專利名稱：通過終止密碼子連讀的多肽同種型的細胞表面展示的制作方法
通過終止密碼子連讀的多肽同種型的細胞表面展示本發(fā)明涉及用于選擇高產(chǎn)哺乳動物宿主細胞的方法，以及適用于該方法的載體和宿主細胞。此外，本發(fā)明涉及用于以高產(chǎn)率有效產(chǎn)生多肽的方法。選擇高產(chǎn)細胞系是開發(fā)任何生物工藝(bioprocess)中的重要的第一步，是生物技術中最大的挑戰(zhàn)之一。一個問題是這類高產(chǎn)克隆很罕見，可將其許多能量消耗在多肽生產(chǎn)上，并因此具有降低的生長速率。這導致無產(chǎn)或低產(chǎn)細胞的過度生長。但是，在多肽的生產(chǎn)中，希望獲得以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽的細胞系。通常，通過多輪有限稀釋克隆化，隨后進行產(chǎn)物分析來選擇高產(chǎn)細胞系。但是，這種傳統(tǒng)途徑有幾個缺點，因為它既費力又費錢。除此之外，整個過程很耗時，可花費幾個月來完成，即使這樣，也不能保證克隆細胞系穩(wěn)定和可用于工業(yè)生物工藝。此外，最高的生產(chǎn)者的選擇可妥協(xié)于可以篩選的細胞數(shù)目上的實際限制，從而潛在地降低了低豐度、高生產(chǎn)力細胞的選擇效率。因此，已有許多努力來提供用于選擇高產(chǎn)克隆的備選方法。例如，流式細胞術已使得可更容易地監(jiān)測生產(chǎn)力和分離具有特定特征的細胞。流式細胞術的重要優(yōu)勢包括以區(qū)分細胞亞群的能力快速篩選大量細胞的能力，有效選擇顯示所希望的特征的低豐度細胞的能力。大部分利用流式細胞術選擇高生產(chǎn)力細胞的傳統(tǒng)方法是為選擇雜交瘤細胞而建立的。一種方法基于可通過使用熒光標記抗體來鑒定和回收的展示增加的細胞表面抗體量的雜交瘤細胞的細胞表面抗體含量。但是，尚未廣泛記錄定量關系。開發(fā)了根據(jù)分泌抗體選擇細胞的其他方法作為備選策略，以克服細胞表面抗體選擇的一些限制。一種方法應用親和基質(zhì)；其他方法使用凝膠微滴技術。前一種方法基于產(chǎn)生對所分泌的目的產(chǎn)物特異的人工親和基質(zhì)。分泌的分子在分泌細胞表面與親和基質(zhì)結(jié)合，隨后用特異性熒光試劑標記，進行流式細胞術分析和細胞分選。微滴包封涉及將單個細胞完全包封在瓊脂糖小球中。這些小球含有特異性捕獲抗體，所以同時捕獲分泌的產(chǎn)物并防止細胞間的產(chǎn)物互養(yǎng)(crossfeeding)。其他方法依賴于可通過流式細胞術檢測的標記基因的共表達。缺點是標記基因 (例如綠色熒光蛋白)表達與目的基因表達的弱聯(lián)系。此外，標記基因的表達消耗細胞的額外能量，且可誘導應激。另一方法依賴于膜結(jié)合的捕獲蛋白質(zhì)的誘導型共表達。膜結(jié)合的捕獲蛋白質(zhì)錨定在細胞表面，分泌的多肽一從細胞分泌就被其捕獲。然后可以在細胞表面檢測那些捕獲的分子。但是，需要遺傳改造的宿主細胞，且也可存在無產(chǎn)細胞的互養(yǎng)。還已用與細胞膜瞬時結(jié)合的分泌產(chǎn)物來選擇生產(chǎn)細胞。但是，存在無產(chǎn)細胞的互養(yǎng)，且此方法具有較高的背景活性。此外，已發(fā)現(xiàn)其不可能進行幾輪富集和選擇。因此，存在開發(fā)用于選擇高產(chǎn)宿主細胞的技術的需要。因此，本發(fā)明的目的是提供用于在無產(chǎn)、低產(chǎn)和/或中產(chǎn)細胞的大群體中檢測高產(chǎn)重組宿主細胞的方法和提供用于以高產(chǎn)率產(chǎn)生多肽的方法。本發(fā)明通過提供用于富集或選擇至少一個表達所希望水平的目的多肽的真核宿主細胞的方法來解決此問題，其包括a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細胞，該異源核酸包含至少一個盒(Cas-POI)，該盒(Cas-POI)至少包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；b)培養(yǎng)該真核宿主細胞，以允許表達該目的多肽，使得至少部分目的多肽表達為包含該免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中該融合多肽展示在該宿主細胞表面；c)根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞?！爱愒春怂帷敝敢牙缤ㄟ^使用重組技術，如轉(zhuǎn)染將其引入宿主細胞中的多核苷酸序列。宿主細胞可以包含或不包含對應于該異源多核苷酸、分別與該異源多核苷酸相同的內(nèi)源多核苷酸。但是，具體而言，術語“異源核酸”指引入宿主細胞中的外源多核苷酸?？梢岳缤ㄟ^轉(zhuǎn)染可整合入宿主細胞基因組中的適宜載體來達到引入(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)。在異源核酸不插入基因組的情況下，該異源核酸可以在隨后的階段，例如在細胞進行有絲分裂時丟失(瞬時轉(zhuǎn)染)。兩種變通方案都是適宜的，但是，優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。適宜的載體還可以例如通過附加型復制保持在宿主細胞中而不整合入基因組中。但是，現(xiàn)有技術中還已知用于將異源核酸引入宿主細胞的其他技術，其也在下文中進一步詳述。“多核苷酸”是通常從一個脫氧核糖或核糖連接至另一個的核苷酸的聚合物，取決于背景，其指DNA以及RNA。術語“多核苷酸”不包含任何大小限制?！昂小泵枋隽吮舜擞行нB接的一組多核苷酸元件，包含例如編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)、編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸、編碼標記的多核苷酸、調(diào)節(jié)元件和/或本文所述的其他多核苷酸。如本文所使用，“盒”包含至少兩個多核苷酸元件。 盒可以包含或不包含調(diào)節(jié)元件作為多核苷酸，如啟動子、增強子和/或PolyA位點。根據(jù)一個實施方案，盒是適用于表達多肽的“表達盒”。表達盒包含至少一個轉(zhuǎn)錄起始元件(例如啟動子)作為與編碼區(qū)(例如編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI))有效連接的調(diào)節(jié)元件， 然后其相應地處于該轉(zhuǎn)錄起始元件的轉(zhuǎn)錄控制之下。表達盒還可以包含用于轉(zhuǎn)錄終止的適宜的調(diào)節(jié)元件，例如PolyA位點。“盒(Cas-POI) ”至少包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。優(yōu)選地，盒(Cas-POI)是表達盒(Exp-POI)。“表達盒(Exp-POI) ”定義了適用于表達目的多肽(POI)的表達盒。作為表達盒， 它包含至少一個轉(zhuǎn)錄起始元件。取決于下文進一步詳述的本發(fā)明所使用的實施方案，該表達盒(Exp-POI)包含編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)作為部分編碼區(qū)或包含適用于插入編碼該目的多肽的各個多核苷酸(Pn-POI)的位點。本發(fā)明的一般概念是將終止密碼子放置在編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼允許將多肽錨定在細胞表面的免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸之間。術語“免疫球蛋白跨膜錨”和“免疫球蛋白跨膜結(jié)構域”在本文中用作同義詞。終止密碼子組成翻譯終止信號或是其部分，可以是編碼目的多核苷酸的多核苷酸的天然終止密碼子，并從而是天然用于終止翻譯的密碼子。當?shù)谝缓偷诙嗪塑账徂D(zhuǎn)錄為可選地經(jīng)加工的轉(zhuǎn)錄物和隨后翻譯時，盒(Cas-POI)的設計通過表達產(chǎn)生兩種不同的多肽。根據(jù)一個翻譯變體，轉(zhuǎn)錄物的翻譯在定位于編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸之間的(至少一個)終止密碼子處中止。翻譯在該終止密碼子處的終止產(chǎn)生不包含跨膜錨的多肽產(chǎn)物。根據(jù)第二個翻譯變體，翻譯連讀該至少一個終止密碼子， 從而產(chǎn)生包含目的多肽和與之融合的能夠?qū)⑷诤隙嚯腻^定在細胞膜上的免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的翻譯產(chǎn)物。這類融合多肽通過所包含的免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體轉(zhuǎn)移并固著在細胞表面。本發(fā)明的一個重要特征是，通過盒(Cas-POI)的表達，由于存在翻譯連讀，該符合讀框的終止密碼子處的翻譯終止在某種程度上“滲漏”，從而產(chǎn)生該融合多肽。由于此翻譯連讀按確定的比例發(fā)生(其也可以受終止密碼子的選擇和數(shù)目及與終止密碼子相鄰的區(qū)域，尤其是終止密碼子之后的核苷酸的影響，以及受培養(yǎng)條件的影響)， 表面結(jié)合的融合多肽的水平直接與目的多肽的表達水平相關。因此，存在于細胞表面的融合多肽的量在某種程度上與該細胞的目的多肽的整體表達水平成比例，因為融合多肽的表面表達和表達目的多肽的宿主細胞的生產(chǎn)力之間存在強相關。因此，表面結(jié)合的融合多肽的水平代表了整體的單細胞生產(chǎn)力，并允許根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量來選擇至少一個真核宿主細胞。包括步驟a)、b)和c)的選擇周期允許有效和可再現(xiàn)地鑒定和分離高產(chǎn)真核宿主細胞。適宜的檢測/選擇方法，如免疫染色、流式細胞術、熒光顯微鏡術、MACS、基于親和力的方法如磁珠及類似的技術允許根據(jù)表面結(jié)合的融合多肽的存在和水平來鑒定、選擇和 /或富集高產(chǎn)細胞。因此，本發(fā)明通過允許從無產(chǎn)、低產(chǎn)和/或中產(chǎn)細胞的群體選擇以及富集至少一個高產(chǎn)細胞或高產(chǎn)細胞的群體而導致顯著減少篩選努力。還可能進行幾輪，優(yōu)選兩輪或三輪選擇和/或富集。例如，可以通過使用檢測化合物如識別膜錨定的融合多肽的抗體或其片段來選擇足夠或甚至高表達的真核宿主細胞或宿主細胞群體。該檢測化合物可以攜帶標記，并從而可通過共同的檢測方法來檢測。按照本發(fā)明的教導，用免疫球蛋白跨膜錨/結(jié)構域的至少一個片段來將目的多肽錨定在細胞表面。在使用片段而不是全長免疫球蛋白跨膜錨的情況下，該片段應允許將融合多肽錨定在細胞表面。免疫球蛋白跨膜錨/結(jié)構域或其功能性片段包埋并從而緊緊錨定在細胞膜上。此緊密錨定將本發(fā)明的錨與例如GPI錨區(qū)別開來。本發(fā)明使用的免疫球蛋白跨膜錨提供融合多肽與細胞表面非常牢固和從而持久的錨定，其還對蛋白酶解脫落不敏感或至少較不敏感。這通過純化后進行的產(chǎn)物分析得到了確認。在所進行的質(zhì)譜分析中未發(fā)現(xiàn)包含重鏈種類的免疫球蛋白跨膜錨(或免疫球蛋白跨膜錨片段)。這是超越現(xiàn)有技術的重要優(yōu)勢，因為還降低了脫落的融合多肽污染分泌的可溶性目的多肽的風險。此外，根據(jù)所分析的表達的目的多肽的特征，也未發(fā)現(xiàn)與來自常規(guī)克隆/表達系統(tǒng)的物質(zhì)的顯著差異。通過本發(fā)明的方法獲得的細胞具有比通過有限稀釋或類似方法克隆化的細胞高的平均表達水平。它們還具有比例如在轉(zhuǎn)染不包含本發(fā)明的特異性跨膜結(jié)構域/錨的標準載體后通過流式細胞術克隆化的細胞高的平均表達水平。一般將從最初的細胞群體的非選擇的細胞分離且可以富集由于本發(fā)明的篩選/ 選擇方法而鑒定的細胞?？梢詫⑺鼈兎蛛x并作為單個細胞培養(yǎng)。還可以將它們用于額外的一輪或多輪選擇，可選地進行額外的定性或定量分析，或可以用于例如開發(fā)用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細胞系。根據(jù)一個實施方案，將按上文所述選擇的高產(chǎn)細胞的富集群體直接用作以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽的群體。有利地，所觀察到的共表達目的多肽，尤其是抗體的跨膜變體的克隆和衍生自不共表達目的多肽的跨膜變體的經(jīng)典載體設置的克隆的生長行為和生產(chǎn)力表現(xiàn)得一樣。此外，克隆的生產(chǎn)穩(wěn)定性也表現(xiàn)得同樣好。還提供用于以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽的方法，該方法包括a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細胞，該異源核酸包含至少一個盒 (Cas-POI)，該盒(Cas-POI)包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；b)培養(yǎng)該真核宿主細胞，以允許目的多肽表達，使得至少部分目的多肽表達為包含該免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中該融合多肽展示在該宿主細胞表面；c)根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量來選擇至少一個真核宿主細胞；d)在允許該目的多肽表達的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的真核宿主細胞?？梢酝ㄟ^破碎宿主細胞來獲得所表達的目的多肽。該多肽還可以如此表達，例如分泌進入培養(yǎng)基中，并可以從培養(yǎng)基獲得。還可能組合該方法。從而可以有效地以高產(chǎn)率產(chǎn)生和獲得/分離多肽。為了以希望的質(zhì)量產(chǎn)生目的多肽，還可以對所獲得的多肽進行進一步的加工步驟，如純化和/或修飾步驟。根據(jù)一個實施方案，在無血清條件下培養(yǎng)該宿主細胞。如上文所述，通過在編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸之間插入至少一個終止密碼子，可能選擇高表達的宿主細胞，從而允許以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽。因此，本發(fā)明的選擇/富集步驟是整個生產(chǎn)方法的整合的和重要的組件。在產(chǎn)生免疫球蛋白分子時，按照本發(fā)明的教導使用免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體尤其有利，因為該免疫球蛋白跨膜錨天然適合于將免疫球蛋白分子固著在細胞表面。 令人驚奇地，發(fā)現(xiàn)在哺乳動物宿主細胞如CHO細胞中表達免疫球蛋白分子時，可以使用免疫球蛋白跨膜錨。這是令人驚奇的，因為現(xiàn)有技術假定，在用Ig跨膜結(jié)構域作為錨時，為了達到抗體的表面錨定和從而達到細胞膜錨定表達，必需在該細胞中共表達Iga和Ig^受體鏈。這些共同受體例如天然表達于B細胞和B細胞衍生物如雜交瘤或骨髓瘤細胞(例如 SP2/0細胞)中，但未期望其表達于非B細胞如CHO細胞中。但是，已發(fā)現(xiàn)，在使用Ig跨膜錨/結(jié)構域時，盡管缺少共同受體的表達，但在非B細胞衍生物如CHO細胞上很好地實現(xiàn)了目的多肽且尤其是免疫球蛋白分子的表面展示。因此，根據(jù)一個實施方案，使用不是B細胞或B細胞衍生物的真核宿主細胞。因此，使用不天然表達Iga和Igi3受體鏈的真核宿主細胞，優(yōu)選哺乳動物宿主細胞。因此，優(yōu)選地，宿主細胞是CHO細胞。此外，根據(jù)一個實施方案，該真核宿主細胞中不存在Iga和Igi3受體鏈的人為共表達?？梢园凑毡景l(fā)明的教導使用任何免疫球蛋白跨膜錨或其功能性片段。具體而言， 免疫球蛋白跨膜錨選自衍生自IgM、IgA、IgE、IgG和/或IgD的免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體。優(yōu)選地，免疫球蛋白跨膜錨衍生自IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4。尤其適宜的是 IgGl免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體。IgG衍生的跨膜錨的優(yōu)選的實例顯示于SEQ ID NO 2 禾口 SEQ ID NO :7 中。根據(jù)一個實施方案，免疫球蛋白跨膜錨包含胞質(zhì)結(jié)構域。優(yōu)選使用包含胞質(zhì)結(jié)構域的免疫球蛋白跨膜錨，因為它提供融合多肽與細胞表面非常緊密的錨定。尤其適宜的是使用免疫球蛋白胞質(zhì)結(jié)構域。根據(jù)一個實施方案，免疫球蛋白胞質(zhì)結(jié)構域衍生自IgG、IgA 和IgE或前述的功能性變體。這些免疫球蛋白胞質(zhì)結(jié)構域比衍生自IgD和IgM的結(jié)構域大。 SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6顯示可以用作胞質(zhì)結(jié)構域的IgG衍生的胞質(zhì)結(jié)構域的適宜的氨基酸序列。包含IgG衍生的胞質(zhì)結(jié)構域的IgG衍生的跨膜錨的優(yōu)選的實例顯示在SEQ ID NO :3 中。因此，免疫球蛋白跨膜錨可以包含SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3中所示的多肽序列或其功能性變體，尤其是功能性片段，其允許將融合多肽錨定在宿主細胞表面。適宜的盒(Cas-POI)的部分核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :1。所顯示的細節(jié)包括適用于翻譯連讀的符合讀框的終止密碼子，以及編碼可按照本發(fā)明的教導使用的尤其適宜的免疫球蛋白(Ig)跨膜結(jié)構域的多核苷酸。終止密碼子符合讀框地定位在編碼目的多肽的多核苷酸下游，因此該多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄并加工為氨基酸序列。編碼序列指翻譯為氨基酸的序列。因此，終止密碼子不屬于編碼序列，并因此不屬于編碼目的多肽的多核苷酸。終止密碼子可以是編碼目的多肽的多核苷酸的天然終止密碼子。在這種情況下，不需要存在， 但可以存在額外的終止密碼子(見上文)。盒(Cas-POI)的第二多核苷酸可編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體，其包含顯示為SEQ ID NO :2的多肽序列。SEQ ID NO :3顯示了適宜的免疫球蛋白跨膜結(jié)構域的另一變體，其還包含胞質(zhì)結(jié)構域(胞質(zhì)結(jié)構域還單獨顯示為SEQ ID NO :4)、假定的對應于滲漏終止密碼子和其他密碼子的氨基酸(WL)及連接區(qū)(連接區(qū)還單獨顯示為SEQ ID NO 5)。 取決于所選擇的終止密碼子和/或終止密碼子的數(shù)目及所使用的相鄰密碼子，在對應于該至少一個密碼子和該相鄰密碼子的位置中還可以存在其他氨基酸。這些氨基酸僅存在于融合多肽中，因此它們不改變目的多肽的氨基酸序列。因此，可以按照本發(fā)明的教導，將包含顯示為SEQ ID NO :2或3的多肽序列的免疫球蛋白跨膜結(jié)構域或其功能性變體，尤其是功能性片段用作跨膜錨，并從而用于所述方法，以及所述載體和宿主細胞中。本發(fā)明的免疫球蛋白跨膜錨的“功能性變體”包括就該天然免疫球蛋白跨膜結(jié)構域及其允許將融合多肽錨定在細胞表面的功能性變體而言具有一個或多個氨基酸序列交換(例如缺失、取代或添加)的免疫球蛋白跨膜錨。取決于所希望的抑制(連讀)水平，可以將發(fā)出終止蛋白質(zhì)合成信號的三個終止密碼子(TAA(UAA)、TAG (UAG)和TGA (UGA)-也在多種四核苷酸鄰近序列中，見下文)中的任何一個用作編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸之間的翻譯終止信號和從而用作終止密碼子。如上文所述，終止密碼子還可以是編碼目的多肽的多核苷酸的天然終止密碼子。優(yōu)選地，為了促進翻譯連讀，該翻譯終止信號具有不完全的終止效率。終止密碼子的“滲漏”還受鄰近和從而處于該至少一個終止密碼子下游的密碼子影響，尤其是第一核苷酸可影響翻譯連讀(見下文)。為了允許目的多肽的表達，需要轉(zhuǎn)錄盒(Cas-POI)。根據(jù)一個實施方案，盒 (Cas-POI)因此是表達盒。根據(jù)另一實施方案，盒(Cas-POI)整合入宿主細胞的基因組中， 使得盒(Cas-POI)處于宿主細胞的轉(zhuǎn)錄起始元件，如啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。盒(Cas-POI)中所包含的核酸的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物，其至少包含-第一多核苷酸，其中該第一多核苷酸的翻譯產(chǎn)生目的多肽；-至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子；
-處于該終止密碼子下游的第二多核苷酸，其中該第二多核苷酸的翻譯產(chǎn)生免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體。至少部分轉(zhuǎn)錄物通過該至少一個終止密碼子的翻譯連讀翻譯為包含目的多肽和免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽。翻譯連讀可以由于終止密碼子的選擇/翻譯終止信號的設計而天然發(fā)生，或可以通過調(diào)整培養(yǎng)條件，例如通過使用終止抑制劑來誘導(見下文)。用于本發(fā)明的方法的盒(Cas-POI)可以僅包含處于免疫球蛋白跨膜錨或其片段的編碼序列上游的單個終止密碼子。但是，還可能使用兩個或多個終止密碼子，例如兩個或三個，或四個終止密碼子的系列，這些密碼子可以相同或不同。終止密碼子的鄰近序列，即三核苷酸終止密碼子自身以及緊處于終止密碼子下游的核苷酸各自的密碼子對連讀水平也有影響。但是，為了允許產(chǎn)生融合多肽，需要確保仍然發(fā)生一定水平的翻譯連讀，根據(jù)一個實施方案，這可以通過調(diào)整培養(yǎng)條件來達到。初級轉(zhuǎn)錄物可以是包含內(nèi)含子的前mRNA。該前mRNA將被加工(剪接)為mRNA。 備選地，轉(zhuǎn)錄可直接產(chǎn)生mRNA。在mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯過程中，通常存在天然水平的終止密碼子的背景連讀，或可以通過調(diào)整培養(yǎng)條件來誘導該連讀水平。此連讀水平產(chǎn)生一定比例的融合多肽，這也取決于所使用的終止密碼子的數(shù)目和性質(zhì)、下游終止密碼子和尤其是終止密碼子的四核苷酸鄰近序列和培養(yǎng)條件。因此，盡管存在終止密碼子，但按照本發(fā)明的教導產(chǎn)生了一定比例的融合多肽。這些融合多肽包含將該融合蛋白緊緊錨定在細胞表面的免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體。結(jié)果，融合多肽展示在宿主細胞表面，且當與適當標記的檢測化合物接觸時，可以例如通過流式細胞術，尤其是通過熒光激活細胞分選術(FACS)來選擇展示高水平的膜錨定重組融合多肽(表明高水平的分泌多肽)的細胞?？梢园船F(xiàn)有技術中所述(參見例如Li等1993，Journal of Virology 67(8)， 5062-5067 ；McCughan等 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 5431-5435 ；Brown等 1990，Nucleic Acids Research 18 Ql) 6339-6345，在此引入作為參考)來設計具有不完全的翻譯終止效率的適宜的翻譯終止信號和終止密碼子及終止密碼子設置。根據(jù)一個實施方案，使用以下終止密碼子設置；以黑體和下劃線顯示終止密碼子TGACTA在編碼鏈上和從而在DNA水平上的終止編碼設置的核苷酸序列；以黑體和下劃線顯示終止密碼子IMCUA RNA水平上的終止密碼子設置的核苷酸序列WL假定的發(fā)生翻譯連讀時對應于終止密碼和鄰近密碼子的氨基酸；因此所顯示的是所示多核苷酸最可能的連讀產(chǎn)物只要融合蛋白質(zhì)展示在細胞表面，由于終止密碼子的連讀而摻入融合多肽中的其他氨基酸可以是任意類型。由于該其他氨基酸僅摻入融合多肽中，目的多肽的氨基酸仍未改變。除可能在編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)之后使用多個終止密碼子外，在編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性片段的序列下游使用多個終止密碼子通常是有利的。在此位置中使用多個終止密碼子，例如至多約10個終止密碼子，如至多約6或8個終止密碼子， 如約2、3、4或5個終止密碼子可確保翻譯的有效終止。
在多肽合成期間，存在于細胞表面和從而可在細胞表面檢測的融合多肽的量通常增加，因為融合多肽保持錨定在細胞膜上，從而隨著表達的持續(xù)而累積在細胞表面。根據(jù)一個實施方案，這樣構建盒(Cas-POI)，使得終止密碼子連讀產(chǎn)生約<50%、<25%、< 15%, 彡10%,^2,5%,^ 1,5%,^ 或少于彡0，5%的融合多肽。其余部分產(chǎn)生為不包含免疫球蛋白跨膜錨或其功能性片段的多肽形式。如已述，終止密碼子的連讀水平可以受終止密碼子的選擇和數(shù)目及鄰近終止密碼子的區(qū)域，尤其是終止密碼子之后的核苷酸， 以及受步驟b)中所使用的培養(yǎng)條件影響。取決于如給定的終止密碼子在給定的構建體中的天然背景連讀水平的因素，在一些情況下，為了進一步降低背景連讀水平，可希望在編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼免疫球蛋白跨膜錨的多核苷酸之間使用一個以上終止密碼子(見上文)。較低的連讀水平的一般優(yōu)勢是隨后優(yōu)選通過FACS進行的選擇/富集和分選流程中更高的嚴格性，這導致高產(chǎn)克隆對超高產(chǎn)克隆的更好的分辨率。若連讀水平太高，可發(fā)生細胞表面對膜結(jié)合多肽的容量的飽和，這可妨礙區(qū)分表達水平，尤其是高表達水平。因此，為了選擇超高表達的克隆，較低的連讀水平是有利的。因此，優(yōu)選僅<5%、 (2%或甚至彡1，5%的轉(zhuǎn)錄物翻譯為融合多肽。但是，如果必要/希望，還可能例如通過在培養(yǎng)期間使用終止抑制劑來提高連讀水平。在步驟b)中在培養(yǎng)基中使用終止抑制劑是通過培養(yǎng)條件影響終止密碼子連讀水平的一種方式。終止抑制劑是能夠抑制終止密碼子的存在引起的翻譯終止的化學試劑。具體而言，終止抑制劑是隸屬于氨基糖苷類的抗生素。氨基糖苷抗生素因其允許在終止密碼子處插入備選氨基酸，從而產(chǎn)生否則將正常導致翻譯終止的終止密碼子或終止密碼子設置的 “連讀”的能力而是已知的。氨基糖苷抗生素包括G418、慶大霉素、巴龍霉素、潮霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、鏈霉素和妥布拉霉素。但是，由于低連讀水平是有利的，優(yōu)選在不存在終止抑制劑的情況下進行選擇。本發(fā)明可應用于任意類型的宿主細胞，其中終止密碼子連讀至少以小百分比發(fā)生或可以通過加入終止抑制劑誘導。適宜的真核宿主細胞的實例是哺乳動物宿主細胞，其包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系、綠猴細胞系(COS)、小鼠細胞(例如NS/0)、幼倉鼠腎 (BHK)細胞系和人細胞及細胞系。優(yōu)選地，宿主細胞是CHO細胞系。雖然一個選擇周期就足以鑒定好的生產(chǎn)宿主細胞，但根據(jù)一個實施方案，進行兩個或多個選擇周期，其中在每個選擇周期中，根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞。實驗結(jié)果顯示，第二選擇周期通常導致改善的結(jié)果。根據(jù)一個實施方案，選擇步驟C)包括使多個宿主細胞與結(jié)合融合多肽的檢測化合物接觸，并根據(jù)結(jié)合至細胞表面的檢測化合物的存在或量來選擇至少一個宿主細胞。用于與融合多肽結(jié)合的檢測化合物可以至少具有以下特征之一-該化合物是標記的；-該化合物是熒光標記的；-該化合物是抗原；-該化合物是免疫球蛋白或其結(jié)合片段；-該化合物是蛋白-A、蛋白-G和/或蛋白-L。用于在細胞表面結(jié)合融合多肽的檢測化合物可以是例如識別該融合多肽的免疫球蛋白分子或其片段，如抗體或抗體片段。一般而言，可以檢測融合多肽的所有可及部分，其中還包括對應于以可溶形式與融合多肽并行分泌的目的多肽的部分。根據(jù)一個實施方案，檢測化合物是抗原。若所表達的目的多肽是例如結(jié)合該抗原的免疫球蛋白分子或其片段，如抗體，則此實施方案是適宜的。為了允許檢測和選擇，可以標記該用于結(jié)合融合多肽的檢測化合物。結(jié)合展示在細胞表面的融合多肽的標記檢測化合物從而標記了各株系的細胞表面。宿主細胞表達的融合多肽的量越高，結(jié)合的標記檢測化合物越多。這具有這樣的優(yōu)勢，可以容易地進行宿主細胞的選擇，因為由于該標記，不僅可以測定結(jié)合的檢測化合物的存在，還可以測定結(jié)合的檢測化合物的量。為了選擇高產(chǎn)宿主細胞，從由檢測化合物最有效地分別密集地標記的宿主細胞群體選擇那些宿主細胞。優(yōu)選熒光標記，因為這允許通過熒光檢測方法，例如流式細胞術容易地進行檢測。適宜的熒光標記為技術人員已知。根據(jù)一個實施方案，可以進行一個或多個，優(yōu)選兩個或三個選擇周期來根據(jù)檢測化合物與細胞表面的結(jié)合程度選擇至少一個真核宿主細胞。根據(jù)此實施方案，在每個選擇周期中，根據(jù)結(jié)合的檢測化合物的量選擇至少一個真核宿主細胞。因此，根據(jù)細胞表面染色量程度選擇最有效/密集地標記的那些宿主細胞。例如，可以選擇前5%或前2%的宿主細胞。在希望一起選擇幾個真核宿主細胞作為庫(pool)(所謂的庫富集)的情況下，選擇幾個細胞，例如至少10個、至少50個、至少500個、至少1000個或至少50. 000個并將其包含在細胞庫中。此實施方案對快速獲得更大量的目的多肽尤其有利，因為包含按照本發(fā)明的教導選擇的幾個高產(chǎn)宿主細胞的細胞庫可以比例如細胞克隆更快地擴大。因此，除應用于選擇性細胞克隆化之外，本發(fā)明還可以用于高產(chǎn)細胞的庫富集，借此可以達到與克隆細胞系相當?shù)男r。根據(jù)檢測化合物與細胞表面，尤其是與融合多肽的結(jié)合程度，可以分離高產(chǎn)宿主細胞和/或可以富集高產(chǎn)細胞的群體?？梢酝ㄟ^流式細胞術，優(yōu)選熒光激活細胞分選術 (FACS)來檢測檢測化合物與宿主細胞表面的融合多肽的結(jié)合。在優(yōu)選實施方案中，用熒光激活細胞分選術(FACQ分選包含高含量融合多肽的宿主細胞，其相應地顯示高信號。在本發(fā)明的背景中，F(xiàn)ACS分選尤其有利，因為它允許快速篩選大量宿主細胞來鑒定和富集以高產(chǎn)率表達目的多肽的那些細胞。由于根據(jù)該優(yōu)選實施方案，約僅5%或更少的多肽產(chǎn)生為融合多肽，在細胞表面檢測到的越高的熒光將對應于可以例如分泌進入培養(yǎng)基中的目的多肽的越高的表達?？梢酝ㄟ^FACS鑒定和分離顯示最高熒光率的那些細胞。發(fā)現(xiàn)并通過實施例確認了通過FACS測定的熒光與所產(chǎn)生的多肽量之間的統(tǒng)計上顯著的正相關。因此，F(xiàn)ACS分選不僅可以用于定性分析來大體上鑒定表達目的多肽的細胞，實際上還可以定量地用來鑒定表達高水平目的多肽的那些宿主細胞。因此，可以根據(jù)標記檢測化合物與錨定在細胞表面的融合多肽的結(jié)合程度來選擇/富集高產(chǎn)宿主細胞。從而可以選擇/富集最好的生產(chǎn)細胞。實驗結(jié)果顯示，將本發(fā)明的選擇方法與FACS 分析組合使用導致所選擇的細胞群體中無產(chǎn)克隆的顯著減少。此外，克隆的高度增加的平均生產(chǎn)力允許顯著減少例如生物藥物生產(chǎn)的細胞系開發(fā)過程中的克隆篩選努力。因此，與經(jīng)典篩選方法相比，可以以更少的資源開發(fā)用于更多候選者或項目的細胞系。此外，此方法允許通過表面染色和FACS分析替代耗時的生產(chǎn)力測定來評估轉(zhuǎn)染并選擇的庫的生產(chǎn)力潛能和克隆分布。就細胞群體的同質(zhì)性而言，還可以用表面染色來分析克隆的生產(chǎn)穩(wěn)定性?？梢匀菀椎貦z測產(chǎn)生的無產(chǎn)或低產(chǎn)亞群。根據(jù)一個實施方案，盒(Cas-POI)和/或(Cas-POI，)還包含-定位于該至少一個終止密碼子下游的編碼親和標記物的多核苷酸(Pn-TAG)，該至少一個終止密碼子定位于第一多核苷酸下游，其中該多核苷酸(Pn-TAG)定位于編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸上游；和/或-編碼選擇標記的多核苷酸(Pn-MARKER)。在終止密碼子和編碼免疫球蛋白跨膜錨的多核苷酸之間提供上文定義的多核苷酸(Pn-TAG)具有將親和標記物摻入融合蛋白質(zhì)的優(yōu)勢。由于親和標記物定位于該至少一個終止密碼子下游，它僅包含在目的多肽的融合變體中?！坝H和標記物”指可以通過結(jié)合化合物/試劑如抗體檢測/結(jié)合的短氨基酸序列。一般而言，親和標記物作為捕獲試劑和/ 或檢測化合物的靶標。由于它定位在目的多肽和免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體之間， 它也展示在細胞表面，因此例如對于檢測化合物而言是可及的。因此，為了允許選擇適宜的真核宿主細胞，親和標記物還可以作為檢測化合物的靶標起作用。使用例如良好表征的親和標記物作為檢測/選擇的靶標是有利的，因為可以用已有且良好表征的檢測化合物來檢測。此外，可將相同的檢測化合物用于不同種類的待表達的目的多肽。根據(jù)此實施方案，可以不用產(chǎn)生對不同目的多肽特異的檢測化合物，因為可以使用對親和標記物特異的相同的檢測化合物。由于親和標記物組成融合多肽的整合部分，它也由于跨膜錨的存在而緊緊錨定在真核宿主細胞的表面。緊緊錨定的融合多肽應不易于脫落(見上文)。即使在使用免疫球蛋白跨膜錨時脫落是罕見事件，膜結(jié)合的融合蛋白質(zhì)的脫落也可以取決于分泌多肽的預期用途而構成污染問題。例如，在表達治療性多肽/蛋白質(zhì)時，希望獲得盡可能純的分泌產(chǎn)物。在使用親和標記物，如His標記物時，該親和標記物將至少部分包含于脫落的蛋白質(zhì)中。由于親和標記物的存在，可能通過使用常規(guī)親和純化方法(例如在His標記物的情況下通過Ni-NTA)從分泌多肽的樣品中去除脫落的融合多肽(若存在)。因此，為了容易地從樣品去除潛在的污染物，親和標記物是有用的。此外，為了控制所表達/獲得的多肽的純度，可以使用親和標記物。對于需要高純度蛋白質(zhì)/多肽的應用，提供適宜的測定來證明所獲得的產(chǎn)物是純凈的和從而不包含脫落的融合多肽引起的污染物也可以是有利的/必須的。這種測定可基于親和標記物的檢測。 由于親和標記物只存在于融合多肽中，它可以作為樣品中存在融合多肽(或其降解/脫落的形式)的特異性標記。若在使用對親和標記物特異的檢測化合物時仍然可以在所獲得的產(chǎn)物中檢測到親和標記物，則樣品中仍然存在微量脫落的融合多肽，取決于其量，樣品可需要進一步純化。若在樣品中檢測不到親和標記物，則所分析的樣品中應不存在或存在極低量的脫落的融合多肽，從而確保樣品對預期應用而言足夠純。因此，在產(chǎn)生目的多肽時，可以通過以下進一步加工所獲得的目的多肽-通過靶向親和標記物的親和純化去除脫落融合多肽的污染物；和/或-通過靶向親和標記物來檢測脫落融合蛋白質(zhì)的存在或缺乏。親和標記物的適宜的實例是例如V5、His標記物、FLAG、Strep, HA、c_Myc等。適宜的親和標記物還可以是人工產(chǎn)生的。根據(jù)另一實施方案，盒(Cas-POI)和/或(Cas-POI’ )包含編碼選擇標記的另一多核苷酸(Pn-MARKER)。優(yōu)選地，該選擇標記定位于編碼免疫球蛋白跨膜錨的多核苷酸下游，從而通過構建體的表達，在展示融合多肽時定位在細胞膜的胞質(zhì)部位。根據(jù)一個實施方案，沒有終止密碼子定位在編碼免疫球蛋白/結(jié)構域或其功能性變體的多核苷酸和多核苷酸(Pn-MARKER)之間，因為希望將它們表達為融合體。應在多核苷酸(Pn-MARKER)的編碼序列下游提供適宜的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號，以確保在表達多核苷酸(Pn-MARKER)后有效終止轉(zhuǎn)錄和翻譯。該多核苷酸(Pn-MARKER)可以是例如藥物抗性基因或報道基因。本文描述了適宜的實例。根據(jù)一個實施方案，用綠色熒光蛋白(GFP)或熒光素酶作為報道基因。這允許根據(jù)兩個融合蛋白質(zhì)特征來選擇真核宿主細胞。根據(jù)一個實施方案，盒(Cas-POI)和/或(Cas-ΡΟΙ，)是表達盒。本領域技術人員能夠選擇用于進行本發(fā)明的方法的適宜的載體、表達控制序列和宿主。例如，在載體的選擇中，必須考慮宿主，因為載體可以需要能夠在其中復制和/或能夠整合入染色體。下文和權利要求中還描述了可以用于本發(fā)明的選擇和生產(chǎn)方法的適宜的載體。還提供適用于在真核宿主細胞，優(yōu)選哺乳動物宿主細胞中表達至少一個目的多肽的載體核酸，該核酸包含至少一個盒(Cas-POI)，該盒(Cas-POI)包含用于編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)的插入位點和/或編碼目的多肽的第一多核苷酸(Ρη-ΡΟΙ)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。本發(fā)明的“載體核酸”是能夠攜帶至少一個外源核酸片段的多核苷酸。載體核酸像“分子載體”一樣發(fā)揮作用，將核酸片段遞送入宿主細胞。它可以包含至少一個含有調(diào)節(jié)序列的表達盒。優(yōu)選地，載體核酸包含至少一個表達盒。為了從其表達，可以將外源多核苷酸插入載體核酸的表達盒中。本發(fā)明的載體核酸可以以環(huán)狀或線性化形式存在。術語“載體核酸”還包括允許轉(zhuǎn)移外源核酸片段的人工染色體或類似的多核苷酸。為了進行上文所述的篩選和產(chǎn)生方法，可以將該載體用作表達載體。上文還結(jié)合篩選方法描述了該載體核酸的優(yōu)勢。該載體核酸還可以至少包含-編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)；-包含哺乳動物選擇標記基因的表達盒(Exp-MSM)；和/或-包含哺乳動物可擴增選擇標記基因的表達盒(Exp-MASM)。表達盒(Exp-MSM)定義了包含哺乳動物選擇標記基因的表達盒。表達盒(Exp-MASM)定義了包含哺乳動物可擴增選擇標記基因的表達盒。術語“5' ”和“3' ”是用來描述與遺傳元件的位置和/或事件的方向(5'至3') 相關的核酸序列特征的約定，例如通過RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄或通過核糖體的翻譯，其按5'至 3'方向前進。同義詞是上游(5’)和下游(3’)。通常，按5'至3'從左至右繪制DNA序列、基因圖譜、載體圖和RNA序列或用箭頭表示5'至3'方向，其中箭頭指向3'方向。因此，在遵循此約定時，5'(上游)表示定位在左手側(cè)的遺傳元件，而3'(下游)表示定位在右手側(cè)的遺傳元件。表達盒的排列和方向也是重要的方面。根據(jù)一個實施方案，表達盒(Exp-MASM) 定位在表達盒(Exp-POI)的5，，而表達盒(Exp-MSM)定位在表達盒(Exp-POI)的3，?？梢栽诒磉_盒(Exp-POI)和(Exp-MSM)之間插入插入其他表達盒，例如用于表達其他目的多肽的其他表達盒(Exp-POI ’)(下文進一步詳述)。優(yōu)選表達盒(Exp-MASM)、(Exp-POI)和(Exp-MSM)均按相同的5'至3'方向排列。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，此特定的載體核苷酸配置允許快速產(chǎn)生高產(chǎn)細胞系。根據(jù)一種選擇，表達盒(Exp-POI)不包含編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)。因此，提供具有表達盒(Exp-POI)的“空”表達載體，其尚未包含編碼目的多肽的多核苷酸 (Pn-POI)。但是，為了將編碼目的多肽的該多核苷酸(Pn-POI)摻入表達盒(Εχρ-ΡΟΙ)，可以通過使用適當?shù)目寺》椒?，例如通過使用限制酶來將該編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI) 摻入表達盒(Exp-POI)中。為了此目的，表達盒(Exp-POI)可以包含例如多克隆位點(MCS)， 其可以例如用于所有閱讀框。例如可以向用戶提供該“空”載體核酸，然后由用戶將其特定目的多核苷酸插入表達盒(Exp-POI)中。這樣插入編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)，使得終止密碼子存在于編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)和編碼跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸之間。表達盒(Exp-POI)還可以包含可通過編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI) 來切除和置換的置換多核苷酸或填充核酸序列。本發(fā)明還提供上文所述的載體核酸，該載體核酸包含表達盒(Exp-POI)，該表達盒(Exp-POI)包含編碼目的多肽的第一多核苷酸 (Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。一般而言，此實施方案涉及最終的表達載體核酸。在用盒(Cas-POI)替代表達盒(Exp-POI)的情況下，基本上適用相同的情況。根據(jù)一個實施方案，載體核酸是環(huán)狀的，且表達盒(Exp-MSM)排列在表達盒 (Exp-POI)的3’，而表達盒(Exp-MASM)排列在表達盒(Exp-MSM)的3’。本發(fā)明的表達盒可以包含用于表達目的多肽的其他表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)。在最終的載體核酸中，該其他表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)包含用于表達其他目的多肽的其他多核苷酸。取決于待表達的多肽，該其他表達盒(Exp-POI’ )可以包含或不包含通過終止密碼子從編碼其他目的多肽的多核苷酸分開的編碼跨膜錨(或用于連接各個錨，如GPI錨的信號肽)的多核苷酸。因此，還可能將用于表達不同多肽的幾個表達盒排列在本發(fā)明的表達載體中。但是，只有表達盒(Exp-POI)需具有滲漏終止密碼子組件，從而具有處于編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸，其他表達盒(Exp-POI’ )可以具有或不具有各個終止密碼子組件。在表達免疫球蛋白分子或其功能性片段的情況下，使用至少兩個表達盒 (Exp-POI)和(Exp-POI’)來表達目的多肽的各個實施方案尤其有利。因此，提供用于表達至少一個免疫球蛋白分子或其功能性片段的載體核酸，其包含-表達盒(Exp-POI)，其包含編碼免疫球蛋白分子重鏈和/或輕鏈或其功能性片段的第一多核苷酸、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子和處于該終止密碼子下游的至少編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性片段的第二多核苷酸；和/或-其他表達盒(Exp-POI’)，其包含編碼相應的免疫球蛋白分子輕鏈和/或重鏈或其功能性片段的多核苷酸。表達盒(Exp-POI’ )編碼與表達盒(Exp-POI)的免疫球蛋白鏈相對應的免疫球蛋白鏈(即若表達盒(Exp-POI)編碼重鏈，則表達盒(Exp-POI’ )編碼輕鏈，反之亦然)。因此，可以從該載體表達功能性免疫球蛋白分子(或其片段)。優(yōu)選從表達盒(Exp-POI)表達重鏈或其功能性片段和從而按一定的程度表達為融合多肽。根據(jù)一個實施方案，從表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)表達相應的輕鏈或其功能性片段。可以將該表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)定位在同一載體核酸上。但是，也可以將它定位在分開的載體核酸上。但是，優(yōu)選將表達盒(Exp-POI)和(Εχρ-ΡΟΙ’)定位在一個載體核酸上。還可能從一個表達盒表達兩條鏈(重鏈和相應的輕鏈)。例如，為了獲得兩條分開的鏈，可以將它們表達為包含自剪接信號或蛋白酶敏感位點的融合多肽。雙或多順反子設置也是可能的，其中從一條mRNA獲得兩條或多條多肽(Ρ0Ι和POI’)，該mRNA可以包含例如一個或多個內(nèi)部核糖體進入位點。根據(jù)一個實施方案，提供用于表達至少一個免疫球蛋白分子或其功能性片段的載體核酸，其包含-表達盒(Exp-POI)，其包含編碼免疫球蛋白分子重鏈或其功能性片段的第一多核苷酸、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；和-其他表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)，其包含編碼相應的免疫球蛋白分子輕鏈或其功能性片段的多核苷酸。優(yōu)選地，表達盒(Exp-POI)包含重鏈，且表達盒(Exp-POI)和(Exp-POI，)都按相同的方向排列。優(yōu)選地，將表達盒(Exp-POI’ )排列在表達盒(Exp-POI)的5’。就免疫球蛋白分子的表達速率而言，將輕鏈表達盒排列在重鏈表達盒的5’是有益的。根據(jù)一個實施方案，還指定這樣設計表達載體，使得表達盒已經(jīng)包含了免疫球蛋白跨膜錨和該至少一個滲漏終止密碼子(例如包含在填充序列中)和可選地包含至少部分免疫球蛋白分子恒定區(qū)。為了獲得最終的表達載體，然后可以通過使用適當?shù)目寺〔呗裕墒褂谜?用戶將免疫球蛋白分子的可變部分插入表達盒中?？梢园诒磉_盒(Exp-MSM)中的哺乳動物選擇標記基因的非限制性實例包括例如賦予 G418、潮霉素(hyg 或 hph，可從 Life Technologies, Inc. Gaithesboro, Md.購買)、新霉素(neo,可從Life Technologies, Inc. Gaithesboro,Md.購買)、zeocin (Sh Ble, 可從Wiarmingen，San Diego Calif.購得)、嘌呤霉素(pac，嘌呤霉素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，可從 Clontech,Palo AltoCalif.獲得)、烏本苷(oua，可從Pharmingen獲得)和殺稻瘟素(可從hvitrogen獲得)抗性的抗生素抗性基因。該哺乳動物選擇標記基因允許選擇包含該基因的哺乳動物宿主細胞和從而選擇包含該載體的宿主細胞。本文所用的術語“基因”不僅指野生型基因的編碼序列，還指編碼提供預期抗性的選擇標記的功能性變體的核酸序列。因此，還涵蓋野生型基因的截短或突變形式，只要它們提供預期的抗性。哺乳動物選擇標記基因優(yōu)選包含外源調(diào)節(jié)元件，如強組成型啟動子。根據(jù)優(yōu)選實施方案，該表達盒(Exp-MSM)包含編碼具有酶功能的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(I或II)的基因，優(yōu)選其包含外源調(diào)節(jié)元件，例如強組成型啟動子，如SV40啟動子。與將編碼具有酶功能的DHFR的基因用作哺乳動物可擴增選擇標記基因組合，此實施方案運行良好。摻入表達盒(Exp-MASM)中的哺乳動物可擴增選擇標記基因允許包含載體的宿主細胞的選擇及基因擴增。哺乳動物可擴增選擇標記基因的非限制性實例是編碼DHFR酶的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。哺乳動物可擴增選擇標記基因優(yōu)選包含外源調(diào)節(jié)元件，如強組成型啟動子。目前使用的其他系統(tǒng)是谷氨酰胺合成酶(gs)系統(tǒng)(BelAington等，1992)和組氨酸驅(qū)動的選擇系統(tǒng)(Hartmarm和Mulligan，1988)等。這些可擴增標記也是選擇標記，因此可以用來選擇獲得載體的那些細胞。DHFR和谷氨酰胺合成酶提供良好的結(jié)果。在兩種情況中，選擇發(fā)生在阻止非轉(zhuǎn)化細胞生長的適當?shù)拇x物(在DHFR的情況下是次黃嘌呤和胸苷，在GS的情況下是谷氨酰胺)缺乏的情況下。使用可擴增系統(tǒng)如DHFR系統(tǒng)，可以通過將細胞暴露于某些促進基因擴增的物質(zhì)，例如在DHFR系統(tǒng)的情況下暴露于氨甲喋呤(MTX) 來提高重組蛋白質(zhì)的表達。例如，可以使用允許例如選擇dhfr+細胞系的野生型DHFR基因或DHFR突變體的編碼序列。促進基因擴增的適宜的GS抑制劑是甲硫氨酸砜亞胺(MSX)。 暴露于MSX也導致基因擴增。根據(jù)一個實施方案，該表達盒(Εχρ-MASM)包含編碼具有酶功能的二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因，優(yōu)選將其與SV40啟動子結(jié)合使用。因此，提供載體核酸，其中表達盒包含至少一個啟動子和/或啟動子/增強子元件。雖然這兩種控制元件之間的物理邊界總是不清楚，但術語“啟動子”通常指RNA聚合酶和/或任意結(jié)合因子與之結(jié)合并在該處起始轉(zhuǎn)錄的核酸分子上的位點。增強子在時間及空間上增強啟動子活性。許多啟動子在廣范圍的細胞類型中具有轉(zhuǎn)錄活性。可將啟動子劃分為兩類，組成性發(fā)揮作用的啟動子和通過誘導或抑制調(diào)節(jié)的啟動子。用于在哺乳動物細胞中高水平產(chǎn)生蛋白質(zhì)的啟動子應是強啟動子，且優(yōu)選在廣范圍的細胞類型中有活性。在許多細胞類型中驅(qū)動表達的強組成型啟動子包括但不限于腺病毒主要晚期啟動子、人巨細胞病毒即時早期啟動子、SV40和RousSarcoma病毒啟動子和3-磷酸甘油酸激酶啟動子、EFla。 在啟動子和/或增強子獲自CMV和/或SV40時，用本發(fā)明的表達載體獲得良好的結(jié)果。根據(jù)一個實施方案，用于表達目的多肽的表達盒包含比用于表達選擇標記的表達盒更強的啟動子和/或增強子。此排列具有產(chǎn)生比選擇標記轉(zhuǎn)錄物多的目的多肽轉(zhuǎn)錄物的作用。分泌性目的多肽的產(chǎn)生相對于選擇標記的產(chǎn)生占優(yōu)勢是有利的，因為單個細胞產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的能力并非是無限的，因此應集中于目的多肽。根據(jù)一個實施方案，用于表達目的多肽的表達盒(Exp-POI)和(Exp-POI’)(若存在)包含CMV啟動子/增強子作為調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選表達DHFR和新霉素標記基因的表達盒 (Exp-MSM)和(Exp-MASM)包含SV40啟動子或SV40啟動子/增強子。已知CMV啟動子是可用于哺乳動物表達的最強的啟動子之一，并導致非常好的表達速率。認為它比SV40啟動子產(chǎn)生顯著多的轉(zhuǎn)錄物。大多數(shù)真核新生mRNA在其3’具有polyA尾，其是在涉及初級轉(zhuǎn)錄物切割和偶聯(lián)聚腺苷化反應的復雜過程中加入的。polyA尾對mRNA穩(wěn)定性和可轉(zhuǎn)移性是有利的。因此， 本發(fā)明的表達盒通常包含聚腺苷化位點。存在幾種可以用于哺乳動物表達載體中的有效的 PolyA信號，其包括衍生自牛生長激素(bgh)、小鼠β-珠蛋白、SV40早期轉(zhuǎn)錄單位和單純皰疹病毒胸苷激酶基因的那些。但是，還已知合成的聚腺苷化位點(參見例如!Iomega的基于 Levitt 等，1989，Genes Dev. 3，(7) :1019-1025 的 pCI-neo 表達載體)。聚腺苷化位點可以選自SV40polyA位點，如SV40晚期和早期poly-A位點(參見例如Subramani等， 1981，Mol. Cell. Biol. 854-864中所述的質(zhì)粒pSV2_DHFR)；合成的polyA位點(參見例如 Promega 的基于 Levitt 等，1989，Genes Dev. 3，(7) :1019-1025 的 pCI-neo 表達載體)；和 bgh polyA位點(牛生長激素)。此外，表達盒可以包含適當?shù)霓D(zhuǎn)錄終止位點。從上游啟動子連續(xù)轉(zhuǎn)錄通過第二轉(zhuǎn)錄單位可抑制下游啟動子的功能，這是稱為啟動子封堵或轉(zhuǎn)錄干擾的現(xiàn)象。在原核生物和真核生物中都已描述了此事件。在兩個轉(zhuǎn)錄單位之間正確放置轉(zhuǎn)錄終止信號可以防止啟動子封堵。轉(zhuǎn)錄終止信號是良好表征的，已顯示將它們摻入表達載體中對基因表達具有多種有益作用。表達盒可以包含增強子(見上文)和/或內(nèi)含子。根據(jù)一個實施方案，用于表達目的多肽的表達盒包含內(nèi)含子。大部分來自高級真核生物的基因包含在RNA加工過程中去除的內(nèi)含子。在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中，基因組構建體比缺乏內(nèi)含子的相同構建體更有效地表達。通常，將內(nèi)含子放置在可讀框的5’端。因此，為了提高表達速率，可以將內(nèi)含子包含在用于表達目的多肽的表達盒中。該內(nèi)含子可以定位在啟動子和/或啟動子/增強子元件和待表達的多肽可讀框的5’端之間。因此，提供載體核酸，其中至少表達盒(Exp-POI)包含內(nèi)含子， 其排列在啟動子和用于表達目的多肽的多核苷酸的起始密碼子之間。幾種適宜的內(nèi)含子是現(xiàn)有技術中已知的，其可以與本發(fā)明結(jié)合使用。根據(jù)一個實施方案，在用于表達目的多肽的表達盒中使用的內(nèi)含子是合成的內(nèi)含子，如SIS或RK內(nèi)含子。RK內(nèi)含子是強合成內(nèi)含子，優(yōu)選將其放置在目的基因的ATG起始密碼子之前。RK內(nèi)含子由CMV啟動子的內(nèi)含子供體剪接位點和小鼠IgG重鏈可變區(qū)的受體剪接位點組成(參見例如 Eaton 等，1986，Biochemistry 25,8343-8347 ；Neuberger 等， 1983，EMBO J. 2 (8)，1373-1378 ；其可獲自 pRK_5 載體(BD PharMingen))。令人驚奇地，將內(nèi)含子放置在DHFR基因可讀框的3’端對構建體的表達/擴增速率具有有利作用。用在DHFR表達盒中的內(nèi)含子導致DHFR基因的較小的非功能性變體 (Grillari等，2001，J. Biotechnol. 87，59-65)。從而降低DHFR基因的表達水平。這導致增加的對MTX的敏感性和更嚴格的選擇條件。因此，提供載體核酸，其中表達盒(MASM)包含內(nèi)含子，其定位在可擴增選擇標記基因的3’。適宜的內(nèi)含子可以獲自PSV2-DHFR載體(參見例如上文)。該載體可以包含至少一個含有原核選擇標記基因的其他表達盒(Exp-PSM)。可以將該表達盒(Exp-PSM)定位在表達盒(Exp-MSM)和(Exp-MASM)之間。該選擇標記可以提供對抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素和/或氯霉素的抗性。優(yōu)選按與其他表達盒 (Exp-POI)、(Exp-MSM)和(Exp-MASM)相同的 5，至 3，方向排列該表達盒(Exp-PSM)。根據(jù)一個實施方案，包含在載體中的表達盒(Exp-POI)和/或(Exp-POI’ )還包含-定位于至少一個終止密碼子下游的編碼親和標記物的多核苷酸(Pn-TAG)，該至少一個終止密碼子定位于第一多核苷酸下游，其中該多核苷酸(Pn-TAG)定位于編碼免疫球蛋白跨膜錨的第二多核苷酸上游；和/或-編碼選擇標記的多核苷酸(Pn-MARKER)。上文描述了其優(yōu)勢?？梢砸云洵h(huán)狀形式將載體核酸轉(zhuǎn)染入宿主細胞。由于內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶活性，超螺旋載體分子通常將在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)化為線性分子。但是，在轉(zhuǎn)染前線性化載體核酸通常改善穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的效率。這還因為在轉(zhuǎn)染前線性化載體可以控制線性化的位點。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，表達載體包含預先確定的限制位點，其可以用于在轉(zhuǎn)染前線性化載體核酸。明智地放置該線性化限制位點是重要的，因為該限制位點決定在何處打開/線性化載體核酸，從而決定構建體整合入真核，尤其是哺乳動物細胞中時表達盒的順序/排列。因此，載體核酸可以包含用于線性化載體的線性化限制位點，其中該線性化限制位點定位在表達盒(Exp-MSM)和(Exp-MASM)之間。優(yōu)選地，該線性化限制位點是唯一的， 且僅在表達載體核酸中出現(xiàn)一次。例如，為了支持僅在線性化限制位點處而不(或只是很少)在例如表達盒或載體主鏈內(nèi)切割載體，可以使用由具有低切割頻率的限制酶識別的線性化限制位點。這可以例如通過提供用于具有超過六個堿基對的識別序列或識別在染色體 DNA中不具代表性的序列的限制酶的限制位點來促進。適宜的實例是SwaI酶，因此載體可以摻入SwaI識別位點作為唯一的線性化限制位點。在該線性化限制位點在載體核酸序列 (包括編碼目的多肽的序列)中出現(xiàn)超過一次的情況下，或在使用在載體核酸序列中切割幾次的限制酶的情況下，為了消除那些其他限制位點和獲得唯一的或至少稀少的線性化限制位點，例如改變/突變除定位于表達盒(Exp-MSM)和(Exp-MASM)之間的線性化限制位點之外的限制位點也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在將載體用作預期例如作為表達幾種不同多肽的工具的標準表達載體的情況下， 提供包含具有低切割頻率的酶的多個識別位點的線性化限制位點是有利的。為了確保酶僅切割一次以正確線性化載體，選擇用于線性化的限制酶應優(yōu)選不在用于選擇標記的表達盒或其他載體主鏈序列內(nèi)切割。通過提供包含具有低切割頻率的限制酶的多個識別位點的線性化限制位點，使用者可以從所提供的選擇中選擇適宜的限制酶來線性化，以安全地避開編碼目的多肽的多核苷酸(Pn-POI)內(nèi)的限制(位點)。但是，如上文所述，可以突變其他限制位點或可以進行不完全限制酶切消化。將線性化限制位點放置在表達盒(Exp-MSM)和表達盒(Exp-MASM)之間具有使表達盒(Exp-MASM)處于表達盒(Exp-POI)(和用于表達目的多肽的其他表達盒-若存在)的 5’側(cè)翼的作用。通過線性化，表達盒(Exp-MSM)定位于表達盒(Exp-POI)的3’。從而通過線性化環(huán)狀載體核酸來將表達盒(MSM)和(MASM)分開。若存在用于細菌選擇標記的表達盒 (Exp-PSM)(參見下文)，則優(yōu)選將線性化限制位點放置在表達盒(Exp-PSM)和(Exp-MASM) 之間。這具有使細菌選擇標記處于3’和從而處于線性化載體核酸的“哺乳動物”部分“之外”的作用。此排列是有利的，因為推測細菌基因?qū)Σ溉閯游锉磉_是不利的，因為細菌序列可以在哺乳動物細胞中導致增加的甲基化或其他沉默作用。目的多肽不限于任何特定的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組，相反，其可以是希望通過本文所述的方法選擇和/或表達的任意大小、功能或來源的任何蛋白質(zhì)。因此，可以表達/產(chǎn)生幾種不同的目的多肽。術語多肽指包含通過肽鍵連接在一起的氨基酸聚合物的分子。多肽包括任意長度的多肽，包含蛋白質(zhì)(例如具有超過50個氨基酸)和肽(例如2-49個氨基酸)。多肽包括任何活性或生物活性的蛋白質(zhì)和/或肽，包含例如生物活性肽，如酶蛋白質(zhì)或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受體蛋白質(zhì)或肽、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)或肽、細菌的和/或結(jié)合內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)、結(jié)構蛋白質(zhì)或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生長因子、疫苗等。該多肽可以選自肽類激素、白細胞介素、組織纖溶酶原激活物、細胞因子、免疫球蛋白，尤其是抗體或抗體片段或其變體。如本文所使用，作為目的多肽的實例，“免疫球蛋白分子”指包含一條或多條基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段，例如包含一個或多個互補決定區(qū)(⑶R)的片段編碼的多肽的蛋白質(zhì)。已知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε禾口 μ恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。通常將輕鏈分類為例如κ或λ。通常將重鏈分類為例如Y、μ、α、δ或ε，其反過來分別定義了免疫球蛋白種類 IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。該免疫球蛋白可以屬于任何同種型。通常產(chǎn)生/需要IgG(例如IgGl)分子作為治療性蛋白質(zhì)。典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構單位包含四聚體。本質(zhì)上，每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈 (約50-70kD)。每條鏈的N端定義了主要負責抗原識別的約100至110或更多個氨基酸的可變區(qū)。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指這些輕鏈和重鏈?？贵w作為完整的免疫球蛋白或作為大量良好表征的可以例如通過用多種肽酶消化來產(chǎn)生的片段存在?？贵w片段是包含至少20個來自該完整抗體的氨基酸的任意抗體片段，優(yōu)選至少100個氨基酸的片段，其至少仍具有抗原結(jié)合能力?？贵w片段可以包含抗體的結(jié)合區(qū)，如Fab片段；F(ab) 2片段；包含多個結(jié)合結(jié)構域的多鏈抗體(multibodies)，如雙抗體、三鏈抗體或四鏈抗體；單結(jié)構域抗體；或affibodies?？贵w變體是抗體或抗體片段的衍生物，其具有相同的結(jié)合功能，但例如具有改變的氨基酸序列。該抗體和/或抗體片段可以包含鼠輕鏈、人輕鏈、人源化輕鏈、人重鏈和/或鼠重鏈及其活性片段或衍生物。因此，它可以是例如鼠抗體、人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了多種抗體片段，但技術人員可理解，可以通過化學方法或通過使用重組DNA技術、肽展示等來從頭合成這類Fab'或F (ab) 2片段。因此，本文所用的術語抗體還包括通過完整抗體的修飾或用重組DNA方法從頭合成產(chǎn)生的抗體片段?？贵w還包括單臂復合單克隆抗體；單鏈抗體，其包含單鏈Fv(SCFV)抗體，其中可變重鏈和可變輕鏈連接在一起(直接或通過肽接頭) 形成連續(xù)的多肽；以及雙抗體、三鏈抗體和四鏈抗體(參見例如I^ack等J Mol Biol. 1995 年 2 月 10 日；246(1) 28-34 ；Pack 等 Biotechnology (NY) · 1993 年 11 月；11(11) :1271-7 ； Pack & Plueckthun Biochemistry. 1992 年 2 月 18 日；31(6) :1579-84)?？贵w是例如多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈、Fab片段、單鏈Fab (Hust等，BMC Biotechnol (2007) 7 :14)、通過Fab表達文庫產(chǎn)生的片段等。可以通過本領域已知的方法回收按照本發(fā)明產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基回收多肽，其包括但不限于離心、過濾、超濾、提取和沉淀?？梢酝ㄟ^本領域已知的多種方法來進行純化，其包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如制備性等點聚焦)、差示溶解度(differential solubility) (例如硫酸銨沉淀)或提取。此外，可以通過細胞破碎來從宿主細胞獲得多肽。還提供用于產(chǎn)生上文所述的載體核酸的方法，其包括將至少一個盒(Cas-POI)， 優(yōu)選表達盒(Exp-POI)組裝入載體的步驟，使得該盒包含編碼目的多肽的第一多核苷酸 (Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或功能性變體的第二多核苷酸。該方法可進一步包括組裝-包含哺乳動物選擇標記基因的表達盒(Exp-MSM)，-包含哺乳動物可擴增選擇標記基因的表達盒(Exp-MASM)，優(yōu)選使得表達盒(Exp-MASM)定位于表達盒(Exp-POI)的5’，表達盒(Exp-MSM) 定位于表達盒(Exp-POI)的3’，其中按相同的5’至3’方向排列表達盒(Exp-MASM)、 (Exp-POI)和(Exp-MSM)。
還提供通過上文所述的篩選方法獲得的真核，優(yōu)選哺乳動物宿主細胞。還提供包含盒(Cas-POI)的真核，優(yōu)選哺乳動物宿主細胞，該盒(Cas-POI)包含編碼目的多肽的異源和從而為外源多核苷酸、至少一個處于該異源多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸。可以例如通過本發(fā)明的載體核酸來引入盒(Cas-POI)。優(yōu)選地，盒(Cas-POI)和/或盒(Cas-POI')是表達盒。盒(Cas-POI)的其他特征和適宜的載體的詳情描述于上文，且還應用于本發(fā)明的宿主細胞。上文描述了適宜的真核宿主細胞。優(yōu)選地，真核宿主細胞是哺乳動物宿主細胞。 根據(jù)一個實施方案，真核宿主細胞不是B細胞或B細胞衍生物。因此，真核，優(yōu)選哺乳動物宿主細胞是不天然表達Ig α和Ig β受體鏈的宿主細胞。此外，根據(jù)一個實施方案，在該宿主細胞中不存在Iga和Ig^受體鏈的人為共表達。CHO細胞是優(yōu)選的宿主細胞。還提供用于產(chǎn)生上文所述的真核宿主細胞的方法，其中用本發(fā)明的載體核酸和/或本發(fā)明的包含盒(Cas-POI)的異源核酸轉(zhuǎn)染真核宿主細胞。現(xiàn)有技術中存在已知用于將表達載體引入哺乳動物細胞的幾種適當?shù)姆椒?。這些方法包括但不限于磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、生物射彈和聚合物介導的基因轉(zhuǎn)移。除傳統(tǒng)的基于隨機整合的方法外，還可以用重組介導的方法來將盒(Cas-POI)轉(zhuǎn)移入宿主細胞基因組中。這類重組方法可以包括使用位點特異性重組酶，如Cre、Flp或Φ031(參見例如Oumard 等，Cytotechnology (2006) 50 :93-108)，其可以介導轉(zhuǎn)基因的定向插入。備選地，可以用同源重組的機制來插入盒(Cas-POI)(綜述于Sorrell等，Biotechnology Advances 23(2005)431-469中)?；谥亟M的基因插入允許最小化包含于轉(zhuǎn)移/引入至宿主細胞的異源核酸中的元件數(shù)目。例如，可以使用已提供了啟動子和poly-A位點(外源或內(nèi)源)的插入基因座，使得僅需將其余元件(例如目的多核苷酸、終止密碼子，和編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性片段的多核苷酸)轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)染至宿主細胞。若缺失的部分可存在于插入位點處，則甚至轉(zhuǎn)移部分盒(Cas-POI)就足夠。上文詳述了本發(fā)明的適宜的表達載體以及適宜的宿主細胞和目的多肽的實施方案；我們稱之為以上公開內(nèi)容。還提供通過上文和權利要求中定義的本發(fā)明的方法獲得的多肽。優(yōu)選該多肽是免疫球蛋白分子或其片段。按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽顯示良好的穩(wěn)定性特性。結(jié)果還顯示，以功能性形式和從而以正確的構象表達了多肽。因此，本發(fā)明還提供用上文詳述的表達載體通過本發(fā)明的產(chǎn)生方法獲得的多肽。如上文所述，由于所摻入的選擇/篩選步驟，以良好的產(chǎn)率獲得了多肽。優(yōu)選多肽是免疫球蛋白分子，如抗體或其片段。通過以下非限制性實例進一步闡述本發(fā)明，但這些實施例描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
實施例實施例1 :Ig跨膜形式的載體構建通過Agel和Ascl將合成的編碼部分IgGl恒定重鏈區(qū)加滲漏終止密碼子填充片段及Ig跨膜和胞質(zhì)結(jié)構域的1113bp DNA片段插入pBW201(含有IgGl重鏈和κ輕鏈的標準載體)中，產(chǎn)生ρΝΤ11(參見表1)。所使用的Ig跨膜結(jié)構域的核苷酸序列顯示在SEQ ID No 1中，顯示滲漏終止密碼子填充片段。當然，還可以按照本發(fā)明的原理使用所編碼的Ig 跨膜結(jié)構域的變體，其提供相同的膜錨定功能。該變體與所編碼的Ig跨膜結(jié)構域同源，且可以例如通過保守性氨基酸取代獲得。它們優(yōu)選具有至少80^^85^^90%同源性。編碼這些變體的多核苷酸例如在嚴格條件下與所示序列雜交。可以通過SwaI和BglII來用合成的編碼DHFR的L23P點突變體的1252bp片段取代pNTll和pBW201的野生型DHFR選擇標記基因，從而產(chǎn)生pND9和pBW478。DHFR突變體允許選擇dhfr+細胞系。FACS載體(ρΝΤ11、ρΝΤ29)基于用于抗體表達的標準載體(pBW201、pBW478)。pNTll 和pBW201在它們所攜帶的DHFR選擇標記盒中與PND9和pBW478不同。除此之外，主鏈是相同的。載體具有單順反子“串聯(lián)”設置，且包含抗體輕鏈和重鏈表達盒，二者都由CMV啟動子/增強子驅(qū)動。產(chǎn)生FACS載體的唯一修飾是在抗體重鏈(HC) cDNA的3’插入IgGl跨膜和胞質(zhì)結(jié)構域。將具有滲漏翻譯終止信號的短填充片段放置在HC和跨膜結(jié)構域之間。 預期選擇用于終止密碼子的序列環(huán)境導致至多5%的連讀。全部四個載體都編碼相同的人 IgG抗體。如上文所述，用于表達的載體核酸，尤其是所選擇的載體元件的方向和排列允許非常有效地表達免疫球蛋白分子。在下表中說明可以與本發(fā)明結(jié)合使用并在上文中描述的適宜的載體(箭頭表示遺傳元件的5’至3’方向)表1 載體圖譜
權利要求
1.用于選擇至少一個表達希望水平目的多肽的真核宿主細胞的方法，其包括a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細胞，所述異源核酸包含至少一個盒 (Cas-POI)，所述盒(Cas-POI)至少包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；b)培養(yǎng)所述真核宿主細胞，以允許表達目的多肽，使得至少部分目的多肽表達為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主細胞表面；c)根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞。
2.用于以高產(chǎn)率產(chǎn)生目的多肽的方法，所述方法包括a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細胞，所述異源核酸包含至少一個盒 (Cas-POI)，所述盒(Cas-POI)包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；b)培養(yǎng)所述真核宿主細胞，以允許表達目的多肽，使得至少部分目的多肽表達為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中所述融合多肽展示在所述宿主細胞表面；c)根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞；d)在允許表達目的多肽的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選擇的真核宿主細胞。
3.權利要求1或2的方法，其中所述盒(Cas-POI)的表達產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物至少包含-第一多核苷酸，其中所述第一多核苷酸的翻譯產(chǎn)生目的多肽；-至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子；-處于所述終止密碼子下游的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸的翻譯產(chǎn)生免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體；其中至少部分轉(zhuǎn)錄物通過所述至少一個終止密碼子的翻譯連讀翻譯為包含所述免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽。
4.權利要求1至3中至少一項的方法，其中所述免疫球蛋白跨膜錨選自a)衍生自IgA,IgE, IgM, IgG和/或IgD的跨膜錨；b)包含胞質(zhì)結(jié)構域的免疫球蛋白跨膜錨；c)包含SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 禾口 / 或 SEQ ID NO 7中所示的序列的免疫球蛋白跨膜錨；和d)前述的功能性變體，其允許將所述融合多肽錨定在真核宿主細胞表面。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中步驟c)包括使多個真核宿主細胞與結(jié)合所述融合多肽的檢測化合物接觸，并根據(jù)結(jié)合的檢測化合物的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞。
6.權利要求1至5中至少一項的方法，其中終止密碼子連讀產(chǎn)生約<50%、< 25%, 彡15%、彡10%、彡2，1，或少于彡0，5%的融合多肽。
7.權利要求1至6中至少一項的方法，其中進行兩個或多個選擇周期，其中在每個選擇周期中，根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞。
8.權利要求1至7中至少一項的方法，其中通過流式細胞術檢測所述檢測化合物與真核宿主細胞表面的接觸。
9.適用于在真核宿主細胞中表達至少一種目的多肽的載體核酸，其包含a)至少一個盒(Cas-POI)，其包含用于編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)的插入位點，和/或編碼目的多肽的第一多核苷酸；b)至少一個處于所述插入位點下游和/或所述第一多核苷酸下游的終止密碼子；和c)處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。
10.權利要求9的載體核酸，其包含至少一個以下特征 -盒(Cas-POI)中編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)； -包含哺乳動物選擇標記基因的表達盒(MSM)；和/或 -包含哺乳動物可擴增選擇標記基因的表達盒(MASM)。
11.用于表達至少一個免疫球蛋白分子或其功能性變體的權利要求9或10的載體核酸，其包含-表達盒(Exp-POI)，其包含編碼免疫球蛋白分子重鏈或其功能性片段的第一多核苷酸、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；和-其他表達盒(Εχρ-ΡΟΙ’)，其包含編碼相應的免疫球蛋白分子輕鏈或其功能性片段的多核苷酸。
12.用于產(chǎn)生權利要求9至11中至少一項的載體核酸的方法，其中所述方法包括將至少一個盒(Cas-POI)組裝入載體，使得所述盒(Cas-POI)包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于所述第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸。
13.真核宿主細胞，其具有至少一個以下特征a)其是通過權利要求1至8中至少一項的方法獲得的；b)其包含盒(Cas-POI)，所述盒(Cas-POI)至少包含編碼目的多肽的異源多核苷酸、至少一個處于所述異源多核苷酸下游的終止密碼子，和處于所述終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的多核苷酸；和/或c)其包含權利要求9至11中至少一項的載體核酸。
14.用于產(chǎn)生目的多肽的方法，其中培養(yǎng)權利要求13的真核宿主細胞來表達所述目的多肽。
15.用于產(chǎn)生權利要求2至8或14中任一項的目的多肽的方法，其中進行至少一個以下步驟-從細胞培養(yǎng)物獲得所述多肽； -使所述多肽分泌進入培養(yǎng)基并從該培養(yǎng)基獲得； -破碎所述真核宿主細胞以獲得所表達的多肽； -分離所表達的多肽； -純化所表達的多肽；和/或 -進一步加工和/或修飾所表達的多肽。
全文摘要
本發(fā)明尤其涉及用于產(chǎn)生或選擇表達所希望的水平的目的多肽的真核宿主細胞的方法，其包括a)提供多個包含異源核酸的真核宿主細胞，該異源核酸包含至少一個盒(Cas-POI)，該盒(Cas-POI)至少包含編碼目的多肽的第一多核苷酸(Pn-POI)、至少一個處于該第一多核苷酸下游的終止密碼子，和處于該終止密碼子下游的編碼免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的第二多核苷酸；b)培養(yǎng)該真核宿主細胞，以允許表達目的多肽，使得至少部分目的多肽表達為包含該免疫球蛋白跨膜錨或其功能性變體的融合多肽，其中該融合多肽展示在該宿主細胞表面；c)根據(jù)展示在細胞表面的融合多肽的存在或量選擇至少一個真核宿主細胞。本發(fā)明還提供包含這樣設計的異源核酸的宿主細胞和用于使用這些宿主細胞產(chǎn)生多肽的方法。
文檔編號C12N15/62GK102197136SQ200980142651
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權日2008年8月28日
發(fā)明者A·J·諾梅, B·威爾姆斯, H-P·科諾普夫, T·約斯多克 申請人:諾瓦提斯公司