專利名稱：按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術領域的基因序列，更具體地，涉及一種按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列。
背景技術：
牛蛙核糖核酸酶(Rana catesbeiana RNase，Rcr)分子量小、細胞毒性強，是臨床惡性腫瘤治療常用的細胞毒素。目前臨床用Rcr主要通過組織提取法獲得，因受組織來源和Rcr含量的限制，使Rcr在臨床應用受限(Liao，etal.Protein Expr Purif.1996，7(2)194-202)。隨著分子生物學和基因工程技術的發(fā)展和應用，利用基因工程技術生產Rcr已成為可能，為Rcr生產和緩解或解決臨床供不應求問題提供了一種新思路。
經對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，雖然付勇等(腫瘤研究與臨床，2004，16(4)217-220)利用原核系統(tǒng)(大腸桿菌)成功地表達了Rcr，不過包括細菌在內的原核表達系統(tǒng)與某些真核表達系統(tǒng)如酵母、動物細胞和轉基因動物與高等植物表達系統(tǒng)相比，在安全、生產成本和規(guī)模化生產方而存在明顯缺陷(Fischer，et al.Transgenic Research，2000，9279-299)，而目前尚未見有按植物偏愛密碼子設計合成Rcr基因，在植物中成功生產Rcr的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中的不足，本發(fā)明提供一種按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列。本發(fā)明中公開一種按植物偏愛密碼子原則設計和人工合成Rcr基因序列和上述基因編碼蛋白質分子的序列。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明按植物偏愛密碼子合成的DNA分子，該分子包括編碼具有牛蛙Rcr蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列有至少70％的同源性，該序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
所述的核苷酸序列在60℃-65℃條件下，用洗膜液(1*SSC，0.1％SDS)(詳見公開文獻金冬雁，等譯著.《分子克隆實驗指南》，第2版，北京，科學出版社，2002)洗滌雜交膜，與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列雜交。
所述的序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列。
所述的Rcr蛋白質多肽，其在植物中表達，包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。
本發(fā)明提供了一種載體，包含上述的DNA分子。用該載體轉化的宿主細胞是真核細胞。在實例中該宿主細胞是番茄和煙草細胞。
在本發(fā)明中，“按植物偏愛密碼子”、“人工合成”DNA是指，該DNA或片段是依據(jù)在植物中編碼氨基酸密碼子使用的偏好通過人工設計和化學合成實現(xiàn)的，并于連入相應的克隆載體(本發(fā)明為pUC18質粒)。
在本發(fā)明中，術語“牛蛙核糖核酸酶(或多肽)編碼序列”指編碼具有牛蛙核糖核酸酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第51-449位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框第51-449位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中第51-449位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的牛蛙核糖核酸酶相同功能的蛋白的SEQID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發(fā)明中，術語“牛蛙核糖核酸酶蛋白序列或多肽”指具有牛蛙核糖核酸酶蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與天然牛蛙核糖核酸酶相同功能的SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括牛蛙核糖核酸酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的牛蛙核糖核酸酶的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與牛蛙核糖核酸酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗牛蛙核糖核酸酶的抗體或抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“牛蛙核糖核酸酶保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產生。
表1 牛蛙核糖核酸酶(Rcr)保守性變異多肽氨基酸替換表


發(fā)明還包括人工合成的Rcr蛋白或多肽的類似物。這些類似物與Rcr的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒、粘粒和入噬菌體等。在植物中表達或生產本發(fā)明的Rcr時，可以將Rcr編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成含Rcr表達載體。
如本發(fā)明所使用“可操作地連于”術語是指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、番茄細胞、煙草細胞等植物細胞。
還可用Nothern印跡法技術分析Rcr基因轉錄情況，即分析Rcr的轉錄物RNA在細胞中的存在與否和數(shù)量。
Rcr RNA的Northern印跡分析和特異抗體的Rcr的Western印跡分析聯(lián)合使用，可以證實在生物樣本中Rcr的表達。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有編碼牛蛙核糖核酸酶的核苷酸編碼序列的8-100個連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼牛蛙核糖核酸酶的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在編碼牛蛙核糖核酸酶(Rcr)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產物，其中PCR擴增引物對應于Rcr核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間，引物長度一般為15-50個核苷酸。
本發(fā)明的Rcr核苷酸編碼序列或片段通常可以用人工合成、PCR或重組方法獲得。特別是人工合成方法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的相關核苷酸序列用本領域研究常用的核酸合成儀來實現(xiàn)。對于PCR方法可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，用含有本發(fā)明所公開核酸序列的載體或生物體基因組DNA或mRNA為模板擴增而獲得相關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。
本發(fā)明可以實現(xiàn)在轉基因植物中高效表達Rcr蛋白，該蛋白或多肽對治療腫瘤的復發(fā)和轉移具有重要作用及應用價值。
具體實施例方式
下面結合具體試驗數(shù)據(jù)和實施例進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1Rcr基因合成與序列信息和同源性分析1.Rcr基因合成(gene synthesis)Rcr基因由本實驗室根據(jù)植物偏愛密碼子原則設計并委托上海生工合成之后連入pUC18載體，即pUC18-Rcr；2.Rcr基因序列信息本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設計合成的Rcr基因全長為463bp(含保護堿基和酶切位點序列組成的接頭)，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于51-449位核苷酸。據(jù)此所推導出的全長Rcr的氨基酸序列共133個氨基酸殘基，分子量Mw＝14762.2，等電點pI＝9.23。詳細序列見SEQ ID NO.2。
3.Rcr基因同源性分析將按植物偏愛密碼子設計合成的Rcr全長序列及其編碼蛋白質用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)Rcr基因與牛蛙RNase A(GenBank AccessionNo.AF351209)核苷酸序列的同源性為79％(見表2)，氨基酸序列同源性為96％(見表3)；
本發(fā)明按植物偏愛密碼子設計人工合成的Rcr核苷酸序列與牛蛙RNase A核苷酸序列(GenBank Accession No.AF351209)同源比較(GAP)，相同的核苷酸在兩個序列之間用豎線符標出，如表279％ identity in 142 nt overlapQuery 168 AACTGCAACACTATTATGGATAACAACATTTACATTGTTGGAGGACAATGCAAGAGAGTT 227||||| ||||| || ||||| ||||| || || || || ||||| ||||||||| ||||Sbjct 118 AACTGTAACACCATCATGGACAACAATATATATATCGTGGGAGGTCAATGCAAGGGAGTG 177Query 228 AACACTTTCATTATTTCTTCTGCTACTACTGTTAAGGCTATTTGCACTGGAGTTATTAAC 287||||||||||| ||||||||||| || || || ||||| || || || || || || ||Sbjct 178 AACACTTTCATAATTTCTTCTGCAACCACCGTGAAGGCCATCTGTACCGGGGTGATAAAT 237Query 288 ATGAACGTTCTTTCTACTACTAGATTCCAACTTAACACTTGCACTAGAACTTCTATTAC 346||||| || | ||| || |||||||| || |||||||||||| | |||||||||||Sbjct 238 ATGAATGTATTAAGTACCACAAGATTCCAGCTCAACACTTGCACTCGTACTTCTATTAC 296Query按植物偏愛密碼子設計人工合成的Rcr核苷酸序列Sbjct牛蛙RNase A核苷酸序列表2按植物偏愛密碼子設計人工合成的Rcr核苷酸序列與牛蛙RNase A核苷酸序列同源比較(GAP)。
本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設計的Rcr氨基酸序列與牛蛙RNase A的氨基酸序列(GenPept Accession No.AAK3025.1)同源比較(FASTA)，其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，如表396％ identity in 128 aa overlapQuery 1MCAKXXXXXXXXXXXXXXXXXXQNWATFQQKHXXXXXXXXXXXXMDNNIYIVGGQCKRVN 60MCAKSLLLVFGILLGLSHLSLSQNWATFQQKHI NT INCNTIMDNNIYIVGGQCK VNSbjct 1MCAKSLLLVFGILLGLSHLSLSQNWATFQQKHITNTSSINCNTIMDNNIYIVGGQCKGVN 60Query 61 TFIISSATTVKAICTGVINMNVLSTTRFQLNTCTRTSITPRPCPYSSRTETNYICVKCEN 120TFIISSATTVKAICTGVINMNVLSTTRFQLNTCTRTSITPRPCPYSSRTE NYICVKCENSbjct 61 TFIISSATTVKAICTGVINMNVLSTTRFQLNTCTRTSITPRPCPYSSRTENNYICVKCEN 120Query 121 QYPVHFAGIGRCP 133QYPVHFAGIGRCPSbjct 121 QYPVHFAGIGRCP 133Query按植物偏愛密碼子設計的Rcr氨基酸序列Sbjct牛蛙RNase A的氨基酸序列表3按植物偏愛密碼子設計的Rcr與牛蛙RNase A的氨基酸序列同源比較(FASTA)。
本實施例通過Rcr基因的核苷酸序列和所編碼氨基酸序列與牛蛙RNase A基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AF351209)和氨基酸序列(GenPeptAccession No.AAK3025.1)從表2和表3可見，本實施例的按植物偏愛密碼子設計人工合成的Rcr基因與牛蛙RNase A基因無論是在核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。
牛蛙RNase A被廣泛用于惡性腫瘤治療細胞毒素，在早期腫瘤的復發(fā)和轉移治療具有重要作用及應用價值，可以認為Rcr在惡性腫瘤治療方面具有相似的功能。
實施例2Rcr基因表達載體構建1.酶切(restriction enzyme cutting)對含有Rcr基因pUC18克隆載體(pUC18-Rcr)用Bam H I和Sac I雙酶切，獲得帶有Bam H I及Sac I粘性末端(與表達載體相同)的Rcr基因的DNA片段(基因中可設計有BamH I及Sac I位點)；2.連接(ligation)將切下的基因Rcr連入已經用Bam H I及Sac I切好的質粒pBI121或用pBI121改造過的pCAMBIA2300植物表達載體大片段中，用藍白篩選或PCR方法檢測轉化的大腸桿菌，從而獲得陽性克隆。
3.基因PCR檢測根據(jù)所述基因的核苷酸序列，設計引物Rcr F5’-atg tgc gct aag tctctt ctt c-3’(正向引物)，Rcr R5’-tgg gca tct tcc aat tcc agc-3’(反向引物)為，以含有Rcr基因的載體或宿主菌為模板進行PCR擴增，PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃40秒、56℃40秒和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后以72℃延伸8分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為399bp。
本實施例通過酶切、連接和PCR檢測獲得了植物雙元表達載體，并證實該載體是所希望的含有目的基因Rcr的植物雙元表達載體。
實施例3Rcr基因在煙草和番茄中進行真核細胞表達1.含Rcr基因表達載體工程菌的制備將實施例2所獲得的含有Rcr基因的植物表達載體，通過酶切鑒定或測序，在確保表達載體中的目的基因(Rcr基因)閱讀框架正確的前提下，再將所構建的表達載體通過凍融法轉化農桿菌(如EHA105)中獲得植物遺傳轉化的工程菌，利用農桿菌介導法轉化番茄和煙草。
2.農桿菌介導法轉化番茄①將番茄(Lycopersicon esculentum.var.cerasiforme cv.Yellow fruitNo.22)(22#黃櫻桃番茄)種子用75％乙醇和20％次氯酸鈉滅菌后播于1/2MS培養(yǎng)基上，待6~8天子葉展開后，將子葉或下胚軸剪成小片(小段)用于轉化；②農桿菌過夜培養(yǎng)，待菌搖至OD600＝0.8~1.0，室溫下6，000g離心5~8min；③棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸，然后加入準備好的外植體(子葉或下胚軸)浸泡8~10分鐘；④取出染菌后的外植體，用無菌吸水紙吸去多余菌液；然后將外植體放在共培養(yǎng)的MS1培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L)上，共培養(yǎng)36小時；⑤共培養(yǎng)后將外植體轉移到含Kan的分化篩選培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA1.0mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，在25-28℃光照下培養(yǎng)，3~4周可見形成抗性愈傷組織或再生芽；⑥待再生芽長至約3-4厘米時將再生芽切下移植到生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L+Cb 250mg/L)上進行生根培養(yǎng)，7~10天左右生根；⑦根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈根系上所附著的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化并用1％的MS補充營養(yǎng)和水分，一周后移入土中。
3.農桿菌介導法轉化煙草①取含表達載體的農桿菌500μL接種于100mL LB+Rif(40mg/L)+Str(25mg/L)+Kan(75mg/L)液體培養(yǎng)基中，28℃過夜搖菌，使其OD600≈0.8-1.0，8000rpm下離心收集菌體并用等體積的MS重懸備用；
②用滅菌剪刀將健壯煙草(Nicotiana tabacum L.cv.BaiRihong)(百日紅)苗的幼嫩葉片剪成0.6×0.6cm2見方葉盤(去主脈)，為防止葉盤脫水置其于MS1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)培養(yǎng)基上；③取約120~150片葉盤在放入用MS重懸農桿菌中，在60-80rpm搖床上室溫搖動10min，使農桿菌被葉盤充分吸附；④吸附完成后用滅菌吸水紙吸去多余菌液；⑤將吸干的葉盤小心置于加蓋一層濾紙的共培養(yǎng)的MS1培養(yǎng)基上(葉盤間不要疊加在一起)，用parafilm封好培養(yǎng)皿，于暗黑處25℃共培養(yǎng)48小時；將共培養(yǎng)后的葉盤直接轉入分化培養(yǎng)基MS2(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan45mg/L+Cb400mg/L)上，盡可能使葉盤邊緣與培養(yǎng)基接觸，每2周轉接1次，其間培養(yǎng)條件為25℃，光周期14小時/10小時(光/暗)；⑥待葉盤邊緣的再生芽長至3-4厘米(約30天)，切下置于生根培養(yǎng)基1/2MS中生根；⑦待生根后用水沖去根部粘附的培養(yǎng)基，然后栽入盛有預先用自來水清洗過的珍珠巖的營養(yǎng)缽中，馴化7-10天后移入帶有營養(yǎng)土的花盆中，細心養(yǎng)護，用于以后的研究。
4.Rcr基因在轉基因番茄或煙草基因組中拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從番茄或煙草葉片(果實)中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用HindIII、Xba I、Bam H I和EcoR I酶切DNA[30μg(微克)/樣品]后，將酶切后的DNA轉至雜交膜(尼龍膜)上后。使用AmershamPharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將Rcr基因編碼區(qū)標記為探針，然后進行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，0.I％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIGlabeled試劑盒說明書)。依據(jù)(Southern blot)的雜交膜上出現(xiàn)的雜交條帶，確定Rcr基因在轉基因番茄或煙草基因組中的拷貝數(shù)。
5.Rcr在轉基因番茄和煙草植株中轉錄水平表達(Northern blot)1)RNA的提取取轉基因煙草和番茄(以非轉基因煙草“百日紅”和“22#黃櫻桃番茄”作陰性對照)嫩葉，用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2)RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1 OD260＝40μg/ml。
3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉入55℃水浴中。③于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，5V/cm電壓電泳5小時左右。
4)RNA尼龍膜上轉移①轉移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。②將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉移12-20小時。④轉移后，將膜于80℃烘烤2小時。
5)膜上雜交信號的檢出①將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/mL鮭魚精DNA]，65℃下預雜交2小時。②將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入①的雜交液中，于65℃雜交16-24小時。③取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉入洗膜液II(0.1*SSC，0.1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。④用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；未轉化煙草和番茄(陰性對照)未檢測到雜交信號，轉化Rcr基因的煙草和番茄的雜交信號在株間存在一定差異，說明Rcr基因在轉基因煙草和番茄株間在轉錄水平存在差異。
6.Rcr在轉基因番茄和煙草植株中翻譯水平表達(western blot)1)蛋白提取(在冰上進行)①取50mg葉片，加入100uL 1×PBS(KH2PO40.2gL，Na2HPO41.15g/L，KCl0.2g/L，NaCl 8g/L)于1.5mL離心管中研磨；②13000rpm 4℃離心10分鐘；③取上清，備用。
2)蛋白定量參考Bradford法(Bradford，1976)，取2uL蛋白樣品加1mL；Bradford試劑混勻后，分光光度計測OD595。
3)SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。
①加樣前樣品中加入少量的含50mM/L DTT加樣緩沖液(2×加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81mL；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20mL)，煮沸10分鐘；②室溫100V電壓下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達到凝膠底部。
4)蛋白質向硝酸纖維膜上轉移①轉移之前，用轉移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mM Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；②室溫下用半干式電轉儀轉移1h，凝膠兩側各墊3層Whatman濾紙；5)硝酸纖維膜蛋白檢測①將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100mL 1×PBS(含0.5g疊氮鈉))；②再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；③加入第一抗體(抗Rcr的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟②，洗滌三次；④加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟②，洗滌兩次；⑤加入底物顯色觀察蛋白條帶。
本實施例通過步驟1、2和3的實施獲得了含Rcr工程菌和轉Rcr基因的番茄和煙草植株。Southern blot分析顯示，在轉Rcr的番茄和煙草基因組中外源基因Rcr拷貝數(shù)為1-6個，而陰性對照卻未檢測到信號，說明外源基因Rcr已成功地整合到轉基因番茄和煙草基因組中。Northern blot和Western blot分析表明，外源基因Rcr在轉基因番茄和煙草中已成功表達(在轉錄和翻譯水平)，而非轉基因番茄和煙草植株中卻未檢測到Rcr的表達，說明Rcr已成功在轉基因植物中表達。在植物中高效表達Rcr蛋白，不僅可能提高該蛋白或多肽的安全性和生產成本，用于早期腫瘤的復發(fā)和轉移治療具有較好的療效，在癌癥(cancer)治療方面具有重要應用價值。
<110>上海交通大學<120>按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列<160>2<170>Patent In version 3.3<210>1<211>463<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(51)...(449)<223>按植物偏愛密碼子原則設計合成，編碼Rcr蛋白<400>1ggggatccgg taccatgcat catcatcatc atcatgatga tgatgataag atgtgcgcta 60agtctcttct tcttgttttc ggaattcttc ttggactttc tcatctttct ctttctcaaa 120actgggctac tttccaacaa aagcatatta ttaacactcc aattattaac tgcaacacta 180ttatggataa caacatttac attgttggag gacaatgcaa gagagttaac actttcatta 240tttcttctgc tactactgtt aaggctattt gcactggagt tattaacatg aacgttcttt 300ctactactag attccaactt aacacttgca ctagaacttc tattactcca agaccatgcc 360catactcttc tagaactgag actaactaca tttgcgttaa gtgcgagaac caatacccag 420ttcatttcgc tggaattgga agatgcccat aataggagct cgg 463<210>2<211>133<212>PRT<213>人工序列<400>2MCAKSLLLVF GILLGLSHLS LSQNWATFQQ KHIINTPIIN CNTIMDNNIY IVGGQCKRVN 60TFIISSATTV KAICTGVINM NVLSTTRFQL NTCTRTSITP RPCPYSSRTE TNYICVKCEN 120QYPVHFAGIG RCP 13權利要求
1.一種按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列，其特征在于，按植物偏愛密碼子合成的DNA分子，該分子包括編碼具有牛蛙Rcr蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列有至少70％的同源性，該序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列，其特征是，所述的核苷酸序列在60℃-65℃條件下，用洗膜液(1*SSC，0.1％SDS)洗滌雜交膜，與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-449位的核苷酸序列雜交。
3.根據(jù)權利要求1所述的按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列，其特征是，所述的Rcr蛋白質活性的多肽，其在植物中表達，包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。
全文摘要
一種按植物偏愛密碼子的Rcr基因序列，合成的DNA分子，該分子包括編碼具有牛蛙Rcr蛋白質活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51－449位的核苷酸序列有至少70％的同源性，該序列編碼具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。該多肽產品可以用于早期腫瘤的復發(fā)和轉移治療，在癌癥(cancer)治療方面具有重要應用價值。
文檔編號C12N9/22GK1807643SQ20061002323
公開日2006年7月26日 申請日期2006年1月12日 優(yōu)先權日2006年1月12日
發(fā)明者趙凌俠, 崔麗潔, 唐克軒, 開國銀, 錢虹妹, 陳玉輝, 張慧 申請人:上海交通大學