專利名稱：按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因序列，更具體地，涉及一種按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列。
背景技術(shù)：
Folkman(Ann Surg，1972，175(3)409-416)認(rèn)為“腫瘤生長依賴血管生成”，F(xiàn)errara(Endocr Rev，1997，18(1)4-25)認(rèn)為血管生成最關(guān)鍵因子是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，Brown等(Hum Pathol，1995，26(1)86-91)研究結(jié)果顯示，常見惡性實(shí)體瘤中均有VEGF的過量表達(dá)?？贵w是腫瘤治療中靶標(biāo)最明確的特異靶向藥物，克服了傳統(tǒng)腫瘤治療的手術(shù)和放、化療靶向性差的缺陷。不過抗體的分子量大(難以進(jìn)入腫瘤組織)、用量大、價(jià)格昂貴和存在免疫源性(目前抗體多為鼠源)等問題在腫瘤治療中并未得到實(shí)質(zhì)性解決，因而生產(chǎn)小分子量、人源化單鏈抗體是目前腫瘤靶向治療的主要趨勢。VEGF是惡性腫瘤治療的最理想靶標(biāo)，因此，生產(chǎn)人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體(human originate vascularendothelial growth factor single chain variable fragments，hEscFv)對(duì)惡性腫瘤的治療具有重要意義。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，盡管2004年2月美國FDA批準(zhǔn)基因工程VEGF單克隆抗體“阿瓦斯汀”(Avastin)用直腸癌治療(Muhsin et al，2004，Nature Reviews Drug Discovery 2004，3995-996)，王大章等(中華醫(yī)學(xué)雜志，2000，80(7)526-529)利用原核系統(tǒng)(大腸桿菌)表達(dá)抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體。而植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)藥用蛋白和抗體在產(chǎn)品安全、生產(chǎn)成本和規(guī)?；a(chǎn)方面顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(Fischer et al.Transgenic Research，2000，9279-299；Ma et al.Naturereviews genetics，2003，4794-805)，不過未見利用植物系統(tǒng)表達(dá)hEscFv的相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列，在本發(fā)明中公開了一種按植物偏愛密碼子原則設(shè)計(jì)和人工合成人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體基因hEscFv序列和上述基因編碼蛋白質(zhì)分子的序列。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的DNA分子，該分子包括編碼具有hEscFv抗體活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從第51-800位的核苷酸序列有至少70％的同源性，該序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
所述的核苷酸序列在60℃-65℃條件下，用洗膜液(1*SSC，0.1％SDS)(詳見公開文獻(xiàn)金冬雁，等譯著.《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第2版，北京，科學(xué)出版社，2002)洗滌膜，與SEQ ID NO.1中從第51-800位的核苷酸序列雜交。
所述的hEscFv抗體活性多肽，其在植物中表達(dá)，包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
在本發(fā)明提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是番茄和煙草細(xì)胞。
在本發(fā)明中，“按植物偏愛密碼子”、“人工合成”DNA是指，該DNA或片段是依據(jù)在植物中編碼氨基酸密碼子使用的偏好通過人工設(shè)計(jì)和化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)的，并連入相應(yīng)的克隆載體(本發(fā)明為pUC18質(zhì)粒)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體編碼序列”指編碼具有人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第51-800位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框第51-800位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中第51-800位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-800位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51-800位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體蛋白序列或多肽”指具有人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與在植物中表達(dá)的人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體相同功能的SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1一10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體(hEscFv)的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低嚴(yán)緊條件下能與人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hEscFv的抗體或抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1 hEscFv保守性變異多肽氨基酸替換表


發(fā)明還包括人工合成的人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體基因(hEscFv)在植物中表達(dá)hEscFv蛋白或多肽的類似物。這些類似物與hEscFv的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成、加工或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒、粘粒和λ噬菌體等。在植物中表達(dá)或生產(chǎn)本發(fā)明的hEscFv時(shí)，可以將hEscFv編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成含hEscFv表達(dá)載體。
如本發(fā)明所使用“可操作地連于”術(shù)語是指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、番茄細(xì)胞、煙草細(xì)胞等植物細(xì)胞。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hEscFv基因轉(zhuǎn)錄情況，即分析hEscFv的轉(zhuǎn)錄物RNA在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量多寡。
hEscFv轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA的Northern印跡分析和特異抗體的hEscFv的Western印跡分析聯(lián)合使用，可以證實(shí)在生物樣本中hEscFv的表達(dá)。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有編碼hEscFv核苷酸編碼序列的8-50個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hEscFv的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測樣品中是否存在編碼人源化抗血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)抗體(hEscFv)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品的DNA進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hEscFv核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間，引物長度一般為15-50個(gè)核苷酸。
本發(fā)明的hEscFv核苷酸編碼序列或片段通?？梢酝ㄟ^人工合成、PCR或重組方法獲得。特別是人工合成方法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的相關(guān)核苷酸序列用本領(lǐng)域研究常用的核酸合成儀來實(shí)現(xiàn)。對(duì)于PCR方法可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，用含有本發(fā)明所公開核酸序列的載體或生物體基因組DNA或mRNA為模板擴(kuò)增而獲得相關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽鏈而加以生產(chǎn)(Stewar等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的蛋白分子。
本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)在植物系統(tǒng)中高效表達(dá)hEscFv多肽，該多肽將對(duì)人血管內(nèi)皮生長因子具有特異的靶向性，抑制腫瘤血管生長從而對(duì)惡性腫瘤治療方面具有重大應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例儀用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hEscFv基因合成與序列信息和同源性分析1.hEscFv基因合成(gene synthesis)hEscFv基因由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)植物偏愛密碼子原則設(shè)計(jì)并委托上海生工合成之后連入pUC18載體，即pUC18-hEscFv，并經(jīng)過2次測序加以驗(yàn)證；2.hEscFv基因序列信息本發(fā)明的按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的hEscFv基因全長為814bp(含保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)接頭)，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1。其中開放讀框位于51-800位核苷酸，是由重鏈可變區(qū)(VH)(51-422位)、柔性肽3×(Gly4Ser1)編碼區(qū)(423-467位)和輕鏈可變區(qū)(VL)(468-800位)構(gòu)成的開放讀框序列。據(jù)此所推導(dǎo)出的全長hEscFv的氨基酸序列共250個(gè)氨基酸殘基，分子量Mw＝26763.14，等電點(diǎn)pI＝6.23，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.2。
3.hEscFv基因同源性分析將按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的hEscFv全長序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hEscFv基因與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)片段抗體基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AF226875.1)同源性為75％(見表2)，氨基酸序列(GenPept Accession No.AAF85943.1)同源性為96％(見表3)；本發(fā)明按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的hEscFv與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)片段抗體基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AF226875.1)同源比較(GAP)，相同的核苷酸在兩個(gè)序列之間用豎線符標(biāo)出，如表275％ identity in 343 nt overlapQuery 54 gaggttcaacttcttgagtctggagctgagcttgttaagccaggagcttctgttaagttc 113||||| || ||||| |||||||| || |||||||| |||||||| || || || |||||Sbjct 1 gaggtacagcttctggagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagtcaagttg 60Query114 tcttgcactgcttctggattcaacattaaggatacttacatgcattgggttaagcaaaga 173|| ||||| |||||||| ||||||||||| || || || ||||| ||||| ||||| ||Sbjct 61 tcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagagg 120Query174 ccagagcaaggacttgagtggattggaagaattgatccaagaaacggaaacactaagtac 233|| || || || || |||||||||||||| |||||||||| || || ||||| ||Sbjct121 cctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatactaaatat 180Query234 --cttggacttaaccaaggaaaggctactattactgctgatacttcttctaacactgctt 291| | | || ||| || ||||| ||||| || || || || || || ||||| || |Sbjct181 gacccgaagtt--ccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcct 238Query292 accttcaactttcttctcttacttctgaggatactgctgtttactactgcgctagaccat 351
|||| || || || || |||||||| ||||| || || ||||| ||||| ||||Sbjct239 acctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtgctaggccat 298Query352 ctatttactacggatcttctcattcttacttcgatgtttgggg 394||||||||||||| | || | ||||||||||| |||||Sbjct299 ctatttactacggtagtaaccactggtacttcgatgtctgggg 341Query按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的hEscFv核苷酸序列Sbjct抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)片段抗體基因核苷酸序列表2按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的hEscFv與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈可變區(qū)片段抗體基因核苷酸序列同源比較(GAP)。
按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的hEscFv所編碼氨基酸序列與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體氨基酸序列(GenPept Accession No.AAF85943.1)同源(FASTA)比較，其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出，如表3。
96％ identity in 249aa overlapQuery 2 EVQLLESGAELVKPGASVKFSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPRNGNTKY 61EVQLLESGAELVKPGASVK SCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDP NGNTKYSbjct 1 EVQLLESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKY 60Query 62 LGLNQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARPSIYYGSSHSYFDVWGQXXXXX 121QGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARPSIYYGS+H YFDVWG GTSVTSbjct 61 DPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCARPSIYYGSNHWYFDYWGAGTSVT 120Query 122 XXXXXXXXXXXXXXXXXXDIVLTQFPASLSYFLGQRATISCRASQSVSTYGYSYMHWNQQ 181VSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQFPASLSVFLGQRATISCRASQSVSTYGYSYMHWNQQSbjct 121 VSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQFPASLSVFLGQRATISCRASQSVSTYGYSYMHWNQQ 180Query 182 KPGQPPRLLIYLVSNLEFGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPYTF 241KPGQPPRLLIYLVSNLEFGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPYTFSbjct 181 KPGQPPRLLIYLVSNLEFGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELPYTF 240Query 242 GGGTKLEIK 250GGGTKLEIKSbjct 241 GGGTKLEIK 249Query按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的hEscFv所編碼氨基酸序列
Sbjct抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體氨基酸序列表3按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)人工合成的hEscFv所編碼氨基酸序列與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體氨基酸序列同源比較(FASTA)本實(shí)施例通過hEscFv基因合成(步驟1)的實(shí)施合成了包括接頭在內(nèi)814bp的核苷酸序列；通過序列信息分析，證明了所合成的814bp的核苷酸序列是hEscFv基因序列(SEQ ID NO.1)，并推斷該基因編碼250個(gè)氨基酸序列(SEQ IDNO.2)。
本實(shí)施例通過hEscFv基因同源性分析(步驟3)，發(fā)現(xiàn)按植物偏愛密碼子合成的hEscFv基因的核苷酸序列及其所編碼氨基酸序列與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體基因核苷酸序列(GenBank Accession No.AF226875.1)和氨基酸序列(GenPept Accession No.AAF85943.1)，同源性分別為75％(見表2)和96％(見表3)。由此可見，hEscFv基因與抗人血管內(nèi)皮生長因子單鏈抗體在核苷酸和氨基酸序列上均具有較高的同源性，可以認(rèn)為hEscFv具有抗人血管內(nèi)皮生長因子的生長的功能。
實(shí)施例2hEscFv基因載體構(gòu)建1.酶切(restriction enzyme cutting)對(duì)含有hEscFv基因pUC18克隆載體(pUC18-hEscFv)用Bam H I和Sac I雙酶切，獲得帶有Bam H I及Sac I粘性末端(與表達(dá)載體相同)的hEscFv基因的DNA片段(基因中設(shè)計(jì)有BamH I及Sac I位點(diǎn)接頭)；2.連接(ligation)將切下的基因連入已經(jīng)用Bam H I及Sac I切好的質(zhì)粒pBI121或用pBI121改造過的pCAMBIA2300植物表達(dá)載體大片段中，用藍(lán)白篩選或PCR方法檢測轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，從而獲得陽性克隆。
3.目的基因的PCR檢測根據(jù)所述基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物hEscFv F5’-atg gag gtt caactt ctt gag-3’(正向引物)和hEscFv R5’-ctt aat ctc aag ctt agt tcc-3’(反向引物)，以含所述基因的載體或宿主菌為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃3分鐘，隨之以94℃40秒、60℃40秒和72℃1分鐘10秒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸8分鐘。電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長度為750bp。
本實(shí)施例通過步驟1、2和3的實(shí)施所獲得的植物雙元表達(dá)載體是所希望的含有目的基因hEscFv的植物雙元表達(dá)載體。
實(shí)施例3hEscFv基因在番茄和煙草真核細(xì)胞中表達(dá)1.含目的基因(hEscFv)植物表達(dá)載體的工程菌制備將實(shí)施例2所獲得的含有hEscFv基因的植物表達(dá)載體，通過酶切鑒定或測序，在確保表達(dá)載體中的目的基因(hEscFv)閱讀框架和與載體連接正確的前提下，再將所構(gòu)建的載體通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(如EHA105)中獲得植物遺傳轉(zhuǎn)化的工程菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄和煙草。
2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄①將番茄(Lycopersicon esculentum.var.cerasiforme cv.Yellow fruitNo.22)(22#黃櫻桃番茄)種子用75％乙醇和20％次氯酸鈉滅菌后播于1/2MS培養(yǎng)基上，待6~8天子葉展開后，將子葉或下胚軸剪成小片(小段)用于轉(zhuǎn)化；②農(nóng)桿菌過夜培養(yǎng)，待菌搖至OD600＝0.8~1.0，室溫下6,000g離心5~8min；③棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸，然后加入準(zhǔn)備好的外植體(子葉或下胚軸)浸泡8~10分鐘；④取出染菌后的外植體，用無菌吸水紙吸去多余菌液；然后將外植體放在共培養(yǎng)的MS1培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+I AA 1.0mg/L)上，共培養(yǎng)36小時(shí)；⑤共培養(yǎng)后將外植體轉(zhuǎn)移到含kanamycin的分化篩選培養(yǎng)基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，在25-28℃光照下培養(yǎng)，5~6周可見形成抗性愈傷組織或再生芽；⑥待再生芽長至約3-4厘米時(shí)將再生芽切下移植到生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L+Cb 250mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，7~10天左右生根；⑦根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈根系上所附著的固體培養(yǎng)基，在珍珠巖中馴化并用1％的MS補(bǔ)充營養(yǎng)和水分，1周后移入土中。
3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草①取含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌500μL接種于100mL LB+Rif(40mg/L)+Str(25mg/L)+Kan(75mg/L)液體培養(yǎng)基中，28℃過夜搖菌，待OD600≈0.8-1.0，8000rpm下離心收集菌體并用等體積的MS重懸備用；②用滅菌剪刀將健壯無菌煙草(Nicotiana tabacum L.cv.BaiRihong)(百日紅)苗的幼嫩葉片剪成0.6×0.6cm2見方葉盤(去主脈)，為防止葉盤脫水置其于MS1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)培養(yǎng)基上；③取約120~150片葉盤在放入用MS重懸農(nóng)桿菌中，在60-80rpm搖床上室溫?fù)u動(dòng)10min，使農(nóng)桿菌被葉盤充分吸附；④吸附完成后用滅菌吸水紙吸去多余菌液；⑤將吸干的葉盤小心置于加蓋一層濾紙的共培養(yǎng)的MS1培養(yǎng)基上(葉盤間不要疊加在一起)，用parafilm封好培養(yǎng)皿，于25℃黑暗處共培養(yǎng)48小時(shí)；⑥將共培養(yǎng)后的葉盤直接轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基MS2(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan45mg/L+Cb400mg/L)上，盡可能使葉盤邊緣與培養(yǎng)基接觸，每2周轉(zhuǎn)接1次，其間培養(yǎng)條件為25℃，光周期14小時(shí)/10小時(shí)(光/暗)；⑦待葉盤邊緣的再生芽長至3-4厘米(約30天)，切下置于生根培養(yǎng)基1/2MS中生根；⑧待生根后用水沖去根部粘附的培養(yǎng)基，然后栽入盛有預(yù)先用自來水清洗過的珍珠巖的營養(yǎng)缽中，馴化7-10天后移入帶有營養(yǎng)土的花盆中，細(xì)心養(yǎng)護(hù)，用于以后的研究。
4.hEscFv基因在轉(zhuǎn)基因番茄或煙草基因組中拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從番茄或煙草葉片(果實(shí))中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用HindIII、Xba I、Bam H I和Eco R I酶切DNA[30μg(微克)/樣品]后，將酶切后的DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用AmershamPharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將hEscFv基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于6C℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，0.1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIG labeled試劑盒說明書)。依據(jù)(Southern blot)的雜交膜上出現(xiàn)的雜交條帶，確定hEscFv基因在轉(zhuǎn)基因番茄或煙草基因組中的拷貝數(shù)。
5.hEscFv在轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)(Northern blot)1)RNA的提取取轉(zhuǎn)基因煙草和番茄(以非轉(zhuǎn)基因煙草“百日紅”和“22#黃櫻桃番茄”作陰性對(duì)照)嫩葉，用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2)RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測OD260；RNA含量計(jì)算1OD260＝40μg/ml。
3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6mL25*(倍)電泳緩沖液，加入117mL無菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。③于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4)RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移①轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。②將濕潤的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。④轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5)膜上雜交信號(hào)的檢出①將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/mL鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。②將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入①的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。③取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，0.1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，0.1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。④用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明；未轉(zhuǎn)化煙草和番茄(陰性對(duì)照)未檢測到雜交信號(hào)，轉(zhuǎn)化HEscFv基因的煙草和番茄的雜交信號(hào)在株間存在一定差異，說明HEscFv基因在轉(zhuǎn)基因煙草和番茄株間在轉(zhuǎn)錄水平存在差異。
6.hEscFv在轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株中翻譯水平表達(dá)(western blot)
1)蛋白提取(在冰上進(jìn)行)①取50mg葉片，加入100uL 1×PBS(KH2PO40.2gL，Na2HPO41.15g/L，KCl0.2g/L，NaCl 8g/L)于1.5mL離心管中研磨；②13000rpm 4℃離心10分鐘；③取上清，備用。
2)蛋白定量參考Bradford法(Bradford，1976)，取2uL蛋白樣品加1mL；Bradford試劑混勻后，分光光度計(jì)測OD595。
3)SDS-PAGE分離蛋白SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)。
①加樣前樣品中加入少量的含50mM/L DTT加樣緩沖液(2×加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81mL；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20mL)，煮沸10分鐘；②室溫100V電壓下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達(dá)到凝膠底部。
4)蛋白質(zhì)向硝酸纖維膜上轉(zhuǎn)移①轉(zhuǎn)移之前，用轉(zhuǎn)移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mM Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；②室溫下用半干式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移1h，凝膠兩側(cè)各墊3層Whatman濾紙；5)硝酸纖維膜蛋白檢測①將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動(dòng)、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100mL 1×PBS(含0.5g疊氮鈉))；②再將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；③加入第一抗體(抗HEscFv的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟②，洗滌三次；④加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物)，37℃溫育30分鐘；同步驟②，洗滌兩次；⑤加入底物顯色觀察蛋白條帶。
本實(shí)施例通過步驟1、2和3的實(shí)施獲得了含hEscFv工程菌和轉(zhuǎn)hEscFv基因的番茄和煙草植株。Southern blot分析顯示，在轉(zhuǎn)hEscFv的番茄和煙草基因組中外源基因hEscFv拷貝數(shù)為1-4個(gè)，而陰性對(duì)照卻未檢測到信號(hào)，說明外源基因hEscFv已成功地整合到轉(zhuǎn)基因番茄和煙草基因組中。Northern blot和Westernblot分析表明，外源基因hEscFv在轉(zhuǎn)基因番茄和煙草中已成功表達(dá)(在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平)，而非轉(zhuǎn)基因番茄和煙草植株中卻未檢測到hEscFv的表達(dá)，說明hEscFv已成功在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，對(duì)利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)hEscFv和惡性腫瘤的治療具有重要意義。
<110>上海交通大學(xué)<120>按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列<160>2<170>Patent In version 3.3<210>1<211>814<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(51)...(499)<223>按植物偏愛密碼子原則設(shè)計(jì)合成，編碼hEscFV蛋白<400>1ggggatccgg taccatgcat catcatcatc atcatgatga tgatgataag atggaggttc 60aacttcttga gtctggagct gagcttgtta agccaggagc ttctgttaag ttctcttgca 120ctgcttctgg attcaacatt aaggatactt acatgcattg ggttaagcaa agaccagagc 180aaggacttga gtggattgga agaattgatc caagaaacgg aaacactaag taccttggac 240ttaaccaagg aaaggctact attactgctg atacttcttc taacactgct taccttcaac 300tttcttctct tacttctgag gatactgctg tttactactg cgctagacca tctatttact 360acggatcttc tcattcttac ttcgatgttt ggggacaagg aacttctgtt actgtttctt 420ctggaggagg aggatctgga ggaggaggat ctggaggagg aggatctgat attgttctta 480ctcaattccc agcttctctt tctgttttcc ttggacaaag agctactatt tcttgcagag 540cttctcaatc tgtttctact tacggatact cttacatgca ttggaaccaa caaaagccag 600gacaaccacc aagacttctt atttaccttg tttctaacct tgagttcgga gttccagcta 660gattctctgg atctggatct ggaactgatt tcactcttaa cattcatcca gttgaggagg 720aggatgctgc tacttactac tgccaacata ttagagagct tccatacact ttcggaggag 780gaactaagct tgagattaag taataggagc tcgg 814<210>2<211>250<212>PRT
<213>人工序列<400>2MEVQLLESGA ELVKPGASVK FSCTASGFNI KDTYMHWVKQ RPEQGLEWIG RIDPRNGNTK60YLGLNQGKAT ITADTSSNTA YLQLSSLTSE DTAVYYCARP SIYYGSSHSY FDVWGQGTSV 120TVSSGGGGSG GGGSGGGGSD IVLTQFPASL SVFLGQRATI SCRASQSVST YGYSYMHWNQ 180QKPGQPPRLL IYLVSNLEFG VPARFSGSGS GTDFTLNIHP VEEEDAATYY CQHIRELPYT 240FGGGTKLEIK 250
權(quán)利要求
1.一種按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列，其特征在于，按植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成的DNA分子，該分子包括編碼具有hEscFv抗體活性的多肽的核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從第51-800位的核苷酸序列有至少70％的同源性，該序列編碼具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列，其特征是，所述的核苷酸序列在60℃-65℃條件下，用洗膜液(1*SSC，0.1％SDS)洗滌膜，與SEQ ID NO.1中從第51-800位的核苷酸序列雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的按植物偏愛密碼子的hEscFv基因序列，其特征是，所述的hEscFv抗體活性多肽，其在植物中表達(dá)，包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
全文摘要
一種按植物偏愛密碼子合成hEscFv基因序列，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明包括根據(jù)植物偏愛密碼子設(shè)計(jì)的編碼具有生物活性hEscFv多肽的核苷酸序列，而且核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51－800位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸第51－800位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明所述的hEscFv基因在真核細(xì)胞中所表達(dá)或產(chǎn)生的多肽，其特征在于具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，所述多肽產(chǎn)品對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)具有靶向作用，對(duì)惡性腫瘤的治療具有重要作用及應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1807624SQ20061002323
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月12日
發(fā)明者趙凌俠, 任薇薇, 唐克軒, 開國銀, 錢虹妹, 陳玉輝, 張慧 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)