專(zhuān)利名稱(chēng)：基因調(diào)節(jié)肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與治療多種疾病如炭疽熱相關(guān)的調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中的表達(dá)，也稱(chēng)為基因控制。如述，炭疽熱是一種動(dòng)物和人類(lèi)疾病，并由于作為生物戰(zhàn)爭(zhēng)和恐怖主義的制劑而造成明顯的威脅。其中吸入炭疽芽胞桿菌的孢子的吸入性炭疽熱幾乎總是致命的，因?yàn)樵诩膊∵M(jìn)展為抗生素治療無(wú)效的時(shí)間點(diǎn)之前幾乎不可能加以確診。炭疽芽胞桿菌的主要毒性因子是一種多-D-谷氨酸莢膜和炭疽熱毒素。炭疽熱毒素由一同作用的三種獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成兩種酶，致命因子(LF)和水腫因子(EF，一種腺苷酸環(huán)化酶)；及保護(hù)性抗原(PA)。PA是一種4個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，通過(guò)其羧基末端結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合；通過(guò)類(lèi)弗林蛋白酶對(duì)其N(xiāo)末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行裂解使PA形成七聚體，其與毒性酶通過(guò)同源N末端結(jié)構(gòu)域而高親和性結(jié)合。所述復(fù)合物被胞吞，內(nèi)涵體的酸化導(dǎo)致PA七聚體通過(guò)形成一個(gè)14鏈的β桶而插入膜中，隨后毒性酶通過(guò)一種未知機(jī)制轉(zhuǎn)位于細(xì)胞質(zhì)中。PA與LF的二元組合當(dāng)靜脈內(nèi)給予時(shí)足以誘導(dǎo)動(dòng)物迅速死亡，而且某些金屬蛋白酶抑制劑在體外阻斷所述毒素的作用。因此，LF是治療劑的潛在靶，所述治療劑抑制其催化活性或阻斷其與PA的結(jié)合。LF是一種蛋白質(zhì)(相對(duì)分子量為90,000)，其在炭疽熱的發(fā)病機(jī)理中很關(guān)鍵。其包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I結(jié)合炭疽熱毒素的膜轉(zhuǎn)位成分，PA；結(jié)構(gòu)域II，III和IV一起產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)深凹陷，其在裂解之前持有有絲分裂原活化蛋白激酶激酶-2(MAPKK-2)的16個(gè)殘基的N末端尾部。結(jié)構(gòu)域II類(lèi)似蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的ADP-核糖基化的毒素，但活化位點(diǎn)已經(jīng)突變并增大了底物識(shí)別性。結(jié)構(gòu)域III插入結(jié)構(gòu)域II中并似乎是來(lái)自于結(jié)構(gòu)域II的結(jié)構(gòu)元件的重復(fù)復(fù)制。結(jié)構(gòu)域IV與鋅金屬蛋白酶家族相關(guān)性遠(yuǎn)，含有催化中心；其也與結(jié)構(gòu)域I類(lèi)似。所述結(jié)構(gòu)因此表明蛋白質(zhì)通過(guò)基因復(fù)制，突變并與具有高度的不同尋常的特異性的酶融合過(guò)程得以進(jìn)化。
蛋白質(zhì)的MAPKK家族是LF的唯一已知細(xì)胞底物。在LF接近其N(xiāo)末端進(jìn)行裂解除去了下游同源物MAP激酶的?？啃蛄?。致命毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用，例如是抑制腫瘤生長(zhǎng)和血管發(fā)生，最可能的是通過(guò)抑制MAPKK-1和MAPKK-2途徑。然而，在炭疽熱發(fā)病機(jī)理中受影響的主要細(xì)胞類(lèi)型是巨噬細(xì)胞。LF已經(jīng)示出可以從有絲分裂原或胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的MAPKK-1，MAPKK-2，MAPKK-3和MAPKK-6，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶1(ERK1)，ERK2和p38的上游激活子中裂解短的N末端片段。最近的數(shù)據(jù)顯示這導(dǎo)致抑制促炎癥介導(dǎo)因子，NO和腫瘤壞死因子-α(TNFα)的釋放，而不是抑制產(chǎn)生。另外，高水平的致命毒素導(dǎo)致巨噬細(xì)胞在幾小時(shí)內(nèi)通過(guò)未知機(jī)制被裂解。最近的數(shù)據(jù)提示出現(xiàn)這種情況是由于生長(zhǎng)因子途徑被抑制而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡。這些觀(guān)察資料提示在感染的早期階段，致命毒素可降低(或延緩)免疫應(yīng)答，而在感染的晚期階段，血流中高滴度的細(xì)菌引發(fā)巨噬細(xì)胞裂解及突然釋放高水平的NO和TNF-α。這可以解釋死亡之前的癥狀，其特征在于宿主巨噬細(xì)胞炎癥途徑的超常刺激，導(dǎo)致劇烈的血壓低和休克。這些癥狀與LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克類(lèi)似。應(yīng)注意的是LPS-無(wú)應(yīng)答小鼠，如C3H/HeJ，對(duì)炭疽熱毒素也具有相當(dāng)?shù)目剐浴?br> LF的識(shí)別位點(diǎn)需要存在脯氨酸(P)殘基，后接一個(gè)疏水性殘基或甘氨酸(G)殘基，LF在此之間進(jìn)行裂解。所述識(shí)別位點(diǎn)在脯氨酸殘基的N末端的5個(gè)氨基酸殘基內(nèi)，還需要在所述疏水性殘基之后的一個(gè)無(wú)電荷的氨基酸及至少一個(gè)荷陽(yáng)性電荷的氨基酸(和無(wú)陰性電荷的氨基酸，如Asp和Glu)。序列中的其它殘基在關(guān)鍵殘基之間或在供體和受體之間提供了合適的間隔，因此其組分不是關(guān)鍵的，可包括任何天然或非天然氨基酸。
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括為所述細(xì)胞提供一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，所述分子包含一種小肽，即寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物。這種分子在此也稱(chēng)為NMPF或者通過(guò)數(shù)字引用。由于目前易于合成這樣氨基酸序列相對(duì)短的小肽，及功能類(lèi)似物和衍生物，因此本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，使用易于獲得的合成化合物如合成肽或其功能類(lèi)似物或衍生物進(jìn)行。
本發(fā)明還提供了一種治療炎癥病變的方法，包括為需要這種治療的客體施用一種分子，所述分子包含一種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，所述分子能降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO，特別是其中所述分子又能調(diào)節(jié)細(xì)胞中存在的基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)位和/或活性，尤其其中所述基因轉(zhuǎn)錄因子包含NF-κB/Rel蛋白。有利的，本發(fā)明提供了一種方法，其中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)位和/或活性可以調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α，特別是其中TNF-α的產(chǎn)生被降低?？紤]到TNF-α的產(chǎn)生對(duì)幾乎所有，如果不是全部，炎癥病變是重要的，因此降低TNF-α的產(chǎn)生可明顯減輕，或緩和在此所述的眾多炎癥病變。特別地，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述炎癥病變包括急性炎癥病變，所述方法特別用于治療炭疽熱相關(guān)的疾病，尤其當(dāng)考慮到在炭疽熱時(shí)，NO和TNF-α的降低將明顯緩和疾病的進(jìn)程。表6列出了具有這種調(diào)節(jié)作用的本發(fā)明的寡肽。
特別地，本發(fā)明提供了一種治療方法，其中所述治療包括為客體施用一種藥物組合物，所述藥物組合物包含能降低細(xì)胞產(chǎn)生NO的一種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，優(yōu)選的，其中所述組合物包含能降低細(xì)胞產(chǎn)生NO的至少兩種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，這種組合的實(shí)施例可以在表6的指導(dǎo)下選擇，從而足以選擇兩或多種具有希望作用的寡肽，例如其中至少兩種寡肽選自L(fǎng)QGV，AQGV和VLPALP。
本發(fā)明還提供了一種分離的，優(yōu)選合成的，寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物或者這種寡肽或其類(lèi)似物或衍生物的混合物，其能降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO。考慮到這些細(xì)胞在炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵作用，這種細(xì)胞優(yōu)選是巨噬細(xì)胞或DC系。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的一種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，或者包含至少兩種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，其能降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO。另外，本發(fā)明提供了能降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO的寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物在生產(chǎn)一種藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物通過(guò)降低治療客體體內(nèi)巨噬細(xì)胞或DC產(chǎn)生的NO而治療炎癥病變。
肽的功能類(lèi)似物或衍生物定義為一種氨基酸序列，或其它序列單體，其已經(jīng)被改變以至所述序列的功能性質(zhì)基本相同，在數(shù)量上非必需相同。可以多種方式提供一種類(lèi)似物或衍生物，例如通過(guò)保守氨基酸取代。也可以設(shè)計(jì)肽模擬化合物，其功能或結(jié)構(gòu)與作為起始點(diǎn)的原始肽相似，但是它們例如由非天然發(fā)生的氨基酸或聚酰胺組成。就保守氨基酸取代而言，一個(gè)氨基酸殘基用具有一般相似性質(zhì)(大小，疏水性)的另一個(gè)殘基取代，由此全部功能很可能不受明顯影響。然而，通常更多地需要改良特異性功能。通過(guò)系統(tǒng)改良氨基酸序列的至少一種希望的性質(zhì)也可以提供一種衍生物。這可以，例如通過(guò)Ala-掃描和/或置換網(wǎng)狀作圖方法進(jìn)行。使用這些方法，基于初級(jí)氨基酸序列，產(chǎn)生許多不同的肽，但每種肽均含有至少一個(gè)氨基酸殘基取代。氨基酸殘基可以用丙氨酸置換(Ala-掃描)或者通過(guò)任何其它氨基酸殘基置換(置換網(wǎng)狀作圖)。通過(guò)這種方式合成原始氨基酸序列的許多位置變體。篩選每個(gè)位置變體的特異性活性。產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用于設(shè)計(jì)有一定氨基酸序列的改良的肽衍生物。
衍生物或類(lèi)似物也可以例如通過(guò)用D氨基酸殘基取代L氨基酸殘基而產(chǎn)生。這種取代產(chǎn)生實(shí)際上不天然發(fā)生的肽，可以改良氨基酸序列的性質(zhì)。例如以反向倒置形式提供已知所有D氨基酸活性的肽序列，從而可以保留活性并提高半衰期。通過(guò)產(chǎn)生原始氨基酸序列的許多位置變體并篩選特異性活性，可以設(shè)計(jì)具有進(jìn)一步改良特性的包含這種D氨基酸的改良的肽衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能產(chǎn)生一種氨基酸序列的類(lèi)似化合物。這可以例如通過(guò)篩選肽文庫(kù)而進(jìn)行。這種類(lèi)似物基本具有相同功能性質(zhì)的序列，在數(shù)量上非必需相同。同樣，肽或類(lèi)似物可以例如通過(guò)為它們提供(末端)半胱氨酸而環(huán)化，例如與賴(lài)氨酸或半胱氨酸或具有可以連接或多聚體化的側(cè)鏈的其它化合物連接而二聚體化或多聚體化，產(chǎn)生串聯(lián)或重復(fù)構(gòu)型，綴合或另外與本領(lǐng)域已知的載體連接，只要是可以分離的不穩(wěn)定連接即可。
本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，所述分子包含一種小肽或其功能類(lèi)似物或衍生物。令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)小肽可作為調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)分子。具有調(diào)節(jié)一或多個(gè)基因在細(xì)胞中表達(dá)的這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的小肽的功能類(lèi)似物或衍生物可以通過(guò)此處提供的發(fā)現(xiàn)這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的多種方法中的至少一種方法鑒別或獲得。
例如，此處提供了一種鑒別或獲得一種信號(hào)傳導(dǎo)分子的方法，所述分子包含能調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的一種肽或其功能衍生物或類(lèi)似物，所述方法包括提供具有肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞并確定一或多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄因子的活性和/或核轉(zhuǎn)位。這種活性可以在多種方式中使用對(duì)研究的特異性轉(zhuǎn)錄因子特異的手段和/或方法確定。在詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明提供了研究NF-κB/Rel蛋白轉(zhuǎn)位和/或活性的方法，但當(dāng)然研究可獲得或可設(shè)計(jì)這種工具的任何其它轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)位和或活性可能更容易。一種這樣的其它轉(zhuǎn)錄因子是例如上述的干擾素α刺激因子。在這項(xiàng)研究中的其它有用轉(zhuǎn)錄因子包含c-Jun，ATF-2，F(xiàn)os及其復(fù)合物，ELK-1，EGR-1，IRF-1，IRF-3/7，AP-1，NF-AT，C/EBPs，Sp1，CREB，PPAR-γ，及STAT蛋白等。考慮到許多蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白酶解從而產(chǎn)生寡肽片段，許多在完整蛋白質(zhì)之前的片段甚至已經(jīng)具有功能，因此確定這種蛋白質(zhì)(所述蛋白質(zhì)是例如在詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中所給出的那些非擴(kuò)展列表，但可以例如認(rèn)為MAPKK-2可產(chǎn)生一種肽MLARRKPVLPALTINP，隨后產(chǎn)生包含MLARRKP或MLAR或VLPALT或VLPAL的肽，但NO合成酶在適當(dāng)?shù)牡鞍酌附庵罂僧a(chǎn)生肽FPGC或PGCP，GVLPAVP，LPA，VLPAVP或PAVP)的寡肽片段參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的反饋機(jī)制，很可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因表達(dá)的作用而進(jìn)行。另外，蛋白質(zhì)的寡肽片段(在詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中所列出的那些非擴(kuò)展列表)也可以調(diào)節(jié)胞外成分如因子X(jué)III(因子X(jué)III的寡肽片段的實(shí)施例是LQGV，LQGVVPRGV，GVVP，VPRGV，PRG，PRGV)或激活的C蛋白(APC)的活性，從而最后導(dǎo)致調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和基因表達(dá)。
如述，本發(fā)明提供了作為信號(hào)傳導(dǎo)分子的活性寡肽。為可以改良這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的生物可利用性(其在藥物學(xué)，尤其當(dāng)人工生產(chǎn)時(shí)有益)，本發(fā)明還提供了一種確定一種小肽或其衍生物或類(lèi)似物是否可作為本發(fā)明的功能性信號(hào)傳導(dǎo)分子的方法，所述方法進(jìn)一步包括確定所述信號(hào)傳導(dǎo)分子是否是可透過(guò)膜的，及如上所解釋的，在通過(guò)質(zhì)膜后及沒(méi)有與細(xì)胞表面受體結(jié)合，是否發(fā)揮其基因調(diào)節(jié)作用。這種信號(hào)傳導(dǎo)分子，即合成化合物是此處提供的一種小肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，因此優(yōu)選不通過(guò)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的隨后一系列胞內(nèi)事件而相互作用，而優(yōu)選具有直接胞內(nèi)活性的。
使用鑒別或獲得一種信號(hào)傳導(dǎo)分子的方法，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子包含能調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的一種肽或其功能衍生物或類(lèi)似物，所述方法包括提供具有一種肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞及確定基因轉(zhuǎn)錄因子的活性和或核轉(zhuǎn)位，如此處所提供，進(jìn)一步可以(如果需要隨機(jī))測(cè)試寡肽或引導(dǎo)肽的多樣性，產(chǎn)生自動(dòng)組合的化學(xué)形式，其中大量候選信號(hào)分子以一種(如果需要隨機(jī))方式測(cè)試其與代表潛在的信號(hào)分子的合成肽的分子文庫(kù)的反應(yīng)性，這可以在幾萬(wàn)個(gè)測(cè)試的(組合)分子中快速檢測(cè)特別相關(guān)的分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述引導(dǎo)肽可位置或空間尋址，例如以陣列方式，如果需要?jiǎng)t借助于計(jì)算機(jī)指導(dǎo)定位。在陣列中，所述大多數(shù)肽是例如可通過(guò)其在柵格或矩陣中的位置而尋址的。測(cè)試的這種肽片段或寡肽(在此也稱(chēng)為引導(dǎo)肽)的長(zhǎng)度為至少2-3個(gè)氨基酸，不超過(guò)大約30個(gè)氨基酸，但優(yōu)選并最適合生物體的明顯情況是，其中內(nèi)源蛋白質(zhì)的這些分解產(chǎn)物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這種肽更小，例如小于16，優(yōu)選小于10，甚至更優(yōu)選小于7個(gè)氨基酸，或者甚至長(zhǎng)度只有4-5個(gè)氨基酸。
本發(fā)明例如提供了一種獲得關(guān)于寡肽，或其修飾物或衍生物調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或趨向信息的過(guò)程或方法，所述方法包括步驟 a)將所述寡肽，或其修飾物或衍生物與至少一種細(xì)胞接觸； b)確定所述細(xì)胞中的或衍生自其中的至少一種基因產(chǎn)物的存在情況。優(yōu)選所述寡肽包含相當(dāng)于天然發(fā)生的多肽，如hCG或MAPKK，或另外的激酶的片段的氨基酸序列，其是源于植物或動(dòng)物細(xì)胞，或者是真核或原核起源，或者細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白的一種合成酶，如其中所述調(diào)節(jié)蛋白是(促)炎癥介導(dǎo)因子，如細(xì)胞因子。一些候選蛋白和肽片段列于詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中，從本發(fā)明人的觀(guān)點(diǎn)出發(fā)其對(duì)這種分析是首選的，但本領(lǐng)域及生物技術(shù)特定領(lǐng)域中的技術(shù)人員應(yīng)立即意識(shí)到針對(duì)這種分析選擇的蛋白質(zhì)根據(jù)與其領(lǐng)域相關(guān)的目的而定。本發(fā)明例如提供了一種方法以獲得關(guān)于一種寡肽，或其修飾物或衍生物調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力或趨向的信息，其中所述方法可以(如果需要隨機(jī))測(cè)試寡肽或引導(dǎo)肽的多樣性，產(chǎn)生自動(dòng)組合的化學(xué)形式，其中大量候選信號(hào)分子在一種(如果需要隨機(jī))方式中被測(cè)試其與表示潛在信號(hào)分子的合成肽的分子文庫(kù)的反應(yīng)性，可以從幾萬(wàn)個(gè)測(cè)試的分子(組合)中快速檢測(cè)特別相關(guān)的分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，其中所述引導(dǎo)肽可位置或空間尋址，例如在陣列方式中，如果需要?jiǎng)t借助于計(jì)算機(jī)指導(dǎo)定位。在陣列中，所述大多數(shù)肽是例如可通過(guò)其在柵格或矩陣中的位置而尋址。測(cè)試的這種肽片段或寡肽(在此也稱(chēng)為引導(dǎo)肽)的長(zhǎng)度為至少2-3個(gè)氨基酸，不超過(guò)大約30個(gè)氨基酸，但優(yōu)選并最適合生物體的顯而易見(jiàn)的情形，其中內(nèi)源蛋白質(zhì)的這些分解產(chǎn)物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這種肽更小，例如小于16，優(yōu)選小于10，甚至更優(yōu)選小于7個(gè)氨基酸，或者甚至長(zhǎng)度只有4-5個(gè)氨基酸。
特別地，本發(fā)明提供的方法還包括步驟c)包括確定未與所述寡肽，或其修飾物或衍生物接觸的細(xì)胞中或衍生自其中的基因產(chǎn)物的存在情況，并確定在b步驟中發(fā)現(xiàn)的基因產(chǎn)物與c步驟中發(fā)現(xiàn)的基因產(chǎn)物的比率，這可易于用目前的基因芯片技術(shù)(見(jiàn)例如詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中所述)及本領(lǐng)域已知的相關(guān)表達(dá)圖方法進(jìn)行。
本發(fā)明提供了另一種鑒別或獲得關(guān)于信號(hào)傳導(dǎo)分子(或者考慮到合成一般是一種小肽的所述分子的下一個(gè)步驟，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子自身是完整的)信息的方法，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子包含能調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的一種肽或其功能衍生物或類(lèi)似物，所述方法包括提供具有一種肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞，并確定在所述細(xì)胞中表達(dá)的至少一種基因的相對(duì)上調(diào)和/或下調(diào)。所述上調(diào)可傳統(tǒng)的通過(guò)在已經(jīng)提供具有所述肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞之后，確定細(xì)胞是否產(chǎn)生更多的(在上調(diào)的情況中)或更少(在下調(diào)情況中)的基因表達(dá)產(chǎn)物如mRNA或蛋白質(zhì)而進(jìn)行研究，其例如通過(guò)Northern或Western印跡或者通過(guò)PCR檢測(cè)核酸，或者通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行。當(dāng)然，可以組合本發(fā)明的多種方法以更好地分析所述肽或衍生物或類(lèi)似物的功能類(lèi)似物。另外，也可以容易的研究在所述細(xì)胞中表達(dá)的多個(gè)基因或基因簇的相對(duì)上調(diào)和/或下調(diào)，使用與一個(gè)陣列結(jié)合的或者以陣列形式產(chǎn)生的預(yù)定或已知相關(guān)核酸序列或其獨(dú)特片段的可位置或空間尋址的文庫(kù)，使用例如一個(gè)核酸文庫(kù)或所謂的基因芯片表達(dá)分析系統(tǒng)進(jìn)行研究。然后將已經(jīng)提供具有所述肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞裂解物或者細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核制品與所述文庫(kù)接觸，并確定例如mRNA與文庫(kù)的各個(gè)核酸的相對(duì)結(jié)合情況，如在詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中進(jìn)一步的描述。
可作為信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的小肽的功能類(lèi)似物或衍生物，也可以通過(guò)鑒別或獲得包含能調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中表達(dá)的寡肽或其功能衍生物或類(lèi)似物的信號(hào)傳導(dǎo)分子的方法鑒別或獲得，包括提供一種肽或其衍生物或類(lèi)似物，并確定所述肽或其衍生物或類(lèi)似物和與基因控制相關(guān)因子的結(jié)合情況。這種基因控制相關(guān)的因子可以是與轉(zhuǎn)錄(初始或終止)，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工，mRNA的穩(wěn)定或不穩(wěn)定及mRNA翻譯相關(guān)的任何因子。
肽或其衍生物或類(lèi)似物與這種因子的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法確定。傳統(tǒng)地，肽或衍生物或類(lèi)似物可以(放射性)標(biāo)記，并通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記的肽-因子復(fù)合物而確定與所述因子的結(jié)合情況，例如通過(guò)電泳，或者本領(lǐng)域已知的其它分離方法。然而，為確定與這種因子的結(jié)合，也可以應(yīng)用陣列技術(shù)，如與肽文庫(kù)一起使用，包括提供多種肽或其衍生物或類(lèi)似物，并確定至少一種肽或其衍生物或類(lèi)似物與基因控制相關(guān)因子的結(jié)合情況。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因控制相關(guān)因子包括一種轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB-Rel蛋白質(zhì)或希望研究的另一種轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)確定本發(fā)明的功能類(lèi)似物與這種因子結(jié)合時(shí)，當(dāng)然可以進(jìn)一步分析所述類(lèi)似物，通過(guò)提供具有所述肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞，并確定細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄因子的活性和/或核轉(zhuǎn)位，和/或通過(guò)提供具有所述肽或其衍生物或類(lèi)似物的細(xì)胞并確定在所述細(xì)胞中表達(dá)的至少一種基因的上調(diào)和/或下調(diào)情況而進(jìn)行分析。
本發(fā)明因此提供了一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，其用于調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中的表達(dá)和/或用于降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO，及通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的方法可鑒別或獲得。這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的實(shí)施例如可選自寡肽LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALPQVVC，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，GVLPALPQ，LQGVLPALPQVVC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEK，EGCPVCITVNTTICAGYCPT，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC，QVVC及其功能類(lèi)似物或衍生物。
盡管更小的分子，尤其是寡肽大小更小的分子已經(jīng)示出特殊效力，但本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子優(yōu)選的大小為至多30-40個(gè)氨基酸。令人驚訝地，本發(fā)明提供了這樣的見(jiàn)解，即基因表達(dá)可以被小肽調(diào)節(jié)或控制，所述小肽很可能是較大多肽的分解產(chǎn)物，所述較大多肽例如是絨毛膜促性腺激素(CG)和生長(zhǎng)激素或生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，EGF，VEGF，RNA 3′末端磷酸環(huán)化酶和CAP18。原則上，這種調(diào)節(jié)肽序列可以衍生自原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)多肽分子的一部分，而且本發(fā)明提供了這樣的見(jiàn)解，即多肽的分解產(chǎn)物，優(yōu)選在此所提供大小的寡肽，是自然用作調(diào)節(jié)基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)分子。特別地，作為信號(hào)傳導(dǎo)分子，所提供的一種(合成)肽可得自或衍生自β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)，優(yōu)選的來(lái)自帶切口的β-HCG。從前認(rèn)為帶切口的β-HCG的分解產(chǎn)物參與免疫調(diào)節(jié)(PCT國(guó)際申請(qǐng)WO99/59671)或者治療消耗性綜合征(PCT國(guó)際申請(qǐng)WO97/49721)，但與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)系在這些出版物中未被指出。當(dāng)然，這種寡肽，或其功能等價(jià)物或衍生物可能得自或衍生自其它蛋白質(zhì)，所述其它蛋白質(zhì)進(jìn)行分解或蛋白酶解并接近于基因調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)。優(yōu)選地，所述肽信號(hào)傳導(dǎo)分子得自具有至少10個(gè)氨基酸的肽，如具有以下氨基酸序列的肽MTRVLQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，CRRSTTDCGGPKDHPLTC，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
不希望被理論所束縛，在此假定不包括一種未曾預(yù)料的基因調(diào)節(jié)模式。將多肽，如內(nèi)源CG，EGF等，以及病原體多肽如病毒，細(xì)菌或原生動(dòng)物多肽，進(jìn)行分解為獨(dú)特的寡肽，例如通過(guò)胞內(nèi)蛋白酶解進(jìn)行。獨(dú)特的蛋白酶解酶在細(xì)胞中可廣泛獲得，例如在真核細(xì)胞溶酶體或蛋白酶體系統(tǒng)中。一些所得分解產(chǎn)物是3-15個(gè)氨基酸，優(yōu)選4-9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選4-6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的寡肽，令人驚奇地是其對(duì)細(xì)胞不是沒(méi)有任何功能或作用，在此表明其可能在內(nèi)源多肽的分解中通過(guò)反饋機(jī)制作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)分子參與，這通過(guò)例如肽LQGV，VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LQG，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALP，VVC，MTRV和MTR調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB的活性或轉(zhuǎn)位而表明。本發(fā)明提供了上述的這些寡肽的合成形式及這些分解產(chǎn)物的功能類(lèi)似物或衍生物，以調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因的表達(dá)，并用于校正基因表達(dá)中誤差或治療疾病的方法中。寡肽如LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，GVLPALPQ，LQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR，VVC，或其較長(zhǎng)序列的功能類(lèi)似物或衍生物(包括分解產(chǎn)物)是特別有效的。
通過(guò)使用本發(fā)明表述的見(jiàn)解，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，包括提供信號(hào)傳導(dǎo)分子給所述細(xì)胞，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子包含一種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，其中所述信號(hào)傳導(dǎo)分子是可透過(guò)膜的，由此其可進(jìn)入細(xì)胞。大多數(shù)所述小肽具有變成包含于胞內(nèi)的固有傾向，但在此提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子也可以具有額外的肽序列，如富集精氨酸或賴(lài)氨酸的氨基酸序列，其可以提高跨脂雙層膜的內(nèi)在化，及可能通過(guò)內(nèi)在的蛋白酶解活性在稍后切除。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，所述方法包括提供信號(hào)傳導(dǎo)分子給所述細(xì)胞，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子包含一種小肽(氨基酸序列)或其功能類(lèi)似物或衍生物，其中信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)NF-κB/Rel蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)位，正如所述，NF-κB最初鑒別是一種基因轉(zhuǎn)錄因子，其與所述基因中Igκ輕鏈增強(qiáng)子元件結(jié)合并確信是B細(xì)胞特異性的。然而，隨后的研究表明NF-κB/Rel蛋白遍在表達(dá)，并作為轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)中起重要作用，特別是參與免疫，炎癥，發(fā)育和凋亡進(jìn)程。NF-κB相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)不同刺激激活，如微生物產(chǎn)物，促炎癥細(xì)胞因子，T和B細(xì)胞有絲分裂原，及物理和化學(xué)刺激。NF-κB反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子，趨化因子，粘附分子，急性期蛋白和抗微生物肽的可誘導(dǎo)表達(dá)。
NF-κB代表一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的及進(jìn)化保守的基因轉(zhuǎn)錄因子。迄今為止，已經(jīng)描述了5種哺乳動(dòng)物NF-κB蛋白，稱(chēng)為Rel(c-Rel)，RelA(p65)，RelB，NF-κ-B1(p50及其前體p105)，及NF-κ-B2(p52及其前體p100)。NF-κB蛋白質(zhì)可存在同源或異源二聚體，而且盡管大多數(shù)NF-κB二聚體是轉(zhuǎn)錄激活因子，但p50/p50和p52/p52同源二聚體通常抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。在果蠅中，已經(jīng)鑒別并定性了3種NF-κB同源物，稱(chēng)為Doκsal，Dif和Relish。在結(jié)構(gòu)上，所有NF-κB/Rel蛋白均呈現(xiàn)高度保守的NH2-末端Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)，其負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合，二聚體化和與抑制蛋白如IκBs相關(guān)。在靜息細(xì)胞中，NF-κB/Rel二聚體與IκBs結(jié)合并在細(xì)胞質(zhì)中保持失活形式。與NF-κB相同，IκBs也是含有7個(gè)已知哺乳動(dòng)物成員和1個(gè)稱(chēng)為Cactus的果蠅IκB的多基因家族的成員，所述哺乳動(dòng)物成員包括IκBa，IκBβ，Iκb γ，IκBε，Bcl-3，前體Rel-蛋白，p100和p105。IκB家族特征在于存在錨蛋白重復(fù)的多個(gè)拷貝，其是蛋白質(zhì)之間相互作用基序，通過(guò)RHD與NF-κB相互作用。在適當(dāng)刺激下，IκB通過(guò)IκB激酶(IKKs)磷酸化，通過(guò)泛素連接酶復(fù)合物被多泛素化，并通過(guò)26S蛋白酶體降解。因此，NF-κB被釋放并轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中以引起基因表達(dá)。
NF-κB相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)在先天免疫應(yīng)答中起重要作用的許多基因的表達(dá)。這種NF-κB靶基因包括編碼細(xì)胞因子(例如IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，TNF-α，Ltα，LTβ和GM-CSF)，粘附分子(例如ICAM，VCAM，內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子[ELAM])，急性期蛋白(例如SAA)及可誘導(dǎo)的酶(例如iNOS和COX-2)的那些基因。另外，最近已經(jīng)表明一些進(jìn)化保守的抗微生物肽，例如β-防衛(wèi)素，也由NF-κB調(diào)節(jié)，情況與果蠅相似。除了調(diào)節(jié)參與先天免疫的分子的表達(dá)之外，NF-κB在對(duì)獲得性免疫重要的分子如MHC蛋白的表達(dá)及關(guān)鍵的細(xì)胞因子如IL-2，IL-12和IFN-γ的表達(dá)也起作用。最后，NF-κB在全部的免疫應(yīng)答中均起重要作用，其通過(guò)影響對(duì)調(diào)節(jié)凋亡過(guò)程關(guān)鍵的基因的表達(dá)而進(jìn)行，如c-IAP-1和c-IAP-2，F(xiàn)as配體，c-myc，p53，及細(xì)胞周期蛋白D1。
在正常條件下，NF-κB在微生物和病毒侵染下迅速激活，這種激活通常與宿主對(duì)感染的抗性相關(guān)。然而，NF-κB的持久激活可導(dǎo)致促炎癥因子如IL-12and TNFα過(guò)量產(chǎn)生，引起組織損害，如胰島素依賴(lài)型糖尿病，動(dòng)脈粥樣硬化，Crohn′s疾病，器官衰竭，甚至宿主死亡，如在細(xì)菌感染引起的膿毒性休克中。令人感興趣地注意到為在宿主中存活，某些病原體如日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonica)，鮑特菌(Bordetella)，耶爾森氏菌(Yersinia)，鼠弓形蟲(chóng)和非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus)具有進(jìn)化機(jī)制以通過(guò)抑制N-κB激活而抵消或逃避宿主系統(tǒng)。另一方面，一些病毒，包括HIV-1，CMV和SV-40，利用NF-κB作為在感染部位激活的一種宿主因子。
另外，本發(fā)明提供了一種方法以探究在抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞中應(yīng)答暴露微生物的基因表達(dá)中的變化，通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞應(yīng)答微生物的基因表達(dá)圖進(jìn)行分析，所述微生物例如是細(xì)菌如大腸桿菌，或其它病原性細(xì)菌，真菌或酵母如白色念珠菌(Candida albicans)，病毒如流感病毒，及探究用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子(同時(shí))治療這些疾病的作用。例如，將人單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞與一或多種病原體一起培養(yǎng)1-36個(gè)小時(shí)，并使用代表一(大或小)系列基因的寡核苷酸陣列分析基因表達(dá)。當(dāng)所述病原體調(diào)節(jié)一系列不同數(shù)目基因表達(dá)時(shí)，這些基因根據(jù)起表達(dá)和功能的動(dòng)力學(xué)加以分類(lèi)。通常地，在暴露于病原體4小時(shí)之內(nèi)，與病原體識(shí)別和吞噬作用相關(guān)的基因?qū)⒈幌抡{(diào)，而在暴露后8小時(shí)針對(duì)抗原處理和呈遞的基因是上調(diào)的。用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子處理這種樹(shù)突細(xì)胞(用病原體同時(shí)或之前或之后進(jìn)行處理所述細(xì)胞)，可以研究本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子對(duì)病原體對(duì)抗原呈遞細(xì)胞作用的作用。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明令人驚訝的提供了一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)分子，所述分子是一種短肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，優(yōu)選長(zhǎng)度至多為30個(gè)氨基酸。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽是一種寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物，其長(zhǎng)度為大約3-15個(gè)氨基酸，優(yōu)選4-12個(gè)氨基酸，更優(yōu)選4-9個(gè)氨基酸，最優(yōu)選4-6個(gè)氨基酸。當(dāng)然，這種信號(hào)傳導(dǎo)分子可以更長(zhǎng)，例如通過(guò)用更多的氨基酸或其它側(cè)鏈基團(tuán)將其延伸(N-和/或C-末端)，當(dāng)所述分子進(jìn)入最終目的地時(shí)，這些延伸部分可(酶促)切除。這種延伸甚至可優(yōu)選預(yù)防信號(hào)傳導(dǎo)分子不合時(shí)宜地激活；然而，所述分子的核心或活性片段包含前述寡肽或其類(lèi)似物或衍生物。本發(fā)明的這種肽通過(guò)與傳統(tǒng)已知的膜不可通透的信號(hào)傳導(dǎo)分子不同的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)而發(fā)揮其生物學(xué)功能，所述膜不可通透的信號(hào)傳導(dǎo)分子如乙酰膽堿，生長(zhǎng)因子，胞外基質(zhì)成分，(肽)-激素，神經(jīng)肽，凝血酶，即不通過(guò)細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)起作用。
特別地，本發(fā)明提供了一種NF-κB/Rel蛋白激活的調(diào)節(jié)因子，其包含本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子。對(duì)這種調(diào)節(jié)因子將進(jìn)行廣泛搜尋。另外，本發(fā)明提供了本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子在生產(chǎn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥物組合物中的應(yīng)用。
同樣，本發(fā)明提供了一種治療骨病如骨質(zhì)疏松的方法，包括為需要這種治療的客體施用包含一種寡肽或其功能類(lèi)似物的一種分子，所述分子能調(diào)節(jié)細(xì)胞產(chǎn)生NO和/或TNFα。這種治療方法在不再獲益于天然來(lái)源的一些在此提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子，如生理上衍生自hCG及其分解產(chǎn)物的信號(hào)傳導(dǎo)分子的絕經(jīng)期后的婦女中特別有效，。另外，本發(fā)明提供了一種治療與成纖維細(xì)胞的TNFα活性相關(guān)的炎癥病變的方法，所述病變?nèi)缏躁P(guān)節(jié)炎或滑膜炎，所述方法包括為需要這種治療的客體施用一種包含寡肽或其功能類(lèi)似物的分子，其中所述分子能調(diào)節(jié)細(xì)胞中存在的基因轉(zhuǎn)錄因子，特別是NF-κB因子的轉(zhuǎn)位和/或活性。這種治療可以通過(guò)系統(tǒng)施用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子而實(shí)現(xiàn)，但也可以在關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)囊或腱鞘局部施用。所述分子可選自表6所示分子，或者在本發(fā)明方法中鑒別的。優(yōu)選當(dāng)所述治療包括為客體施用一種藥物組合物時(shí)，所述藥物組合物包含還能降低細(xì)胞產(chǎn)生NO的寡肽或其功能類(lèi)似物，例如其中所述組合物包含至少兩種寡肽或其功能類(lèi)似物，每種均能降低細(xì)胞產(chǎn)生的NO和/或TNFα，尤其其中至少兩種寡肽選自L(fǎng)QGV，AQGV和VLPALP。
另外，本發(fā)明提供了能降低細(xì)胞產(chǎn)生NO和/或TNFα的寡肽或其功能類(lèi)似物在生產(chǎn)一種藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物用于治療炎癥病變或絕經(jīng)期后病變，或骨病如骨質(zhì)疏松，或者用于導(dǎo)致體重下降。術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指單獨(dú)的活性信號(hào)傳導(dǎo)分子或者含有所述信號(hào)傳導(dǎo)分子及一種藥劑學(xué)可接受的載體，稀釋劑或賦形劑的組合物。在詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中描述的寡肽的可接受的稀釋劑是例如生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽溶液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將一種信號(hào)分子以有效濃度系統(tǒng)施用于動(dòng)物或人，例如通過(guò)靜脈內(nèi)，肌內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。另一種施用方式包括體內(nèi)或ex vivo器官或組織灌注，灌注液包含本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子。也可以應(yīng)用局部施用例如藥膏或噴霧，例如在皮膚或粘膜表面例如口腔，鼻腔和/或生殖器炎癥的情況中在關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)囊，腱鞘，脊髓內(nèi)或四周神經(jīng)束分叉的部位，疝氣部位，心或腦梗塞部位或四周等可進(jìn)行局部施用。所述施用可以是單一劑量施用，各種劑量按順序間斷施用，或者持續(xù)施用一段時(shí)間以足以可以基本上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在持續(xù)施用的情況中，施用時(shí)間根據(jù)許多因素加以變化，這些因素為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。
活性分子的施用劑量可以在廣泛范圍內(nèi)變化?？墒┯玫幕钚苑肿拥臐舛认抻谠谳^低值的效力和在較高值的溶解性之間。對(duì)特定患者的最佳劑量應(yīng)該并且可以由醫(yī)生或?qū)I(yè)人員根據(jù)熟知的相關(guān)因素加以確定，所述因素如患者的病情，體重和年齡等。
所述活性分子可在合適的載體中直接施用，所述載體如磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)或者于乙醇或DMSO中的溶液。然而，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，所述活性分子通過(guò)使用一種藥物輸送系統(tǒng)經(jīng)單一劑量輸送而施用，所述系統(tǒng)如持續(xù)釋放輸送系統(tǒng)，其能使活性分子以足以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的所需濃度保持一段時(shí)間。一種合適的藥物輸送系統(tǒng)是藥物學(xué)失活的或者至少是可耐受的。優(yōu)選不是免疫原性的或者導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的，并應(yīng)允許活性分子釋放以在希望的時(shí)間內(nèi)保持有效的水平。本領(lǐng)域已知適于持續(xù)釋放的大量可選擇的方法并包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。合適的輸送載體包括但非限于以下物質(zhì)微囊體或微球體，脂質(zhì)體及其它基于脂質(zhì)的釋放系統(tǒng)，粘性灌輸液，可吸收的和/或可生物降解的機(jī)械屏障和移植體，及聚合的輸送物質(zhì)如聚環(huán)氧乙烷/聚環(huán)氧丙烷封阻共聚物，聚酯，交聯(lián)的聚乙烯醇，聚酐，聚甲基丙烯酸酯和聚甲基丙烯酰胺水凝膠，陰離子碳水化合物聚合物等。本領(lǐng)域熟知有益的輸送系統(tǒng)。
完成活性分子釋放的一種特別合適的配方包括由生物可降解聚合物制成的可注射微囊體或微球體，所述聚合物如聚(d1-丙交酯)，聚(d1-丙交酯-共-乙交酯)，聚己內(nèi)酯，聚乙交酯，聚乳酸共乙交酯，聚(羥基丁酸)，聚酯或聚甲醛。包含直徑微大約50-大約500微米的微囊體或微球體的可注射系統(tǒng)具有比其它輸送系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。例如，它們一般使用較低活性的分子并可以由醫(yī)輔人員施用。另外，這種系統(tǒng)通過(guò)選擇微囊體或微球體的大小，藥物荷載及施用劑量而固有地適應(yīng)設(shè)計(jì)不同的藥物釋放持續(xù)時(shí)間和速度。另外，它們能通過(guò)γ射線(xiàn)照射而成功滅菌。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知微囊體和微球體的設(shè)計(jì)，制備和應(yīng)用，關(guān)于這些要點(diǎn)的詳細(xì)信息可在文獻(xiàn)中獲得。生物可降解的聚合物(如丙交酯，乙交酯和己內(nèi)酯聚合物)也可以用于除了微囊體和微球體之外的配方中，例如根據(jù)本發(fā)明含有活性分子的這些聚合物的預(yù)制膜或噴霧于膜上也是適合應(yīng)用的。包含所述活性分子的纖維或細(xì)絲也包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明適于單一劑量輸送活性分子的另一種特別合適的配方包括脂質(zhì)體?；钚苑肿影b于脂質(zhì)體或多層囊泡中對(duì)于定向藥物輸送及延長(zhǎng)藥物停留時(shí)間是所熟知的方法。荷載藥物的脂質(zhì)體的制備和應(yīng)用是本發(fā)明技術(shù)人員所熟知的，在文獻(xiàn)中已充分論證。
根據(jù)本發(fā)明另一種合適的單一劑量輸送活性分子的方法包括使用粘性灌輸。在這種技術(shù)中，高分子量的載體與所述活性分子混合使用，產(chǎn)生一種結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生具有高粘性的一種溶液。合適的高分子量載體包括但非限于以下物質(zhì)葡聚糖和環(huán)葡聚糖；水凝膠；(交聯(lián)的)粘性物質(zhì)，包括(交聯(lián)的)粘彈性物質(zhì)；羧甲基纖維素；透明質(zhì)酸及硫酸軟骨素。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知荷載藥物的粘性灌輸液的制備和應(yīng)用。
根據(jù)另一種方法，所述活性分子可與可吸收的機(jī)械屏障如氧化再生的纖維素組合施用。所述活性分子可以與這種屏障共價(jià)或非共價(jià)的(例如離子)結(jié)合，或者其可簡(jiǎn)單地分散于其中。
本發(fā)明提供的一種藥物組合物特別用于通過(guò)抑制NF-κB/Rel蛋白激活而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
NF-κB/Rel蛋白是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)的及進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)(Rel)。熟知的是c-Rel，RelA(p65)，RelB，NF-κB1(p50及其前體p105)及NF-κB2(p52及其前體p100)。大多數(shù)NF-κB二聚體是轉(zhuǎn)錄的激活因子；p50/p50及p52/p52同源二聚體抑制其靶基因的轉(zhuǎn)錄。所有NF-κB/Rel蛋白均具有高度保守的NH2-末端Rel同源結(jié)構(gòu)域(RHD)。RHD負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合，二聚體化，并與已知為I κBs的抑制蛋白相關(guān)。在靜息細(xì)胞中，NF-κB/Rel二聚體與IκBs結(jié)合并以失活形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。IκBs是多基因家族的成員(IκBα，IκB β，IκB γ，IκBε，Bcl-3，及其前體Rel-蛋白，p100和p105)。錨蛋白重復(fù)的多個(gè)拷貝與NF-κB通過(guò)RHD相互作用(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用)。在適當(dāng)?shù)拇碳は?，IκB通過(guò)被IκB激酶(IKκs)磷酸化，通過(guò)泛素連接酶復(fù)合物被多泛素化，并通過(guò)26S蛋白酶體降解。NF-κB釋放并轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中引起基因表達(dá)。
NF-κB對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括先天免疫應(yīng)答，如通過(guò)細(xì)胞因子IL-1，IL-2，IL-6，IL-12，TNFα，LT-α，LT-β，GM-CSF；粘附分子(ICAM，VCAM，內(nèi)皮白細(xì)胞粘附分子[ELAM])的表達(dá)，急性期蛋白(SAA)，可誘導(dǎo)酶(iNOS和COX-2)及抗微生物肽(β-防衛(wèi)素)。就獲得性免疫而言，MHC蛋白IL-2，IL-12和IFN-α由NF-κB調(diào)節(jié)。全部免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)包括調(diào)節(jié)對(duì)調(diào)節(jié)凋亡關(guān)鍵的基因(c-IAP-1和c-IAP-2，F(xiàn)as配體，c-myc，p53及細(xì)胞周期蛋白D1)。
考慮到NF-κB及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子是最重要的促炎癥轉(zhuǎn)錄因子，并鑒于本發(fā)明提供了一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，如可以抑制NF-κB及可能也抑制其它促炎癥轉(zhuǎn)錄因子的寡肽及其功能類(lèi)似物或衍生物，在此也稱(chēng)為NF-κB抑制因子，因此本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)NF-κB激活的基因表達(dá)，尤其抑制所述表達(dá)并因此抑制重要的促炎癥途徑的方法。
這種抑制所述促炎癥途徑的效力的結(jié)果是廣泛而深遠(yuǎn)的。本發(fā)明例如提供了一種減輕或治療炎癥性呼吸道疾病如哮喘的方法。一般地，哮喘患者表現(xiàn)出呼吸道內(nèi)細(xì)胞的NF-κB持續(xù)激活。為這些患者，例如通過(guò)氣霧劑提供本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子，如LQGV或AQGV或MTRV或其功能類(lèi)似物或衍生物，將通過(guò)抑制細(xì)胞的NF-κB激活而減輕這些個(gè)體的炎癥呼吸道反應(yīng)。可方便地生產(chǎn)這種將信號(hào)傳導(dǎo)分子置于脂質(zhì)體中的組合物。
正如所述，炎癥包括相繼激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致促炎癥和抗炎癥介導(dǎo)因子的產(chǎn)生?？紤]到更多的注意力集中于引發(fā)炎癥的促炎癥途徑，因此關(guān)于切斷炎癥并解決炎癥反應(yīng)的機(jī)制相對(duì)了解較少。認(rèn)為轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在誘導(dǎo)促炎癥基因表達(dá)中具有重要作用，并引起將其作為治療炎癥疾病新目標(biāo)的興趣。然而，在炎癥發(fā)作期間產(chǎn)生的白細(xì)胞NF-κB激活也與促炎癥基因表達(dá)相關(guān)，而這種在炎癥消退期間的激活與抗炎基因的表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。在炎癥消退期間抑制NF-κB延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)并防止凋亡。這示出NF-κB具有體內(nèi)抗炎作用，包括調(diào)節(jié)炎癥消退。本發(fā)明提供了一種工具以在末期調(diào)節(jié)炎癥，本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子或調(diào)節(jié)因子可以在體內(nèi)在炎癥反應(yīng)的不同階段調(diào)節(jié)NF-κB途徑，在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種NF-κB調(diào)節(jié)因子，以用于消退炎癥，例如通過(guò)調(diào)節(jié)白細(xì)胞凋亡而進(jìn)行。有益的寡肽可在促進(jìn)休克的那些因子中發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明還提供了一種方法以減輕或治療新生兒肺部疾病，這種疾病也稱(chēng)為早產(chǎn)兒慢性肺部疾病，這是通常見(jiàn)于早產(chǎn)兒的一種病變，其進(jìn)展為一種長(zhǎng)期的肺部炎癥或支氣管肺部發(fā)育異常。用本發(fā)明提供的NF-κB抑制因子，如寡肽LQGV或其功能類(lèi)似物或衍生物治療這種新生兒，可以預(yù)防或減輕這種肺部疾病。
近年來(lái)骨生物學(xué)中的進(jìn)展使得可洞察骨病的發(fā)病機(jī)理。本發(fā)明還提供了一種治療絕經(jīng)期后病變?nèi)绻琴|(zhì)疏松癥的方法，包括調(diào)節(jié)并抑制破骨細(xì)胞分化及抑制TNFα誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞程序死亡，從而限制在絕經(jīng)期后的婦女中非常顯著的骨結(jié)構(gòu)的分解，已知絕經(jīng)期后婦女不再具有天然來(lái)源的hCG并因此缺乏hCG衍生的信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明因此提供了一種治療骨病的如骨質(zhì)疏松癥(其通常見(jiàn)于但非僅見(jiàn)于絕經(jīng)期后婦女)的方法。另外，本發(fā)明提供的NO和TNFα調(diào)節(jié)因子在牙周炎中抑制炎癥反應(yīng)和骨損失。另外，考慮到在強(qiáng)直性脊椎炎中在TNFα活性與臨床表現(xiàn)的程度之間存在相互關(guān)系，因此本發(fā)明提供了通過(guò)使用本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子治療脊椎炎的方法。
另外，考慮到在胰島素依賴(lài)型糖尿病(I型)的進(jìn)展中一種重要的病原性成分包括在樹(shù)突細(xì)胞中見(jiàn)到的NF-κB途徑過(guò)度激活，用本發(fā)明的NF-κB抑制因子處理將導(dǎo)致糖尿病癥狀減輕，或者至少推遲疾病發(fā)作的時(shí)間。根據(jù)本發(fā)明特別有效的寡肽信號(hào)傳導(dǎo)分子是GVLPALPQ，LQGV，MTRV，VLPALPQVVC，VLPALP，VLPALPQ，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，和CPRGVNPVVS，它們示出在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)中推遲糖尿病的發(fā)作。治療糖尿病尤其非胰島素依賴(lài)型糖尿病(II型)的另一種方法包括用一種寡肽信號(hào)傳導(dǎo)分子或其功能類(lèi)似物或衍生物抑制PPARγ級(jí)聯(lián)。
提供的另一種應(yīng)用是關(guān)于抗擊或治療自身免疫疾病。免疫疾病的非限制性實(shí)例包括橋本氏甲狀腺炎，原發(fā)性粘液水腫，甲狀腺功能亢進(jìn)，惡性貧血，自身免疫性萎縮性胃炎，Addison′s病，絕經(jīng)期提前，胰島素依賴(lài)型糖尿病，僵人(stiff-man)綜合征，Goodpasture′s綜合征，肌無(wú)力，男性不育，普通天皰瘡，類(lèi)天皰瘡，交感神經(jīng)眼炎，晶狀體性眼色素層炎，多發(fā)性硬化，自身免疫性溶血性貧血，先天血小板減少性紫癜，先天白細(xì)胞減少癥，原發(fā)膽管硬化，慢性活動(dòng)性肝炎，隱發(fā)性硬化，潰瘍性結(jié)腸炎，

綜合征，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，皮肌炎，多肌炎，硬皮病，混合結(jié)締組織病，盤(pán)狀紅斑狼瘡，及系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
本發(fā)明提供的另一種應(yīng)用是關(guān)于抗擊或治療微生物所致感染的方法，特別是由在感染期間激活NF-κB途徑的微生物所引起的那些感染。
這種微生物有很多，包括細(xì)菌，病毒，真菌和原生動(dòng)物，但其它病原體(例如蠕蟲(chóng))可具有相同作用。微生物感染激活NFκB途徑一般通過(guò)激活Toll樣受體途徑而發(fā)生。本發(fā)明提供了一種方法以調(diào)節(jié)尤其抑制與生物體的一般通過(guò)Toll樣受體途徑之一激活的炎癥反應(yīng)相關(guān)的部分基因表達(dá)。
Toll樣受體介導(dǎo)的NF-κB激活在宿主識(shí)別病原體中是重要的。這種病原體識(shí)別一般通過(guò)種系編碼的分子發(fā)生，即所謂的模式識(shí)別受體(PRR)。這些PRR識(shí)別普遍的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)。所述模式識(shí)別受體表示為膜結(jié)合或可溶的蛋白質(zhì)。它們包括CD14，β2-整聯(lián)蛋白(CD11/CD18)，C-型凝集素，巨噬細(xì)胞消除受體，補(bǔ)體受體(CR1/CD35，CR2/CD21)及Toll樣受體(TLR)。TLR通過(guò)其識(shí)別及區(qū)分不同類(lèi)別病原體的能力而與其它PRR區(qū)別。TLR代表一個(gè)跨膜蛋白家族，所述跨膜蛋白具有一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，包含多個(gè)拷貝的富亮氨酸重復(fù)(LRRs)和一個(gè)胞質(zhì)Toll/IL-1R(TIR)基序，其與I型IL-1受體(IL-1RI)的胞內(nèi)信號(hào)化結(jié)構(gòu)域明顯同源。因此，認(rèn)為T(mén)LR屬于IL-1R超家族。
病原體相關(guān)的分子模式(PAMPS)不是由宿主表達(dá)的，而是病原微生物的成分。這種PAMPS包含細(xì)菌細(xì)胞壁成分如脂多糖(LPS)，脂蛋白(BLP)，肽聚糖(PGN)，脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，脂磷壁酸質(zhì)(LTA)，含有未甲基化的CpG基序的DNA，酵母和真菌細(xì)胞壁甘露聚糖及β葡聚糖，雙鏈RNA，原生動(dòng)物的一些獨(dú)特的糖基化蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。
這些PAMPS的識(shí)別首先使得可通過(guò)TLR差示識(shí)別病原體。例如，TLR2通常在應(yīng)答革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的BLP、PGN，分枝菌的LAM，及酵母的甘露聚糖時(shí)激活，而TLR4通常由革蘭氏陰性細(xì)菌的LPS及革蘭氏陰性細(xì)菌的LTA激活，一種分泌的小分子MD-2也可導(dǎo)致TLR4信號(hào)傳導(dǎo)。
根據(jù)本發(fā)明能調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一些寡肽先前已經(jīng)在小動(dòng)物中exvivo和在體內(nèi)進(jìn)行了測(cè)試，但與調(diào)節(jié)基因表達(dá)的關(guān)系無(wú)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。觀(guān)測(cè)到這些寡肽對(duì)小鼠中LPS誘導(dǎo)的膿毒病的有益作用，即對(duì)膿毒病的抑制作用。這些寡肽的免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)在體外及ex vivo的分析如T細(xì)胞分析中觀(guān)測(cè)到，其示出抑制病理性Th1免疫應(yīng)答，抑制炎癥性細(xì)胞因子(MIF)，增加抗炎細(xì)胞因子(IL-10，TGF-β)的產(chǎn)生及對(duì)抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的合成寡肽或其類(lèi)似物或衍生物，例如與通過(guò)蛋白酶解從內(nèi)源性蛋白質(zhì)如hCG中衍生的分解產(chǎn)物相似的寡肽，可用于例如通過(guò)NF-κB抑制而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此發(fā)現(xiàn)了這種寡肽的更廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在已知活性NF-κB在細(xì)胞中釋放在各種刺激之后發(fā)生，所述刺激包括用細(xì)菌脂多糖處理細(xì)胞及與Toll樣受體相互作用(見(jiàn)例如Guha an Mackman，Cell.Sign.2001，1385-94)。特別地，對(duì)樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行LPS刺激會(huì)誘導(dǎo)在轉(zhuǎn)錄因子激活的影響下的許多基因，所述轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB，p50，EGR-1，IRF-1及可通過(guò)本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)的其它因子?？紤]到LPS誘導(dǎo)EGR-1是最大程度誘導(dǎo)TNFα所需的，因此可預(yù)見(jiàn)EGR-1的抑制會(huì)顯著降低在LPS激活之后見(jiàn)到的膿毒病的作用?，F(xiàn)已知信號(hào)傳導(dǎo)分子如本發(fā)明所提供的寡肽的基因調(diào)節(jié)作用使得可以合理設(shè)計(jì)信號(hào)分子混合物，以更好地減輕膿毒病中所見(jiàn)癥狀。將一種這樣的混合物，LQGV，AQGV和VLPALP的1∶1∶1混合物施用于靈長(zhǎng)類(lèi)革蘭氏陰性細(xì)菌誘導(dǎo)的獼猴膿毒病休克模型，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)模型中是有效的。因此，本發(fā)明提供了治療靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物膿毒病的一種藥物組合物，及治療靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物膿毒病的一種方法，包括將所述靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子接觸，優(yōu)選與這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的混合物接觸。這種信號(hào)傳導(dǎo)分子或混合物的施用優(yōu)選系統(tǒng)施用，例如通過(guò)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這種治療還包括應(yīng)用例如抗生素，然而只有當(dāng)這種應(yīng)用未顯示治療不當(dāng)時(shí)才可進(jìn)行，因?yàn)樵谀切┲委煹膫€(gè)體中由抗生素作用的細(xì)菌分解會(huì)產(chǎn)生進(jìn)一步的毒素負(fù)擔(dān)的危險(xiǎn)。
涵蓋的其它應(yīng)用是關(guān)于抗擊或治療病毒感染，尤其是在感染期間激活NFκB途徑的病毒所致感染的方法。這種病毒感染有多種多樣，經(jīng)典的實(shí)例是B型肝炎病毒通過(guò)持久激活NF-κB而誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。使用本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子提供了對(duì)抗或預(yù)防這種細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。
由本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子有效抑制的其中NF-κB持久激活的其它疾病是一種移植相關(guān)疾病，如移植相關(guān)的免疫應(yīng)答，移植物抗宿主病(尤其是骨髓移植)，急性或慢性異體移植排斥，及輸血后血小板減少癥。
由本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子有效抑制的其中NF-κB持續(xù)激活的另一種情況是預(yù)防或減輕梗塞后局部缺血相關(guān)的組織損害，例如在體內(nèi)的腦和心血管梗塞中或者在制備或貯存的以制備進(jìn)一步用作移植物的ex vivo的器官或組織中可見(jiàn)的組織損害。局部缺血相關(guān)的組織損害現(xiàn)可通過(guò)用抑制NF-κB激活的本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子灌注(原)缺血部位而減輕。其中局部缺血(也稱(chēng)為灌注不足)起作用的病變例如包括驚厥，其可歸因于血管收縮所致病灶局部腦缺血，這與通過(guò)新的腦成像技術(shù)檢測(cè)到的變化證據(jù)一致。HELLP(溶血，肝酶升高，及低血小板計(jì)數(shù))固有的肝臟機(jī)能障礙也可歸因于急性灌注不足的作用。局部缺血的其它病變?cè)谛募」Ｈ罂梢?jiàn)，產(chǎn)生由冠狀動(dòng)脈長(zhǎng)期閉塞及體內(nèi)再灌注所致不可逆轉(zhuǎn)的心肌損害，其在PCT/NL01/00259中已經(jīng)加以論述。
既然已經(jīng)了解獨(dú)特的合成寡肽可用于例如通過(guò)NF-κB抑制而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此發(fā)現(xiàn)了這種寡肽的更廣泛的應(yīng)用，所述寡肽例如是與通過(guò)蛋白酶解從內(nèi)源性蛋白質(zhì)如hCG中衍生的分解產(chǎn)物相似的那些寡肽。例如，本發(fā)明提供了用包含至少一種信號(hào)傳導(dǎo)分子的灌注液灌注移植物的一種方法，然后可以更大程度減少由于移植物中NF-κB激活所致局部缺血或植入前損害，由此可以更廣泛應(yīng)用移植物。
本發(fā)明提供了一種信號(hào)傳導(dǎo)分子，用于調(diào)節(jié)基因在細(xì)胞中的表達(dá)。在此給出了這種信號(hào)傳導(dǎo)分子在生產(chǎn)治療人或動(dòng)物疾病的藥物組合物中的應(yīng)用的一些實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在治療免疫介導(dǎo)的功能失調(diào)中的這種應(yīng)用，尤其在發(fā)現(xiàn)NF-κB/Rel蛋白在免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用的那些情況中。然而正如所述的，既然已知信號(hào)傳導(dǎo)分子如寡肽或其類(lèi)似物或衍生物的基因調(diào)節(jié)，因此還提供了通過(guò)調(diào)節(jié)其它轉(zhuǎn)錄因子如AP-1或PPARγ及其它因子的活性而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，也正如所述的，現(xiàn)已知很可能是分解產(chǎn)物的寡肽在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中起如此關(guān)鍵的作用，因此本發(fā)明提供了簡(jiǎn)便的方式以鑒別進(jìn)一步的基因表達(dá)調(diào)節(jié)肽，并提供了這些肽的合成形式及其類(lèi)似物和衍生物用于各種病變中及用于制備各種藥物組合物。這種治療及有效的藥物組合物例如見(jiàn)于以下病變，其中免疫介導(dǎo)的病變包括慢性炎癥，如糖尿病，多發(fā)性硬化或者急性或慢性移植排斥，特別是在抗原呈遞細(xì)胞(APC′s)或樹(shù)突細(xì)胞(DCs)由于(過(guò)度活性)和持久的NF-κB表達(dá)而增強(qiáng)的那些情況中，或者其中免疫介導(dǎo)的病變包括急性炎癥，如膿毒病或過(guò)敏性休克或急性移植排斥?？梢杂冒景l(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的藥物組合物治療的其它免疫介導(dǎo)的病變包括自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(尤其通過(guò)抑制NF-κB對(duì)這些基因表達(dá)的作用而抑制IL-8和/或IL-15產(chǎn)生)，過(guò)敏反應(yīng)，如哮喘或寄生蟲(chóng)病，對(duì)感染因素的過(guò)強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述感染因素如病毒或細(xì)菌(尤其包括生物體感染所致急性出血性疾病，所述生物體如Yersinia pestis，埃博拉病毒，Staphylococcus aureus(例如tampon-disease)，細(xì)菌(如meningococcal)或病毒性腦膜炎和/或腦炎，及其它危及生命的病變中)。這種過(guò)強(qiáng)應(yīng)答例如見(jiàn)于前驚厥，反復(fù)發(fā)作的自然流產(chǎn)(RSA)或者早產(chǎn)或其它妊娠相關(guān)的病變。尤其在與遺傳編程性腫瘤生長(zhǎng)因子β-1產(chǎn)生增加相關(guān)的驚厥/前驚厥形式中，推薦使用本發(fā)明的治療方法。同樣，在RSA可能歸因于妊娠期間IL-10水平提高或者歸因于例如由于存在不利的等位基因所致TNFα活性提高，尤其編碼TNFα的基因的啟動(dòng)子中存在G-A多態(tài)性的情況中，推薦使用本發(fā)明提供的藥物組合物進(jìn)行治療。本發(fā)明還提供了這種妊娠相關(guān)的免疫失調(diào)的治療方法，其通過(guò)激活天然殺傷細(xì)胞(NK)活性而抑制NF-κB活性而進(jìn)行治療。同樣，在妊娠的豬中見(jiàn)到的LPS誘導(dǎo)的生育力下降或者流產(chǎn)可通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子或方法而降低。
在治療免疫介導(dǎo)的病變中的這種應(yīng)用優(yōu)選包括調(diào)節(jié)治療的個(gè)體中淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞亞群的相對(duì)比率和/或細(xì)胞因子活性，尤其是當(dāng)所述亞群包含Th1或Th2，或者DC1或DC2細(xì)胞時(shí)。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括使用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子以生產(chǎn)一種藥物，以調(diào)節(jié)心血管或循環(huán)系統(tǒng)疾病，如冠狀動(dòng)脈閉塞，及用于妊娠相關(guān)的心血管或循環(huán)系統(tǒng)疾病中。
另外，本發(fā)明提供了一種藥物組合物以調(diào)節(jié)心血管疾病或循環(huán)系統(tǒng)疾病，尤其妊娠相關(guān)的心血管疾病或循環(huán)系統(tǒng)疾病，所述藥物組合物包含本發(fā)明的一種信號(hào)傳導(dǎo)分子或其混合物。這種組合物用于調(diào)節(jié)心血管或循環(huán)系統(tǒng)疾病，尤其妊娠相關(guān)的心血管或循環(huán)系統(tǒng)疾病的方法中，包括將動(dòng)物(尤其是哺乳動(dòng)物)用本發(fā)明的至少一種信號(hào)傳導(dǎo)分子處理。非妊娠相關(guān)的病變例如血膽固醇過(guò)多相關(guān)的病變對(duì)本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子治療也敏感。例如，阿樸脂蛋白E(apo E)缺乏癥與一系列病理學(xué)改變相關(guān)，包括異常脂蛋白血癥，動(dòng)脈硬化，Alzheimer′s病，體重增加及壽命變短。多態(tài)性apoE基因的不同等位基因的遺傳在大多數(shù)人群中是造成血漿膽固醇中10％的變化的原因。針對(duì)一個(gè)變體apoE2是雜合的個(gè)體，如果存在一個(gè)額外的遺傳或環(huán)境因素，可產(chǎn)生III型β異常脂蛋白血癥。apoE的一些更不常見(jiàn)的等位基因在雜合個(gè)體中產(chǎn)生這種病變的顯性表達(dá)。ApoE是LDL受體的配體，其對(duì)血漿膽固醇的作用由LDL受體對(duì)攜帶變體apoE蛋白的脂蛋白的親和性的差別介導(dǎo)。已經(jīng)通過(guò)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)基因構(gòu)建體而廣泛研究了調(diào)節(jié)apoE基因轉(zhuǎn)錄的因子，其包括因子之間的復(fù)雜相互作用，所述因子結(jié)合5’啟動(dòng)子區(qū)域，第一個(gè)內(nèi)含子及與結(jié)構(gòu)基因相隔幾千個(gè)堿基的3’區(qū)域中的成分。apoE基因的缺失與脂蛋白代謝物(血漿總膽固醇)，HDL膽固醇，HDL/TC，和HDL/LDL比率，apo B缺失的血漿中的酯化率，血漿甘油三酯，肝HMG-CoA還原酶活性，肝膽固醇含量，血漿高半胱氨酸(高胱氨酸)和葡萄糖水平降低，及嚴(yán)重動(dòng)脈硬化和皮膚黃瘤癥中的變化相關(guān)。本發(fā)明提供了一種方法和信號(hào)傳導(dǎo)分子以治療與LDL受體功能失調(diào)相關(guān)的病變，所述LDL受體如ApoE及阿樸脂蛋白家族其它成員。特別地，優(yōu)選使用包含GVLPALPQ和/或VLPALP或其功能類(lèi)似物或衍生物的一種信號(hào)傳導(dǎo)分子。
本發(fā)明還提供了信號(hào)傳導(dǎo)分子在制備藥物組合物或藥物或者治療各種疾病的方法中的應(yīng)用，所述應(yīng)用不同于在制備治療免疫介導(dǎo)的病變的藥物組合物或治療免疫介導(dǎo)的病變的方法中的應(yīng)用。例如，本發(fā)明提供了局部應(yīng)用，例如制成包含本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的藥膏或噴霧劑，以預(yù)防或減輕皮膚病，如濕疹，銀屑病，也可以用于與過(guò)度暴露于紫外線(xiàn)相關(guān)的皮膚損害。
同樣，本發(fā)明涵蓋了在緩解控制中的應(yīng)用，從而調(diào)節(jié)與前列腺素合成相關(guān)的基因，由此影響COX2途徑。
另外，本發(fā)明還提供了信號(hào)傳導(dǎo)分子在制備一種藥物組合物或藥物及在治療各種病變的方法中的應(yīng)用，其不同于在制備治療消耗綜合征如治療患有HIV感染的特殊個(gè)體的藥物組合物中的應(yīng)用，或者治療這種個(gè)體的消耗綜合征的方法中的應(yīng)用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了應(yīng)用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子制備藥物組合物或藥物以調(diào)節(jié)血管發(fā)生或血管形成，尤其在胚胎發(fā)育期間，或者在移植后刺激移植的器官中的血管形成或者在以后的階段對(duì)其加以抑制。導(dǎo)致血管發(fā)生的信號(hào)傳導(dǎo)分子在詳細(xì)描述中揭示。
本發(fā)明提供的應(yīng)用還包括調(diào)節(jié)細(xì)胞上TNFα受體(例如CD27)表達(dá)，從而調(diào)節(jié)治療的個(gè)體中淋巴細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞亞群的相對(duì)比率和/或細(xì)胞因子活性。如在詳細(xì)描述中所描述的，本發(fā)明的特殊寡肽能負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞系細(xì)胞上CD27表達(dá)。
負(fù)調(diào)節(jié)TNFα在與膿毒性休克相似的、不僅展示TNFα活性提高而且表現(xiàn)為進(jìn)一步釋放其它炎癥化合物如NO的病變中也特別有效。NO的產(chǎn)生在血管和炎癥應(yīng)答中是關(guān)鍵的介導(dǎo)因素。我們的結(jié)果示出用炎癥活性化合物如LPS刺激的炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量NO。然而，用大多數(shù)NMPF肽(NMPF肽1-14，43-66和69)，甚至以非常低的劑量(1pg/ml)共刺激這些細(xì)胞，就抑制NO產(chǎn)生?？蓛?yōu)選通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)TNFα和NO產(chǎn)量而治療的典型類(lèi)膿毒性休克病變包括以下病變，例如Bacillus anthracis(炭疽熱)和Yersinia pestis毒素所致疾病，或者可能參與生物恐怖活動(dòng)的這些微生物的感染。炭疽熱毒素由Bacillus anthracis產(chǎn)生，是導(dǎo)致炭疽熱的致病因素，而且是所述疾病的主要癥狀的原因。臨床上炭疽熱很罕見(jiàn)，但在生物戰(zhàn)爭(zhēng)和恐怖活動(dòng)中潛在應(yīng)用B.anthracis而逐漸增加。盡管存在炭疽熱的疫苗，但各種因素使大規(guī)模接種不切實(shí)際。通過(guò)用抗生素治療可從宿主中根除這種細(xì)菌，但因?yàn)槎舅氐某掷m(xù)作用，一旦癥狀明顯則這種治療的效力很低。因此，所述毒素作用的特異性抑制劑為抗生素治療提供了有價(jià)值的幫助。所述毒素由一個(gè)稱(chēng)為“保護(hù)性抗原”(PA)的單一受體結(jié)合基序及兩個(gè)稱(chēng)為“水腫因子”(EF)和“致死因子”(LF)的酶基序組成。在作為無(wú)毒單體從所述細(xì)菌中釋放后，這三種蛋白質(zhì)布散于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面并裝配為毒性的細(xì)胞結(jié)合的復(fù)合物。
通過(guò)細(xì)胞表面蛋白酶將PA切割為兩個(gè)片段，使得保留與細(xì)胞結(jié)合的片段PA63七聚體化，并高親和性結(jié)合EF和LF。在通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞而內(nèi)化之后，所述復(fù)合物被運(yùn)輸至內(nèi)涵體。在低pH下，PA基序插入膜中并介導(dǎo)EF和LF轉(zhuǎn)位于細(xì)胞液中。EF是一種腺苷酸環(huán)化酶，其對(duì)專(zhuān)業(yè)的吞噬細(xì)胞具有抑制作用，而LF是一種蛋白酶，其特異性作用于巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致其死亡及宿主死亡。
另外，本發(fā)明提供了本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子在生產(chǎn)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的藥物組合物中的應(yīng)用及在通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)而進(jìn)行治療的方法中的應(yīng)用。可通過(guò)特殊肽調(diào)節(jié)的特殊基因如圖70所示。
TNFα自身和/或TNFα受體的負(fù)調(diào)節(jié)，也有益于具有Chagas心肌病變的個(gè)體。
同樣，在此提供了本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子在制備一種藥物組合物中的應(yīng)用，所述藥物組合物在創(chuàng)傷修復(fù)尤其在燒傷中調(diào)節(jié)血管形成或血管發(fā)生。同樣，在此提供了一種藥物組合物，其用于手術(shù)后生理應(yīng)激反應(yīng)的情況中，從而不僅有益于從治療中形成血管，而且還改善患者的一般狀態(tài)。
本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的另一種應(yīng)用包括其用于制備治療癌癥的另一種藥物組合物。這種藥物組合物優(yōu)選通過(guò)調(diào)節(jié)及正調(diào)節(jié)傳統(tǒng)上由NF-κB活性負(fù)調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序死亡應(yīng)答而起作用。用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子抑制所述活性可以增加腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子的另一種抗癌活性包括尤其在人體造血系腫瘤的情況中負(fù)調(diào)節(jié)c-myb。本發(fā)明還提供了對(duì)14.3.3蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)。
本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的另一種應(yīng)用包括其用于制備治療癌癥的進(jìn)一步的藥物組合物。這種藥物組合物優(yōu)選通過(guò)調(diào)節(jié)及負(fù)調(diào)節(jié)尤其是腫瘤細(xì)胞上的運(yùn)鐵蛋白受體可利用性而起作用。運(yùn)鐵蛋白受體傳統(tǒng)上通過(guò)NF-κB活性而正調(diào)節(jié)。用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子抑制所述活性可以降低鐵的攝取并增加腫瘤細(xì)胞的死亡。特別地，類(lèi)紅細(xì)胞和血栓樣細(xì)胞對(duì)這種治療敏感。
本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子的再一種應(yīng)用包括其用于制備治療癌癥、尤其是由病毒引起的癌癥的再一種藥物組合物，如逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的惡性腫瘤及其它病毒誘導(dǎo)的惡性腫瘤。這種藥物組合物優(yōu)選通過(guò)調(diào)節(jié)及負(fù)調(diào)節(jié)傳統(tǒng)上由病毒誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或NF-κB活性正調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖應(yīng)答而起作用。用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子抑制所述活性可以降低增殖并增加腫瘤細(xì)胞死亡。這種藥物組合物也可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-8誘導(dǎo)的血管發(fā)生應(yīng)答而起作用，從而例如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1或NF-κB表達(dá)而抑制IL-8表達(dá)，導(dǎo)致抑制依賴(lài)于血管形成的腫瘤的生長(zhǎng)。
另外，本發(fā)明提供了信號(hào)傳導(dǎo)分子在制備優(yōu)化人或動(dòng)物生育力及胚胎存活的藥物組合物中的應(yīng)用及在優(yōu)化生育力和胚胎存活的方法中的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明提供了使得在受精個(gè)體中負(fù)調(diào)節(jié)TNFα的一種方法和組合物，優(yōu)選地其與在所述個(gè)體中正調(diào)節(jié)IL-10的組合物和方法組合。這種組合物和方法在人體和動(dòng)物醫(yī)藥中均有直接用途。
本發(fā)明還提供了信號(hào)傳導(dǎo)分子在制備調(diào)節(jié)個(gè)體體重的藥物組合物中的應(yīng)用，特別是通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子而在過(guò)氧化物酶體增殖因子激活的受體γ(PPARγ)及脂質(zhì)代謝物的影響下調(diào)節(jié)基因表達(dá)，本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)體重的方法，包括為個(gè)體施用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子。
本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子的進(jìn)一步應(yīng)用是調(diào)節(jié)基因在培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)，例如圖70所示。這種方法包括用本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子作用于培養(yǎng)的細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞(在本領(lǐng)域已知的體外細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞)的增殖和或分化可以通過(guò)本發(fā)明的信號(hào)傳導(dǎo)分子作用于所述培養(yǎng)的細(xì)胞而調(diào)節(jié)。應(yīng)理解的是研究細(xì)胞的增殖或分化，如干細(xì)胞研究，將非常有益于了解存在影響基因調(diào)節(jié)的第三種主要途徑，而且合成肽及其類(lèi)似物或衍生物應(yīng)用簡(jiǎn)便。
另外，應(yīng)理解的是本發(fā)明提供的信號(hào)傳導(dǎo)分子有一種有利用途，即用作疫苗中的共刺激物質(zhì)，伴隨現(xiàn)代佐劑或代替?zhèn)鹘y(tǒng)使用的分枝桿菌佐劑，尤其鑒于某些分枝桿菌表達(dá)hCG樣蛋白，現(xiàn)假定這些細(xì)菌通過(guò)為宿主提供模擬本發(fā)明鑒別的信號(hào)傳導(dǎo)分子的分解產(chǎn)物已經(jīng)利用本發(fā)明提供的在基因調(diào)節(jié)中發(fā)現(xiàn)的這種第三種途徑。本發(fā)明提供的治療和組合物的應(yīng)用非僅限于動(dòng)物，植物及其它生物體也可進(jìn)行本發(fā)明提供的該第三種途徑。另外，既然已經(jīng)表明存在這種途徑，本發(fā)明提供了使其作為診斷項(xiàng)目，例如在一種方法中確定細(xì)胞的基因調(diào)節(jié)狀態(tài)，包括確定信號(hào)傳導(dǎo)分子的存在與否或者確定能從(優(yōu)選內(nèi)源)蛋白質(zhì)中產(chǎn)生這種信號(hào)傳導(dǎo)分子的蛋白酶的存在與否。
附圖簡(jiǎn)述

圖1-2處理的BALB/c小鼠(6只)的骨髓(BM)細(xì)胞產(chǎn)量。從處理的小鼠中分離BM細(xì)胞，并在體外在存在rmGM-CSF的情況下培養(yǎng)9天。這些圖示出在培養(yǎng)分離自處理的小鼠的BM細(xì)胞9天后的細(xì)胞產(chǎn)量，所述處理是用PBS，LPS，或與NMPF肽4，46，7和60組合的LPS處理。在這些圖中，細(xì)胞產(chǎn)量以與PBS處理的細(xì)胞產(chǎn)量的相對(duì)百分比表示。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條表示與LPS對(duì)照組相比的顯著性數(shù)據(jù)。示出了一代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖3體內(nèi)處理對(duì)CD11c+細(xì)胞上MHC-II表達(dá)的作用。從處理的BALB/c小鼠(n＝6)中分離骨髓(BM)細(xì)胞，并在體外在存在rmGM-CSF的情況下培養(yǎng)9天。該圖示出在分離自PBS，LPS，或與NMPF組合的LPS處理的小鼠的BM細(xì)胞培養(yǎng)9天后，以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示的MHC-II表達(dá)。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條代表與LPS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)。示出了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖4-7在體外處理的BM培養(yǎng)物的骨髓(BM)細(xì)胞產(chǎn)量。將BALB/c小鼠(n＝3)的BM細(xì)胞在體外培養(yǎng)，及在存在rmGM-CSF情況下，用PBS，LPS(t＝6天)，NMPF 4，7，46，60(t＝0天或t＝6天)或者NMPF與LPS的組合(t＝6天)處理。這些圖示出在培養(yǎng)BM細(xì)胞9天后以與PBS處理的細(xì)胞產(chǎn)量相比的相對(duì)百分比表示的細(xì)胞產(chǎn)量。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條代表與LPS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)，點(diǎn)劃線(xiàn)代表與PBS組相比顯著的數(shù)據(jù)。示出了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖8-11體外處理對(duì)CD11c+細(xì)胞上MHC-II表達(dá)的作用。將BALB/c小鼠(n＝3)的BM細(xì)胞在體外培養(yǎng)，及在存在rmGM-CSF情況下，用PBS，LPS(t＝6天)，NMPF 4，7，46，60(t＝0天或t＝6天)或者NMPF與LPS的組合(t＝6天)處理。這些圖示出在培養(yǎng)BM細(xì)胞9天后以CD11c陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示的MHC-II。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條代表與LPS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)，點(diǎn)劃線(xiàn)代表與PBS組相比顯著的數(shù)據(jù)。示出了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖12-15處理的BALB/c小鼠(n＝6)的骨髓(BM)細(xì)胞產(chǎn)量。從處理的小鼠中分離BM細(xì)胞，并在存在rmGM-CSF的情況下ex vivo(ex vivo)培養(yǎng)9天。這些圖示出在懸浮(未附著)及附著于(附著)培養(yǎng)平皿培養(yǎng)BM細(xì)胞9天后的細(xì)胞產(chǎn)量。BM分離自用PBS，LPS或者與不同NMPF肽組合的LPS處理的小鼠。在這些圖中，細(xì)胞產(chǎn)量以與PBS處理相比的相對(duì)百分率表示。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條代表與LPS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)。示出了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖16-17NOD小鼠的體外處理的BM培養(yǎng)物的骨髓(BM)細(xì)胞產(chǎn)量。將15周齡年老雌性NOD小鼠(3只)的BM細(xì)胞在體外培養(yǎng)，并在存在rmGM-CSF的情況下用PBS或NMPF處理9天。這些圖示出在懸浮(未附著)及附著于(附著)培養(yǎng)平皿培養(yǎng)BM細(xì)胞9天后的細(xì)胞產(chǎn)量。在這些圖中，細(xì)胞產(chǎn)量以與PBS處理相比的相對(duì)百分率表示。每種條件由6個(gè)培養(yǎng)平皿組成，這些圖中示出的結(jié)果是6個(gè)平皿的代表結(jié)果。大于20％的差異認(rèn)為是顯著的，線(xiàn)條代表與LPS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)。示出了一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。包括所有實(shí)驗(yàn)條件的發(fā)現(xiàn)在三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)中全部再現(xiàn)。
圖18NMPF-1，2，3，4，5，6，10，11和13對(duì)巨噬細(xì)胞(RAW264.7)中LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)量(以微摩爾表示)的作用。該圖示出在0.78ng/ml-100ng/ml濃度范圍內(nèi)10μg/ml NMPF明顯抑制NO產(chǎn)量。
圖19Jurkat T細(xì)胞在有或無(wú)NMPF 4(LQGV)，87(VGQL)，6(VLPALP)和88(PLAPLV)的情況下用PHA(10μg/ml)處理。在溫育3小時(shí)后，制備核提取物并分析轉(zhuǎn)錄因子(p65，p50，c-REL，c-FOS，CREB1和ATF2)。該圖示出NMPF對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用。
圖20-32用NMPF在體外處理受精雞卵及NMPF對(duì)血管發(fā)生的作用。將受精雞卵(第0天)用PBS，NMPF，VEGF或與NMPF組合的VEGF處理。針對(duì)每種條件注射10只雞卵。在溫育第8天，將胚胎從雞卵中取出并置于100-mm培養(yǎng)平皿上。將所述胚胎和血管用顯微鏡體內(nèi)照相。對(duì)每個(gè)雞卵照1張一般觀(guān)察照片，對(duì)血管照4張?jiān)敿?xì)照片。血管發(fā)生(血管分枝)的量化通過(guò)計(jì)數(shù)血管分枝的數(shù)目實(shí)現(xiàn)。這種血管形成(vasculogenesis)的量化通過(guò)測(cè)定血管厚度實(shí)現(xiàn)。在照片中測(cè)定血管分枝的數(shù)目和血管厚度，并聯(lián)系10mm2的光柵(照片中)以進(jìn)行對(duì)比。計(jì)算每種條件的分枝平均數(shù)和平均血管厚度(N＝10)，并使用Student′s T檢驗(yàn)與PBS或VEGF對(duì)照組相對(duì)比。線(xiàn)條表示與PBS對(duì)照組相比顯著的數(shù)據(jù)(p＜0.05)，點(diǎn)劃線(xiàn)表示與VEGF組相比顯著的數(shù)據(jù)(p＜0.05)。圖20-30示出NMPF對(duì)血管分枝的作用。圖31-32示出NMPF對(duì)血管厚度的作用。
圖33通過(guò)EMSA檢測(cè)NF-κB。該圖示出用LPS或NMPF與LPS的組合處理4小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的核提取物中NF-κB存在情況。數(shù)字1-13相當(dāng)于用NMPF和LPS處理的細(xì)胞核提取物。CTL相當(dāng)于只用LPS處理的細(xì)胞核提取物。放射性標(biāo)記的NF-κB探針的特異性通過(guò)用CTL的核提取物和相當(dāng)于只含標(biāo)記的寡核苷酸的樣品(無(wú)核提取物)的olg測(cè)試與三種不同濃度(1×，10×，100×)的未標(biāo)記寡核苷酸(u1，u2，u3)競(jìng)爭(zhēng)而示出。描述(NMPF-1)VLPALPQVVC，(NMPF-2)LQGVLPALPQ，(NMPF-3)LQG，(NMPF-4)LQGV，(NMPF-5)GVLPALPQ，(NMPF-6)VLPALP，(NMPF-7)VLPALPQ，(NMPF-8)GVLPALP ，(NMPF-9)VVC，(NMPF-11)MTRV，(NMPF-12)MTR。
圖34.HPLC層析(波長(zhǎng)206)，其中疊加了得自L(fǎng)PS及LPS與NMPF組合刺激的RAW264.7細(xì)胞的核蛋白提取物的數(shù)據(jù)圖。
圖35.NMPF-4肽的MSn分析。
圖36LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞的核提取物的一個(gè)級(jí)分的MSn分析。上方示出所述級(jí)分的全部譜圖，下方示出質(zhì)量413.13處的MS/MS譜。
圖37LPS與NMPF-4組合刺激的RAW264.7細(xì)胞的核提取物的一個(gè)級(jí)分的MSn分析。上方示出所述級(jí)分的全部譜圖，下方示出質(zhì)量416.07處的MS/MS譜。
圖38-49在獼猴中NMPF對(duì)膿毒性休克綜合征的作用。在70分鐘時(shí)間點(diǎn)灌注大腸桿菌，并在灌注大腸桿菌結(jié)束時(shí)(190分鐘時(shí)間點(diǎn))注射抗生素Baytril。對(duì)照猴(猴429)在100分鐘時(shí)間點(diǎn)用0.9％NaCl處理，而NMPF處理的猴(猴459和427)在相同時(shí)間點(diǎn)接受NMPF處理作為對(duì)照猴。這些圖示出了在實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照猴429(圖38-41)，NMPF處理的猴459(圖42-45)及427(圖46-49)的心率(每分鐘跳動(dòng)的次數(shù))，血壓(mmHg)，收縮壓和舒張壓之間的壓差及血氧濃度(飽和度％)。
圖50這些圖(A-C)示出LPS(10μg/ml)與不同NMPF肽(1pg/ml)共同刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的NO產(chǎn)量。
圖51這些圖(A-C)示出LPS(10μg/ml)與三種不同濃度的不同NMPF肽(1pg/ml)共同刺激的RAW 264.7巨噬細(xì)胞的NO產(chǎn)量。
圖52該圖示出用各種NMPF肽處理2周的糖尿病NOD小鼠的百分比。
圖53該圖示出在用NMPF肽處理的NOD小鼠中進(jìn)行的葡萄糖耐量測(cè)試(GTT)(A)，及空腹血糖水平。
圖54和55處理的RAW264.7細(xì)胞核提取物中存在的NF-κB的半定量數(shù)量。(A)示出抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位的NMPF肽NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)，NMPF-4(LQGV)，NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-6(VLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-12(MTR)和NMPF-14(環(huán)LQGVLPALPQVVC)。促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位的NMPF肽是NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)和NMPF-11(MTRV)。在該圖中，A表示用未標(biāo)記的寡核苷酸的一倍競(jìng)爭(zhēng)，B只表示未標(biāo)記的寡核苷酸，C表示用10倍未標(biāo)記的寡核苷酸的競(jìng)爭(zhēng)，D表示用百倍未標(biāo)記的寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)。為進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，使用LPS處理的細(xì)胞的標(biāo)記的提取物(見(jiàn)+LPS)與未標(biāo)記的寡核苷酸。核中NF-κB的基礎(chǔ)水平由以下肽降低NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)和NMPF-4(LQGV)，而核中NF-κB的基礎(chǔ)水平由以下肽提高NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-13(LQGVLPALPQVVC)(圖55)。
圖56處理的NOD小鼠脾DC中的NFκB 將NOD小鼠用PBS或NMPF處理。之后，分離脾DC并分析核NFκB p65。用NMPF-3，4，5，4+5，4+6，5+6和4+5+6處理的NOD小鼠示出NFκB p65水平降低。
圖57NOD和CS7b16小鼠骨髓衍生的DC中的NFκB 我們?cè)隗w外測(cè)試了NMPF對(duì)NOD和C57BL/6小鼠DC中NFκB的作用。分離骨髓(BM)并在存在GM-CSF的情況下培養(yǎng)，以產(chǎn)生BM衍生的DC。獲得的DC用LPS(5ng/ml)和NMPF 1，2，5或6刺激30分鐘，然后測(cè)定NFκB p65活性。
當(dāng)用5ng/ml LPS刺激時(shí)，C57BL/6DC與未處理的DC相比未示出NFκB活化提高。然而，NOD DC示出在用LPS刺激后，NFkB活化提高2倍。NMPF對(duì)NFκB的作用在C57BL/6DC中檢測(cè)不到，因?yàn)橛肔PS刺激不引起NFκB活化。然而，NOD DC中NMPF能抑制(NMPF1，2，5和6)LPS誘導(dǎo)的NFκB活化(圖57)。這些結(jié)果示出與C57BL/6DC相比，NOD DC中NFκB的高反應(yīng)性，且NMPF抑制NODDC中高反應(yīng)性NFκB活化。
圖58該圖(圖58A)示出NMPF 1-9對(duì)血管發(fā)生的作用，它們?cè)诘?天加入。NMPF 1，2，3，5，6，7，8和9處理與PBS處理相比示出明顯抑制血管發(fā)生。而NMPF-4明顯增加血管發(fā)生。該圖還示出在第8天僅用VEGF處理明顯增加血管發(fā)生。圖58B示出在第8天用NMPF 2，3，5，7，8和9處理明顯抑制VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。另外，在第0天用NMPF 1和6及VEGF處理明顯抑制血管發(fā)生(數(shù)據(jù)未示出)。
圖59-65這些圖示出未處理的猴(429)及NMPF處理的猴(459)和NMPF處理的猴(427)的血清TNFα(圖59)，IL-1β(圖60)，IL-8(圖61)，IL-6(圖62)，IL-5(圖63)，IL-10(圖64)和IFN-γ(圖65)水平，所述未處理的猴在注射大腸桿菌后8小時(shí)處死，所述NMPF處理的猴(459)在與未處理的猴同一時(shí)間處死，所述NMPF猴(427)不處死，其在大腸桿菌處理后38小時(shí)死亡。在以下時(shí)間點(diǎn)取血液樣品0，30(注射大腸桿菌)，45，60(安慰劑或NMPF處理)，75，90，105，120，135，150(Baytril處理)，165，180，195，210，225，240，255，270，300，330，360，390，420，450，480，510，540，570，600及630分鐘。
圖66-69這些圖示出使用NMR1小鼠進(jìn)行膿毒性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在靜脈內(nèi)注射S.aureus LS-1細(xì)菌后，將一組小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)用PBS處理，每周三次共兩周，將其它組小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)用NMPF-6(100μg)處理，每周三次共兩周。每組10只小鼠。在13天的期間內(nèi)測(cè)定體重降低情況(圖66)，存活力(圖67)，關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度(圖68)及關(guān)節(jié)炎發(fā)生頻率(圖69)。
圖70示出在LPS或PHA刺激的PMBC中被調(diào)節(jié)的基因，所述PMBC進(jìn)一步用本發(fā)明的基因調(diào)節(jié)肽處理。圖70A-70E涉及LPS刺激的細(xì)胞，70F-70J涉及PHA刺激的細(xì)胞。圖70A示出對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞只用LPS處理，不額外用所述肽處理，70B示出用VVC的處理作用，70C示出用MTRV的處理作用，70D示出用MTR的處理作用，70E示出用MTRVLQGVLPALPQ的處理作用。70F示出對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中細(xì)胞只用LPS刺激，不額外用所述肽處理，70G示出用VVC的處理作用，70H示出用MTRV的處理作用，70I示出用MTR的處理作用，70J示出用MTRVLQGVLPALPQ的處理作用。分離周?chē)獑魏思?xì)胞(PBMC)，來(lái)自肝素化靜脈血的PBMC通過(guò)Ficoll Hypaque的密度梯度離心儀(Pharmacia，Uppsala，Sweden)分離。將PBMC洗滌三次并以5.0x10e6細(xì)胞/ml再懸浮于補(bǔ)加2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，1mM丙酮酸及10％熱滅活的人血清的RPMI-1640中。將2ml(10×106個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞懸浮液鋪板于6孔平板中，并用LPS(1μg/ml)，LPS和NMPF(1μg/ml)，PHA(10μg/ml)，PHA和NMPF(1μg/ml)或只用等體積的PBS處理。未處理的PBMC及用LPS或LPS與NMPF處理的PBMC培養(yǎng)1.5小時(shí)，而未處理的PBMC及用PHA或PHA與NMPF處理的PBMC培養(yǎng)3小時(shí)。在溫育后，收集所有細(xì)胞(附著及未附著的)并洗滌3次，進(jìn)一步用于微陣列實(shí)驗(yàn)中。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中測(cè)試以下NMPFNMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-70(MTRVLQGVLPALPQ)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述 細(xì)胞對(duì)環(huán)境和內(nèi)在變化均起反應(yīng)，它們通過(guò)細(xì)胞外和細(xì)胞間以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)察知。這些信號(hào)的性質(zhì)可例如是物理或化學(xué)信號(hào)。另外，血液中存在的不同類(lèi)別的分子彼此相互反應(yīng)并誘導(dǎo)一連串反應(yīng)，對(duì)其它分子具有直接作用和/或最后引起細(xì)胞應(yīng)答，例如補(bǔ)體系統(tǒng)及血液凝固蛋白。
許多基因不是通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)的，而是通過(guò)與細(xì)胞表面上特異性受體結(jié)合的分子而調(diào)節(jié)，所述細(xì)胞表面上特異性受體例如具有酶活性的受體(受體酪氨酸激酶，受體樣蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，受體絲氨酸/蘇氨酸激酶，組氨酸激酶，鳥(niǎo)苷酰基環(huán)化酶)及不具有酶活性的受體(細(xì)胞因子受體，整聯(lián)蛋白，G-蛋白偶聯(lián)受體)。細(xì)胞表面受體與其配體之間的相互作用可通過(guò)調(diào)節(jié)一或多種胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的一連串胞內(nèi)事件級(jí)聯(lián)進(jìn)行，包括所謂第二信使(二酰甘油，Ca2+，環(huán)核苷酸，肌醇(1，4，5)三磷酸，磷脂酰肌醇(3，4，5)三磷酸，磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITP))的胞內(nèi)水平的變化。這導(dǎo)致激活或抑制所謂的“效應(yīng)蛋白”。第二信使反過(guò)來(lái)引起蛋白質(zhì)中的變化，例如通過(guò)環(huán)AMP，環(huán)GMP，鈣激活的蛋白激酶，或蛋白激酶(例如AGC組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，CAMK組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，CMGC組絲氨酸/蘇氨酸激酶，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶組，或其它激酶如MEK/Ste7p)的作用使蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白激酶所致的磷酸化是信號(hào)傳播中的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，其調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞途徑如Ras/MAPK途徑，MAP激酶途徑，JAK-STAT途徑，wnt-途徑。在許多情況中，這均導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生變化(例如用于調(diào)節(jié)其它基因，細(xì)胞存活，生長(zhǎng)，分化，成熟，功能活性的基因)。
對(duì)配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合的許多應(yīng)答是細(xì)胞質(zhì)性的，而且不涉及細(xì)胞核中立即基因激活。在一些情況中，在細(xì)胞表面相互作用之后預(yù)先存在的無(wú)活性轉(zhuǎn)錄因子被激活，導(dǎo)致立即基因激活。例如，蛋白質(zhì)NF-κB，其可在幾分鐘之內(nèi)通過(guò)各種刺激激活，包括膜受體(例如模式識(shí)別受體，如與病原體相關(guān)的分子模式結(jié)合的Toll樣受體)，炎性細(xì)胞因子如TNF-α，IL-1，T細(xì)胞活化信號(hào)，生長(zhǎng)因子及應(yīng)激誘導(dǎo)因子。
我們用NMPF肽LQGV進(jìn)行的基因組實(shí)驗(yàn)示出自從細(xì)胞僅用肽處理4小時(shí)后，就顯示出對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)節(jié)非常明顯的立即作用。在這個(gè)短時(shí)間內(nèi)，在存在強(qiáng)刺激因子(PHA/IL-2刺激的T-細(xì)胞系(PM1))的情況中，LQGV負(fù)調(diào)節(jié)至少120個(gè)基因并正調(diào)節(jié)至少6個(gè)基因，表明對(duì)本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的具有深遠(yuǎn)意義的作用及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。受LQGV影響的基因包括致癌基因，轉(zhuǎn)錄因子、胞內(nèi)酶、膜受體、胞內(nèi)受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(例如激酶)的基因及一些未知分子的基因。這示出在此描述的作為合成的信號(hào)傳導(dǎo)分子(寡肽或其功能類(lèi)似物或衍生物)的一個(gè)例子的LQGV，在不同胞外和胞內(nèi)水平具有廣譜作用。另外，我們的HPLC/MS數(shù)據(jù)示出在半小時(shí)內(nèi)巨噬細(xì)胞系(RAW267.4)的細(xì)胞核中存在LQGV，還表明在DNA水平以及在胞內(nèi)水平的直接作用，這通過(guò)NF-κB實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。LQGV的最終調(diào)節(jié)作用依賴(lài)于例如細(xì)胞類(lèi)型，細(xì)胞的分化和成熟狀態(tài)，其它調(diào)節(jié)分子的功能狀態(tài)和存在狀況。這通過(guò)休克實(shí)驗(yàn)而證實(shí)，其中不同的NMPF肽對(duì)疾病具有相似或不同作用。用DC，受精雞卵和CAO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲得相同結(jié)果；NMPF作用依賴(lài)于共刺激的類(lèi)型(GM-CSF單獨(dú)或與LPS或VEGF組合)及處理時(shí)間。由此，NMPF具有在不同水平調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)答的能力。
本發(fā)明借助于以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例 材料和方法 肽合成 本文中提及的肽如LQG，AQG，LQGV，AQGV，LQGA，VLPALP，ALPALP，VAPALP，ALPALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，LAGV，VLAALP，VLPALA，VLPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，GVLPALP，CNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，LQGVLPALPQVVC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，LPGC，MTRV，MTR和VVC通過(guò)固相合成制備(Merrifield，1963)，使用基于芴甲氧羰基(Fmoc)/叔丁基的方法(Atherton，1985)，用2-氯三苯甲基氯化物樹(shù)脂(Barlos，1991)作為固體支持物。谷氨酰胺的側(cè)鏈用三苯甲基官能團(tuán)保護(hù)。手工合成所述肽。每個(gè)偶聯(lián)均由以下步驟組成(i)通過(guò)于二甲基甲酰胺(DMF)中的哌啶除去α-氨基Fmoc-保護(hù)，(ii)將Fmoc氨基酸(3eq)與在DMF/N-甲基甲酰胺(NMP)中的二異丙基碳二亞胺(DIC)/1-羥基苯并三唑(HOBt)偶聯(lián)，及(iii)將剩余的氨基官能團(tuán)用在DMF/NMP中的乙酐/二異丙基乙胺(DIEA)加帽。在完成合成的基礎(chǔ)上，將所述肽樹(shù)脂用三氟乙酸(TFA)/H2O/三異丙基硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5的混合物處理。30分鐘后，加入TIS直至脫色。將該溶液真空蒸發(fā)并用二乙醚沉淀所述肽。將粗制的肽溶解于水中(50-100mg/ml)，通過(guò)反相高效液相層析(RP-HPLC)純化。HPLC條件是層析柱-VydacTP21810C18(10×250mm)；洗脫系統(tǒng)-于水中的0.1％TFA梯度系統(tǒng)(A)及于乙腈(ACN)中的0.1％TFA v/v梯度系統(tǒng)(B)；流速-6ml/分鐘；在190-370nm檢測(cè)吸光度。使用不同的洗脫系統(tǒng)。例如針對(duì)肽LQG和LQGV10分鐘100％A，隨后50分鐘內(nèi)線(xiàn)性梯度0-10％B。例如針對(duì)肽VLPALP和VLPALPQ5分鐘5％，B隨后以1％B/分鐘線(xiàn)性梯度進(jìn)行。將收集的級(jí)分通過(guò)旋轉(zhuǎn)膜蒸發(fā)在40℃減壓濃縮為大約5ml。剩余的TFA通過(guò)具有乙酸鹽形式陰離子交換樹(shù)脂(Merck II)的柱洗脫兩次而用乙酸鹽交換。將洗脫物濃縮并在28小時(shí)內(nèi)凍干。隨后將其在PBS中溶解以制備所述肽。
轉(zhuǎn)錄因子實(shí)驗(yàn) 巨噬細(xì)胞系將得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞在37℃在5％CO2中使用含有10％FBS和抗生素(100U/ml的青霉素，及100μg/ml鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)。將細(xì)胞(1×106/ml)與2ml肽(10μg/ml)溫育。8小時(shí)后，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞并制備核提取物。
核提取物核提取物和EMSA根據(jù)Schreiber等所述方法(Schriberet al.1989，Nucleic Acids Research 17)制備。簡(jiǎn)而言之，肽刺激或未刺激的巨噬細(xì)胞的核提取物通過(guò)細(xì)胞裂解及隨后的核裂解制備。然后將細(xì)胞懸浮于400μl緩沖液(10mM HEPES(pH 7.9)，10mM KCl，0.1mM KCL，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF及蛋白酶抑制劑)中，強(qiáng)力渦旋15秒，在4℃放置15分鐘，并以15，000rpm離心2分鐘。將沉淀的核再懸浮于在冰上的緩沖液(20mMHEPES(pH 7.9)，10％甘油，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑)中30分鐘，然后將裂解物在15，000rpm離心2分鐘。含有溶解的核蛋白的上清貯存在-70℃直至用于電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)。
EMSA通過(guò)將從對(duì)照組(RAW 264.7)和肽處理的RAW 264.7細(xì)胞中制備的核提取物與代表NF-κB結(jié)合序列的合成的32P標(biāo)記雙鏈探針(5′AGCTCAGAGGGGGACTTTCCGAGAG 3′)溫育進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析。簡(jiǎn)而言之，將探針用T4多核苷酸激酶根據(jù)廠(chǎng)商指導(dǎo)進(jìn)行末端標(biāo)記(Promega，Madison，WI)。將退火的探針如下與核提取物溫育在EMSA中，結(jié)合反應(yīng)混合物(20μl)含有在結(jié)合緩沖液中的0.25μg聚(dI-dC)(Amersham Pharmacia Biotech)及20000rpm的32P標(biāo)記的DNA探針，所述結(jié)合緩沖液由5mM EDTA，20％Ficoll，5mM DTT，300mM KCl和50mM HEPES組成。所述結(jié)合反應(yīng)通過(guò)加入細(xì)胞提取物(圖10)起始，在室溫持續(xù)30分鐘。通過(guò)在6％聚丙烯酰胺凝膠中電泳將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物與游離寡核苷酸區(qū)別開(kāi)。將所述凝膠干燥并曝光于X光膠片。
Apo E實(shí)驗(yàn) 阿樸脂蛋白E(apo E)的缺乏與一系列病癥相關(guān)，包括異常脂蛋白血癥，動(dòng)脈硬化，Alzheimer′s病，體重增加及壽命變短。多態(tài)性apoE基因的不同等位基因的遺傳是造成大多數(shù)人群中10％的血漿膽固醇變異的原因。對(duì)于一個(gè)變體apoE2是純合的個(gè)體，如果存在一種額外的遺傳或環(huán)境因子，可產(chǎn)生III型異常β脂蛋白血癥。apoE的一些更罕見(jiàn)的等位基因在雜合個(gè)體中產(chǎn)生這一病癥的顯性表達(dá)。ApoE是LDL受體的配體，其對(duì)血漿膽固醇的作用通過(guò)LDL受體與攜帶變體apoE蛋白的脂蛋白的親和性差異而介導(dǎo)。調(diào)節(jié)apoE基因轉(zhuǎn)錄的因子已經(jīng)通過(guò)在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)基因構(gòu)建體而深入研究，其涉及結(jié)合5’啟動(dòng)子區(qū)域，第一個(gè)內(nèi)含子及與結(jié)構(gòu)基因相隔幾千個(gè)堿基的3’區(qū)域中的元件的各種因子間的復(fù)雜相互作用。apoE基因的缺失與脂蛋白代謝(血漿總膽固醇)、HDL膽固醇、HDL/TC及HDL/LDL比率、apo B-耗竭的血漿中的酯化率、血漿甘油三酯、肝HMG-CoA還原酶活性、肝膽固醇含量的變化，血漿高半胱氨酸(高胱氨酸)和葡萄糖水平降低，及嚴(yán)重動(dòng)脈硬化和皮膚黃瘤癥相關(guān)。
結(jié)果 NF-κB實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。從LPS和肽處理的RAW264.7細(xì)胞中或者從LPS處理的RAW264.7細(xì)胞中制備核蛋白提取物。為確定所述肽是否調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，對(duì)這些提取物進(jìn)行EMSA。圖33示出用LPS或者LPS與肽組合處理4小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞的核提取物中存在的NF-κB量。在此我們觀(guān)察到一些肽確實(shí)能調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)位，因?yàn)獒槍?duì)NF-κB的標(biāo)記寡核苷酸量降低。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，示出調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)位的肽是(NMPF-1)VLPALPQVVC，(NMPF-2)LQGVLPALPQ，(NMPF-3)LQG，(NMPF-4)LQGV，(NMPF-5)GVLPALPQ，(NMPF-6)VLPALP，(NMPF-7)VLPALPQ，(NMPF-8)GVLPALP，(NMPF-9)VVC，(NMPF-11)MTRV，(NMPF-12)MTR。
在巨噬細(xì)胞中NFκB分析 小鼠巨噬細(xì)胞系將RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞在含有10％或2％FBS，青霉素，鏈霉素和谷氨酰胺的DMEM中，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞種植在12孔平板(3×106個(gè)細(xì)胞/ml)中2小時(shí)，總體積為1ml，然后用LPS(E.coli 026B6；Difco Laboratories，Detroit，MI，USA)和/或NMPF(1μg/ml)刺激。溫育30分鐘后，將平板離心及收集細(xì)胞以提取核提取物。
核提取物核提取物和EMSA根據(jù)Schreiber等所述方法制備(Schriber et al.1989，Nucleic Acids Research 17)。將細(xì)胞收集在試管中并以2000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))在4℃離心5分鐘(Universal 30RF，HettichZentrifuges)。將沉淀用冰凍的Tris緩沖鹽水(TBS pH 7.4)洗滌，再懸浮于400μl低滲緩沖液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KC1，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(Complete Mini，Roche))中，在冰上放置15分鐘。加入25μl 10％NP-40并將樣品離心(2分鐘，4000rpm，4℃)。收集上清(細(xì)胞質(zhì)級(jí)分)并貯存于-70℃。將含有細(xì)胞核的沉淀用50μl緩沖液A洗滌并再懸浮于50μl緩沖液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物及10％甘油)。將樣品在4℃搖動(dòng)至少60分鐘。最后，將樣品離心并將上清(核級(jí)分)貯存于-70℃。
用Bradford試劑(Sigma)確定提取物中最終蛋白質(zhì)濃度。
EMSA為進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)分析，合成代表NF-KB結(jié)合序列的一種寡核苷酸(5′-AGC TCA GAG GGG GAC TTT CCG AGA G-3′)。將100pmol有義和反義寡聚物退火并使用T4多核苷酸激酶根據(jù)廠(chǎng)商指導(dǎo)用γ-32p-dATP標(biāo)記(Promega，Madison，WI)。將核提取物(5-7.5μg)在結(jié)合反應(yīng)混合物(20μl)中與75000cpm探針在室溫溫育30分鐘，所述結(jié)合反應(yīng)混合物含有0.5μg聚dI-dC(Amersham PharmaciaBiotech)及結(jié)合緩沖液BSB(25mM MgCl2，5mM CaCl2，5mM DTT和20％Ficoll)。將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物通過(guò)在4-6％聚丙烯酰胺凝膠中電泳(150V，2-4小時(shí))而從游離寡核苷酸中分離。然后將該凝膠干燥并曝光于X線(xiàn)膠片。
結(jié)果 轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，核蛋白質(zhì)提取物從LPS(1mg/ml)，NMPF(1mg/ml)或者LPS與NMPF組合處理的RAW264.7細(xì)胞中制備。為確定NMPF肽是否調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，對(duì)這些提取物進(jìn)行EMSA。圖54和55示出處理的RAW264.7細(xì)胞中存在的NF-κB量。圖54示出NMPF肽能調(diào)節(jié)NF-κB的基礎(chǔ)水平以及LPS誘導(dǎo)的NF-κB水平。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，示出抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位的NMPF肽是NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)，NMPF-4(LQGV)，NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-6(VLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-12(MTR)及NMPF-14(環(huán)LQGVLPALPQVVC)。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的NF-κB轉(zhuǎn)位的NMPF肽是NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)和NMPF-11(MTRV)。細(xì)胞核中NF-κB 基礎(chǔ)水平由NMPF-1(VLPALPQVVC)，NMPF-2(LQGVLPALPQ)，NMPF-3(LQG)和NMPF-4(LQGV)降低，而細(xì)胞核中NF-κB基礎(chǔ)水平由NMPF-5(GVLPALPQ)，NMPF-7(VLPALPQ)，NMPF-8(GVLPALP)，NMPF-9(VVC)，NMPF-11(MTRV)，NMPF-12(MTR)和NMPF-13(LQGVLPALPQVVC)提高(圖55)。在其它實(shí)驗(yàn)中，NMPF-10(QVVC)還示出調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中(數(shù)據(jù)未示出)。
NMPF對(duì)DC的作用(ex vivo/體外) NOD和C57BL/6小鼠這些研究中使用的小鼠全部在鹿特丹的Erasmus醫(yī)學(xué)中心(C57BL/6)或荷蘭Balkbrug的Lucky Farm Company(NOD)的無(wú)病原體設(shè)備中飼養(yǎng)。所有小鼠均自由攝食和飲水。所述實(shí)驗(yàn)由荷蘭鹿特丹的Erasmus醫(yī)學(xué)中心的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。
體內(nèi)處理在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用13-14周齡的雌性NOD小鼠。隨機(jī)分成10組，每組11只(NMPF-3，4，5和6)或13只(NMPF-7，4+5，4+6，5+6和4+5+6)小鼠，用PBS(PBS組)或NMPF(溶解于PBS中)處理。每種NMPF的注射量為100μg，總體積為100μl。在處理5周后，將小鼠處死并分離脾以純化DC。
分離脾DC在無(wú)菌條件下取出PBS和NMPF處理的小鼠的脾。然后將脾用膠原酶D(Gibco BRL，life technologies)和DNase 1在RPMI-1640中37℃消化45分鐘，產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。通過(guò)與Gey′s培養(yǎng)基在正在融化的冰上溫育5分鐘取出紅細(xì)胞。將細(xì)胞洗滌并根據(jù)廠(chǎng)商指導(dǎo)用N418磁珠(Miltenyi Biotec，Bisley，U.K.)和AutoMACS(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)富集表達(dá)CD 11c的細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確定所述富集的細(xì)胞群由80-90％CD11c+和MHC II+細(xì)胞組成。集合每組獲得的DC并在12孔平板(Nalge NuncInternational)中培養(yǎng)2小時(shí)(3×106個(gè)細(xì)胞/ml)，然后在體外用1μg/mlLPS(Sigma，E.Coli 026.B6)刺激30分鐘。將細(xì)胞根據(jù)在核提取物段落中所述方案裂解并使用TransFactorTM試劑盒(Clontech，BD)分析NFκB(p65)。
分離骨髓衍生的DC針對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，使用未處理的雌性NOD(13-14周齡)和C57BL/6(13-14周齡)小鼠。取出股骨和脛骨，使用具有0.45mm針頭的注射器用MI-1640沖洗骨髓。骨髓懸浮液內(nèi)的聚集部分通過(guò)強(qiáng)烈抽吸而分離，通過(guò)70微米細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。懸浮液中的紅細(xì)胞用Gey′s培養(yǎng)基裂解并洗滌。每只小鼠獲得大約4-6×107個(gè)骨髓細(xì)胞。
在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為在R10培養(yǎng)基中2×105個(gè)細(xì)胞/ml，R10培養(yǎng)基為無(wú)HEPES的RPMI-1640培養(yǎng)基，補(bǔ)加了100IU/ml青霉素，50mg/ml鏈霉素，1mM丙酮酸，50uM 2-ME，10％v/v熱滅活的胎牛血清(BioWhittaker，Europe)及20ng/ml重組小鼠粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF；BioSource International，Inc.，USA)。然后將10ml細(xì)胞種植于100mm無(wú)附著物的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)平皿(Falcon)中。每種條件使用6個(gè)培養(yǎng)平皿。將培養(yǎng)物置于37℃5％CO2溫育器中。在開(kāi)始培養(yǎng)后，每3天在每個(gè)平皿中加入10ml新鮮R10培養(yǎng)基。在培養(yǎng)開(kāi)始后11天，收集未附著的DC細(xì)胞，用Coulter Counter(Coulter)計(jì)數(shù)。
集合從每只小鼠獲得的DC，在12孔平板(Nalge Nunc International)中培養(yǎng)2小時(shí)(3×106個(gè)細(xì)胞/ml)，然后在體外用5ng/ml LPS(Sigma，E.Coli 026.B6)或者LPS和1μg/ml NMPF(NMPF-1，2，5或6)刺激30分鐘。根據(jù)在核提取物段落所述方案裂解細(xì)胞，使用TransFactorTM試劑盒(Clontech，BD)針對(duì)NFκB(p65)進(jìn)行分析。
核提取物核提取物和EMSA根據(jù)Schreiber等所述方法制備(Schreiber et al.1989，Nucleic Acids Research 17)。將細(xì)胞收集在試管中，在4℃以2000rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))離心5分鐘(Universal 30RF，Hettich Zentrifuges)。用冰冷的Tris緩沖鹽水(TBS pH 7.4)洗滌沉淀并再懸浮于400μl低滲緩沖液A(10mM HEPES pH 7.9，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物(Complete Mini，Roche))，在冰上放置15分鐘。加入25μl10％NP-40并將樣品離心(2分鐘，4000rpm，4℃)。收集上清(細(xì)胞質(zhì)級(jí)分)并貯存于-70℃。將含有細(xì)胞核的沉淀用50μl緩沖液A洗滌并再懸浮于50μl緩沖液C(20mM HEPES pH 7.9，400mM NaCl，1mMEDTA，1mM EGTA，1mM DTT，0.5mM PMSF和蛋白酶抑制劑混合物及10％甘油)。將樣品在4℃搖動(dòng)至少60分鐘。最后，將樣品離心并將上清(核級(jí)分)貯存于-70℃ 用Bradford試劑(Sigma)確定提取物中最終蛋白質(zhì)濃度。
轉(zhuǎn)錄因子分析使用基于ELISA的TransFactorTM(Clontech，BD)試劑盒根據(jù)廠(chǎng)商指導(dǎo)分析NFκB亞基p65。
結(jié)果 在處理的NOD小鼠的脾DC中的NFκB 本領(lǐng)域熟知高血糖癥與細(xì)胞核中的較高水平的NFκB相關(guān)。用NMPF-3，4，5，4+5，4+6，5+6和4+5+6處理的NOD小鼠與PBS處理的NOD小鼠相比示出糖尿病的發(fā)生率降低，并具有較低血糖水平(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)分析這些小鼠脾DC的核提取物中的NFκB時(shí)，NMPF處理的小鼠DC示出較低水平的NFκB(圖56)。
NOD和C57bl6小鼠中骨髓衍生的DC中的NFκB 近來(lái)，Weaver et alJ.Immunol 2001及其它人已經(jīng)描述了NOD小鼠和I型糖尿病患者的DC中，由于活性過(guò)強(qiáng)的IKK所致NFκB調(diào)節(jié)中的缺陷。他們示出衍生自NOD小鼠的DC與衍生自C57BL/6和BALB/c小鼠的DC對(duì)各種形式的NFκB刺激更敏感。這增強(qiáng)了NODDC分泌IL-12的能力，在致糖尿病的應(yīng)答期間促成病原性Th1(Tc1)細(xì)胞發(fā)育。Hegazy DM et al.Genes Immun 2001示出NFκB基因的多樣性及對(duì)I型糖尿病的敏感性具有A10等位基因與具有A14等位基因的個(gè)體更可能發(fā)展為糖尿病。因此，我們測(cè)試了NMPF對(duì)NOD和C57BL/6小鼠DC中NFκB的作用。我們從這些小鼠中分離了骨髓(BM)并在存在GM-CSF的情況下培養(yǎng)，以產(chǎn)生BM衍生的DC。對(duì)附著和未附著的細(xì)胞均加以收集。獲得的細(xì)胞群首先使用CD11c，CD 11b，MHC II(I-AK)和MHC I(H-2BD)抗體通過(guò)FACS進(jìn)行鑒定(數(shù)據(jù)未示出)。在NOD和C57BL/6小鼠中，95％的細(xì)胞是CD11c+，90％是CD11b+。然而在NOD小鼠中，86％是CD11c+/CD11b+，而在C57BL/6小鼠中僅67％是CD11c+/CD11b+。這提示NOD和C57BL/6小鼠中DC的成熟和分化水平不相同。與C57BL6小鼠相比，我們觀(guān)測(cè)到顯著較低的DC產(chǎn)量(p＝0.0001)。之后，將DC用LPS(5ng/ml)和NMPF 1，2，5或6刺激30分鐘，然后確定NFκB活性。
當(dāng)用5ng/ml LPS刺激時(shí)，與未處理的DC相比，C57BL/6DC不示出NFκB活化增加(圖57)。然而，NOD DCs在用LPS刺激后示出NFκB活化增加2倍。NMPF對(duì)NFκB的作用在C57BL/6DC中檢測(cè)不到，因?yàn)橛肔PS刺激不引起NFκB活化。然而，在NOD DC中，NMPF能抑制(NMPF1，2，5和6)LPS誘導(dǎo)的NFκB活化(圖57)。
這些結(jié)果示出在NOD DC中與在C57BL/6DC中相比，NFκB過(guò)度應(yīng)答，而且NMPF在NOD DC中抑制過(guò)度活性的NFκB活化。
肽的核位置實(shí)驗(yàn) 使用反向高效液相層析(RP-HPLC)方法證實(shí)核提取物中存在合成的寡肽。使用裝備Vydac單體C18柱(column218MS54，LC/MS C18reversed phase，300A，50m，4.6mm ID×250mm L)的Shimadzu HPLC系統(tǒng)；洗脫系統(tǒng)是于水中的0.01％TFA和5％乙腈(v/v)(CAN)梯度系統(tǒng)(A)，及于80％乙腈(ACN)中的0.01％TFA(v/v)梯度系統(tǒng)(B)；流速為0.5ml/min，在190-370nm測(cè)定吸光度。
梯度時(shí)間程序如下 時(shí)間(min) 緩沖液B濃度 0.010 5.0 0 30.080 40.0100 60.0100 65.00 70.00 肽LQGV的洗脫時(shí)間通過(guò)在一單獨(dú)的層析中注射2μg該肽而確定。在LCQ Deca XP(Thermo Finnigan)上對(duì)可能含有NMPF-4(LQGV)的級(jí)分進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析(洗脫時(shí)間通過(guò)在同一或單獨(dú)的層析中注射所述肽而確定)。
結(jié)果 肽的核位置實(shí)驗(yàn) 對(duì)EMSA實(shí)驗(yàn)中使用的核蛋白質(zhì)提取物也通過(guò)HPLC和MS檢測(cè)LQGV的存在情況。圖34示出HPLC層析(波長(zhǎng)206)，其中疊加了從LPS及LPS與NMPF-4(LQGV)組合刺激的RAW264.7細(xì)胞的核蛋白質(zhì)提取物中獲得的數(shù)據(jù)圖。這個(gè)圖還示出寡肽加上LPS處理的細(xì)胞的核提取物與LPS處理的細(xì)胞的核提取物相比各種分子信號(hào)的存在與否。由于LQGV的HPLC圖示出所述肽在大約12分鐘洗脫(數(shù)據(jù)未示出)，因此收集相當(dāng)于10-15分鐘區(qū)間的級(jí)分并在MS中分析這種肽的存在情況。
所述肽的分子量為大約416道爾頓。除了416質(zhì)量之外，圖35還示出了一些其它分子量。這可以通過(guò)肽濃度高而誘導(dǎo)了二聚體和鈉加成物的形成而解釋(m/z 416-[M+H]+，438-[M+Na]+，831-[2M+H]+，853-[2M+Na]+，1245-[3M+H]+，1257-[3M+Na]+)。圖36示出得自L(fǎng)PS刺激的細(xì)胞的核提取物的10-15分鐘級(jí)分的MS結(jié)果。這些結(jié)果示出沒(méi)有416道爾頓質(zhì)量，而圖37示出存在416道爾頓質(zhì)量，MSn數(shù)據(jù)(圖37)和MS序列證實(shí)得自L(fǎng)QGV+LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中的核蛋白質(zhì)提取物中存在LQGV肽。
內(nèi)毒素休克模型(膿毒病(sepsis)) 膿毒病為制備內(nèi)毒素模型，將BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射8-9mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。對(duì)照組(PBS)僅用PBS經(jīng)腹膜內(nèi)處理。為測(cè)試不同來(lái)源(合成的，商業(yè)hCG制品[c-hCG])的NMPF的作用，在LPS注射2小時(shí)后，用300-700IU不同的hCG制品(PG23；Pregnyl batch no.235863，PG25；Pregnyl batch no.255957)及合成的肽(5mg/kg)處理BALB/c小鼠。在其它實(shí)驗(yàn)中，將BALB/c小鼠腹膜內(nèi)注射10mg/kg或11mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。在LPS處理2和24小時(shí)后，將小鼠用NMPF肽處理。
半定量疾病測(cè)定使用以下測(cè)定方案記錄小鼠疾病的嚴(yán)重程度 1皮毛有滲出物，但與正常小鼠相比未檢出行為差異。
2皮毛有滲出物，蜷縮反射，對(duì)刺激(如敲擊籠子)有應(yīng)答，在手握期間如健康小鼠一樣主動(dòng)。
3對(duì)敲擊籠子應(yīng)答減慢，當(dāng)手握時(shí)處于被動(dòng)或溫順狀態(tài)，但單獨(dú)在新環(huán)境中仍好奇。
4缺乏好奇，對(duì)刺激很少應(yīng)答或不應(yīng)答，經(jīng)常不動(dòng)。
5呼吸困難，在翻滾至背位后無(wú)力或緩慢翻滾右側(cè)位(垂死)。
6處死。
結(jié)果 內(nèi)毒素休克模型(膿毒病) 膿毒病實(shí)驗(yàn)為確定合成肽(NMPF)在高劑量LPS休克模型中的作用，將BALB/c小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射不同劑量的LPS，并在5天的時(shí)間里每天評(píng)估存活者。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中(LPS內(nèi)毒素模型)，將BALB/c小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射8-9mg/kg LPS(E.coli 026B6；Difco Lab.，Detroit，MI，USA)。對(duì)照組(PBS)僅用PBS經(jīng)腹膜內(nèi)注射處理。在注射LPS 2小時(shí)后，用300-700IU不同hCG制品(PG23；Pregnyl batch no.235863，PG25；Pregnyl batch no.255957)或用肽(5mg/kg)處理BALB/c小鼠。
這些實(shí)驗(yàn)示出(表1)NMPF肽4，6，66和PG23完全抑制休克(所有小鼠在前24小時(shí)內(nèi)疾病分值均不高于2；不久之后完全康復(fù)，疾病分值為0)，而肽2，3和7加速休克(所有小鼠在前24小時(shí)內(nèi)疾病分值為5，大多數(shù)死亡，而用LPS+PBS處理的對(duì)照小鼠在前24小時(shí)內(nèi)疾病分值為3-4，大多數(shù)在具有疾病分值5之后48小時(shí)死亡(在72小時(shí)存活率為17％)。另外，肽1，5，8，9，11，12，13，14和64在不同實(shí)驗(yàn)中示出在功效以及活性類(lèi)型(抑制vs促進(jìn))方面有可變性。這種可變性可能歸因于各種肽的分解速度，以及各種肽及其分解產(chǎn)物在體內(nèi)所具有的不同作用。另外，這些實(shí)驗(yàn)還示出在c-hCG制品中抗休克活性的可變性，其可能歸因于抗休克和促進(jìn)休克的NMPF中存在的變化。疾病跡象在所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中均可見(jiàn)，但動(dòng)力學(xué)和疾病的嚴(yán)重程度明顯不同。這些數(shù)據(jù)是至少10個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。
在表2中可見(jiàn)在膿毒性休克實(shí)驗(yàn)中，肽LQG，LQGV，VLPALP，VLPALPQ中的ALA置換作用(PEPSCAN)。推斷甚至一個(gè)氨基酸由中性氨基酸置換即可引起不同的活性。因此，這些肽中基因組差異以及多樣性可非常精確調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。這些肽的衍生物也可引起更好的活性有效性，所述衍生物例如但非限于通過(guò)加入在合成期間或之后差別修飾的經(jīng)典或非經(jīng)典氨基酸或衍生物而產(chǎn)生，所述修飾例如芐基化，酰胺化，糖基化，蛋白酶解，與抗體分子或其它細(xì)胞配體連接等。
為確定用NMPF處理的BALB/c小鼠在疾病的不同階段是否抑制膿毒性休克，在用高劑量LPS(10mg/kg)誘導(dǎo)膿毒性休克后2和24小時(shí)，經(jīng)腹膜內(nèi)注射合成的肽(NMPF)。
如表3和4所示，在誘導(dǎo)休克后用PBS處理的對(duì)照小鼠在14和24小時(shí)達(dá)到疾病分值5，并在第二次注射PBS之后仍保持如此狀態(tài)。對(duì)照組在48小時(shí)的存活率為0％。與對(duì)照組相反，用NMPF 9，11，12，43，46，50和60處理的小鼠在誘導(dǎo)膿毒性休克后24小時(shí)達(dá)到最大疾病分值2-3，并在第二次注射N(xiāo)MPF之后在48小時(shí)進(jìn)一步達(dá)到最大疾病分值1-2。另外，用NMPF 5，7，8，45，53和58處理的小鼠達(dá)到疾病分值5，在第二次注射N(xiāo)MPF之后，所有小鼠均恢復(fù)為疾病分值1-2，在NMPF組中存活率為100％。用NMPF 3處理的小鼠達(dá)到疾病分值3-4，第二次注射N(xiāo)MPF后挽救了這些小鼠。這些實(shí)驗(yàn)示出NMPF肽在疾病不同階段具有抗休克活性，而且NMPF甚至在已經(jīng)出現(xiàn)其它不可逆轉(zhuǎn)損害時(shí)的疾病階段仍具有抗休克活性。這表明NMPF在不同細(xì)胞水平均有作用，而且還具有修復(fù)和再生能力。
樹(shù)突細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 小鼠在這項(xiàng)研究中使用的小鼠品系是BALB/c(Harlan，Bicester，Oxon，GB)。在實(shí)驗(yàn)中使用的所有小鼠均為雌性8-12周齡的小鼠。
將小鼠在特殊的無(wú)病原體的設(shè)備中飼養(yǎng)。荷蘭鹿特丹Erasmus大學(xué)的動(dòng)物使用委員會(huì)批準(zhǔn)了所有研究。
體內(nèi)處理為每組至少6只小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射LPS(10mg/kg；Sigma)。在LPS誘導(dǎo)2和24小時(shí)后，將小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射100μl的NMPF(5mg/kg)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在這個(gè)模型中LPS誘導(dǎo)的休克在48小時(shí)有90％以上死亡率。
骨髓細(xì)胞培養(yǎng)從處理的小鼠中分離骨髓細(xì)胞并如下培養(yǎng)。通過(guò)CO2窒息殺死BALB/c小鼠。在無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨并剝離肌和肌腱。將骨置于R10培養(yǎng)基(RPMI 1640，補(bǔ)加50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，0.2M丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺，50μM 2-巰基乙醇和10％胎牛血清(Bio Whittaker，Europe))中。
然后將骨通過(guò)使用無(wú)菌棉紙更徹底清潔，移至具有2ml R10培養(yǎng)基的冰冷研缽中。將骨用研缽粉碎以從骨中獲得細(xì)胞。將細(xì)胞通過(guò)無(wú)菌100μM濾膜(Beckton Dickinson Labware)過(guò)濾并收集在50ml試管中(FALCON)。重復(fù)這個(gè)步驟直至骨部分呈現(xiàn)透明狀態(tài)。
將分離的細(xì)胞再懸浮于10ml的RIO中，加入30ml的Geys培養(yǎng)基。將細(xì)胞懸浮液在冰上保持30分鐘，以裂解紅細(xì)胞。
之后，將細(xì)胞在R10培養(yǎng)基中洗滌兩次。在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為于R10培養(yǎng)基中2×105個(gè)細(xì)胞/ml，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加20ng/ml重組小鼠粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF；BioSourceInternational，Inc.，USA)，將細(xì)胞種植于100mm無(wú)附著物的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)平皿(Falcon)中。針對(duì)每種條件，使用6個(gè)培養(yǎng)平皿并進(jìn)一步分析，集合細(xì)胞并如前述分析。將培養(yǎng)物置于37℃，5％CO2-溫箱中。在開(kāi)始培養(yǎng)后每3天在每個(gè)平皿中加入一次10ml新鮮R10培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中補(bǔ)加了20ng/ml的rmGM-CSF。
在開(kāi)始培養(yǎng)后9天，收集未附著的細(xì)胞并用Coulter Counter(Coulter)計(jì)數(shù)。
或者，如上所述從未處理的小鼠中分離BM細(xì)胞及培養(yǎng)，并在體外用如下條件處理在培養(yǎng)開(kāi)始后第0天或第6天加入NMPF 4，NMPF46，NMPF 7，NMPF 60(20μg/ml)?；蛘咴诘?天加入有或無(wú)NMPF的LPS(1pg/ml)。
免疫熒光染色將細(xì)胞(2×105)用FACS緩沖液(具有1％BSA和0.02％疊氮化鈉的PBS)洗滌，移至一個(gè)圓底96孔平板(NUNC)中。用于染色的抗體是MHC-II(I-A/I-E)PE和CD11c/CD18FITC(PharMingen/Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，US)。
將細(xì)胞再懸浮于200μl FACS緩沖液中，其含有濃度為2.5ng/μl抗體的這兩種抗體。然后將細(xì)胞在4℃溫育。之后，將細(xì)胞洗滌3次并最后再懸浮于200μl FACS緩沖液中，在FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)中進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)量分析。所有FACS數(shù)據(jù)均使用CellQuest軟件(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)進(jìn)行分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析高于20％的差異認(rèn)為是顯著的。
結(jié)果 樹(shù)突細(xì)胞實(shí)驗(yàn) ex vivo骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量為確定LPS和NMPF處理對(duì)得自骨髓與rmGM-CSF的9天培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量的體內(nèi)作用，如上所述將細(xì)胞從處理的小鼠的BM中分離并培養(yǎng)，收獲并計(jì)數(shù)。如圖1和2所述，LPS(10mg/kg)處理的小鼠的骨髓培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量與PBS處理的小鼠相比明顯降低。在LPS誘導(dǎo)休克之后，用NMPF 4，NMPF7，NMPF 46和NMPF 60處理的小鼠與在存在rmGM-CSF時(shí)用LPS處理的小鼠相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯提高。另外，得自NMPF46處理的小鼠的BM培養(yǎng)物甚至與PBS組相比明顯提高細(xì)胞產(chǎn)量。
體內(nèi)處理的骨髓衍生的DC的免疫熒光染色在存在rmGM-CSF情況下培養(yǎng)BM細(xì)胞使針對(duì)CD11c和MHC-II是陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)增加。針對(duì)這些細(xì)胞膜標(biāo)記是陽(yáng)性的細(xì)胞是骨髓衍生的樹(shù)突細(xì)胞(DC)。DC是潛在的抗原呈遞細(xì)胞(APC)，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。為確定骨髓產(chǎn)生的DC的成熟狀態(tài)，將細(xì)胞用CD11c和MHC-II染色。
如圖3所示，與PBS組相比，LPS處理的小鼠的CD11c陽(yáng)性細(xì)胞上MHC-II分子的表達(dá)明顯降低。MHC-II表達(dá)中的這種降低通過(guò)在體內(nèi)用NMPF 4和NMPF 46處理進(jìn)一步加強(qiáng)。然而，用NMPF 7和NMPF 60處理甚至與PBS組相比仍明顯提高M(jìn)HC-II分子表達(dá)。
體外骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量為確定LPS和NMPF在體外對(duì)骨髓細(xì)胞的9天培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量的作用，從未處理的BALB/c小鼠中分離BM細(xì)胞，并在存在rmGM-CSF的情況下培養(yǎng)。除了rmGM-CSF之外，向培養(yǎng)物中在第0天或第6天補(bǔ)加NMPF，在第6天加入或不加入LPS。
如圖4-7所示，LPS處理的BM細(xì)胞與PBS處理組相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯降低。用NMPF 4，7，46或60在第0天或第6天無(wú)LPS處理的BM細(xì)胞，示出與PBS組相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯增加。然而，用NMPF 4在第6天處理的BM細(xì)胞培養(yǎng)物示出與PBS組相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯降低，這種作用與LPS的作用相似(圖4)。另外，用NMPF 4，7，46或60在第6天與LPS組合處理的BM細(xì)胞示出與LPS組相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯增加，甚至在NMPF 7組中，細(xì)胞產(chǎn)量與PBS組相比也明顯增加。
體外處理的骨髓衍生的DC的免疫熒光染色為確定DC的成熟狀態(tài)，將CD11c陽(yáng)性細(xì)胞針對(duì)MHC-II抗體進(jìn)行染色。圖7-11示出LPS對(duì)MHC-II表達(dá)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比具有相反作用，即LPS體外處理組與PBS組相比MHC-II表達(dá)明顯提高。NMPF 4與LPS組合進(jìn)一步加強(qiáng)LPS的作用，而NMPF 7在有或無(wú)LPS(t＝6)的情況下分別與LPS和PBS處理組相比明顯抑制MHC-II表達(dá)。然而，用NMPF 46而無(wú)LPS(t＝0)處理的細(xì)胞示出CD11c陽(yáng)性細(xì)胞上MHC-II表達(dá)明顯增加。另外，在NMPF 60及有或無(wú)LPS的處理組中發(fā)現(xiàn)與LPS和PBS處理的細(xì)胞相比對(duì)MHC-II表達(dá)無(wú)明顯不同。
為確定LPS和NMPF處理對(duì)得自骨髓與rmGM-CSF的9天培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量的體內(nèi)作用，如上述從處理的小鼠中分離BM并培養(yǎng)，收獲并計(jì)數(shù)?！案街奔?xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量在NMPF 4，7，9，11，43，46，47，50，53，58，60處理組中明顯增加，甚至在NMPF 7，46和60處理組中細(xì)胞產(chǎn)量與PBS組相比也明顯增加(圖14-15)。另外，“未附著”細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)量在NMPF 4，7，9，11，46，50，53，58，60處理組中明顯增加，同樣在NMPF 46處理組中細(xì)胞產(chǎn)量與PBS組相比也明顯提高(圖12，13)。
為確定LPS和NMPF在體外對(duì)雌性NOD小鼠的骨髓細(xì)胞的9天培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量的作用，從未處理的NOD小鼠中分離BM細(xì)胞，并在存在rmGM-CSF的情況下培養(yǎng)。除了rmGM-CSF之外，培養(yǎng)物中還補(bǔ)加了NMPF。在這些實(shí)驗(yàn)中，“未附著”細(xì)胞的骨髓細(xì)胞產(chǎn)量在NMPF 1，2，3，4，5，6，7，8，9，12和13處理組中與PBS組相比明顯增加，在NMPF11處理組中觀(guān)測(cè)到無(wú)作用(圖16)。這些實(shí)驗(yàn)的“附著”骨髓細(xì)胞示出與“未附著”的細(xì)胞不同的產(chǎn)量，即在用NMPF 3和13處理的培養(yǎng)物中細(xì)胞產(chǎn)量明顯增加，而用NMPF 2和6處理的培養(yǎng)物中示出與PBS組相比細(xì)胞產(chǎn)量明顯降低(圖17)(更多的額外結(jié)果概括于表5)。
冠狀動(dòng)脈閉塞(CA0)實(shí)驗(yàn) CAO誘導(dǎo)和處理NMPF在慢性炎癥以及急性炎癥小鼠模型中具有免疫調(diào)節(jié)作用。由于一些細(xì)胞因子如TGFβ，TNFα，IL-1和ROS(活性氧)參與由長(zhǎng)期冠狀動(dòng)脈閉塞及再灌注所產(chǎn)生的不可逆轉(zhuǎn)的心肌損害，引起局部缺血和心肌梗塞，我們?cè)陔S意飼養(yǎng)的雄性Wistar大鼠(300g)中測(cè)試了這些肽的心臟保護(hù)性質(zhì)。根據(jù)由美國(guó)生理學(xué)協(xié)會(huì)委員會(huì)批準(zhǔn)的動(dòng)物關(guān)懷及使用指導(dǎo)原則以及鹿特丹Erasmus大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)而言之，將大鼠(3只)穩(wěn)定30分鐘，隨后在10分鐘內(nèi)靜脈內(nèi)注射1ml肽(0.5mg/ml)進(jìn)行處理。在完成處理后5分鐘，將大鼠進(jìn)行60分鐘冠狀動(dòng)脈閉塞(CAO)。在CAO之后5分鐘，將大鼠再次在10分鐘時(shí)間內(nèi)靜脈內(nèi)注射1ml肽(0.5mg/ml)，隨后再灌注(IP)120分鐘。實(shí)驗(yàn)及手術(shù)程序詳見(jiàn)于Cardiovascular Research37(1998)76-81中所述。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將冠狀動(dòng)脈再次閉塞并灌注10ml臺(tái)盼藍(lán)(0.4％，Sigma Chemical Co.)以將正常灌注的心肌染成深藍(lán)色，描繪了未染色的危險(xiǎn)區(qū)(AR)。然后將心臟迅速切離并從上至下切成1mm的薄片。使用顯微外科剪刀從每個(gè)薄片中去除右心室并將左心室分成AR區(qū)和剩余的左心室。然后將AR區(qū)在37℃在Nitro-Blue-Tetrazolium(Sigma Chemical Co.；1mg/ml Sorensen緩沖液，pH 7.4)中溫育10分鐘，其將活組織染成紫色，但梗塞的組織不染色。在從未梗塞區(qū)中分離梗塞區(qū)(IA)之后，將LV的不同區(qū)域干燥并單獨(dú)稱(chēng)重。梗塞大小以與AR區(qū)的百分比表示。對(duì)照大鼠用PBS處理。
結(jié)果 冠狀動(dòng)脈閉塞(CAO)實(shí)驗(yàn) 我們的CAO數(shù)據(jù)示出對(duì)照組中僅用PBS處理的15只大鼠在60分鐘CAO及隨后再灌注2小時(shí)后，梗塞面積為70±2％(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。而用肽VLPALP，LQGV，VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LAGV，LQAV和MTRV處理的大鼠梗塞面積分別為62.6％，55.6％，55.5％，67.2％，51.4％，62.6％及68.12％。在此我們觀(guān)測(cè)到某些肽(如VLPALP，LQGV，VLPALPQVVC，LAGV)對(duì)梗塞危險(xiǎn)區(qū)具有保護(hù)作用。另外，肽LQAV處理示出較小的梗塞面積，但在一些情況中，該區(qū)域時(shí)出血性梗塞。另外，NMPF-64(LPGCPRGVNPVVS)在CAO實(shí)驗(yàn)中也具有保護(hù)作用(35％)。令人注意的是用某些上述肽處理的大鼠示出血液粘稠度較低。除了免疫學(xué)作用之外，這些肽對(duì)血液凝固系統(tǒng)也許還具有直接或間接作用，因?yàn)樗鼈兣c血液凝固因子有一些相同之處(NMPF的其它結(jié)果見(jiàn)表5)。因此，在這兩個(gè)模型中，循環(huán)系統(tǒng)在所述疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
雞卵實(shí)驗(yàn) 用NMPF在體內(nèi)處理受精雞卵。將受精的雞卵(Drost LoosdrechtBV，the Netherlands)以對(duì)角線(xiàn)位置在孵化器中(Pas Reform BV，theNetherlands)在37℃和32％相對(duì)濕度下孵化。
在PBS中產(chǎn)生NMPF肽(1mg/ml)和VEGF溶液。每種條件注射至少10只雞卵。如下進(jìn)行處理孵化第0天，在蛋殼上鉆一個(gè)洞以打開(kāi)氣囊。在第一個(gè)洞右下方10mm處鉆第二個(gè)洞以進(jìn)行注射。將蛋殼上的洞用碘酒消毒。注入100μl的NMPF肽(100μg/卵)和/或VEGF(100ng/ml)。將蛋殼上的洞用膠帶(Scotch MagicTM Tape，3M)密封，并將雞卵置于孵化器中。
量化血管發(fā)生在孵化第7天，將雞卵在UV燈下觀(guān)測(cè)以檢測(cè)胚胎是否以正常方式發(fā)育，并計(jì)數(shù)死亡的胚胎。在孵化的第8天，將胚胎通過(guò)在雞卵底部打開(kāi)蛋殼從雞卵中取出。將蛋殼膜小心切開(kāi)并去除。將胚胎置于一個(gè)100mm培養(yǎng)平皿中。使用顯微鏡(Zeiss Stemi SV6，Germany)為胚胎和血管體內(nèi)照相(Nikon E990，Japan)。照1張一般觀(guān)察照片及4張血管詳細(xì)照片。只對(duì)具有存活胚胎的雞卵進(jìn)行評(píng)估。
數(shù)據(jù)分析血管發(fā)生的量化通過(guò)計(jì)數(shù)血管分枝數(shù)而實(shí)現(xiàn)。血管形成的量化通過(guò)測(cè)定血管厚度而實(shí)現(xiàn)。使用Corel Draw 7在照片中計(jì)數(shù)血管分枝數(shù)和血管厚度(4張照片/雞卵)。之后，將血管分枝數(shù)和血管厚度數(shù)值與顯微鏡的光柵(10mm2)聯(lián)系起來(lái)以用于對(duì)比。計(jì)算每種條件(10種)下血管分枝平均數(shù)和血管平均厚度并使用Student′s T檢驗(yàn)與PBS對(duì)照組對(duì)比。
結(jié)果 雞卵實(shí)驗(yàn) 為確定NMPF對(duì)血管發(fā)生和血管形成的作用，如材料和方法部分所述用NMPF或者NMPF與VEGF的組合處理受精雞卵。圖20-30示出NMPF 3，4，9和11促進(jìn)血管發(fā)生(p＜0.05)，而NMPF VEGF，7，43，44，45，46，51和56抑制血管發(fā)生(p＜0.05)。NMPF 6，7，12，45，46和66能抑制VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生。另外，NMPF 6自身未示出對(duì)血管發(fā)生的任何作用，但其抑制(p＜0.05)NMPF 3誘導(dǎo)的血管發(fā)生。
圖31-32示出NMPF1，2，3，4，6，7，8，12，50，51和52具有血管形成抑制作用(p＜0.05)，只有NMPF 44促進(jìn)(p＜0.05)血管形成。
NOD實(shí)驗(yàn) 小鼠將13-14周齡的雌性小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射PBS(6只)或NMPF肽(VLPALPQVVC，LQGV，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，MTRV，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，MTRVLQGVLPALPQVVC，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL)(5mg/kg，n＝6)進(jìn)行處理，每周3次共兩周。每4天檢測(cè)尿液葡萄糖含量(Gluketur Test；Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)。將這些研究中使用的所有小鼠均在無(wú)病原體設(shè)備中飼養(yǎng)。使其自由攝食和飲水。該實(shí)驗(yàn)由鹿特丹Erasmus大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。使用AbbottMedisense Precision血糖儀測(cè)定靜脈血葡萄糖水平而評(píng)估糖尿病。如果兩次連續(xù)測(cè)定葡萄糖水平≥11mmol/l(200mg/dl)則認(rèn)為小鼠具有糖尿病。糖尿病的發(fā)作從第一次連續(xù)讀數(shù)開(kāi)始確定日期。
在28周齡的禁食小鼠中(5只)通過(guò)腹膜內(nèi)注射(i.p.)1g/kg D-葡萄糖進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)。在0(禁食)，5，30和60分鐘從尾靜脈收集血樣并測(cè)試葡萄糖含量。
NO試驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)將得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA，USA)的RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞系，在37℃及5％CO2條件下使用含有10％胎牛血清(FCS)，50U/ml青霉素，50μg/ml鏈霉素，0.2M丙酮酸鈉，2mM谷氨酰胺和50μM 2-巰基乙醇的DMEM中培養(yǎng)(BioWhittaker，Europe)。每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。
亞硝酸鹽測(cè)定在RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清中測(cè)定亞硝酸鹽的產(chǎn)生情況。將細(xì)胞(7.5×105/ml)在48孔平板中的500μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞用LPS(10μg/ml)和/或NMPF(1pg/ml，1ng/ml，1μg/ml)刺激24小時(shí)，然后收集培養(yǎng)基。亞硝酸鹽通過(guò)向100μl培養(yǎng)基樣品中加入100μl Griess試劑(Sigma)而測(cè)定。使用微量平板讀數(shù)器測(cè)定OD540，亞硝酸鹽濃度通過(guò)與使用亞硝酸鈉在培養(yǎng)基中的標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的OD540對(duì)比而計(jì)算。
結(jié)果 NOD實(shí)驗(yàn) 為確定NMPF對(duì)NOD小鼠中疾病進(jìn)展是否有作用，測(cè)試NMPF對(duì)預(yù)先糖尿病化的13-14周齡的雌性NOD小鼠的作用。僅在處理兩周后(每隔一天注射N(xiāo)MPF(5mg/kg))，分析所有NOD小鼠17周齡的糖尿數(shù)據(jù)。在不同的NMPF組中觀(guān)測(cè)到與PBS組相比有意義的抗糖尿作用(小鼠糖尿陰性)，尤其在用肽VLPALPQVVC，VLPALP，MTRV，LPGCPRGVNPVVS和LPGC處理的NMPF組中。另外，葡萄糖耐量試驗(yàn)的損害與胰島炎正相關(guān)，但與功能性β細(xì)胞的數(shù)目負(fù)相關(guān)，這個(gè)試驗(yàn)還示出用NMPF成功處理的NOD小鼠與PBS組相比耐受葡萄糖。我們的結(jié)果示出PBS處理的NOD小鼠在23周均患有糖尿病。而用NMPF每周3次共處理兩周的NOD小鼠示出有意義的對(duì)糖尿病進(jìn)展的抑制。最強(qiáng)的抗糖尿病作用在用NMPF-1，4，5，6，7，65，66和商業(yè)hCG制品(Pregnyl，Organon，Oss，The Netherlands，batch no.235863)處理組中觀(guān)測(cè)到。這些小鼠具有低空腹血糖水平并耐受葡萄糖(數(shù)據(jù)部分示出)。然而，NMPF-71示出對(duì)糖尿病的發(fā)生率無(wú)作用，而NMPF-64和NMPF-1具有中等抗糖尿病作用。
NO實(shí)驗(yàn) NO產(chǎn)生是血管和炎癥應(yīng)答的一種重要介導(dǎo)因子。我們的結(jié)果示出LPS刺激的巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)產(chǎn)生大量NO。然而，用甚至非常低劑量(1pg/ml)的大多數(shù)NMPF肽(NMPF肽1-14，43-66和69)共刺激這些細(xì)胞均抑制NO產(chǎn)生。
結(jié)果 ApoE實(shí)驗(yàn) 本發(fā)明提供了一種方法和一種信號(hào)傳導(dǎo)分子以治療與LDL受體功能異常相關(guān)的病變，所述LDL受體如ApoE及阿樸脂蛋白家族其它成員。特別地，優(yōu)選使用包含GVLPALPQ(NMPF-5)和/或VLPALP(NMPF-6)或其功能類(lèi)似物或衍生物的一種信號(hào)傳導(dǎo)分子。ApoE缺陷小鼠實(shí)驗(yàn)組(6只/組)給予高膽固醇飲食并每隔一天腹膜內(nèi)注射PBS或NMPF。2.5周后，測(cè)定體重，如下表所示。平均體重(g) SD(g)p值 ApoE-/-PBS 31.6671.007 ApoE-/-NMPF-431.2561.4960.536 ApoE-/-NMPF-529.7431.1600.019 背景/PBS 26.7601.58210-6 ApoE-/-NMPF-629.6141.0640.004 在數(shù)據(jù)庫(kù)中分析不同的肽 分析肽的不同數(shù)據(jù)庫(kù)例如是 蛋白質(zhì)組學(xué)工具相似性檢索 BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(ExPasy，NCBI) SMART(EMBL) 蛋白質(zhì)組學(xué)工具相似性檢索 BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)(ExPasy，NCBI) SMART(EMBL) PATTINPROT(PBIL) 翻譯后修飾預(yù)測(cè) SignalP(CBS) 一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)(BIMAS) MHC I型和II型肽結(jié)合 (SYFPEITHI) 氨基酸級(jí)表現(xiàn)(疏水性，其它構(gòu)象參數(shù)等)(PROTSCALE) 一個(gè)蛋白質(zhì)片段作為螺旋輪的表現(xiàn)(HelixWheel/HelixDraw) 結(jié)果 可從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中產(chǎn)生的用于鑒別本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子方法中的相關(guān)寡肽不完全列表 pdb|1DE7|1DE7-A INTERACTION OF FACTOR XIII ACTIVATION PEPTIDE WITH ALPHA-THROMBIN LQGV，LQGVV，LQGVVP pdb|1DL6|1DL6-ASOLUTION STRUCTURE OF HUMAN TFIIB N-TERMINAL DOMAIN LDALP pdb|1QMH|1QMH-A CRYSTAL STRUCTURE OF RNA 3′-TERMINAL PHOSPHATECYCLASE，AN UBIQUITOUS ENZYME LQTV，VLPAL，LVLQTVLPAL pdb|1LYP|1LYP CAP18(RESIDUES 106-137) IQG，IQGL，LPKL，LLPKL pdb|1B9O|1B9O-A HUMAN ALPHA-LACTALBUMIN LPEL pdb|1GLU|1GLU-A GLUCOCORTICOID RECEPTOR(DNA-BINDING DOMAIN)PARP pdb|2KIN|2KIN-BKINESIN(MONOMERIC)FROM RATTUS NORVEGICUS MTRI pdb|1SMP|1SMP-I MOL_ID1；MOLECULESERRATIA METALLO PROTEINASE；CHAINA LQKL，LQKLL，PEAP，LQKLLPEAP pdb|1ES7|1ES7-B COMPLEX BETWEEN BMP-2 AND TWO BMP RECEPTOR IAECTODOMAINS LPQ，PTLP，LQPTL pdb|1BHX|1BHX-F X-RAY STRUCTURE OF THE COMPLEX OF HUMAN ALPHATHROMBIN WITH THE INHIBITOR SDZ 229-357 LQV，LQVV pdb|1VCB|1VCB-ATHE VHL-ELONGINC-ELONGINB STRUCTURE PELP pdb|1CQK|1CQK-ACRYSTAL STRUCTURE OF THE CH3 DOMAIN FROM THE MAK33 ANTIBODY PAAP，PAAPQ，PAAPQV pdb|1FCB|1FCB-A FLAVOCYTOCHROME LQG， pdb|1LDC|1LDC-A L-LACTATE DEHYDROGENASECYTOCHROME C OXIDOREDUCTASE(FLAVOCYTOCHROME B＝2＝)(E.C.1.1.2.3)MUTANT WITH TYR143 REPLACED BY PHE(Y143F)COMPLEXED WITH PYRUVATE LQG pdb|1BFB|1BFB BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR COMPLEXED WITHHEPARIN TETRAMER FRAGMENT LPAL，PA LP，PALPE pdb|1MBF|1MBF MOUSE C-MYB DNA-BINDING DOMAIN REPEAT 1 LPN pdb|1E2A|1R2A-A THE MOLECULAR BASIS FOR PROTEIN KINASE A LQG，LTELL pdb|1CKA|1CKA-B C-CRK(N-TERMINAL SH3 DOMAIN)(C-CRKSH3-N)COMPLEXEDWITH C3G PEPTIDE(PRO-PRO-PRO-ALA-LEU-PRO-PRO-LYS-LYS-ARG)PALP pdb|1RLQ|1RLQ-R C-SRC(SH3 DOMAIN)COMPLEXED WITH THE PROLINE-RICHLIGAND RLP2(RALPPLPRY)(NMR，MINIMIZED AVERAGE STRUCTURE) LPPL，PPLP pdb|1TNT|1TNT MU TRANSPOSASE(DNA-BINDING DOMAIN)(NMR，33STRUCTURES) LPG，LPGL，LPK pdb|1GJS|1GJS-A SOLUTION STRUCTURE OF THE ALBUMIN BINDING DOMAINOF STREPTOCOCCAL PROTEIN G LAAL，LAALP pdb|1GBR|1GBR-B GROWTH FACTOR RECEPTOR-BOUND PROTEIN 2(GRB2，N-TERMINAL SH3 DOMAIN)COMPLEXED WITH SOS-A PEPTIDE(NMR，29STRUCTURES) LPKL，PKLP pdb|1A78|1A78-A COMPLEX OF TOAD OVARY GALECTIN WITH THIO-DIGALACTOSE VLPSIP pdb|1ISA|1ISA-A IRON(II)SUPEROXIDE DISMUTASE(E.C.1.15.1.1) LPAL，PALP pdb|1FZV|1FZV-A THE CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN PLACENTA GROWTHFACTOR-1(PLGF-1)，AN ANGIOGENIC PROTEIN AT 2.0A RESOLUTIONPAVP，MLPAVP pdb|1JLI|1JLI HUMAN INTERLEUKIN 3(IL-3)MUTANT WITH TRUNCATION ATBOTH N-AND C-TERMINI AND 14 RESIDUE CHANGES，NMR，MINIMIZEDAVERAGE LPC，LPCL，PCLP pdb|1HSS|1HSS-A 0.19 ALPHA-AMYLASE INHIBITOR FROM WHEATVPALP pdb|3CRX|3CRX-A CRE RECOMBINASE/DNA COMPLEX INTERMEDIATE I LPA，LPAL，PALP pdb|1PRX|1PRX-A HORF6A NOVEL HUMAN PEROXIDASE ENZYME PTIP，VLPTIP pdb|1RCY|1RCY RUSTICYANIN(RC)FROM THIOBACILLUS FERROOXIDANSVLPGFP pdb|1A3Z|1A3Z REDUCED RUSTICYANIN AT 1.9 ANGSTROMS PGFP，VLPGFP pdb|1GER|1GER-A GLUTATHIONE REDUCTASE(E.C.1.6.4.2)COMPLEXED WITHFAD LPALP，PALP pdb|1PBW|1PBW-A STRUCTUURE OF BCR-HOMOLOGY(BH)DOMAIN PALP pdb|1BBS|1BBS RENIN(E.C.3.4.23.15) MPALP AI188872 11.3 366 327 18 382[Homo sapiens]qd27c01.x1 Soares_placenta_8to9weeks_2NbHP8to9W Homo sapiens cDNA clone IMAGE1724928 3′similar to gbJ00117CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR (HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translated MXRVLQGVLPALPQVVC，MXRV，MXR， AI12690619.8 418 343 1 418[Homo sapiens]qb95f01.x1Soares_fetal_heart_NbHH19WHomo sapiens cDNA clone IMAGE17078653′similar to gbJ00117 CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR (HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translated ITRVMQGVIPALPQVVC AI221581 29.1 456 341 23 510[Homo sapiens]qg20a03.x1 Soares_placenta_8to9weeks_2NbHP8to9W Homo sapiens cDNA clone IMAGE1760044 3′similar to gbJ00117CHORIOGONADOTROPIN BETA CHAIN PRECURSOR(HUMAN)；，mRNA sequence.；minus strand；translated MTRVLQVVLLALPQLV Mm.42246.3 Mm.42246 101.3 837 304 28 768 GENE＝Pck1 PROTSIM＝pirT24168phosphoenolpyruvate carboxykinase 1， cytosolic；translated KVIQGSLDSLPQAV，LDSL，LPQ Mm.22430.1Mm.22430 209.4 1275 157 75 1535 GENE＝Ask-pending PROTSIM＝pirT02633 activator of S phase kinase；translated VLQAILPSAPQ，LQA，LQAIL，PSAP，LPS Hs.63758.4Hs.63758 93.8 3092 1210 51 2719 GENE＝TFR2 PROTSIM＝pirT30154 transferrin receptor 2；trANSLated KVLQGRLPAVAQAV，LQG，LPA，LPAV Mm.129320.2Mm.129320 173.0 3220 571 55 2769 GENE＝PROTSIM＝pirT16409 Sequence8 from Patent WO9950284；translated LVQKVVPMLPRLLC，LVQ，LPRL，PMLP Mm.22430.1 Mm.22430 209.4 1275 157 75 1535 GENE＝Ask-pending PROTSIM＝pirT02633 activator of S phase kinase；translated VLQAILPSAPQ，LQA，LQAIL，PSAP，PSAPQ P20155IAC2_HUMAN Acrosin-trypsin inhibitor II precursor(HUSI-II)[SPINK2][Homosapiens] LPGCPRHFNPV，LPG，LPGC Rn.2337.1 Rn.2337 113.0 322 104 1 327 GENE＝PROTSIM＝PRF1402234A Rat pancreaticsecretory trypsin inhibitor type II(PSTI-II)mRNA，complete cds；minus strand；translated LVGCPRDYDPV，LVG，LVGC Hs.297775.1 Hs.297775 43.8 1167 753 31 1291 GENE＝PROTSIM＝spO00268 ESTs， Weakly similar to T2D3_HUMAN TRANSCRIPTION INTTIATION FACTOR TFIID 135KDA SUBUNIT[H.sapiens]；minus strand；translated PGCPRG，PGCP Mm.1359.1Mm.1359 PROTSTM＝pir.A39743 urokinase plasmiogen activator receptorLPGCP，PGCP，LPG，LPGC sptremb1|O56177|O56177 ENVELOPE GLYCOPROTEIN VLPAAP，PAAP sptremb1|Q9W234|Q9W234 CG13509 PROTEIN.//:tremb1|AE003458|AE003458_7gene″CG13509″；Drosophila melanogaster genomic scaffold LAGTIPATP，LAG，PATP swiss|P81272|NS2 BHUMAN NITRIC-OXIDE SYNTHASE IIB(EC 1.14.13.39)(NOS，TYPE II B)(NOSIIB)(FRAGMENTS) GVLPAVP，LPA，VLPAVP，PAVP sptremb1|O30137|O30137HYPOTHETICAL 17.2 KDA GVLPALP，PALP，LPAL sptremb1|Q9IYZ3|Q9IYZ3DNA POLYMERASE GLLPCLP，LPC，LPCL，PCLP sptremb1|Q9PVW5|Q9PVW5 NUCLEAR PROTEIN NP220 PGAP，LPQRPRGPNP，LPQ，PRGP，PNP Hs.303116.2 PROTSIM＝pir；T33097 stromal cell-derived factor 2-like1；translatedGCPR pdb|1DU3|1DU3-A CRYSTAL STRUCTURE OF TRAIL-SDR5 GCPRGM pdb|1D0G|1D0G-R CRYSTAL STRUCTURE OF DEATH RECEPTOR 5(DR5)BOUNDTO APO2L/TRAIL GCPRGM pdb|1BIO|1BIO HUMAN COMPLEMENT FACTOR D IN COMPLEX WITH ISATOICANHYDRIDE INHIBITOR LQHV pdb|4NOS|4NOS-A HUMAN INDUCIBLE NITRIC OXIDE SYNTHASE WITHINHIBITOR FPGC，PGCP pdb|1FL7|1FL7-B HUMAN FOLLICLE STIMULATING HORMONE PARP，VPGC pdb|1HR6|1HR6-A YEAST MITOCHONDRIAL PROCESSING PEPTIDASE CPRG，LKGC pdb|1BFA|1BFA RECOMBINANT BIFUNCTIONAL HAGEMAN FACTOR/AMYLASEINHIBITOR FROM PPGP，LPGCPREV，LPGC，PGCP，CPRE swissnew|P01229|LSHB HUMAN Lutropin bets chain precursor MMRVLQAVLPPLPQVVC，MMR，MMRV，LQA，LQAV，VLPPLP，PPLP，QVVC，VVC，VLPPLPQ，AVLPPLP，AVLPPLPQ swissnew|P07434|CGHB PAPAN Choriogonadotropin beta chain precursor MMRVLQAVLPPVPQVVC，MMR，MMRV，LQA，LQAG，VLPPVP，VLPPVPQ，QVVC，VVC，AVLPPVP，AVLPPVPQ swissnew|Q28376|TSHB HORSE Thyrotropin beta chain precursor MTRD，LPK，QDVC，DVC，IPGC，PGCP swissnew|P95180|NUOB MYCTU NADH dehydrogenase I chain B LPGC，PGCP sptremb1|Q9Z284|Q9Z284 NEUTROPHIL ELASTASE PALP，PALPS sptremb1|Q9UCG8|Q9U CG8URINARY GONADOTROPHIN PEPTIDE(FRAGMENT). LPGGPR，LPG，LPGG，GGPR XP_028754 growth hormone releasing hormone[Homo sapiens] LQRG，LQRGV，LGQL 一個(gè)進(jìn)一步非限制性列表包括膠原蛋白，PSG，CEA，MAGE(黑素瘤相關(guān)的生長(zhǎng)抗原)，血小板反應(yīng)蛋白-1，生長(zhǎng)因子，MMP，鈣調(diào)蛋白，嗅感受蛋白，細(xì)胞色素p450，激酶，Von Willebrand因子(凝固因子)，液泡蛋白(ATP合成酶)，糖蛋白激素，DNA聚合酶，脫氫酶，氨基肽酶，胰蛋白酶，病毒蛋白(如包膜蛋白)，彈性蛋白，冬眠相關(guān)蛋白，抗凍糖蛋白，蛋白酶，環(huán)子孢子蛋白，核受體，轉(zhuǎn)錄活動(dòng)蛋白，細(xì)胞因子及其受體，細(xì)菌抗原，Nramp，RNA聚合酶，細(xì)胞骨架蛋白，造血(神經(jīng))膜蛋白，免疫球蛋白，HLA/MHC，G-偶聯(lián)蛋白及其受體，TATA結(jié)合蛋白，轉(zhuǎn)移酶，鋅指蛋白，剪接蛋白，HMG(高速泳動(dòng)族蛋白)，ROS(活性氧)，超氧化物酶，超氧化物歧化酶，原癌基因/腫瘤阻抑基因，載脂蛋白。
SignalP(CBS) SignalP預(yù)測(cè)(例如) MTRVLQGVLPALP QVVC HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)(BIMAS) (例如) 半解離時(shí)間 I型HLA分子(A_0201)VLQGVLPAL (84) GVLPALPQV(51) VLPALPQVV(48) RLPGCPRGV(14) TMTRVLQGV(115) 分值 MHC II(H2-Ak 15-mers)CPTMTRVLQGVLPAL 14 PGCPRGVNPVVSYAV 14 HLA-DRB 1*010115-mers PRGVNPVVSYAVALS 29 TRVLQGVLPALPQVV 28 LQGVLPALPQVVCNY 22 HLA-DRB1*0301(DR17) 15-mers CPTMTRVLQGVLPAL 26 MTRVLQGVLPALPQV 21 SIRLPGCPRGVNPVV 17 表1小鼠休克實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測(cè)試物質(zhì)在如下時(shí)間(小時(shí))的存活百分率(％) 0 1640 72 PBS 100100 67 17 PG23100100 100100 PG2510083 8383 肽 NMPF 序列 1 VLPALPQVVC10010 5017 2 LQGVLPALPQ10067 0 0 3 LQG 10083 2017 4 LQGV 100100100 100 5 GVLPALPQ 1001008017 6 VLPALP100100100 100 7 VLPALPQ 10083 0 0 8 GVLPALP 1001008367 9 VVC 1001005050 11MTRV 1001006750 12MTR 1001006750 13LQGVLPALPQVVC 100100100 100 14(環(huán))LQGVLPALPQVVC 10083 8383 64LPGCPRGVNPVVS 100100100 100 66LPGC 100100100 100 表2休克實(shí)驗(yàn)的額外結(jié)果 NMPF序列ID 抗休克作用 LQGV +++ AQGV +++ LQGA +++ VLPALP +++ ALPALP ++ VAPALP ++ ALPALPQ++ VLPAAPQ++ VLPALAQ+++ 加速休克作用 LAGV +++ LQAV +++ VLAALP +++ VLPAAP +++ VLPALA +++ VLPALPQ+++ VLAALPQ+++ VLPALPA+++ 表3休克實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步額外結(jié)果 NMPF肽 在如下時(shí)間(小時(shí))的存活百分率(％) Tx Tx 0 14 24 48 PBS1001001000 NMPF-3 1001001000 NMPF-5 100100100100 NMPF-7 10010010067 NMPF-8 100100100100 NMPF-9 100100100100 NMPF-11100100100100 NMPF-12100100100100 NMPF-43100100100100 NMPF-45100100100100 NMPF-46100100100100 NMPF-50100100100100 NMPF-53100100100100 NMPF-58100100100100 NMPF-60100100100100 表4進(jìn)一步的額外結(jié)果
表5各種肽在各種實(shí)驗(yàn)致的結(jié)果總結(jié) +＝有效；-+＝可變效果；空格表示在作表時(shí)無(wú)效或者未測(cè)試 表6 NO和/或TNF-A的調(diào)節(jié)

從-+至+++++++代表從剛有調(diào)節(jié)活性至調(diào)節(jié)活性非常高。
猴實(shí)驗(yàn) NMPF的功效在此將LQGV，AQGV和VLPALP的1∶1∶1混合物施用于革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)的獼猴膿毒病模型以預(yù)防膿毒性休克。
勢(shì)不可擋的炎癥和免疫應(yīng)答是膿毒性休克的基本特點(diǎn)并在組織損害，多器官損傷及膿毒病引起的死亡的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。細(xì)胞因子尤其腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β，及巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)已經(jīng)示出是膿毒性休克的關(guān)鍵介導(dǎo)因子。然而，傳統(tǒng)的抗TNF和抗IL-1治療未表現(xiàn)出對(duì)具有嚴(yán)重膿毒病的患者有更多的益處。我們?cè)O(shè)計(jì)了在小鼠中完全阻斷LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克的肽，即使當(dāng)注射LPS后接近24小時(shí)才開(kāi)始用這些肽治療也完全阻斷膿毒性休克。這些肽還能抑制MIF產(chǎn)生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了使用這些肽治療患有膿毒性休克患者的可能性。由于靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與人在進(jìn)化上更接近，我們測(cè)試了這些肽在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的安全性和有效性。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
在這個(gè)臨床前研究中僅使用首次用于實(shí)驗(yàn)的猴，以排除與先前處理的任何相互作用。將動(dòng)物用鹽酸克他命(ketamine)麻醉。將動(dòng)物從口腔插管并使其自由呼吸。用O2/N2O/異氟烷使動(dòng)物保持麻醉狀態(tài)。給予動(dòng)物阿托品作為O2/N2O/異氟烷麻醉前的藥物處理。在2小時(shí)的輸注大腸桿菌及隨后的大腸桿菌攻擊6小時(shí)期間維持手術(shù)麻醉的水平，之后去除氣管內(nèi)插管并將動(dòng)物安樂(lè)死。在細(xì)菌誘導(dǎo)之前，進(jìn)行1小時(shí)輸注前心率和血壓監(jiān)測(cè)。
給兩只獼猴輸注10CFU/kg革蘭氏陰性菌大腸桿菌以誘導(dǎo)致命的膿毒性休克。1只猴接受安慰劑處理，并在輸注細(xì)菌后7小時(shí)內(nèi)未從麻醉中恢復(fù)而處死。另一只猴接受測(cè)試化合物治療并在同一時(shí)間點(diǎn)處死。
在1991年用相同的細(xì)菌菌株進(jìn)行的一個(gè)限制劑量的滴定試驗(yàn)中，所用劑量被證實(shí)在8小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)致命的休克。在近年來(lái)的試驗(yàn)中，使用低3倍的劑量誘導(dǎo)明顯的臨床和病理解剖學(xué)膿毒性休克跡象而無(wú)致命結(jié)果。
將所述猴在觀(guān)測(cè)期間保持麻醉狀態(tài)并在開(kāi)始輸注細(xì)菌7小時(shí)后處死以進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。將所述動(dòng)物進(jìn)行大體尸檢，其中打開(kāi)腹腔和胸腔并原位檢測(cè)內(nèi)臟器官。
使用3只獼猴的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)描述 在獼猴(Maccaca mulatta)中進(jìn)行研究。在研究中只使用首次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的獼猴以排除與先前處理的任何相互作用。在實(shí)驗(yàn)之前，由獸醫(yī)自然評(píng)估動(dòng)物的健康狀態(tài)。所有動(dòng)物菌告知健康狀態(tài)良好及沒(méi)有病原性體外和體內(nèi)寄生蟲(chóng)和常見(jiàn)的細(xì)菌如Yersinia pestis，Yersiniaenterocolitica，Yersinia pseudotuberculosis，Shigella，Aeromonashydrophilia，病原性Campylobacter species和Salmonella的感染。
試劑大腸桿菌菌株購(gòu)自ATCC(E-coli；086aK61serotype，ATCC33985)。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，該菌株證實(shí)對(duì)人與獼猴血清中的殺細(xì)菌因子易感性相同。
在實(shí)驗(yàn)之前，建立新鮮的培養(yǎng)物；將大腸桿菌菌株培養(yǎng)1天，收獲并徹底洗滌以除去游離的內(nèi)毒素。在輸注入動(dòng)物之前，評(píng)估細(xì)菌數(shù)和存活力。將系列稀釋的大腸桿菌原種鋪板于BHI瓊脂上并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。計(jì)數(shù)每個(gè)平板上菌落并計(jì)算每ml的菌落形成單位數(shù)。使用實(shí)驗(yàn)當(dāng)天體重測(cè)定值以計(jì)算大腸桿菌劑量，并將大腸桿菌原種以輸注所需的濃度(輸注的總劑量體積為大約10ml/kg)懸浮于等滲鹽水(N.P.B.I.，Emmer-Compascuum，The Netherlands)中。將該大腸桿菌懸浮液在冰上保持直至進(jìn)行輸注。
在猴中使用抗生素以同步休克誘導(dǎo)。使用Baytril(Baytril 2.5％，Bayer，Germany)代替慶大霉素，因?yàn)樗镁曜C實(shí)只對(duì)后者略易感。
通過(guò)動(dòng)物胸部上的數(shù)字或字母組合記號(hào)鑒別各個(gè)動(dòng)物。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 麻醉將所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前禁食一夜。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的當(dāng)天早晨，將動(dòng)物用鹽酸克他命(Tesink，The Netherlands)鎮(zhèn)靜，并運(yùn)至手術(shù)室。將動(dòng)物側(cè)面置于溫控的取暖電毯上以保持體溫。使用Vet-OX 5700監(jiān)測(cè)直腸溫度。將動(dòng)物經(jīng)口腔插管并使其自由呼吸。將動(dòng)物使用O2/N2O/異氟烷吸入麻醉法在輸注大腸桿菌及觀(guān)測(cè)大腸桿菌攻擊的7小時(shí)期間保持麻醉，之后除去氣管內(nèi)插管并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死或使其從麻醉中恢復(fù)。將導(dǎo)管插入股靜脈或頭靜脈并用于輸注等滲鹽水，活大腸桿菌及抗生素。難以覺(jué)察的體液丟失通過(guò)以3.3ml/kg/hr速度輸注含有2.5％葡萄糖的等滲鹽水(Fresenius，′s Hertogenbosch，The Netherlands)而補(bǔ)償。
預(yù)備工作在麻醉期間將動(dòng)物利用器具測(cè)定血壓(用自動(dòng)護(hù)腕)，心率和體溫。以3.3ml/kg/hr速度輸注等滲鹽水以補(bǔ)償體液?jiǎn)适?。將?dǎo)管插入股靜脈以輸注大腸桿菌和抗生素。使用溫控取暖電毯以保持體溫。在大腸桿菌攻擊期間及施用大腸桿菌后6小時(shí)期間對(duì)所述猴持續(xù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在7小時(shí)后，將兩只動(dòng)物(對(duì)照動(dòng)物及用NMPF處理的動(dòng)物)處死以對(duì)比所述化合物在組織學(xué)水平的直接作用。將用NMPF處理的第三只動(dòng)物從麻醉中恢復(fù)并在恢復(fù)后的前12個(gè)小時(shí)期間密切觀(guān)測(cè)，隨后進(jìn)行定期的每日觀(guān)測(cè)。使第三只動(dòng)物恢復(fù)是與獸醫(yī)商議后決定的。
誘導(dǎo)膿毒性休克在輸注大腸桿菌之前，進(jìn)行1小時(shí)輸注前心率和血壓監(jiān)測(cè)。所有三只動(dòng)物均接受靜脈內(nèi)注射致死劑量10×109CFU/kg體重的大腸桿菌086(k61serotype；ATCC 33985)。在該小組在1991年進(jìn)行的一個(gè)劑量滴定研究中，這個(gè)細(xì)菌劑量在開(kāi)始輸注后8小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)致命休克。輸注時(shí)間為2小時(shí)。
抗生素在完成2小時(shí)的大腸桿菌輸注后立即靜脈內(nèi)施用Baytril(i.V.；9mg/kg)。
用NMPF處理在大腸桿菌攻擊開(kāi)始后30分鐘，為動(dòng)物施用一種單一靜脈內(nèi)藥丸注射劑，其是NMPF寡肽的混合物。所述寡肽混合物含有以下NMPF肽LQGV(5mg/kg)，AQGV(5mg/kg)和VLPALP(5mg/kg)。將這些NMPF肽溶解于0.9％氯化鈉溶液中以進(jìn)行注射(N.P.B.I.，Emmer Compascuum，The Netherlands)。
結(jié)果 初步猴實(shí)驗(yàn)結(jié)果 觀(guān)測(cè)測(cè)試化合物對(duì)在用所述寡肽混合物處理的猴中膿毒病的抗休克作用，即觀(guān)測(cè)對(duì)這個(gè)靈長(zhǎng)類(lèi)模型的早期7小時(shí)軌跡中膿毒病作用的抑制作用。這些肽的免疫調(diào)節(jié)作用已經(jīng)在體外及ex vivo分析如T細(xì)胞分析中觀(guān)測(cè)到，如抑制病理性Th1免疫應(yīng)答，抑制炎性細(xì)胞因子(MIF)，提高抗炎細(xì)胞因子(IL-10，TGF-β)的產(chǎn)生及提高對(duì)抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
將以下器官稱(chēng)重并進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù) 腎 肝 肺 淋巴結(jié) 總損害 將所有器官的組織保存在中性磷酸鹽水溶液緩沖的4％甲醛溶液中。淋巴器官低溫保存。所有組織均進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。
在3只猴的實(shí)驗(yàn)中獲得的進(jìn)一步結(jié)果 猴429(對(duì)照組)將雌性猴(5.66kg)靜脈內(nèi)注射大腸桿菌086(10E10CFU/kg)。在該小組1991年進(jìn)行的一個(gè)劑量滴定研究中，這個(gè)細(xì)菌劑量在開(kāi)始輸注后8小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)致命的休克。輸注時(shí)間為2小時(shí)。在完成2小時(shí)的輸注后立即靜脈內(nèi)施用Baytril。
大腸桿菌輸注(靜脈內(nèi)；9mg/kg)在注射大腸桿菌后，通過(guò)不知哪只猴接受NMPF處理的獸醫(yī)對(duì)猴進(jìn)行觀(guān)測(cè)。臨床觀(guān)測(cè)如下嘔吐，脈搏無(wú)法檢測(cè)，心律失常，ECG異常心室擴(kuò)張/心代償失調(diào)跡象(QPS波延長(zhǎng)，期外收縮)，血液凝固時(shí)間降低及強(qiáng)迫呼吸。另外，心率波動(dòng)大(30-150次/分鐘)，收縮壓和舒張壓均下降(35/20mmHg)及血氧濃度降低(80-70％)。在開(kāi)始輸注大腸桿菌7小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)猴開(kāi)始吐血及排便并抽搐。在最后的檢查后，獸醫(yī)未許可讓這個(gè)猴蘇醒。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將對(duì)照猴安樂(lè)死。之后，進(jìn)行尸檢并原位檢測(cè)內(nèi)臟器官。病理學(xué)者發(fā)現(xiàn)許多內(nèi)出血。
猴459(NMPF)。將雌猴(5.44kg)靜脈內(nèi)注射大腸桿菌086(10E10CFU/kg)。在該小組1991年進(jìn)行的一個(gè)劑量滴定研究中，這個(gè)細(xì)菌劑量在開(kāi)始輸注后8小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)致命的休克。輸注時(shí)間為2小時(shí)。在開(kāi)始輸注大腸桿菌30分鐘后，以單一藥丸注射方式靜脈內(nèi)注射N(xiāo)MPF。在完成2小時(shí)大腸桿菌(靜脈內(nèi)注射；9mg/kg)輸注后，立即靜脈內(nèi)施用Baytril。在注射大腸桿菌后，將該猴也由不知道哪只猴接受NMPF處理的獸醫(yī)進(jìn)行觀(guān)測(cè)。臨床觀(guān)測(cè)結(jié)果如下正常脈搏，心音正常，正常ECG，較高心率但穩(wěn)定(180次/分鐘)，無(wú)低血壓(75/30mmHg)，正常血氧濃度(95-85％)，肺呼吸音正常，正常充盈。在開(kāi)始輸注大腸桿菌后7小時(shí)，該猴的臨床狀況穩(wěn)定。在最后測(cè)試后，獸醫(yī)允許讓該猴蘇醒，因?yàn)槠錉顩r穩(wěn)定。然而，為能在對(duì)照猴與NMPF處理猴之間對(duì)比血液學(xué)和免疫學(xué)參數(shù)，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)將NMPF處理的猴459也安樂(lè)死。之后進(jìn)行尸檢，并在原位檢測(cè)內(nèi)臟器官。病理學(xué)者未發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的內(nèi)出血。
猴427(NMPF)將雌性猴(4.84kg)靜脈內(nèi)注射大腸桿菌086(10E10CFU/kg)。在該小組1991年進(jìn)行的一個(gè)劑量滴定研究中，這個(gè)細(xì)菌劑量在開(kāi)始輸注后8小時(shí)內(nèi)誘導(dǎo)致命休克。輸注時(shí)間為2小時(shí)。在開(kāi)始輸注大腸桿菌后30分鐘，靜脈內(nèi)注射N(xiāo)MPF。在完成2小時(shí)的大腸桿菌輸注后(靜脈內(nèi)注射；9mg/kg)立即靜脈內(nèi)施用Baytril。在注射大腸桿菌后，將該猴也由不知道哪只猴接受NMPF處理的獸醫(yī)進(jìn)行觀(guān)測(cè)。臨床觀(guān)測(cè)結(jié)果如下正常脈搏，心音正常，正常ECG，心率較高但穩(wěn)定(160次/分鐘)，無(wú)低血壓(70/30mmHg)，正常血氧濃度(95-90％)，肺呼吸音正常，正常充盈。在開(kāi)始輸注大腸桿菌后7小時(shí)，該猴的臨床狀況穩(wěn)定。在最后測(cè)試后，獸醫(yī)允許讓該猴蘇醒，因?yàn)槠錉顩r穩(wěn)定。猴迅速蘇醒，保持警惕，水腫緩慢消失。
病理學(xué)報(bào)告的概括評(píng)論 為對(duì)比評(píng)估病理學(xué)報(bào)告，特殊重點(diǎn)放在實(shí)驗(yàn)中在大約7小時(shí)安樂(lè)死或死亡的兩只猴(429和459)的那些示出明顯研究相關(guān)的改變的器官上。
在動(dòng)物429中肝臟損傷最嚴(yán)重，表現(xiàn)為多病灶明顯的(接近全部)肝小葉壞死區(qū)域，有嗜中性粒細(xì)胞-有粒白細(xì)胞分界。這個(gè)動(dòng)物示出多病灶急性肝細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞分裂和竇周隙白細(xì)胞增多。
相反，與動(dòng)物429上述變化相比動(dòng)物459未示出明顯的肝細(xì)胞損害，盡管肝細(xì)胞混濁腫脹非常充分地表明肝細(xì)胞膜功能(細(xì)胞膜以及亞細(xì)胞區(qū)室膜如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體)有損害。然而，能量依賴(lài)性膜轉(zhuǎn)運(yùn)中的異常最后可能是暫時(shí)現(xiàn)象。
對(duì)上述動(dòng)物的肝臟組織的病理解剖學(xué)特征加以概括，獼猴459示出相對(duì)最小的變化。
在動(dòng)物429中，胃粘膜示出明顯的急性彌漫性出血，認(rèn)為與內(nèi)毒素血癥相關(guān)。另外，動(dòng)物429在腹腔子宮病灶周?chē)屑毙猿鲅?。在?dòng)物459中無(wú)相應(yīng)發(fā)現(xiàn)存在。
另一只動(dòng)物中無(wú)相應(yīng)發(fā)現(xiàn)存在。
在三只動(dòng)物之間對(duì)比性評(píng)估腎上腺未示出明顯差別。雙方動(dòng)物的腎上腺均呈現(xiàn)多發(fā)病灶，播散皮質(zhì)嗜中性粒細(xì)胞-有粒白細(xì)胞浸潤(rùn)。
概括評(píng)論組織損害在動(dòng)物429中最嚴(yán)重，而動(dòng)物459示出在定量上和定性上均只是輕微組織改變。
基因組實(shí)驗(yàn) ANNEMIEK PM1 T-細(xì)胞系得自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)，在37℃及在5％CO2中培養(yǎng)。維持這些細(xì)胞并在RPMI 1640，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，及抗生素青霉素和鏈霉素中培養(yǎng)。為進(jìn)行基因組實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞(2×106/ml)在6孔平板中與2ml體積的植物凝集素(PHA，10μg/ml)和IL-2(200IU/ml)或者PHA、IL-2和肽LQGV(10mg/ml)溫育。培養(yǎng)4小時(shí)后，將10×106個(gè)細(xì)胞洗滌并針對(duì)基因芯片探針陣列實(shí)驗(yàn)進(jìn)行制備。根據(jù)廠(chǎng)商指導(dǎo)進(jìn)行基因芯片表達(dá)分析(Expression Analysis，Technical Manual，Affymetrix Genechip)。以下主要步驟概括了基因芯片表達(dá)分析1)靶制備，2)靶雜交，3)設(shè)立實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用流體學(xué)工作站，4)探針陣列洗滌和染色，5)探針陣列掃描，及6)數(shù)據(jù)分析。
結(jié)果 基因組實(shí)驗(yàn) 基因芯片表達(dá)分析表明由于在存在PHA/IL-2的情況下用LQGV處理PM1(T細(xì)胞系)細(xì)胞4小時(shí)，導(dǎo)致負(fù)調(diào)節(jié)至少120個(gè)基因，與對(duì)照PM1細(xì)胞(僅用PHA/IL-2刺激)相比多2倍。另外，在肽處理的細(xì)胞中至少6個(gè)基因被正調(diào)節(jié)，與對(duì)照細(xì)胞相比多2倍。
在基因組實(shí)驗(yàn)中鑒別了由于LQGV處理所致負(fù)調(diào)節(jié)的基因。以下給出了這些基因的改變倍數(shù)和登記號(hào)或描述。
21.2 M11507 10.1 U22376 9.7X68836 9.3M97935 8.7D30037 7.5U28964 6.7U10564；L23959 6.5W29030 6.1U08997 5.7M97935 5.6Y00638 5.3Ras樣蛋白Tc21；X83492 4.8AJ002428 4.7Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap 1b 4.6AL080119 4.5AF047448；D14710；X59618；D28364；AA477898 4.4L19161；U48736；L43821；Ras樣蛋白Tc21；U22376 4.3U18271 4.2Fk506結(jié)合蛋白，Alt.Splice 2；J05614 4.1U08316；W28732；Y00638 4 AF000545 3.8U08997 3.6X03484；M32886；M28209 3.5L34075；J04088 3.4L19161；D28423；AA442560；X98248 3.3AB020670；W28869；Z12830；AL021546 3.2U78082；X74262 3.1M64174；AI862521；W27517 3 D13988；AL080119；M33336；L75847；M21154； AA675900；M97936 2U16720；M33336；U50079；U16720；X87212；AI740522； M21154；X00737 2.1AF034956；Ras抑制劑Inf；M27749；Ras樣蛋白質(zhì)Tc4； X92106；D88674；H15872；L07541；V01512；L23959； C-Ki-Ras P21和Smg P21的刺激性Gdp/Gtp交換蛋白； L13943；X78925；U78733 2.2L07540；AF040958；D00596；AI659108；AF042083； W28907 2.3AF073362；J04423；D59253；M21154；原癌基因C-Myc； W26787 2.4L12002；M55536；S75881；S75881；AF050110；M86667 2.5U17743；U90549；U31382；S81916；M64595；絲氨酸 羥甲基轉(zhuǎn)移酶；U88629；U72518；L14595；AB014584； AI924594；U68111；AI924594；AL009179；AF091077； M28211；Z85986；AB019435；U39318；X78711；Y09443； Z82200 2.6X69549鋅指蛋白，Kruppel-Like；D88357 2.7D10656；M28211 2.8W27594；X05360；V00568；L24804 2.9L05624。
由于LQGV處理所致正調(diào)節(jié)的基因的鑒別。以下描述的是基因的改變倍數(shù)和登記號(hào)或描述。
4.9AF043324 3.3L08096 2.1AL031681；X87838 2.2AW024285；D38524；L38935 2.5L12711 2.6AF026029 2.8X70683。
進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)例 使用本發(fā)明信號(hào)傳導(dǎo)分子的不同疾病發(fā)病機(jī)理中包含的不同受體-胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的例子如下 LPS刺激抗原呈遞細(xì)胞(如DC，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞)，通過(guò)不同的Toll樣受體激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括MAPK途徑，ERK，JNK和p38途徑。這些途徑直接或間接使各種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化及激活，所述轉(zhuǎn)錄因子包括E1k-1，c-Jun，c-Fos，ATF-1，ATF-2，SRF和CREB。另外，LPS激活MyD88、IRAK及TRAF6的IKK途徑。TAK1-TAB2與MEKK1-ECSIT復(fù)合物使IKKb磷酸化，其隨之磷酸化IkBs。隨后的IkBs降解使NFκB/Rel復(fù)合物如p50/p65核轉(zhuǎn)位。另外，P 13K-Akt途徑通過(guò)未知的激酶使p65磷酸化和激活。一些途徑也可以通過(guò)其它受體信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)節(jié)，如激素/生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(PKC/Ras/IRS途徑)及細(xì)胞因子受體(JAK/STAT途徑)。在用T細(xì)胞系進(jìn)行的基因組實(shí)驗(yàn)中，一些基因表現(xiàn)為被所用肽(LQGV)負(fù)調(diào)節(jié)或正調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在清楚T細(xì)胞中其它肽及其它類(lèi)型細(xì)胞中的相同及其它肽相似地負(fù)調(diào)節(jié)或正調(diào)節(jié)一些轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)傳導(dǎo)分子。在DC和受精卵實(shí)驗(yàn)中，NMPF具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子(GM-CSF，VEGF)及LPS信號(hào)傳導(dǎo)的能力。與NF-κB及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)異常相關(guān)的一些疾病是動(dòng)脈硬化，哮喘，關(guān)節(jié)炎，炭疽熱，惡病質(zhì)，癌癥，糖尿病，甲狀腺疾病綜合征，AIDS，炎癥性腸病，中風(fēng)，(膿毒病)膿毒性休克，炎癥，神經(jīng)病理學(xué)疾病，自身免疫性疾病，血栓癥，心血管疾病，心理疾病，手術(shù)后抑郁，傷口愈合，燒傷愈合及神經(jīng)變性疾病。
PKC通過(guò)刺激例如AP-1和NF-κB而在T細(xì)胞激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其通過(guò)Vav/Rac途徑選擇性改變T細(xì)胞突觸的位置。PKC參與許多免疫學(xué)和非免疫學(xué)疾病，這從內(nèi)科醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教材中清楚得知(例如參與代謝疾病，癌癥，血管發(fā)生，免疫介導(dǎo)的病變，糖尿病等)。
LPS和神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)不同的多聚體受體復(fù)合物，包括CD14，CD11b，F(xiàn)c-gRIII，CD36，TAPA，DAF和TLR4。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑解釋了高膽固醇血癥和高血脂中單核細(xì)胞功能的變化。
氧化的低密度脂蛋白導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，一定濃度的氧化的低密度脂蛋白通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞程序死亡。這些途徑參與各種血管病變?nèi)鐒?dòng)脈硬化，血栓癥等。
細(xì)菌DNA被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞識(shí)別。這種識(shí)別需要內(nèi)體成熟并引起NF-κB和MAPK途徑激活。近年來(lái)已經(jīng)示出信號(hào)傳導(dǎo)需要Toll樣受體9(TLR9)及信號(hào)傳導(dǎo)銜接蛋白MyD88。在病毒感染期間dsRNA的識(shí)別似乎依賴(lài)于dsRNA依賴(lài)性蛋白激酶PKR的胞內(nèi)識(shí)別。TLRs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且它們?cè)跇蚪蛹捌胶庀忍烀庖吆瞳@得性免疫中起重要作用。這些受體或其下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)對(duì)治療各種免疫學(xué)病變很重要，所述病變?nèi)绺腥荆┌Y，免疫介導(dǎo)的疾病，自身免疫性疾病，某些具有免疫學(xué)成分的代謝疾病，血管病變，炎癥疾病等。
在類(lèi)風(fēng)濕性滑膜炎中，生長(zhǎng)因子PDGF-AA對(duì)NF-κB及促炎細(xì)胞因子起作用；PDGF-AA增強(qiáng)NF-κB活性及IL-1b，IL-8和MIP-1a的mRNA表達(dá)。因此，PDGF-AA在炎癥進(jìn)展以及RA中滑膜細(xì)胞增殖中起重要作用。
樹(shù)突細(xì)胞(DC)激活是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。通過(guò)LPS誘導(dǎo)的DC激活可以分成兩個(gè)獨(dú)立的過(guò)程首先是成熟，導(dǎo)致MHC及共刺激分子正調(diào)節(jié)，其次，從生長(zhǎng)因子除去后的立即細(xì)胞程序死亡中獲救(存活)。LPS誘導(dǎo)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。抑制NF-κB激活能在MHC及共刺激分子正調(diào)節(jié)方面阻斷DC成熟。另外，LPS激活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的激酶(ERK)，對(duì)激活ERK的激酶MEK1的特異性抑制消除了LPS防止細(xì)胞程序死亡的能力，但不抑制DC成熟或NF-κB核轉(zhuǎn)位。這示出ERK和NF-κB調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的DC激活的不同方面。我們的DC數(shù)據(jù)和NF-κB數(shù)據(jù)還示出在有或無(wú)LPS的情況下，NMPF肽對(duì)DC成熟及增殖的各種作用。NMPF肽調(diào)節(jié)這些途徑而且是調(diào)節(jié)DC功能和免疫調(diào)節(jié)的新手段。這開(kāi)辟了治療免疫疾病的新途徑，尤其治療免疫系統(tǒng)不平衡(DC1-DC2，Th1-Th2，調(diào)節(jié)細(xì)胞等)的那些病變。
DC介導(dǎo)NK細(xì)胞激活，其可導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)被抑制。DC細(xì)胞及其它抗原呈遞細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞)在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，而且它們?cè)跇蚪雍推胶庀忍烀庖吆瞳@得性免疫中也起重要作用。這些細(xì)胞或其下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)對(duì)治療各種免疫學(xué)病變很重要，所述病變?nèi)绺腥?，癌癥，免疫介導(dǎo)的疾病，自身免疫性疾病，具有免疫學(xué)成分的某些代謝疾病，血管病變，炎癥疾病等。在文獻(xiàn)中還有這樣的證據(jù)，即肥大細(xì)胞在通過(guò)釋放炎性細(xì)胞因子及在通過(guò)肥大細(xì)胞上TLR識(shí)別感染因素后補(bǔ)充中性粒細(xì)胞而發(fā)揮先天免疫性中起重要作用。
在鼠巨噬細(xì)胞中，肺結(jié)核分枝桿菌感染通過(guò)JAK途徑激活STAT1，STAT1的激活也許是參與IFN-γ誘導(dǎo)的MHC II型抑制的主要轉(zhuǎn)錄因子。
通過(guò)TLR識(shí)別甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)影響應(yīng)答感染的多種免疫機(jī)制并參與先天免疫。先天和獲得性免疫之間的平衡對(duì)平衡免疫系統(tǒng)至關(guān)重要，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致不同的疾病譜，如炎癥疾病，自身免疫性疾病，感染性疾病，妊娠相關(guān)的疾病(如流產(chǎn)和子癇前期)，糖尿病，動(dòng)脈硬化及其它代謝疾病。
核因子-κB(NFκB)對(duì)參與心肌缺血-再灌注損傷的多種基因的轉(zhuǎn)錄至關(guān)重要。臨床核實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)示出心肌缺血-再灌注損傷通過(guò)在心肌梗塞，動(dòng)脈硬化，腸局部缺血，出血性休克肺部損傷及腦梗塞等疾病中的經(jīng)典及替代途徑導(dǎo)致TLR和補(bǔ)體系統(tǒng)激活。
過(guò)氧化物酶體增殖因子激活的受體(PPARs)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)脂質(zhì)和脂蛋白代謝，葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡，影響細(xì)胞增殖，分化和細(xì)胞程序死亡及調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答。PPAR α在肝臟，肌，腎和心臟中高度表達(dá)，在此其刺激脂肪酸的β氧化降解。PPARγ在小腸和脂肪組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在此其觸發(fā)脂肪細(xì)胞分化并促進(jìn)脂質(zhì)貯存。近年來(lái)還報(bào)道了PPARα和PPARγ在血管壁細(xì)胞中表達(dá)，如單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。降血脂藥fibrates及抗糖尿病藥物glitazones分別是PPARα和PPARγ的合成配體。另外，脂肪酸衍生物和類(lèi)花生酸是天然的PPAR配體PPAR α由白三烯B4激活，而前列腺素J2以及氧化的LDL的一些成分如9-和13-HODE是PPAR γ配體。這些觀(guān)測(cè)提示PPARs的一種潛在作用，其不僅參與代謝而且還參與炎癥控制并因此參與相關(guān)的疾病如動(dòng)脈硬化。最近示出PPAR激活因子抑制炎癥應(yīng)答基因(如IL-2，IL-6，IL-8，TNFα和金屬蛋白酶)的激活，這通過(guò)負(fù)面干擾血管壁細(xì)胞中NF-κB，STAT和AP-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑而進(jìn)行。另外，PPARs還可控制動(dòng)脈粥樣硬化斑的細(xì)胞中的脂質(zhì)代謝。PPARs還參與各種免疫學(xué)及非免疫學(xué)疾病，這從內(nèi)科醫(yī)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教材中可清楚獲知(例如參與代謝疾病，癌癥，血管發(fā)生，免疫介導(dǎo)的病變，糖尿病等)。
如上所述，核受體PPARg在脂肪生成，脂質(zhì)貯存中很重要并參與動(dòng)脈硬化。雖然在脂肪組織中表達(dá)，但這個(gè)受體也在巨噬細(xì)胞和結(jié)腸中表達(dá)。另外，PPARg參與許多進(jìn)程如癌癥和炎癥。另外，微生物通過(guò)其關(guān)聯(lián)受體(典型為T(mén)LR)而具有調(diào)節(jié)PPARg依賴(lài)性代謝功能的能力，由此表明消化道中微生物菌群與代謝控制之間復(fù)雜的相互影響。
環(huán)加氧酶2(COX2)是前列腺素H合酶的一種可誘導(dǎo)同種型，其在炎癥期間介導(dǎo)前列腺素合成，而且在結(jié)腸腫瘤中選擇性過(guò)表達(dá)，據(jù)信其在結(jié)腸癌發(fā)生中起重要作用。通過(guò)炎性細(xì)胞因子或缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)COX2的誘導(dǎo)可以通過(guò)核因子κB(NF-κB)介導(dǎo)。因此，抑制NF-κB可調(diào)節(jié)COX途徑，且NF-κB的這種抑制在涉及COX的疾病中具有治療用途，所述疾病如炎癥，疼痛，癌癥(尤其結(jié)腸直腸癌)，炎癥性腸道疾病等。
正常腦組織中神經(jīng)元亞群組成型表達(dá)功能C5a受體。C5a受體的功能作用表明C5a觸發(fā)快速激活蛋白激酶C及激活并核轉(zhuǎn)位NF-κB轉(zhuǎn)錄因子。另外，發(fā)現(xiàn)C5a對(duì)未分化的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤具有促分裂作用，這是針對(duì)C5aR的一種新作用。相反，C5a保護(hù)末期分化的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞免于淀粉樣A β肽介導(dǎo)的毒性。這示出正常海馬神經(jīng)元以及未分化的和分化的人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞均表達(dá)功能性C5a受體。這些結(jié)果示出神經(jīng)元C5aR受體在正常神經(jīng)元發(fā)育，神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)炎癥病變?nèi)鏏lzheimer′s病中的作用。
補(bǔ)體系統(tǒng)的激活在動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)理中也起重要作用。促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6潛在參與疾病的進(jìn)展。補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)Gi依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)IL-6從人血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中釋放，包括產(chǎn)生氧化應(yīng)激及激活氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1。補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)對(duì)許多疾病很重要，如血液病變，感染，一些代謝疾病(糖尿病)，血管病變，移植排斥及相關(guān)疾病，自身免疫性疾病及其它免疫學(xué)疾病。
不同的轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子如不同的激酶也參與多藥抗性。因此，有理由相信NMPF肽將有效抗多藥抗性。另外，我們的基因組數(shù)據(jù)示出許多基因和信號(hào)傳導(dǎo)分子參與腫瘤發(fā)生并調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，因?yàn)楣央膶?duì)血管發(fā)生也有作用，因此這些肽也將用于治療需要調(diào)節(jié)血管發(fā)生的癌癥及相關(guān)疾病。
增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病(PDR)是后天失明的主要原因之一。PDR的特點(diǎn)是新血管形成(NV)，異常血管發(fā)生，其最后可導(dǎo)致嚴(yán)重玻璃體出血和/或視網(wǎng)膜脫落。因?yàn)镹MPF肽具有血管發(fā)生刺激以及抑制作用，并具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子(如胰島素)相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)能力，因此用某些NMPF肽的藥物治療可改善代謝控制(如葡萄糖)或減弱高血糖癥生物化學(xué)結(jié)果(通過(guò)如其中包含醛糖還原酶，蛋白激酶C(PKC)，PPARs的機(jī)制)。針對(duì)這種代謝控制或糖尿病(II型)，推薦使用NMPF肽LQGV，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALPQ，AQG，LAG，LQA，AQGV，VAPALP，VAPALPQ，VLPALPA，LPGC，MTR，MTRV，LQG，CRGVNPVVS。PDR中的血管發(fā)生也可以用上述寡肽進(jìn)行處理。
膿毒性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn) 小鼠這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用NMR1小鼠。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理組10只小鼠。
細(xì)菌及接種S.aureus LS-1最初分離自自發(fā)患有關(guān)節(jié)炎的NZB/W小鼠的腫脹關(guān)節(jié)。這個(gè)葡萄球菌菌株的一個(gè)特點(diǎn)是其產(chǎn)生大量TSST-1，這是具有超級(jí)抗原性的外毒素。將該細(xì)菌在血瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)，然后在血瓊脂上再培養(yǎng)24小時(shí)。將其在含有5％牛血清白蛋白和10％二甲基亞砜(C2H6OS)的PBS(0.13M氯化鈉，10mM磷酸鈉(pH7.4))中，在-20℃冷凍直至使用。在使用之前，將細(xì)菌溶液解凍，在PBS中洗滌，并在PBS中稀釋以達(dá)到希望的細(xì)菌濃度。將小鼠經(jīng)尾靜脈之一接種該細(xì)菌(200μl)。從剩余的細(xì)菌溶液中產(chǎn)生活細(xì)胞計(jì)數(shù)，系列稀釋?zhuān)缓笤谘傊桨迳吓囵B(yǎng)以確定注射的細(xì)菌數(shù)。在靜脈內(nèi)注射細(xì)菌后，將一組小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射PBS進(jìn)行處理，每周3次共兩周，其它組小鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射N(xiāo)MPF-6(100μg)進(jìn)行處理，每周3次共兩周。在進(jìn)行研究的13天期間，測(cè)定關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，死亡率和體重降低情況。
臨床評(píng)估關(guān)節(jié)炎將所有小鼠單獨(dú)進(jìn)一步評(píng)估。定期目測(cè)檢查關(guān)節(jié)即指/趾和腕關(guān)節(jié)/踝關(guān)節(jié)，即至少每?jī)商旎蛉鞕z查一次。關(guān)節(jié)炎定義為可見(jiàn)關(guān)節(jié)紅斑和/或至少一個(gè)關(guān)節(jié)腫脹。為評(píng)估關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，使用肉眼可見(jiàn)檢查系統(tǒng)針對(duì)每個(gè)肢體產(chǎn)生0-4點(diǎn)分值進(jìn)行臨床記錄(關(guān)節(jié)炎指數(shù))(0，既無(wú)腫脹也無(wú)紅斑；1，輕微腫脹和/或紅斑；2，中等腫脹和紅斑；3，明顯腫脹和紅斑；4，最大腫脹和紅斑(垂死的小鼠)。另外，測(cè)定關(guān)節(jié)炎發(fā)生頻率和體重。
結(jié)果 體重降低在兩組之間關(guān)于體重降低方面無(wú)差別(圖66)。
存活直至第10天，觀(guān)測(cè)到關(guān)于存活性無(wú)明顯差別(PBS處理組70％，NMPF處理組80％)。在研究結(jié)束時(shí)，PBS處理的小鼠存活率為40％，NMPF處理的小鼠存活率為80％(圖67)。
關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度測(cè)定實(shí)驗(yàn)組之間關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的明確(clear-cut)差異。從一開(kāi)始即可觀(guān)測(cè)到差異，并隨著時(shí)間而增加。在第10天，PBS處理小鼠中關(guān)節(jié)炎指數(shù)為2.4，NMPF處理小鼠中為1.0。在第13天，PBS處理小鼠中關(guān)節(jié)炎指數(shù)為3.8，NMPF處理小鼠中為0.9(圖68)。
關(guān)節(jié)炎小鼠的發(fā)生頻率在兩組小鼠中觀(guān)測(cè)到在0-6天關(guān)節(jié)炎的發(fā)生頻率無(wú)差異。之后PBS處理組的關(guān)節(jié)炎發(fā)生頻率持續(xù)增加(在第天為100％)，但NMPF處理組降低(在第13天為50％)(圖69)。
結(jié)論是這些結(jié)果示出NMPF-6(VLPALP)處理能預(yù)防小鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，甚至明顯降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。
破骨細(xì)胞發(fā)生分析 骨再吸收和骨形成之間的精確平衡對(duì)保持骨的強(qiáng)度和完整非常重要，其中骨再吸收的破骨細(xì)胞和骨形成的成骨細(xì)胞起關(guān)鍵作用。事實(shí)上，這個(gè)稱(chēng)為骨再塑的生理學(xué)進(jìn)程必須嚴(yán)格調(diào)節(jié)，在病理學(xué)病變中觀(guān)測(cè)到該平衡的傾斜有利于破骨細(xì)胞導(dǎo)致骨破壞，所述病變?nèi)缱陨砻庖咝躁P(guān)節(jié)炎，牙周炎，(絕經(jīng)期后)骨質(zhì)疏松癥，Paget′s病及骨腫瘤。
調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化是了解骨病如自身免疫性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制及治療的重要方面。RANKL(NF-κB配體的受體激活因子)是破骨細(xì)胞發(fā)生所必需的腫瘤壞死因子(TNF)家族的一個(gè)成員，其所致的過(guò)度信號(hào)傳導(dǎo)據(jù)信與這種病變相關(guān)。由于基質(zhì)降解和過(guò)度骨喪失所致關(guān)節(jié)破壞是炎癥性骨病的特征，所述骨病如骨質(zhì)溶解，骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。炎性細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物在炎癥部位的聚集吸引破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞，導(dǎo)致骨成分的進(jìn)一步破壞。腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素-1(IL-1)，和RANKL(也稱(chēng)為OPGL和ODF)在炎癥部位很豐富，并已知促進(jìn)破骨細(xì)胞補(bǔ)充，分化和激活。破骨細(xì)胞分化本質(zhì)上需要RANK/RANKL途徑激活。
RANKL和TNFα在破骨細(xì)胞(OC)形成中的作用已經(jīng)明確確定。為確定NMPF對(duì)破骨細(xì)胞形成的作用，使用骨髓(BM)細(xì)胞和RAW264.7小鼠多核細(xì)胞作為多核破骨細(xì)胞分化的模型系統(tǒng)。
OC產(chǎn)生及定性O(shè)C是通過(guò)用重組的可溶RANKL(20ng/ml)和M-CSF(10ng/ml)在有或無(wú)NMPF(10μg/mL)的情況下將BM細(xì)胞培養(yǎng)7天而產(chǎn)生的。OC也可以通過(guò)用RANKL(20ng/ml)在無(wú)M-CSF或有TNFα的情況下培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞并用NMPF處理而產(chǎn)生。這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)均產(chǎn)生大量TRAP+多核細(xì)胞，其表達(dá)典型的OC標(biāo)記。使用細(xì)胞化學(xué)染色，通過(guò)量化多核TRAP陽(yáng)性細(xì)胞(多于3個(gè)核)的存在情況測(cè)定破骨細(xì)胞的形成。
結(jié)果正如所預(yù)期的，我們觀(guān)測(cè)到當(dāng)細(xì)胞與能抑制NF-κB活性的那些肽共溫育時(shí)，配體(RANKL；MCS-F；TNF α)誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞發(fā)生被明顯抑制。如與只接受配體的對(duì)照細(xì)胞相比多核TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少所表明的那樣，該系列肽抑制破骨細(xì)胞形成的能力在BM以及RAW 264.7模型系統(tǒng)中均觀(guān)測(cè)到。
序列表
<110>比奧滕普特公司
<120>基因調(diào)節(jié)肽
<130>NLVER69162
<140>PCT/NL02/00639
<141>2002-10-04
<150>EP 01203748.7
<151>2001-10-04
<150>US 10/028,075
<151>2001-12-21
<160>203
<170>PatentIn Ver.2.1
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Ser Cys Gln Cys Ala Leu
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<213>人工序列
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Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys
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<213>人工序列
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<400>49
Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Cys Pro Thr
20
<210>50
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(18)
<400>50
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
1 5 10 15
Pro Ser
<210>51
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(16)
<400>51
Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser
1 5 10 15
<210>52
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(13)
<400>52
Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser
1 5 10
<210>53
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>53
Leu Pro Gly Cys
1
<210>54
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>54
Met Thr Arg Val
1
<210>55
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>55
Met Thr Arg
1
<210>56
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>56
Val Val Cys
1
<210>57
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>57
Gln Val Val Cys
1
<210>58
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(17)
<400>58
Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val
1 5 10 15
Cys
<210>59
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(35)
<400>59
Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu
1 5 10 15
Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr
20 25 30
Cys Pro Thr
35
<210>60
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(21)
<400>60
Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp
1 5 10 15
His Pro Leu Thr Cys
20
<210>61
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>S ITE
<222>(1)..(18)
<400>61
Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu
1 5 10 15
Thr Cys
<210>62
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(37)
<400>62
Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
1 5 10 15
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
20 25 30
Pro Ile Leu Pro Gln
35
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽
信號(hào)傳導(dǎo)分子
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(10)
<400>63
Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln
1 5 10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(10)
<400>64
Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser
1 5 10
<210>65
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-87肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>65
Val Gly Gln Leu
1
<210>66
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-88肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>66
Pro Leu Ala Pro Leu Val
1 5
<210>67
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-70肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(14)
<400>67
Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln
1 5 10
<210>68
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述代表NF-kappaB結(jié)合序列的探針
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<400>68
agctcagagg gggactttcc gagag 25
<210>69
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述肽LQAV顯示較小的梗塞區(qū)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>69
Leu Gln Ala Val
1
<210>70
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1DE7/1DE7-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>70
Leu Gln Gly Val Val
1 5
<210>71
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1DE7/1DE7-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>71
Leu Gln Gly Val Val Pro
1 5
<210>72
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1DL6/1DL6-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>72
Leu Asp Ala Leu Pro
1 5
<210>73
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1QMH/1QMH-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>73
Leu Gln Thr Val
1
<210>74
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1QMH/1QMH-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(10)
<400>74
Leu Val Leu Gln Thr Val Leu Pro Ala Leu
1 5 10
<210>75
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1LYP/1LYP
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>75
Ile Gln Gly
1
<210>76
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1LYP/1LYP
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>76
Ile Gln Gly Leu
1
<210>77
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1LYP/1LYP
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>77
Leu Pro Lys Leu
1
<210>78
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1LYP/1LYP
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>78
Leu Leu Pro Lys Leu
1 5
<210>79
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1B9O/1B9O-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>79
Leu Pro Glu Leu
1
<210>80
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1GLU/1GLU-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>80
Pro Ala Arg Pro
1
<210>81
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/2KIN/2KIN-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>81
Met Thr Arg Ile
1
<210>82
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1SMP/1SMP-I
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>82
Leu Gln Lys Leu
1
<210>83
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1SMP/1SMP-I
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>83
Leu Gln Lys Leu Leu
1 5
<210>84
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1SMP/1SMP-I
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>84
Pro Glu Ala Pro
1
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1SMP/1SMP-I
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>85
Leu Gln Lys Leu Leu Pro Glu Ala Pro
1 5
<210>86
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1ES/1ES7-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>86
Leu Pro Gln
1
<210>87
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1ES/1ES7-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>87
Pro Thr Leu Pro
1
<210>88
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1ES/1ES7-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>88
Leu Gln Pro Thr Leu
1 5
<210>89
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BHX/1BHX-F
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>89
Leu Gln Val
1
<210>90
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BHX/1BHX-F
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>90
Leu Gln Val Val
1
<210>91
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1VCB/1VCB-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>91
Pro Glu Leu Pro
1
<210>92
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1CQK/1CQK-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>92
Pro Ala Ala Pro
1
<210>93
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1CQK/1CQK-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>93
Pro Ala Ala Pro Gln
1 5
<210>94
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1CQK/1CQK-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>94
Pro Ala Ala Pro Gln Val
1 5
<210>95
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFB/1BFB
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>95
Leu Pro Ala Leu
1
<210>96
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFB/1BFB
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>96
Pro Ala Leu Pro
1
<210>97
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFB/1BFB
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>97
Pro Ala Leu Pro Glu
1 5
<210>98
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1MBF/1MBF
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>98
Leu Pro Asn
1
<210>99
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1R2A/1R2A-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>99
Leu Thr Glu Leu Leu
1 5
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述C3G肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(10)
<400>100
Pro Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Lys Arg
1 5 10
<210>101
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1RLQ/1RLQ-R
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>101
Leu Pro Pro Leu
1
<210>102
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1RLQ/1RLQ-R
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>102
Pro Pro Leu Pro
1
<210>103
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1TNT/1TNT
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>103
Leu Pro Gly
1
<210>104
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1TNT/1TNT
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>104
Leu Pro Gly Leu
1
<210>105
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1TNT/1TNT
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>105
Leu Pro Lys
1
<210>106
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1GJS/1GJS-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>106
Leu Ala Ala Leu
1
<210>107
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1GJS/1GJS-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>107
Leu Ala Ala Leu Pro
1 5
<210>108
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1GBR/1GBR-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>108
Pro Lys Leu Pro
1
<210>109
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1A78/1A78-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>109
Val Leu Pro Ser Ile Pro
1 5
<210>110
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1FZV/1FZV-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>110
Met Leu Pro Ala Val Pro
1 5
<210>111
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1JLI/1JLI
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>111
Leu Pro Cys
1
<210>112
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1JLI/1JLI
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>112
Leu Pro Cys Leu
1
<210>113
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1JLI/1JLI
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>113
Pro Cys Leu Pro
1
<210>114
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1HSS/1HSS-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>114
Val Pro Ala Leu Pro
15
<210>115
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1PRX/1PRX-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>115
Pro Thr Ile Pro
1
<210>116
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1PRX/1PRX-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>116
Val Leu Pro Thr Ile Pro
1 5
<210>117
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1RCY/1RCY
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>117
Val Leu Pro Gly Phe Pro
1 5
<210>118
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1A3Z/1A3Z
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>118
Pro Gly Phe Pro
1
<210>119
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1GER/1GER-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>119
Leu Pro Ala Leu Pro
1 5
<210>120
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BBS/1BBS
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>120
Met Pro Ala Leu Pro
1 5
<210>121
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述AI188872
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(17)
<223>/note＝″X(qián) on position two stands for unknown″
<400>121
Met Xaa Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val
1 5 10 15
Cys
<210>122
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述AI188872
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<223>/note＝″X(qián) on position two stands for unknown″
<400>122
Met Xaa Arg Val
1
<210>123
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述AI 188872
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<223>/note＝″X(qián) on position two stands for unkown″
<400>123
Met Xaa Arg
1
<210>124
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述AI126906
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(17)
<400>124
Ile Thr Arg Val Met Gln Gly Val Ile Pro Ala Leu Pro Gln Val Val
1 5 10 15
Cys
<210>125
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述AI221581
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(16)
<400>125
Met Thr Arg Val Leu Gln Val Val Leu Leu Ala Leu Pro Gln Leu Val
1 5 10 15
<210>126
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.42246.3
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(14)
<400>126
Lys Val Ile Gln Gly Ser Leu Asp Ser Leu Pro Gln Ala Val
1 5 10
<210>127
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.42246.3
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>127
Leu Asp Ser Leu
1
<210>128
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(11)
<400>128
Val Leu Gln Ala Ile Leu Pro Ser Ala Pro Gln
1 5 10
<210>129
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>129
Leu Gln Ala
1
<210>130
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>130
Leu Gln Ala Ile Leu
1 5
<210>131
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>131
Pro Ser Ala Pro
1
<210>132
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>132
Leu Pro Ser
1
<210>133
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Hs.63758.4
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(14)
<400>133
Lys Val Leu Gln Gly Arg Leu Pro Ala Val Ala Gln Ala Val
1 5 10
<210>134
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Hs.63758.4
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>134
Leu Pro Ala Val
1
<210>135
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.129320.2
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(14)
<400>135
Leu Val Gln Lys Val Val Pro Met Leu Pro Arg Leu Leu Cys
1 5 10
<210>136
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.129320.2
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>136
Leu Val Gln
1
<210>137
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.129320.2
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>137
Leu Pro Arg Leu
1
<210>138
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.129320.2
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>138
Pro Met Leu Pro
1
<210>139
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.22430.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>139
Pro Ser Ala Pro Gln
1 5
<210>140
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述P20155
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(11)
<400>140
Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val
1 5 10
<210>141
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Rn.2337.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(11)
<400>141
Leu Val Gly Cys Pro Arg Asp Tyr Asp Pro Val
1 5 10
<210>142
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Rn.2337.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>142
Leu Val Gly
1
<210>143
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Rn.2337.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>143
Leu Val Gly Cys
1
<210>144
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Hs.297775.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>144
Pro Gly Cys Pro Arg Gly
1 5
<210>145
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Mm.1359.1
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>145
Leu Pro Gly Cys Pro
1 5
<210>146
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/O56177/O56177
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>146
Val Leu Pro Ala Ala Pro
1 5
<210>147
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9W234/Q9W234
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>147
Leu Ala Gly Thr Ile Pro Ala Thr Pro
1 5
<210>148
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9W234/Q9W234
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>148
Leu Ala Gly
1
<210>149
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9W234/Q9W234
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>149
Pro Ala Thr Pro
1
<210>150
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9IYZ3/Q9IYZ3
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>150
Gly Leu Leu Pro Cys Leu Pro
1 5
<210>151
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9PVW5/Q9PVW5
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>151
Pro Gly Ala Pro
1
<210>152
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9PVW5/Q9PVW5
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(10)
<400>152
Leu Pro Gln Arg Pro Arg Gly Pro Asn Pro
1 5 10
<210>153
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9PVW5/Q9PVW5
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>153
Pro Arg Gly Pro
1
<210>154
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9PVW5/Q9PVW5
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>154
Pro Asn Pro
1
<210>155
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述Hs.303116.2
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>155
Gly Cys Pro Arg
1
<210>156
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1DU3/1DU3-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>156
Gly Cys Pro Arg Gly Met
1 5
<210>157
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BIO/1BIO
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>157
Leu Gln His Val
1
<210>158
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1FL7/1FL7-B
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>158
Val Pro Gly Cys
1
<210>159
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1HR6/1HR6-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>159
Cys Pro Arg Gly
1
<210>160
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1H6/1HR6-A
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>160
Leu Lys Gly Cys
1
<210>161
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFA/1BFA
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>161
Pro Pro Gly Pro
1
<210>162
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFA/1BFA
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(8)
<400>162
Leu Pro Gly Cys Pro Arg Glu Val
1 5
<210>163
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述pdb/1BFA/1BFA
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>163
Cys Pro Arg Glu
1
<210>164
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swi ssnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(17)
<400>164
Met Met Arg Val Leu Gln Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val
1 5 10 15
Cys
<210>165
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>165
Met Met Arg
1
<210>166
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>166
Met Met Arg Val
1
<210>167
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>167
Val Leu Pro Pro Leu Pro
1 5
<210>168
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swi ssnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>168
Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln
1 5
<210>169
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>169
A1a Val Leu Pro Pro Leu Pro
1 5
<210>170
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P01229/LSHB HUMAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(8)
<400>170
Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln
1 5
<210>171
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swi ssnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(17)
<400>171
Met Met Arg Val Leu Gln Ala Val Leu Pro Pro Val Pro Gln Val Val
1 5 10 15
Cys
<210>172
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>172
Leu Gln Ala Gly
1
<210>173
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>173
Val Leu Pro Pro Val Pro
1 5
<210>174
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>174
Val Leu Pro Pro Val Pro Gln
1 5
<210>175
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>175
Ala Val Leu Pro Pro Val Pro
1 5
<210>176
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swi ssnew/P07434/CGHB PAPAN
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(8)
<400>176
Ala Val Leu Pro Pro Val Pro Gln
1 5
<210>177
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/Q28376/TSHB HORSE
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>177
Met Thr Arg Asp
1
<210>178
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/Q28376/TSHB HORSE
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>178
Gln Asp Val Cys
1
<210>179
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/Q28376/TSHB HORSE
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(3)
<400>179
Asp Val Cys
1
<210>180
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述swissnew/Q28376/TSHB HORSE
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>180
Ile Pro Gly Cys
1
<210>181
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q92284/Q92284
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>181
Pro Ala Leu Pro Ser
1 5
<210>182
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9UCG8/Q9UCG8
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(6)
<400>182
Leu Pro Gly Gly Pro Arg
1 5
<210>183
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9UCG8/Q9UCG8
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>183
Leu Pro Gly Gly
1
<210>184
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述sptrembl/Q9UCG8/Q9UCG8
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>184
Gly Gly Pro Arg
1
<210>185
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述XP_028754
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>185
Leu Gln Arg Gly
1
<210>186
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述XP 028754
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(5)
<400>186
Leu Gln Arg Gly Val
1 5
<210>187
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述XP_028754
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(4)
<400>187
Leu Gly Gln Leu
1
<210>188
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述SignalP(CBS)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(13)
<400>188
Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro
1 5 10
<210>189
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述I型HLA分子(A_0201)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>189
Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val
1 5
<210>190
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述I型HLA分子(A_0201)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>190
Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val
1 5
<210>191
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述I型HLA分子(A_0201)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>191
Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val
1 5
<210>192
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述MHC II(H2-Ak 15-mers)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>192
Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
<210>193
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述MHC II(H2-Ak
15-mers)
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>193
Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val
1 5 10 15
<210>194
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述HLA-DRB1*0101
15-mers
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>194
Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser
1 5 10 15
<210>195
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述HLA-DRB1*0101
15-mers
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>195
Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val
1 5 10 15
<210>196
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述HLA-DRB1*0101
15-mers
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>196
Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr
1 5 10 15
<210>197
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述HLA-DRB1*0301
(DRl7)15-mers
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>197
Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val
1 5 10 15
<210>198
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述HLA-DRB1*0301
(DR17)15-mers
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(15)
<400>198
Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val
1 5 10 15
<210>199
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-56肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>199
Val Ala Pro Ala Leu Pro Gln
1 5
<210>200
<211>35
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-62肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(35)
<400>200
Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro
1 5 10 15
Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu
20 25 30
Ser Cys Gln
35
<210>201
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-67肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(7)
<400>201
Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro
1 5
<210>202
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF-75肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(18)
<400>202
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
1 5 10 15
Pro Cys
<210>203
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述NMPF肽
<220>
<221>SITE
<222>(1)..(9)
<400>203
Cys Arg Gly Val Asn Pro Val Val Ser
1 權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含作為活性成分的至少一種由選自如下一組中的氨基酸序列組成的分離的肽AQG，LAG，LQA，LAGV，LQAV，VLAALP，VLPAAP，VLPALA，VAPALPQ，VLAALPQ，VLPALPA，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，CPRGVNP，PGCP，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，MTRVLQGVLPALPQ，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ和CRRSTTDCGGPKDHPLTC。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述肽選自由AQG，LAG，LQA和VAPALPQ組成的一組中。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其包含至少兩種所述分離的肽。
4.一種分離的肽，其由選自以下一組中的氨基酸序列組成AQG，LAG，LQA，VAPALPQ，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQC，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，CPRGVNP，PGCP，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，MTRVLQGLVLPALPQ，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ和CRRSTTDCGGPKDHPLTC。
5.權(quán)利要求4的分離的肽，其中所述肽選自由AQG，LAG，LQA和VAPALPQ組成的一組中。
6.至少一種分離的肽在制備用于治療、抑制或預(yù)防NF-κB調(diào)節(jié)的炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病選自由哮喘、炎癥性腸病、炭疽熱、骨病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、慢性阻塞性肺病、腦血管疾病和過(guò)敏性鼻炎組成的一組中，所述分離的肽具有選自由以下氨基酸序列組成的一組中的氨基酸序列VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LQG，LQGV，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALP，VVC，QVVC，MTRV，MTR，LQGVLPALPQVVC，環(huán)-LQGVLPALPQVVC，AQG，LAG，LQA，AQGV，LAGV，LQAV，LQGA，ALPALP，VAPALP，VLAALP，VLPAAP，VLPALA，ALPALPQ，VAPALPQ，VLAALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，VLPALPA，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQ，SIRLPGCPRGVNPVVS，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC，CPRGVNP，PGCP，RPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPT，MTRVLQGVLPALPQ，CALCRRSTTDCGGPKDHPLTC，SKAPPPSLPSPSRLPGPS，TCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ和CRRSTTDCGGPKDHPLTC。
7.權(quán)利要求6的應(yīng)用，其中所述至少一種分離的肽選自如下一組VLPALPQVVC，LQGVLPALPQ，LQG，LQGV，GVLPALPQ，VLPALP，VLPALPQ，GVLPALP，VVC，QVVC，MTRV，MTR，LQGVLPALPQVVC，環(huán)-LQGVLPALPQVVC，AQG，LAG，LQA，AQGV，LAGV，LQAV，LQGA，ALPALP，VAPALP，VLAALP，VLPAAP，VLPALA，ALPALPQ，VAPALPQ，VLAALPQ，VLPAAPQ，VLPALAQ，VLPALPA，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCAL，VVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQ和LPGCPRGVNPVVS。
8.權(quán)利要求6或7的應(yīng)用，包括應(yīng)用至少兩種所述分離的肽的混合物，優(yōu)選其中所述至少兩種肽選自如下一組LQGV，AQGV和VLPALP。
9.權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述骨病是自身免疫性關(guān)節(jié)炎、牙周炎、(絕經(jīng)后)骨質(zhì)疏松、Paget’s病、炎癥性骨病或骨腫瘤。
10.一種分離的肽在制備用于治療、抑制或預(yù)防糖尿病的藥物中的應(yīng)用，所述分離的肽具有選自如下一組中的氨基酸序列LQGV，GVLPALPQ，VLPALPQ，VLPALP，MTRV，LPGCPRGVNPVVS，CPRGVNPVVS，LPGC。
全文摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，也稱(chēng)為基因控制，特別涉及各種疾病的治療。本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，包括提供信號(hào)傳導(dǎo)分子給所述細(xì)胞，所述信號(hào)傳導(dǎo)分子包含一種肽或其功能類(lèi)似物。另外，本發(fā)明提供了一種鑒別或獲得一種信號(hào)傳導(dǎo)分子的方法，所述分子包含能在細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種肽或其功能衍生物或類(lèi)似物，所述方法包括提供一種肽或其衍生物或類(lèi)似物給所述細(xì)胞，并確定基因轉(zhuǎn)錄因子的活性和/或核轉(zhuǎn)位。
文檔編號(hào)C07K5/103GK101721676SQ20091016347
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2002年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月4日
發(fā)明者尼薩爾·艾哈邁德·卡恩, 羅貝特·本納 申請(qǐng)人:比奧滕普特公司