專利名稱：一種多肽gapM1及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型多肽，稱之為gapM1(globulardomain of adipose abundant manuscript 1，gapM1)及其制備方法。具體地說，本發(fā)明涉及gapM1的氨基酸序列和基因序列、基因密碼子優(yōu)化(無義突變)、蛋白質(zhì)表達、蛋白質(zhì)純化以及功能測定。
背景技術(shù)：
apM1(adipose abundant manuscript 1，apM1)是由脂肪細胞等機體細胞分泌，具有降低血糖、血脂和體重等重要生理功能的血漿蛋白質(zhì)。gapM1是全長apM1的球狀結(jié)構(gòu)域，是全長apM1的活性結(jié)構(gòu)域。全長apM1和gapM1在體內(nèi)同時存在，gapM1是由全長apM1經(jīng)體內(nèi)蛋白酶消化后的產(chǎn)物。全長apM1的球狀結(jié)構(gòu)域(gapM1)有137個的氨基酸殘基。在機體發(fā)揮比全長apM1更強的生物學活性。
目前生產(chǎn)重組gapM1的方法有以下幾種1)，專利WO01/51645A1公開了利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，表達全長apM1，然后再模擬體內(nèi)的代謝過程，用乙?；鹊鞍酌笇⑷LapM1的氨基端切除，從而生成gapM1。這種方法的缺點是生產(chǎn)工藝復雜，成本很高；大腸桿菌表達的全長apM1是以非活性形式的包涵體純在，需要復性；加入蛋白酶后不利于純化；得率非常低。2)，專利WO03/055916A2)公開了在CHO真核表達系統(tǒng)表達全長apM1，然后再利用上述酶切的方法得到gapM1。此種方法雖然表達的gapM1是以活性形式存在，但是CHO真核表達系統(tǒng)表達水平很低；生產(chǎn)周期很長，是大腸桿菌、酵母等表達系統(tǒng)的幾十倍；同時此系統(tǒng)生產(chǎn)成本極高，生產(chǎn)過程難以操控；同樣酶切過程加入蛋白酶后不利于下游純化。3)，專利CN1380304是直接利用大腸桿菌系統(tǒng)表達gapM1，這種方法雖然省去了蛋白酶切的過程，但是gapM1是以非活性形式的包涵體存在，而且沒有了氨基端后的球狀結(jié)構(gòu)域由于二級結(jié)構(gòu)的特點(全β折疊結(jié)構(gòu))，比全長apM1更難在體外復性，得率是上述方法中是最低的；同時很難復性的gapM1在生產(chǎn)工藝絕大多數(shù)步驟中，可溶性很差，給生產(chǎn)過程帶來極大不便。因上述已知技術(shù)存在的種種缺陷，導致國外gapM1的三期臨床實驗終因gapM1制備困難，不能滿足實驗需要而終止。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供多肽gapM1及其制備方法。所述的多肽，為gapM1(globular domain of adipose abundant manuscript 1，gapM1)，gapM1具有序列2的氨基酸序列，由137個氨基酸殘基組成。本發(fā)明提供的制備方法能克服已知技術(shù)的缺點，所制得的多肽gapM1具有以可溶性的活性形式表達，表達水平高，得率高，且生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。
本發(fā)明所述的多肽gapM1經(jīng)密碼子偏好設(shè)計(無義突變)后，利用PCR方法合成經(jīng)過優(yōu)化后的gapM1的基因片段，然后與表達載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞。工程菌或工程細胞經(jīng)擴增，收集培養(yǎng)基上清，應(yīng)用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。
所述編碼gapM1的密碼子具有序列1的核苷酸序列，其它編碼gapM1的密碼子序列是能編碼相應(yīng)氨基酸殘基的任何密碼子。
表1突變核酸序列(無義突變)A
B 將本發(fā)明的gapM1 cDNA片斷與表達載體重組，形成重組表達質(zhì)粒。本發(fā)明所述的表達載體是真核表達載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用真核表達載體，例如pPIC9K等。
上述重組表達載體可按常規(guī)方法導入適宜宿主細胞。本發(fā)明所述的表達細胞是真核表達細胞，能夠表達所述重組表達載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用畢赤酵母菌GS115等。
本發(fā)明的表達產(chǎn)物以具有活性的可溶性形式存在于培養(yǎng)基上清中，培養(yǎng)基上清經(jīng)超濾濃縮、分子篩、離子交換后進行純化即獲得有活性的gapM1。
本發(fā)明從人cDNA文庫中或人腹部脂肪組織中獲取gapM1基因。為了實現(xiàn)gapM1的高效表達，本發(fā)明對其cDNA序列進行密碼子優(yōu)化，從而實現(xiàn)了gapM1在不同表達系統(tǒng)中的高效表達。生產(chǎn)工藝比原核表達系統(tǒng)更容易放大，生產(chǎn)成本也更低。并且純化后的gapM1顯示出更強的降低血糖、血脂和體重等作用。
以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學操作均參照《分子克隆實驗指南》。


圖1是表達上清、純化的電泳圖和免疫印跡檢測。
圖2顯示r-gapM1能夠明顯降低高血糖模型的血糖水平，其中分組1，高劑量r-gapM1組(7.5ug/gBW)，2，中劑量r-gapM1組(5ug/gBW)，3，低劑量r-gapM1組(2.5ug/gBW)，
4，生理鹽水組，5，空白對照組。
圖3顯示r-gapM1能夠明顯降低急性高血脂模型的血脂水平，其中分組1，生理鹽水組，2，低劑量r-gapM1組(2ug/gBW)，3高劑量r-gapM1組(6ug/gBW)。
圖4顯示r-gapM1能夠明顯降低肥胖模型的體重水平。
具體實施例方式
實施例1 gapM1基因的優(yōu)化和制備(1)gapM1基因的優(yōu)化及真核表達質(zhì)粒rpPIC9K/gapM1的構(gòu)建gapM1基因的優(yōu)化方法為按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性將gapM1的cDNA進行優(yōu)化改造。采用PCR方法，利用引物以野生性gapM1的cDNA為模板擴增出優(yōu)化后的gapM1編碼序列。優(yōu)化后的基因與真核表達載體pPIC9K重組，核苷酸序列分析證實基因序列與預期相符。
gapM1密碼子優(yōu)化方法如下采用引物擴增法，根據(jù)酵母密碼子使用的偏好性，合成引物，以野生性gapM1的cDNA序列為模板，進行PCR。PCR產(chǎn)物即為經(jīng)過優(yōu)化的gapM1的編碼基因。優(yōu)化后的編碼基因經(jīng)Xhol和NotI酶切后與pPIC9K重組。
上述限制性內(nèi)切酶購自NEB公司，大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pPIC9K、酵母菌GS115為Invitrogen公司產(chǎn)品。
(2)篩選高拷貝高效表達細胞株將質(zhì)粒rpPIC9K-gapM1電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，使其與酵母菌染色體發(fā)生重組，G418篩選高效表達細胞株。
篩選方法按照invitrogen說明書進行。
挑取上述陽性克隆接種于10ml低營養(yǎng)培養(yǎng)基BMGY〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗中，30℃快速振遙(250RPM)，培養(yǎng)過夜。次目測定光密度OD600，離心棄BMGY培液，用無菌水洗滌后用BMMY培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗稀釋至OD600＝1。每天補加體積百分數(shù)為1％的甲醇兩次，誘導培養(yǎng)3天，離心棄沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清與2x上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS掃描定純度、分子量?？梢娬T導后上清液在分子量約16kd處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，目的蛋白約占上清總蛋白的60％；上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進行。
(3)發(fā)酵表達工程細胞株按上述篩選高表達細胞株作為工程細胞株，然后以30L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱培養(yǎng)2-3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級潔凈度條件下接種于10ml BMGY培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過夜，此為一級種子液。再將一級種子液加入1000ml培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)6-8小時，直至OD600＝6，此為二級種子液。種子菌接入后，自然擴增，待基礎(chǔ)培養(yǎng)基中預加的甘油被耗盡以后，開始補充甘油，補充速度16ml/L/h，待OD600達到120左右，停止補加甘油。待培養(yǎng)液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導。甲醇補料速度從1ml/L/h逐漸升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發(fā)明的發(fā)酵技術(shù)是用低鹽培養(yǎng)基擴增工程菌，誘導前用含微量元素的甘油溶液進行補料，到達一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進行誘導表達。
甲醇誘導30h以后，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中立即放出菌液進行離心，分離沉淀菌體，收集上清進行純化。發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清經(jīng)Millipore超濾裝置(NMWL3000kD，Millipore公司)超濾濃縮至0.4L。
(5)凝膠過濾Sephacryl 100(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH6.4)平衡后，將超濾濃縮液上樣。然后用PB洗脫，流速1ml/min，收集蛋白峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以20倍體積的20mmol/L PB(pH6.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的目的蛋白峰以30ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB pH6.4)線性梯度洗脫，收集蛋白峰，分裝，冷凍干燥，-80℃保存。
(7)純度鑒定及分子量測定樣品進行15％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測定純度、分子量。同時HPLC進一步鑒定純度。所得產(chǎn)品純度96％以上，分子量約16kD。
實施例2 gapM1的性質(zhì)測定應(yīng)用本發(fā)明所制備的gapM1進行活性測定，證實其具有降低血糖、血脂即體重的作用。
(1)降低血糖活性的測定，方法給予C57BL/6J小鼠腹腔一次性注射高劑量鏈脲霉素(STZ)，造成胰島素抵抗型糖尿病模型。對照組給予生理鹽水，治療組給予rgapM1，4小時后測小鼠的空腹血糖水平。
結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示rgapM1具有明顯降低血糖的作用；(2)降低血脂活性的測定，給予C57BL/6J小鼠尾靜脈注射一定劑量的脂肪乳劑，造成急性高血脂模型。然后于一小時后腹腔注射一定劑量的rgapM1，對照組給予生理鹽水，一小時后取血測血脂水平。
結(jié)果見圖3.結(jié)果顯示rgapM1具有明顯降低血脂的作用(3)減肥活性測定給3月齡C57BL/6J小鼠高脂飲食十周，造成飲食性肥胖小鼠模型。對照給予生理鹽水和繼續(xù)給予高脂飲食。治療組給予一定量的rgapM1，每天一次，繼續(xù)給予高脂飲食。二周后治療組體重開始下降。
結(jié)果見圖3，可見gapM1具有明顯的降低體重的作用。
實施例3本發(fā)明方法與已有技術(shù)優(yōu)勢比較之前的已有技術(shù)生產(chǎn)方法是在大腸桿菌系統(tǒng)表達rgapM1，表達的rgapM1是以包涵體形式(非活性形式)存在。所以在rgapM1被表達、純化后需要復性的過程。由于空間結(jié)構(gòu)的特點導致了變性后復性的困難，直接的結(jié)果就是生產(chǎn)得率低，生物學活性低。同時由于復性過程的復雜性，使得復性后的蛋白存在活性不均一和活性不能完全恢復天然活性的問題。
本發(fā)明方法的優(yōu)點在于利用真核表達系統(tǒng)，rgapM1合成后被宿主細胞分泌到培養(yǎng)基中，以可溶的并且具有天然活性的蛋白形式存在。同時，分泌到培養(yǎng)基中的蛋白種類很少，在量上以重組居多，故利于下游工藝的操作，使的得率更高，生產(chǎn)成本降低。
表2是本發(fā)明方法與已有技術(shù)方法的比較。
表2 無需進一步詳細闡述，相信采用上述所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變更和改進。
SEQUENCE LISTING<110>復旦大學<120>gapM1的一種制備方法<130>Fudan-1206<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>411<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(411)<400>1gcc tat gtt tac aga tca gct ttc tcc gtt ggt ttg gag act tac gtt48Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val1 5 10 15act atc cca aac atg cca att aga ttt acc aag atc ttc tac aat cag96Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln20 25 30caa aac cac tat gat ggc tcc act ggt aaa ttc cac tgc aac att cct144Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro35 40 45ggg ctg tac tac ttt gcc tac cac atc aca gtc tat atg aag gat gtg192Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val50 55 60aag gtc agc ctc ttc aag aag gac aag gct atg ctc ttc acc tat gat240Lys Val Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp65 70 75 80
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1.一種多肽gapM1，具有序列2的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽gapM1的制備方法，其特征是包括下述步驟，gapM1經(jīng)密碼子偏好設(shè)計(無義突變)，利用PCR方法合成經(jīng)過密碼子偏愛性優(yōu)化后的gapM1的基因片段，然后與表達載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞，工程菌或工程細胞經(jīng)擴增，收集培養(yǎng)基上清，用分離純化方法獲得高純度目的蛋白，所述編碼gapM1的密碼子具有序列1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中所述的表達載體是真核表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的制備方法，其中所述的表達載體是pPIC9K。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中所述的表達細胞是真核表達細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的制備方法，其中所述的表達細胞是畢赤酵母GS115。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的制備方法，其中所述的分離純化方式是超濾后，進行分子篩和離子交換層析。
8.權(quán)利要求1的多肽gapM1在制備降低血糖藥物中的用途。
9.權(quán)利要求1的多肽gapM1在制備降低血脂藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽gapM1及其制備方法，所述多肽具有序列2的氨基酸序列。gapM1經(jīng)密碼子偏愛性設(shè)計(無義突變)后，用PCR方法合成優(yōu)化的gapM1的基因片段，與表達載體重組，轉(zhuǎn)化相應(yīng)的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞，經(jīng)擴增，收集培養(yǎng)基上清，分離純化獲得高純度目的蛋白。所制得的多肽具有以可溶性的活性形式表達，表達水平高，得率高，具有良好的降低血糖、血脂和體重等作用。本發(fā)明制備方法克服已知技術(shù)的缺點，具有生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低的優(yōu)點。
文檔編號A61K38/17GK1740195SQ200510025128
公開日2006年3月1日 申請日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者湯其群, 劉宏磊, 李希, 宋后燕 申請人:復旦大學