增減。因此，抑制任何一類細胞的藥物都具有腫瘤治療作用。前者是以抑制腫瘤細胞增殖為靶的腫瘤化學治療，后者是腫瘤血管生成抑制劑(如Endostatin，Tumstatin等)為主的抗腫瘤血管生成療法。
血管生成抑制劑與現今常用化療藥物比較有如下優(yōu)點(1)血管生成抑制劑直接作用于血管內皮細胞能很快聚集于血管內皮細胞增殖速度快的腫瘤部位，而化療藥經組織擴散時受組織壞死、纖維化、組織內高壓的影響，常在組織內達不到有效濃度；(2)腫瘤血管內皮細胞除了增殖速度大大快于正常血管內皮細胞外，其余的類似于正常組織，基因型穩(wěn)定，不易產生耐藥性，腫瘤細胞基因型不穩(wěn)定，易產生耐藥性；(3)原發(fā)腫瘤和繼發(fā)腫瘤的血管內皮相同，抗血管生成療法的效果相似，而原發(fā)灶和繼發(fā)灶中的腫瘤細胞的生物學特性差異較大，化療反應各異；(4)腫瘤血管內皮細胞較正常組織血管內皮細胞增殖的速度快幾十倍，血管生成抑制劑對快速增埴的腫瘤血管內皮細胞有選擇性的作用，對正常組織血管內皮細胞作用小，而化療藥對正常細胞毒副作用較大。但血管生成抑制劑無法根治實體瘤(小的實體瘤能無血管生存)，必須長期應用，一旦停藥，腫瘤可能會繼續(xù)生長。因此，有機綜合抗腫瘤血管生成療法和抑制腫瘤細胞增殖策略將有助于提高實體瘤臨床治療效果，是腫瘤防治藥物研究的發(fā)展趨勢。
本發(fā)明血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白是一種多靶點抑制腫瘤生長新基因工程新藥，血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP-GST 10mg/kg，6mg/kg，2mg/kg)對小鼠Lewis肺癌皮下接種原發(fā)瘤具有顯著抑制作用(瘤重抑制率分別為95.5％，80.4％，60.05％)。血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP-GST 10mg/kg，6mg/kg，2mg/kg)對小鼠Lewis肺癌自發(fā)性肺轉移具有顯著抑制作用(自發(fā)性肺轉移瘤結節(jié)抑制率分別為94.8％，86.4％，73.9％)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于利用IgG3上游鉸鏈柔性接頭連接，使腫瘤抑素(Tumstatin)兩個功能區(qū)的空間結構自然伸展，達到抑制血管內皮細胞和腫瘤細胞的雙重功能，獲得一種新抗腫瘤基因工程藥，即血管基膜衍生多功能肽(vascular basement membrane～derived multifunctional peptide，VBMDMP)。
本發(fā)明的技術解決方案1.構建VBMDMP克隆載體用DNA合成儀人工合成VBMDMP DNA全序列，序列如下cgggatccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgaaatgattattcatacBamHI Tumstatin 74～98aa對應序列tggctgaccccacttggtgacacaactcacacatccggatgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggctIgG3上游絞鏈區(qū)序列 Tumstat in 197～215aa對應序列tcattaaacccagaaagaaagcttcccHindIIIBamHI和HindIII雙酶切該序列和pUC19質粒，T4DNA酶16□連接過夜，將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細菌，氨芐青霉素(Amp)篩選陽性克隆，小量提取質粒，酶切、測序鑒定。
2.構建VBMDMP表達載體用限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切VBMDMP/pUC19質粒，重新設計PCR引物，5’端含EcoRI，3’端含SalI酶切位點F1GCGAATTCACAATGCCATTCTTATTCTG(EcoRI)F2GCGTCGACTCTTTCTGGGTTTAATGAAG(SalI)PCR擴增目的片段VBMDMP，然后EcoRI和Sal雙酶切表達載體pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，回收酶切后的pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，T4DNA連接酶連接過夜，轉化感受態(tài)Ecoli JM109，Amp篩選陽性克隆。挑取陽性克隆于含Amp 100mg.L-1的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，小量提取質粒，酶切、普通PCR初步鑒定、經上海生工公司測序鑒定3.VBMDMP的原核表達和純化取鑒定后的單克隆菌落于5ml LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，以1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基250r/min振搖3h，加入IPTG0.1mmol.L-1.M誘導3～7h，取1ml菌液，12000g×5min離心收集菌體。用PBS洗滌1次，加入等體積的蛋白質上樣緩沖液，沸水浴中5min后上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％，電泳緩沖液采用Tris-甘氨酸系統(tǒng)。重組菌株菌液100ml誘導4h后，培養(yǎng)液5000g×10min收集菌體，懸浮于1ml預冷的PBS(150mmol.L-1NaCl，16mmol.L-1Na2HPO4，4mmol.L-1NaH2PO4，pH7.4)中，冰上超聲破碎細胞10×30s然后加入預冷的Triton X-100至終濃度1％，4℃溫和攪拌30min，離心12000g×5min，收集破碎的上清液過Glutathione Sepharose 4B層析柱；PBS，pH7.3充分洗脫，然后用5～10倍柱床體積的還原型谷胱甘肽洗脫(20mmol.L-1)，濃縮收集成分即為純化的ST-VBMDMP。蛋白質含量測定參照Bradford方法，以BSA為標準。本發(fā)明的目的在于利用IgG3上游鉸鏈柔性接頭連接，使腫瘤抑素(Tumstatin)兩個功能區(qū)的空間結構自然伸展，達到抑制血管內皮細胞和腫瘤細胞的雙重功能，獲得一種新抗腫瘤基因工程藥，即血管基膜衍生多功能肽(vascular basementmembrane～derived multifunctional peptide，VBMDMP)。
血管基膜衍生多功能肽由55個氨基酸組成，其氨基酸序列如下Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Ser-Gly-Cys-Asn-Tyr-Tyr-Ser-Asn-Ser-Tyr-Ser-Phe-Trp-Leu-Ala-Ser-Leu-Asn-Pro-Glu-Arg該肽的分子量為6.38kDa，等電點為4.395。
本發(fā)明通過用原核或真核細胞表達血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白。體內外藥效學實驗證實血管基膜衍生多功能肽是一種全新的同時具有抑制血管內皮細胞增殖和抑制腫瘤細胞增殖兩種不同抗腫瘤特性的新基因工程藥物。


下面結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
圖1是本發(fā)明專利的VBMDMP/pUC19酶切分析圖。
圖2是本發(fā)明專利的VBMDMP/pGEX-4T-1的測序報告。
圖3是本發(fā)明專利的純化GST-VBMDMP融合蛋白的SDS-PAGE分析。
圖1圖標M為DNA標準；圖標1、圖標2為VBMDMP/PUC19用BamHI和HindIII酶切可見清晰180bp條帶，認為獲得重組目的基因；圖標3為PUC19用BamHI和HindIII酶切對照無180bp條帶。
圖2測序圖示插入序列與VBMDMP序列完全相符。
圖3圖標M為蛋白質分子量標準；圖標1為IPTG誘導3小時的PGEX-4T-1/JM109菌液的電泳圖譜；圖標2為純化的GST蛋白(26KD)；圖標3為IPTG誘導3小時的VBMDMP/PGEX-4T-1/JM109菌液電泳圖譜；圖標4為為純化的vbmdmp-GST蛋白(32KD)。
具體實施例方式
下面結合實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
1.VBMDMP克隆載體的構建 用DNA合成儀人工合成VBMDMP DNA全序列如下cgggatccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgaaatgattattcatacBamHI Tumstatin 74～98aa對應序列tggctgaccccacttggtgacacaactcacacatccggatgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggctIgG3上游絞鏈區(qū)序列 Tumstatin 197～215aa對應序列tcattaaacccagaaagaaagcttcccHindIII
JM109感受態(tài)細菌，氨芐青霉素(Amp)篩選陽性克隆，獲得重組質粒VBMDMP/pUC19。
小量提取質粒，BamHI和HindIII雙酶切該重組質粒，1％瓊脂糖電泳，出現了質粒條帶和180bp條帶(圖1)。初步認為獲得了重組子。對該重組子進行序列測定，結果表明，插入序列與人工合成VBMDMP DNA序列完全一致。
VBMDMP DNA序列如下2.VBMDMP表達載體的構建用限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切VBMDMP/pUC19質粒，重新設計引物，5’端含EcoRI，3’端含SalI酶切位點F1GCGAATTCACAATGCCATTCTTATTCTG(EcoRI)F2GCGTCGACTCTTTCTGGGTTTAATGAAG(SalI)PCR(PCR緩沖液10×5μl；Taq酶0.5μl；dNTP 2μl；F1，F2 0.25μl；模板1μl，94℃2min；94℃45s；56℃45s72℃1min；72℃5min，從第2步至第4步延伸35個循環(huán))擴增目的片段，用PCR產物回收試劑盒回收目的片段VBMDMP，EcoRI和Sal雙酶切pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，回收酶切后的pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，T4DNA連接酶連接過夜，轉化感受態(tài)E coli JM109，Amp篩選陽性克隆。挑取陽性克隆于含Amp 100mg.L-1的LB培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，獲得表達載體質粒VBMDMP/pGEX-4T-1。
用EcoRI和SalI雙酶切提取的質粒VBMDMP/pGEX-4T-1，可切出質粒大片段條帶和180bp左右片段，表明擴增的VBMDMP片段已插入載體質粒中。測序分析表明與VBMDMP序列相符(圖2)。
3.VBMDMP的純化 取鑒定后的單克隆菌落于5ml LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，以1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基250r/min振搖3h，加入IPTG0.1mmol.L-1.M誘導3～7h，取1ml菌液，12000g×5min離心收集菌體。用PBS洗滌1次，加入等體積的蛋白質上樣緩沖液，沸水浴中5min后上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％，電泳緩沖液采用Tris-甘氨酸系統(tǒng)。重組菌株菌液100ml誘導4h后，培養(yǎng)液5000g×10min收集菌體，懸浮于1ml預冷的PBS(150mmol.L-1NaCl，16mmol.L-1Na2HPO4，4mmol.L-1NaH2PO4，pH7.4)中，冰上超聲破碎細胞10×30s然后加入預冷的Triton X-100至終濃度1％，4℃溫和攪拌30min，離心12000g×5min，收集破碎的上清液過Glutathione Sepharose 4B層析柱；PBS，pH7.3充分洗脫，然后用5～10倍柱床體積的還原型谷胱甘肽洗脫(20mmol.L-1)，濃縮收集成分即為純化的GST-VBMDMP。蛋白質含量測定參照Bradford方法，以BSA為標準。
對照JM109組(轉化有載體質粒pGEX-4T-1)可誘導26kD的特異蛋白(GST片段)，轉化有重組質粒VBMDMP/pGEX-4T-1的JM109經IPTG誘導后，在33kD左右出現一條新的蛋白帶，與預期的分子量大小相吻合，而在26KD處的蛋白帶消失了，說明插入的外源基因已經成功地在大腸桿菌中表達，并與GST形成了融合蛋白?？扇苄猿煞种苯佑肎lutathione Sepharose 4B層析柱純化表達產物上清液，得到高純度的GST-VBMDMP融合蛋白(如圖3所示)。GST-VBMDMP占大腸桿菌表達產物的18.5％，純化效率為90％。
權利要求
1.一種多靶點抑制腫瘤生長的新基因工程藥，其特征在于它是用原核或真核細胞表達的由人IgG3上游鉸鏈區(qū)序列(該序列由11個氨基酸組成，柔性好，不影響連接肽段的空間構象)連接Tumstatin的N-端74～98氨基酸功能肽(25個氨基酸性)和Tumstatin197～215氨基酸功能肽(19個氨基酸)組成的55個氨基酸的肽，命名為血管基膜衍生多功能肽。其氨基酸序列如下Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Ser-Gly-Cys-Asn-Tyr-Tyr-Ser-Asn-Ser-Tyr-Ser-Phe-Trp-Leu-Ala-Ser-Leu-Asn-Pro-Glu-Arg該肽的分子量為6.38kDa，等電點為4.395。該肽具有抑制血管內皮細胞增殖和抑制腫瘤細胞增殖的兩種不同抗腫瘤特性。
2.按權利要求1所述的血管基膜衍生多功能肽與GST、6×His Tag、β-半乳糖苷酸，trpE，硫氧還蛋白(Trx)等用原核或真核細胞表達的融合蛋白作為抗腫瘤藥物應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新多肽，即血管基膜衍生多功能肽。其氨基酸序列如下Thr－Met－Pro－Phe－Leu－Phe－Cys－Asn－Val－Asn－Asp－Val－Cys－Asn－Phe－Ala－Ser－Arg－Asn－Asp－Tyr－Ser－Tyr－Trp－Leu－Thr－Pro－Leu－Cys－Asp－Thr－Thr－His－Thr－Ser－Gly－Cys－Asn－Tyr－Tyr－Ser－Asn－Ser－Tyr－Ser－Phe－Trp－Leu－Ala－Ser－Leu－Asn－Pro－Glu－Arg。該肽的分子量6.38kDa等電點4.395。及該肽序列與GST、6×His Tag、β－半乳糖苷酸，trpE，硫氧還蛋白(Trx)等構成的融合蛋白作為抗腫瘤藥物應用。
文檔編號A61K38/16GK1594580SQ03159649
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月11日 優(yōu)先權日2003年9月11日
發(fā)明者曹建國 申請人:曹建國