本發(fā)明涉及一種樹蛙(Polypedates puerensis)防御肽cathelidin-PP及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
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近年來的研究表明，抗菌肽是所有動(dòng)物、植物和微生物防御系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分。它們是機(jī)體為抵御病原微生物侵襲而產(chǎn)生的一類小分子活性多肽，具有分子量小、穩(wěn)定性好、殺菌迅速和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。這些特性使得抗菌肽具有非常廣闊的運(yùn)用前景，有望替代目前臨床上易于產(chǎn)生耐藥性的傳統(tǒng)抗生素藥物?？咕牟灰桩a(chǎn)生耐藥性的原因是，其殺菌機(jī)理與傳統(tǒng)抗生素不同。它們主要是作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜,破壞其穩(wěn)定性，進(jìn)而細(xì)胞膜滲透性發(fā)生改變，使得內(nèi)容物外泄導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不同物種來源或同一物種中抗菌肽的結(jié)構(gòu)形式和生物活性差別較大。國(guó)內(nèi)外研究人員一直致力于從不同物種中發(fā)掘結(jié)構(gòu)新穎的抗菌肽，直接利用或者以其為模板進(jìn)行分子改造。目前，已有抗菌肽用于海產(chǎn)品保鮮和動(dòng)物飼料添加劑中。結(jié)合生態(tài)環(huán)境從各種自然資源中發(fā)掘具有潛在藥用價(jià)值的抗菌肽是目前多肽新藥研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

兩棲動(dòng)物是抗菌肽資源發(fā)掘中最重要的一類資源，其皮膚裸露，為抵御環(huán)境中各種微生物的侵襲，它們能夠分泌多種分子結(jié)構(gòu)新穎、功能復(fù)雜多樣的的抗菌肽。這些活性多肽廣泛參與機(jī)體的各種生理活動(dòng)，具有各種藥理活性，如抗微生物、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷修復(fù)、鎮(zhèn)痛等作用。樹蛙與其它的兩棲動(dòng)物明顯不同的地方就是，它們的大部分時(shí)間都是在樹上度過，而其它的兩棲動(dòng)物大部分時(shí)間都在水里或陸地上。這種特異的樹棲生活使得它們面臨的天敵以及外界微生物都與其他的兩棲動(dòng)物有所差異，經(jīng)過適應(yīng)性進(jìn)化，必然擁有一套具有自身優(yōu)勢(shì)的先天免疫防御系統(tǒng)。普洱泛樹蛙Polypedates puerensis主要分布于云南省普洱市周邊地區(qū)，是我國(guó)特色資源動(dòng)物之一，其皮膚分泌物中cathelicidin家族的抗菌肽尚無報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰性菌和真菌)的樹蛙防御肽及其基因和應(yīng)用。

本發(fā)明的防御肽cathelicidin-PP是中國(guó)兩棲類樹蛙防御肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量3366.08道爾頓，等電點(diǎn)10.05，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列SEQ ID NO:1)為：

(ASENGKCNLLCLVKKKLRAVGNVIKTVVGKIA)，其第七位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸組成一對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。

該樹蛙防御肽前體的編碼基因由615個(gè)核苷酸(SEQ ID NO:2)組成，其自5’端至3’端序列為:

其中，第346–441位核苷酸為成熟樹蛙防御肽cathelicidin-PP的編碼基因。

本發(fā)明的樹蛙防御肽cathelicidin-PP在制備大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌和光滑念球菌引起的感染疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌)的樹蛙防御肽cathelidin-PP，本發(fā)明對(duì)大腸桿菌、甲型副傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌和光滑念球菌引起的感染疾病具有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用。

附圖說明：

附圖1顯示使用反相高壓液相分離純化樹蛙皮膚分泌液，箭頭所示為具有抗菌活性的組分。

附圖2顯示使用反相高壓液相進(jìn)一步純化該組分，箭頭所示為純化的防御肽cathelicidin-PP。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明。

一、樹蛙防御肽cathelicidin-PP的制備和氨基酸序列測(cè)定：

1、收集樹蛙皮膚分泌液：

活體樹蛙用水清洗干凈，置于直徑10厘米，高10厘米的圓柱體樣品瓶中。乙醚刺激2分鐘后，用10ml 0.1M pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗蛙背部泡沫液體。將該分泌液于4℃條件下12000rpm離心15分鐘，上清于-80℃保存。2、樹蛙防御肽cathelicidin-PP的分離純化：

以上述收集的上清液為原料，按照下述程序純化防御肽cathelicidin-PP，分離純化的每個(gè)組分都進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，具體方法如下：

(a)采用美國(guó)Millipore公司的超濾管將上清液中分子量大于10kDa的物質(zhì)去除。上清液加入超濾管(10kDa，15ml)中進(jìn)行第一次離心(3000×g，40分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第二次離心(3000×g，10分鐘)，收集濾液，再進(jìn)行第三次離心(3000×g，5分鐘)，收集剩余的濾液，于-20℃保存。

(b)上述的濾液采用反相高壓液相(RP-HPLC)C₁₈色譜柱進(jìn)行純化，該步驟在美國(guó)Waters公司的2795四元梯度高效液相色譜儀中進(jìn)行，以0-60％乙腈線性梯度進(jìn)行洗脫，流速為0.7ml/min,收集各洗脫組分，如圖1所示，并測(cè)定抗菌活性。將圖1箭頭所示的具有抗菌活性的組分凍干，繼續(xù)使用RP-HPLC C₁₈色譜柱進(jìn)一步純化，得到如圖2箭頭所示的純化的樹蛙防御肽cathelicidin-PP。

3、樹蛙防御肽cathelicidin-PP的氨基酸測(cè)定

純化的樹蛙防御肽cathelicidin-PP運(yùn)用Edman降解法進(jìn)行測(cè)序，該步驟在美國(guó)ABI公司的Proscise ^TM 491蛋白質(zhì)測(cè)序儀中進(jìn)行。測(cè)序結(jié)果表明樹蛙防御肽的全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：ASENGKCNLLCLVKKKLRAVGNVIKTVVG KIA。

二、樹蛙防御肽cathelicidin-PP基因的克隆

1、樹蛙皮膚總RNA提?。?/p>

活體樹蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍10小時(shí)，取300mg皮膚組織，加入3ml Trizol溶液，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為樹蛙皮膚總RNA 。

2、樹蛙皮膚mRNA的純化：mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。

提取的樹蛙皮膚總RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加入3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻后放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠(SA-PMP)輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的樹蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3、樹蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：

采用CLONTECH公司Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。

(a)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：

在0.5ml無菌的離心管加入1μl樹蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15秒，72℃保溫2分鐘。將離心管在冰上孵育2分鐘。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。混合離心管中試劑并以12000rpm離心15秒，在42℃保溫1小時(shí)。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

(b)采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈

95℃預(yù)熱PCR儀，將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃，20秒鐘；22個(gè)循環(huán)(95℃，5秒鐘；68℃，6分鐘)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行回收。

(c)PCR產(chǎn)物回收：

用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：

將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟2。12000rpm離心5分鐘，將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。12000rpm離心30秒，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

(d)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備：

挑取單個(gè)DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)OD₆₀₀值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物。將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。于4℃以4100rpm離心10分鐘，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置l min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預(yù)冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂,20mmol/L

CaCl₂)重懸每份細(xì)胞沉淀。于4℃以4100rpm離心10分鐘，回收細(xì)胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置l分鐘以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。每50m1初始培養(yǎng)物用2m1用冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl₂重懸每份細(xì)胞沉淀，分裝后備用。

(e)酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：

在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl樹蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2小時(shí)。全量10μl加入100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

4、樹蛙防御肽基因克隆篩選：

擴(kuò)增引物序列為5’ATGAAGGTCTGGCAGTGTGTGATC3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART ^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃，30秒鐘；52℃，45秒鐘；72℃，2分30秒鐘，共35個(gè)循環(huán)。首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升，和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl),37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有10個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

5、樹蛙防御肽基因序列測(cè)定：

提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)Applied Biosystems373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCAC ACAGG 3’，BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTC CCAGTCACGAC 3’。

基因測(cè)序結(jié)果表明編碼樹蛙防御肽前體的基因由615個(gè)核苷酸(SEQ ID NO:2)組成(GenBank Accession Number:KY610282)，自5’端至3’端序列為:

其中第346–441位核苷酸為成熟樹蛙防御肽cathelicidin-PP的編碼基因。

三、樹蛙防御肽cathelicidin-PP抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用：

以Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)。供試菌株經(jīng)LB固體培養(yǎng)基復(fù)蘇后，用無菌水稀釋菌落成每毫升含2×10⁵個(gè)細(xì)菌的菌液，備用。測(cè)定最小抑菌濃度時(shí)，采用二倍稀釋法進(jìn)行抗菌檢測(cè)。具體方法如下：在0.19ml培養(yǎng)基中加入0.01ml樣品作為第一孔，混勻后取0.1ml加入第2孔(已加入0.1ml新鮮培養(yǎng)基)，依次倍比稀釋，自第6孔吸出0.1ml棄去，四周各孔系對(duì)照，將各孔中加入已校正的菌液(2×10⁵cfu/ml)0.1ml，混勻后放置37℃培養(yǎng)18小時(shí)，于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收。最小抑菌濃度為看不見細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。細(xì)菌菌株來源于昆明醫(yī)科大學(xué)，此試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果如表1。

表1，樹蛙防御肽cathelicidin-PP抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用：

由表1可見，樹蛙防御肽cathelicidin-PP具有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明醫(yī)科大學(xué)

<120> 樹蛙防御肽cathelicidin-PP及其基因和應(yīng)用

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> Polypedates puerensis

<400> 1

Ala Ser Glu Asn Gly Lys Cys Asn Leu Leu Cys Leu Val Lys Lys Lys

1 5 10 15

Leu Arg Ala Val Gly Asn Val Ile Lys Thr Val Val Gly Lys Ile Ala

20 25 30

<210> 2

<211> 615

<212> DNA

<213> Polypedates puerensis

<400> 2

atgaaggtct ggcagtgtgt gatctttcta gcggctctaa cattgcacct ggctcacttt 60

cagtcaggac ggatcagagc agcgctggat gcctacaacc agaaggatga tggagagtgc 120

tactttaagt tcgtgtcgga tctcccgggg tccctcctgc aggaggagga agagtctcca 180

tcagtcaact ttttaatcaa ggagacggag tgccgcaagt ccgaagacgt tgacttggag 240

cgatgcgagt acaagaagga cggggaggtg aaggcgtgcg ctctgtacct ggagaaagag 300

gaggtggaat gcgtcagtct ttccgagaat tcgcgcccca agcgagccag tgagaatgga 360

aagtgcaact tattgtgctt agtgaagaag aagctgcgag ctgtcggcaa cgttatcaag 420

accgtcgtcg gtaaaatagc atagcgaata ttatccgtat tttgccgcgc cttcaatgca 480

accttccttt accgctaata tcccctccga gcttttgcaa ggatggtgtt tgtgcacaga 540

gcgccgacat cgccccaaac ccgaataaat ttgcattccc ataaagaaaa aaaaaaaaaa 600

aaaaaaaaaa aaaaa 615