專利名稱：按植物偏愛密碼子合成降鈣素基因相關(guān)肽基因及其在植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、酶學(xué)、生理學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種首次根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計人工合成的降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitoningene-related peptide，CGRP)的核酸序列。本發(fā)明還涉及降鈣素基因相關(guān)肽在植物中的表達(dá)。
本發(fā)明中，我們用化學(xué)合成法，首次根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計了可以在植物中表達(dá)的具有生物活性的降鈣素基因相關(guān)肽及其編碼序列。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽編碼序列。
本發(fā)明的第二目的是提供一種在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述新的降鈣素基因相關(guān)肽的蛋白及核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種新的降鈣素基因相關(guān)肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種人工設(shè)計并合成的含有新的降鈣素基因相關(guān)肽基因的克隆載體pGEM-5zf-cgrp，該載體包括根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計的降鈣素基因相關(guān)肽的核酸序列，所述的核酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位DNA分子的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了幾種表達(dá)載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在實例中該宿主細(xì)胞是煙草和番茄。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種在植物中產(chǎn)生和表達(dá)具有活性的降鈣素基因相關(guān)肽的方法，其步驟如下(1)將人工合成的編碼具有降鈣素基因相關(guān)肽活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成降鈣素基因相關(guān)肽蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列有至少75％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成降鈣素基因相關(guān)肽的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.5中第18-130位的序列。
在本發(fā)明中，術(shù)語“降鈣素基因相關(guān)肽編碼序列”指編碼具有降鈣素基因相關(guān)肽活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第18-130位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的編碼框第18-130位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.5中第18-130位核苷酸序列同源性低至約75％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列的同源性至少75％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的降鈣素基因相關(guān)肽相同功能的蛋白的SEQ IDNO.5中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“降鈣素基因相關(guān)肽”指具有降鈣素基因相關(guān)肽活性的SEQ IDNO.6序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與降鈣素基因相關(guān)肽在植物中表達(dá)相同功能的SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-20個，較佳地1-15個，更佳地1-10個，最佳地1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為15個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的在植物中偏愛的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個植物偏愛密碼子所表達(dá)的氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括在植物中的表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的降鈣素基因相關(guān)肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與降鈣素基因相關(guān)肽DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗降鈣素基因相關(guān)肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“降鈣素基因相關(guān)肽保守性變異多肽”是指與SEQ ID NO.6的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


發(fā)明還包括人工合成的在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽或多肽的類似物。這些類似物與降鈣素基因相關(guān)肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽時，可以將降鈣素基因相關(guān)肽編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞、番茄細(xì)胞及其它植物細(xì)胞。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析降鈣素基因相關(guān)肽基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析降鈣素基因相關(guān)肽的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
降鈣素基因相關(guān)肽RNA的Nothern印跡分析和特異抗體的降鈣素基因相關(guān)肽Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實在生物樣本中降鈣素基因相關(guān)肽的表達(dá)。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸編碼序列的8-50個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在核苷酸序列的降鈣素基因相關(guān)肽方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為15-50個核苷酸。
本發(fā)明的降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸編碼序列通?？梢杂萌斯ず铣傻姆椒ǐ@得。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
表2為本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設(shè)計人工合成的降鈣素基因相關(guān)肽與人類降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸序列(GenBank Accession No.AAA52011.1)的同源比較(GAP)表。相同的核苷酸在兩個序列之間用豎線符標(biāo)出。
表3為本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設(shè)計的降鈣素基因相關(guān)肽與人類降鈣素基因相關(guān)肽的氨基酸序列(GenPept Accession No.K03512.1)的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用用豎線符標(biāo)出。
實施例1，降鈣素基因相關(guān)肽基因的合成1.基因合成(gene synthesis)降鈣素基因相關(guān)肽基因由本實驗室根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計并委托上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成之后連入pGEM-5zf載體。
2.酶切(restriction enzyme cutting)將含合成基因的質(zhì)粒載體用BamHI及SacI雙酶切，切下合成的降鈣素基因相關(guān)肽基因；3.連接(ligation)將切下的基因連入已經(jīng)用BamHI及SacI切好的質(zhì)粒pBI121和改造的pCAMBIA2301植物表達(dá)載體大片段中，用藍(lán)白篩選檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌陽性克隆。
4.基因的PCR檢測以以下序列為引物，用合成的基因為模板進(jìn)行PCR檢測SEQ ID NO.1GGA ATT CCG GAT CCA TGG GTT GCGSEQ ID NO.2CCC AAG GTT GCA GCT CGT TAT TAG AAAGCTPCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、56℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為151bp。
將基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體后用以下引物對所含基因進(jìn)行PCR檢測SEQ ID NO.3ATG GCT TGC GAT ACT GCT ACCSEQ ID NO.4CAT CGC AAG ACC GGC AAC AGPCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為200bp。
實施例2，降鈣素基因相關(guān)肽基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明的降鈣素基因相關(guān)肽基因的全長為151bp(含接頭)，詳細(xì)序列見SEQ IDNO.5，其中開放讀框位于15-136位核苷酸。根據(jù)推導(dǎo)出的全長降鈣素基因相關(guān)肽的氨基酸序列，共37個氨基酸殘基，分子量為3792.3pI為9.50。詳細(xì)序列見SEQID NO.6。
將按植物偏愛密碼子設(shè)計合成的降鈣素基因相關(guān)肽全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與人類降鈣素基因相關(guān)肽基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與人類降鈣素基因相關(guān)肽基因的全編碼序列(GenBank AccessionNo.K03512.1)有72％的相同性(見表2)，在氨基酸水平上，它與人類降鈣素基因相關(guān)肽(GenPept Accession No.AAA52011.1)的第36-72位氨基酸殘基有100％的相似性(見表3)。由上可見，在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽與人類降鈣素基因相關(guān)肽基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
實施例3，降鈣素基因相關(guān)肽在煙草和番茄細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)含目的基因(降鈣素基因相關(guān)肽基因)表達(dá)載體的構(gòu)建將含降鈣素基因相關(guān)肽基因的中間載體PGEM-5zf進(jìn)一步克隆到植物雙元表達(dá)載體(如pBI121、pCAMBIA2301)中，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(如EHA105)中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草和番茄。
利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2mlYEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；7.將葉片轉(zhuǎn)到含卡那霉素(Kan)的篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見抗性愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化番茄1.將番茄種子滅菌后播于1/2MS培養(yǎng)基上，約10天左右長出子葉；2.農(nóng)桿菌培養(yǎng)過夜，OD為0.8-1.5，室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，加入子葉浸泡10分鐘；4.在無菌濾紙上吸干菌液；將子葉放在MS1培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)兩天；5.將葉片轉(zhuǎn)到含Kan的愈傷和分化培養(yǎng)基(MS+ZT1.0mg/L+IAA1.0mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見抗性愈傷組織的形成和植株再生；6.待芽長大后約1-2厘米的時將幼芽移植在生根培養(yǎng)基中(1/2MS)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；7.根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化一周，用1％的MS澆灌，移入土中。利用western blot檢測降鈣素基因相關(guān)肽在轉(zhuǎn)基因煙草和番茄植株中的表達(dá)1.蛋白的提取a)取50mg葉片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl0.2g/l，NaCl8g/l)于1.5ml離心管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過程于冰上進(jìn)行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595。
3.SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加樣前，將樣品置于含50mmol/LDTT的加樣緩沖液(2*加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；b)室溫100V電壓下聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。
4.蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移a)轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；b)室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1h，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5.膜上蛋白的檢測a)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g疊氮鈉))；b)再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；c)加入第一抗體(抗降鈣素基因相關(guān)肽的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；d)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌兩次；e)加入底物顯色觀察蛋白條帶。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度24bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GGAATTCCGGATCCATGGGTTGCG(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CCCAAGGTTGCAGCTCGTTATTAGAAAGCT(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3ATGGCTTGCGATACTGCTACC(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.4
CATCGCAAGACCGGCAACAG(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度151bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.51GGAATTCCGGATCCATGGCTTGCGATACTGCTACCTGCGTTACTCATAGG51 CTTGCTGGACTTCTTTCTAGGTCTGGAGGAGTTGTTAAGAACAACTTCGT100 TCCAACCAACGTTGGATCTAAGGCTTTCTAATAACGAGCTCCAAGCTTGG151 G(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度37氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.61ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF37表2p 18 gcttgcgatactgctacctgcgttactcataggcttgctggacttctttc|| || || ||||| || || || |||||| |||| || || | ||h 106 gcctgtgacactgccacttgtgtgactcatcggctggcaggcttgctgagp 69 taggtctggaggagttgttaagaacaacttcgttccaaccaacgttggat|| || || || || || ||||||||||| || || ||||| || || |h 156 cagatcagggggtgtggtgaagaacaactttgtgcccaccaatgtgggttp 119 ctaaggctttc| || || ||h 206 ccaaagcctttPercent Identity72％in nt overlap上列本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設(shè)計的降鈣素基因相關(guān)肽的核酸序列下列人類的降鈣素基因相關(guān)肽的核酸序列(GenBank Accession No.K03512.1)表3p ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 37|||||||||||||||||||||||||||||||||||||h 36 ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 72plantcgrp本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設(shè)計的降鈣素基因相關(guān)肽氨基酸序列humcgrp人類降鈣素基因相關(guān)肽氨基酸序列(GenBankAccessionNo.AAA52011.1)
權(quán)利要求
1.一種人工合成的DNA分子，其特征在于，它包括根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計的編碼具有降鈣素基因相關(guān)肽活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列。
4.一種在植物中表達(dá)的降鈣素基因相關(guān)肽多肽，其特征在于，它包括具有SEQID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是在植物中表達(dá)的具有SEQ IDNO.6序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是真核細(xì)胞。
8.一種在植物中產(chǎn)生和表達(dá)具有降鈣素基因相關(guān)肽活性的多肽的方法，特征在于其步驟如下(1)將人工合成的編碼具有降鈣素基因相關(guān)肽活性多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成降鈣素基因相關(guān)肽蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.5中從核苷酸第18-130位的核苷酸序列有至少75％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成降鈣素基因相關(guān)肽蛋白的重組細(xì)胞(3)在適合表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)再生重組細(xì)胞，獲得表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。
9.一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
10.一種用于檢測樣品中是否存在降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用權(quán)利要求9所述探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于降鈣素基因相關(guān)肽核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度為15～50個核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種按植物偏愛密碼子設(shè)計合成的編碼降鈣素基因相關(guān)肽的基因。涉及包含所說基因的融合基因構(gòu)建體,攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體。該表達(dá)載體具有在普通植物中高效表達(dá)的特性。還涉及被所說的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞,以及由所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽的轉(zhuǎn)基因植物及其后代,包括植物種子及植物組織。本發(fā)明還提供了在樣品中檢測降鈣素基因相關(guān)肽核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C07K14/575GK1342756SQ0112691
公開日2002年4月3日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者唐克軒, 龐永珍, 趙凌俠, 孫小芬 申請人:復(fù)旦大學(xué)