專利名稱：密碼子優(yōu)化的輪狀病毒蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及密碼子優(yōu)化的輪狀病毒VP6或VP7蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及 宿車細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過(guò)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因密碼子的優(yōu)化提高 蛋白表達(dá)量的方法及其在免疫學(xué)上的用途。
背景技術(shù)：
輪狀病毒A組輪狀病毒(Rotavirus， RV)是引起全世界嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最重 要病原(參見(jiàn)Parashar， U. D., Bresee， J.S., Gentsch, J. R. & Glass, R. I. Rotavirus./"/e". Z)&. 1998， 4: 561-570)。在發(fā)展中國(guó)家，每年 約600,000至870，000兒童死于輪狀病毒感染。鑒于輪狀病毒危害嚴(yán)重且 無(wú)有效治療手段，世界衛(wèi)生組織將發(fā)展輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)先發(fā)展的 疫苗項(xiàng)目之一。RV屬呼腸病毒科(i Wn'^^)的RV屬，因其在電鏡下 形態(tài)酷似車輪而得名("rota"來(lái)源于拉丁文，意為"車輪")。1973年， Bishop等首次從腹瀉兒童小腸上皮細(xì)胞中分離到人RV (參見(jiàn)Bishop RF, Davidson GP， Holmes IH, Ruck BJ. Virus particles in epithelial cells of duodenal mucosa from children with acute non-bacterial gastroenteritis. Lancet, 1973， 2: 1281-1283)。此后，RV被認(rèn)為是全世界嬰幼兒嚴(yán)重 脫水腹瀉的主要病因。根據(jù)RV基因組雙鏈RNA (double stranded RNA, dsRNA)電泳型和 血清學(xué)反應(yīng)的不同，可將RV分為7個(gè)組(A G組)，其中A、 B、 C3 個(gè)組既可感染人類也可感染動(dòng)物，D、 E、 F、 G 4個(gè)組迄今為止只在動(dòng) 物中發(fā)現(xiàn)。A組RV能引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉已經(jīng)得到公認(rèn)，2002年Banyai, K等報(bào)道在匈牙利Gl型A組RV也能感染成年人，引起腹灣暴發(fā)(參 見(jiàn)Banyai， K. et al. Outbreak of human rotavirus infection in an adult community. Orv. Hetil. 2002, 143: 1347-1352) 。 B組RV主要在中國(guó)引.起成人腹瀉的大流行(參見(jiàn)Hung, T. et al. Waterbome outbreak of rotavirus diarrhoea in adults in China caused by a novel rotavirus. Lancet 1, 1983， 1139-1142)，而C組RV則主要引起散發(fā)。根據(jù)RV外殼蛋白VP4和VP7的特性，可將A組RV可分為不同 的血清型。VP7是糖蛋白，所以VP7的分型又稱為G型，到目前為止， 已發(fā)現(xiàn)了 14個(gè)G型。其中最常見(jiàn)的感染嬰幼兒的RV為G1 G4型。VP4 對(duì)蛋白水解酶敏感，因此VP4的分型又稱為P型，VP4蛋白的血清型 分型系統(tǒng)獨(dú)立于VP7 (G)血清型，不同G血清型的毒株可屬于同一P 血清型，而一些相同的G血清型的毒株又可屬于不同的P血清型(參 見(jiàn)Hoshino,Y. & Kapikian, A. Z. Rotavirus antigens. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994， 185: 179-227; Hoshino, Y. & Kapikian， A. Z. Rotavirus vaccine development for the prevention of severe diarrhea in infants and young children. Trends Microbiol. 1994， 2: 242-249.; Kapikian， A. Z. Overview of viral gastroenteritis. Arch. Virol. 1996， Suppl 12: 7-19 )。 目前我國(guó)流行的輪狀病毒主要以G3， Gl， G2血清型為主，P血清型以 P[8]多見(jiàn)(參見(jiàn)方肇寅.我國(guó)輪狀病毒腹瀉----流行病學(xué)和疾病負(fù)擔(dān)估計(jì). 第二屆輪狀病毒疫苗研討會(huì)2005)。輪狀病毒為分節(jié)段dsRNA病毒，無(wú)包膜，由外層、中間層和內(nèi)部核 心層3層組成二十面體蛋白衣殼，直徑約70 75nm，基因組由ll個(gè)dsRNA 節(jié)段組成，分別編碼病毒的6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，VP7 蛋白是輪狀病毒的主要的中和抗原，是位于病毒外層上的一種糖蛋白， VP7蛋白基因全長(zhǎng)1062個(gè)核苷酸，編碼297個(gè)氨基酸，對(duì)于輪狀病毒的分 型和抗體的產(chǎn)生有重要的作用。VP6蛋白是位于中間層的主要的蛋白， 是輪狀病毒的組特異性抗原，基因全長(zhǎng)1356個(gè)核苷酸，編碼397個(gè)氨基 酸，在輪狀病毒的檢測(cè)和抗體的產(chǎn)生中都有重要的作用(參見(jiàn)金奇.醫(yī) 學(xué)分子病毒學(xué)，科學(xué)出版社，2001)。在生物界，不同種類生物對(duì)同義密碼子的使用頻率是不同的，優(yōu)勢(shì) 密碼子與基因表達(dá)水平呈正相關(guān)(參見(jiàn)Ikemura T and Ozeki H. Codon usage and transfer RNA contents: organism-specific codon-choice patterns in reference to the isoaccepor contents. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1983, 47 Pt2: pl087-97; Bemardi G, et al. Codon usage and genomecomposition. JMolEvoU985，22(4):363-365)。分析表明，野生型輪狀病 毒蛋白基因密碼子與真核細(xì)胞密碼子使用頻率存在差異，AT含量明顯偏高，某些氨基酸的同義密碼子在真核細(xì)胞中使用頻率很低，而在輪狀病 毒中使用頻率很高。所以，用哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)未經(jīng)密碼子優(yōu)化的VP7 和VP6蛋白時(shí)，蛋白的表達(dá)量很低，這在我室的前期工作中已經(jīng)得到了 證明(參見(jiàn)姜秀麗.表達(dá)人輪狀病毒VP7基因重組腺病毒的免疫效果 研究.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所博士論文.2003)。這將 阻礙其作為疫苗的應(yīng)用，因?yàn)槿绻胍_(dá)到比較好的免疫效果，對(duì)于載 體疫苗就要加大載體病毒的用量，而輪狀病毒疫苗的應(yīng)用人群為5歲以 下的兒童，無(wú)疑會(huì)增加應(yīng)用的危險(xiǎn)性。為了提高其安全性，提高蛋白的 表達(dá)量，減少載體病毒的用量是非常必要的。 密碼子優(yōu)化生物的遺傳密碼采用61組三連核苷酸(密碼子)編碼20種氨基酸， 并采用3個(gè)密碼子終止蛋白質(zhì)的翻譯。這20種氨基酸中，除了蛋氨酸 (Met)和色氨酸(Trp)由一個(gè)密碼子編碼以外，其它氨基酸都由一個(gè) 以上的同義密碼子編碼，這種一種氨基酸對(duì)應(yīng)多個(gè)密碼子的性質(zhì)，稱為 "密碼子的簡(jiǎn)并性"。密碼子的簡(jiǎn)并性使得同一種蛋白可以采用多種不同 的核苷酸序列編碼。然而，同義密碼子的使用是存在偏性的，對(duì)于兩種 不同的生物，或者同一種生物的高表達(dá)和低表達(dá)基因，甚至在同一個(gè)操 縱子內(nèi)部，不同密碼子的使用頻率可能差別很大(參見(jiàn)Gouy，M.and Gautier, C. Codon usage in bacteria: correlation with gene expressivity. Nucleic Acids Res, 1982， 10(22): 7055-7074)。迄今為止，科學(xué)家仍在 思索是什么進(jìn)化壓力導(dǎo)致了密碼子使用偏性。 一些研究者認(rèn)為，每種生 物體內(nèi)同義密碼子之間的突變-選擇平衡可以部分解釋基因組GC含量對(duì) 密碼子分布的影響及密碼子使用形式的改變(參見(jiàn)Knight, R.D. et al. A simple model based on mutation and selection explains trends in codon and amino-acid usage and GC composition within and across genomes. Genome Biol, 2001， 2(4),RESEARCH0010.Epub2001Mar0022)。而另一些研 究者認(rèn)為，密碼子的偏性可以減少tRNA的多樣性，從而降低新陳代謝 負(fù)荷，有利于生物在快速生長(zhǎng)條件下節(jié)約部分能量(參見(jiàn)Andersson， GE. and Kurland, C.G. An extreme codon preference strategy: codonreassignment Mol Biol Evol， 1991， 8 (4): 530-544)。不論是什么原因 導(dǎo)致了密碼子的偏性，已經(jīng)日益清楚的是密碼子的偏性對(duì)異源蛋白質(zhì)的 表達(dá)存在深遠(yuǎn)的影響(Kane， J.F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol， 1995， 6 (5), 494-500)。通常，如果一個(gè)基因包含越多宿主 細(xì)胞罕用的密碼子，就越不可能獲得高水平的異源表達(dá)。如果稀有密碼 子出現(xiàn)在或連續(xù)出現(xiàn)在基因讀碼框的5'端，則會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平的急 劇下降。因此，在異源的宿主細(xì)胞中提高目的基因表達(dá)量常用的一個(gè)策 略就是改變目的基因的稀有密碼子，在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列 的基礎(chǔ)上，使之更接近于宿主細(xì)胞的密碼子使用方式，這種旨在提高目 的基因異源表達(dá)量的方法就稱為密碼子優(yōu)化。應(yīng)用密碼子優(yōu)化技術(shù)，可以使目的基因的異源表達(dá)量得到大幅度的 提高?，F(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的是利用大腸埃希桿菌細(xì)胞(￡. co//)表達(dá)哺 乳動(dòng)物蛋白。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在￡."http://中表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白時(shí)，由密碼子優(yōu)化 帶來(lái)的表達(dá)量增加通常在5 15倍之間，占￡. co"中可溶蛋白的5。/。(參 見(jiàn)Claes Gustafsson, et al. Codon Bias and Heterologous Protein Expression. TRENDS in Biotechnology, 2004, 22(7): 346-353)。另外，密 碼子優(yōu)化還有一個(gè)成功的范例就是提高病毒基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中 的表達(dá)，這種基因優(yōu)化的方式一般通過(guò)重新合成基因?qū)崿F(xiàn)。病毒是一種 非常特殊的例子，它們的密碼子受到完全不同的進(jìn)化壓力約束，所以它 們經(jīng)常通過(guò)重疊的讀碼框來(lái)負(fù)載高密度的信息，而且很多病毒基因還在 編碼序列內(nèi)部編碼順式調(diào)控序列。因此，需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá) 病毒蛋白時(shí)，可以按照宿主密碼子偏性重新合成基因，同時(shí)破壞病毒基 因內(nèi)部的調(diào)控元件，從而使目的蛋白產(chǎn)量得以提高(參見(jiàn)Graf, M. et al. Concerted action of multiple cisacting sequences is required for Rev dependence of late human immunodeficiency virus type 1 gene expression. J Virol， 2000， 74(22): 10822-10826)。然而通過(guò)密碼子優(yōu)化，尤其是通過(guò)對(duì)病毒基因的優(yōu)化來(lái)達(dá)到提高基 因異源表達(dá)量的方法仍然存在諸多不確定的因素，并不是使用某一特定 宿主體系喜用密碼子就可以實(shí)現(xiàn)目的基因的高水平表達(dá)。重新設(shè)計(jì)一個(gè)基因序列在具體的操作過(guò)程中需要考慮多方面的問(wèn)題。在不考慮其他限制條件的情況下，編碼同一個(gè)蛋白質(zhì)的核苷酸序列可能有很多種。假設(shè)
每個(gè)氨基酸平均可以被3個(gè)不同的密碼子編碼，則一個(gè)由100個(gè)氨基酸 組成的蛋白，大約能夠被3， (~5xl047)個(gè)核苷酸序列編碼產(chǎn)生。這些 可能的序列中有哪些可以帶來(lái)高水平的異源蛋白表達(dá)，又如何將這些序 列挑選出來(lái)是一個(gè)繁復(fù)的過(guò)程?，F(xiàn)今優(yōu)化密碼子的方式是將每個(gè)氨基酸 對(duì)應(yīng)使用的一個(gè)密碼子更換為被宿主細(xì)胞最頻繁使用的那個(gè)同義密碼 子。這種"一個(gè)氨基酸一一一個(gè)密碼子"的優(yōu)化方法有幾個(gè)缺點(diǎn)。首先， 相對(duì)于一個(gè)tRNA庫(kù)而言，由這種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的大量mRNA將會(huì)產(chǎn)生 一個(gè)高的密碼子濃度，從而導(dǎo)致tRNA庫(kù)失去平衡，并造成密碼子使用 方式的傾斜以及潛在的翻譯錯(cuò)誤(參見(jiàn)Kurland， C. and Gallant, J. Errors of eterologous protein expression. Curr Opin Biotechnol. 1996， 7 (5), 489-493)。異源表達(dá)的蛋白可能占總細(xì)胞質(zhì)量的60%，因此采用單一的 tRNA庫(kù)將是一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題。有研究發(fā)現(xiàn)，在"一個(gè)氨基酸——一 個(gè)密碼子"優(yōu)化的基因中引入同義突變可以提高蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(參 見(jiàn)Klasen, M. and Wabl, M. Silent point mutation in DsRed resulting in enhanced relative fluorescence intensity. BioTechniques， 2004， 36 (2): 236-237)。第二，在密碼子選擇上如果沒(méi)有機(jī)動(dòng)性，則難以避免基因和 轉(zhuǎn)錄后的mJRNA中產(chǎn)生一些重復(fù)元件和二級(jí)結(jié)構(gòu)，而抑制核糖體的通 過(guò)，導(dǎo)致翻譯過(guò)程的阻滯。另外重復(fù)元件的存在可能使基因合成的難度 增加。過(guò)多的重復(fù)元件的存在還會(huì)影響基因在宿主內(nèi)的穩(wěn)定性。第三， 優(yōu)化的基因還經(jīng)常需要在序列中引入或排除一些序列元件，如限制性內(nèi) 切酶位點(diǎn)，以便于隨后的操作。由此可見(jiàn)， 一個(gè)成功的優(yōu)化基因，不僅 需要消除不利的密碼子配對(duì)和極端GC含量、消除重復(fù)序列、避免不利 的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、避免或引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，還需要避免脆性剪 接位點(diǎn)、調(diào)控元件、免疫激活或免疫抑制元件(對(duì)DNA疫苗而言)、RNA 甲基化信號(hào)和許多其它與所使用宿主系統(tǒng)相關(guān)的特殊因素，才能達(dá)到最 終提高異源表達(dá)量的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種DNA分子，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼Gl 型輪狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實(shí)施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:2。
本發(fā)明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼' G1型輪狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實(shí)施方案中，所述密碼子優(yōu)化的核苷酸序列為SEQIDNO:2。該重 組載體可為病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒載體，優(yōu)選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為rvAdGlVP7(opt) (opt指優(yōu)化 后的基因)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述桿狀病毒載體為 rvBacGlVP7(opt)。
本發(fā)明另一方面還提供了一種宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的重組載 體。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 該宿主細(xì)胞為草地貪夜蛾細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)或293細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面還提供了一種提高G1型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本 發(fā)明的宿主細(xì)胞并獲得G1型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。
本發(fā)明另一方面還提供了本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的G1型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發(fā)明還提供了 一種DNA分子，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼G2型輪 狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實(shí) 施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:4。
本發(fā)明另 一方面提供了 一種重組載體，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼 G2型輪狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實(shí)施方案中，所述密碼子優(yōu)化的核苷酸序列為SEQIDNO:4。該重 組載體可為病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒載體，優(yōu)選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為rvAdG2VP7(opt)。在另一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacG2VP7(opt)。
本發(fā)明另一方面還提供了一種宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的重組載 體。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 該宿主細(xì)胞為草地貪夜蛾細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)或293細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面還提供了一種提高G2型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本 發(fā)明的宿主細(xì)胞并獲得G2型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。本發(fā)明另一方面還提供了本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的G2型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發(fā)明還提供了 一種DNA分子，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼G3型輪 狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實(shí) 施方案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:6。
本發(fā)明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼 G3型輪狀病毒VP7蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在 具體實(shí)施方案中，所述密碼子優(yōu)化的核苷酸序列為SEQIDNO:6。該重 組載體可為病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒載體，優(yōu)選腺病毒載體或桿狀病毒載體。 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為rvAdG3VP7(opt)。在另一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacG3VP7(opt)。
本發(fā)明另一方面還提供了一種宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的重組載 體。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 該宿主細(xì)胞為草地貪夜蛾細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)或293細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面還提供了一種提高G3型輪狀病毒VP7蛋白或者其 免疫原性部分的表達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本 發(fā)明的宿主細(xì)胞并獲得G3型輪狀病毒VP7蛋白或者其免疫原性部分。
本發(fā)明另一方面還提供了本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的G3型輪狀病毒 VP7蛋白或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。
本發(fā)明還提供了一種DNA分子，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼輪狀病 毒VP6蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體實(shí)施方 案中，該核苷酸序列為SEQIDNO:8。
本發(fā)明另一方面提供了一種重組載體，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼 輪狀病毒VP6蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。在具體 實(shí)施方案中，所述密碼子優(yōu)化的核苷酸序列為SEQIDNO:8。該重組載 體可為病毒、細(xì)菌或質(zhì)粒載體，優(yōu)選腺病毒載體或桿狀病毒載體。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腺病毒載體為rvAdVP6(opt)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，所述桿狀病毒載體為rvBacVP6(opt)。
本發(fā)明另 一方面還提供了 一種宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的重組載 體。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 該宿主細(xì)胞為草地貪夜蛾細(xì)胞(如Sf9細(xì)胞)或293細(xì)胞。
9本發(fā)明另一方面還提供了一種提高輪狀病毒VP6蛋白或者其免疫原
性部分的表達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的
宿主細(xì)胞并獲得輪狀病毒VP6蛋白或者其免疫原性部分。
本發(fā)明另一方面還提供了本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的輪狀病毒VP6蛋白 或者免疫原性部分的核苷酸序列及其重組體作為疫苗的用途。


現(xiàn)在，參照旨在說(shuō)明而非限定本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的附圖，對(duì) 本發(fā)明的各方面特征進(jìn)行描述。
圖1 pShuttle-CI載體構(gòu)建的酶切鑒定結(jié)果(Kpnl單酶切鑒定)。
1. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.重組載體pShuttle-CI; 3陰性對(duì)照pShuttle; 圖2目的片段連接到載體pShuttle-CI上的酶切鑒定結(jié)果。
1. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2. pShuttle-CI/GlVP7(opt)(MluI， Sail); 3. pShuttle-CI/G2VP7(opt)(MM，SalI ); 4.pShuttle-CI/G3VP7(opt) (MluI，SalI); 5.pShuttle-CI(MM,SalI); 6. pShuttle-CI/VP6 (opt) (kpnl); 7.pShuttle-CI/VP6(opt)(XhoI，SalI); 8. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 圖3重組腺病毒質(zhì)粒的酶切鑒定。
1. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2. pShuttle-CI 3. pAdeasy-l/ GlVP7(opt) (Pac I); 4. pAdeasy-l/ G2VP7 (opt) (Pac I); 5. pAdeasy-l/ G3VP7(opt) (Pac I); 6. pAdeasy-1/ VP6(opt) (Pac I); 圖4輪狀病毒蛋白基因在293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Western blot分析。
A: 1.輪狀病毒SA11感染MA104細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照)；2.蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)；3. rvAdGlVP7(opt) ; 4. rvAdG2VP7 (opt) ; 5. rvAdG3VP7(opt); 6. rvAdVP6(opt); 7. Ad5(空載體對(duì)照)；8. 293(空 細(xì)胞對(duì)照)；
B:肌動(dòng)蛋白內(nèi)參，加樣順序和量同A圖
圖5輪狀病毒蛋白基因在293細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量差異的Western blot分析。 A: rvAdG3VP7密碼子優(yōu)化前后表達(dá)量的差異 第一排1.rvAdG3VP7優(yōu)化基因；2. rvAdG3VP7原始基因 第二排肌動(dòng)蛋白內(nèi)參，加樣順序和量同上。 B: rvAdVP6密碼子優(yōu)化前后表達(dá)量的差異第一排1.rvAdVP6優(yōu)化基因；2. rvAdVP6原始基因 第二排肌動(dòng)蛋白內(nèi)參，加樣順序和量同上。
圖6提取BacmidDNA的PCR鑒定。
l.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2.pFBl/GlVP7(opt); 3. pFBl/G2VP7(opt); 4.
pFBl/G3VP7(opt); 5. pFBl/G3VP7; 6. J)NA+Hind111 marker; 7.
pFBl/G2VP6(opt); 8.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； 圖7輪狀病毒蛋白基因在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及表達(dá)量差異的Western blot 分析。
A: 1.空白Sf9細(xì)胞；2.輪狀病毒SA11感染的MA、104細(xì)胞)；3. rvBacGlW7(opt); 4. rvBacG2VP7(opt); 5. rvBacG3VP7(opt); 6. rvBacG3VP7; 7. rvBac VP6(opt);其中，3、 4、 5和7為密碼子優(yōu) 化的基因，6為野生型基因 B:肌動(dòng)蛋白內(nèi)參，加樣順序和量同A圖
具體實(shí)施例方式
序列說(shuō)明
SEQIDNO 1:G1型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化前序列。 SEQIDN0 2: Gl型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化后序列。 SEQIDNO 3: G2型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化前序列。 SEQ ID NO 4: G2型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化后序列。 SEQ ID NO 5: G3型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化前序列。 SEQ ID NO 6: G3型輪狀病毒VP7蛋白基因優(yōu)化后序列。 SEQIDNO 7:輪狀病毒VP6蛋白基因優(yōu)化前序列。 SEQIDNO 8:輪狀病毒VP6蛋白基因優(yōu)化后序列。 密碼子優(yōu)化
由于本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的基因序列將在來(lái)自于人的293細(xì)胞中表 達(dá)，因此，本發(fā)明依據(jù)人的優(yōu)選密碼，首先選取人使用頻率最高的密碼
子(http:〃www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=Homo+sapiens+『gbpril)，再根
據(jù)總體GC含量在50X 55X和同一密碼子連續(xù)不超過(guò)3個(gè)的原則，調(diào)整 所選密碼子，為次選密碼子。調(diào)整總體GC含量在50X 55X之間是因 為該含量范圍為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA的常見(jiàn)GC含量。而同一密碼子連續(xù)不超過(guò)3個(gè)是為了提高RNA的利用率。然后用相關(guān)軟件分析起始端的 RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，防止發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。最后，再在起始端加上KOZAK序列，兩端加上下一步連接到載體上所需要的酶切位點(diǎn)，得到上述所列 優(yōu)化序列。本發(fā)明所用優(yōu)化密碼子Amino AcidCodonAmino AcidCodonAla(A)GCC/GCTAsn(N)AAC/AATCys(C)TGCPro(P)CCC/CCTAsp(D)GAC/GATGln(Q)CAG/CAAGlu(E)GAG/GAAArg(R)AGAPhe(F)TTCSer(S)AGC/TCCGly(G)GGC/GGAThr(T)ACC/ACAHis冊(cè)CACVal(V)GTG/GTCIte(I)ATC/ATTTrp(W)TGGLys(K)AAG/AAATyr(Y)TAC/TATLeu(L)CTG/CTCTGAMet(M)ATG應(yīng)用在獲得了如前所述的密碼子優(yōu)化基因的基礎(chǔ)上，將該基因克隆入合 適的載體即可得到有用的重組載體。在該重組載體中，含有本發(fā)明的密 碼子優(yōu)化的核苷酸序列。具體而言，所述密碼子優(yōu)化的核苷酸序列為SEQIDNO:2、 4、 6或8。該重組載體可為任何合適的載體，包括病毒、 細(xì)菌或質(zhì)粒載體。其中，病毒載體可為桿狀病毒、腺病毒、皰疹病毒、 EB病毒、腺病毒伴隨病毒、痘苗病毒、甲病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、 流感病毒、副流感病毒、水泡性口炎病毒、冠狀病毒、麻疹病毒、乙腦 病毒、登革病毒等病毒載體。質(zhì)粒載體可以是復(fù)制型的，也可以是非復(fù) 制型的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體為病毒載體，優(yōu)選為腺病毒載體或 桿狀病毒載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組載體為重組腺病毒載體rvAd GlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述所述重組載體為桿狀病毒載體 rvBacGlVP7(opt)、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3VP7(opt)、 rvBacVP6(opt)。將本發(fā)明的前述重組載體通過(guò)合適的方法引入細(xì)胞宿主，即可獲《尋 一種新的宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的重組載體。該宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。所述原核細(xì)胞可以是細(xì)菌，例如大腸桿菌等。所述真核細(xì)胞可以是畢赤酵母等酵母類細(xì)胞、Sf9或Sf21細(xì)胞等昆蟲(chóng)細(xì)胞、293細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞系等等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞為草地貪夜蛾細(xì)胞Sf9或293細(xì)胞。在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞就可以獲得本發(fā)明的 輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。由于本發(fā)明的宿主細(xì)胞中，含有經(jīng)過(guò)優(yōu)化的核苷酸序列，因此，相對(duì)于使用含有相應(yīng)天然 序列的同樣宿主細(xì)胞的情形時(shí)，使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞時(shí)輪狀病毒VP7 或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表達(dá)量更高。因此，本發(fā)明提供了提 高輪狀病毒VP7或VP6蛋白表達(dá)量的方法。適合表達(dá)的條件可以根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞確定。宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和 進(jìn)行蛋白表達(dá)的條件有可能不同。使用原核宿主細(xì)胞表達(dá)外源蛋白基因時(shí)，這些重組肽或蛋白經(jīng)常需 要進(jìn)一步的修飾。它們常常會(huì)失去進(jìn)行折疊的能力，不能形成二硫鍵。 還可能在細(xì)菌內(nèi)源性蛋白酶的作用下表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，并且容易聚集成 無(wú)活性的復(fù)合體。因此，與天然的蛋白相比，重組肽或蛋白常常產(chǎn)量較 低，抗原性或免疫原性也降低。而使用真核宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)時(shí)，由于 真核細(xì)胞具有翻譯后的加工修飾體系,表達(dá)的外源蛋白更接近于天然蛋 白質(zhì)。因此，在本發(fā)明中，使用真核宿主細(xì)胞表達(dá)輪狀病毒VP7蛋白或 VP6蛋白或者其免疫原性部分。本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的輪狀病毒VP7或VP6蛋白或者其免疫原性部 分的編碼核苷酸序列的重組體可以作為疫苗使用。通過(guò)注射、口服、滴 鼻或者噴霧等方式對(duì)宿主進(jìn)行免疫。由于載體本身就具有良好的免疫刺 激作用，因此，本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列的重組體作為疫苗時(shí) 可以不使用免疫佐劑。根據(jù)使用的具體情形，也可以添加合適的佐劑， 以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域的常規(guī)佐劑均可以使用，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員根據(jù)需要決定添加的量。并且，由于病毒載體疫苗不僅可以直接激發(fā) 機(jī)體的免疫應(yīng)答，而且，可以通過(guò)在機(jī)體內(nèi)持續(xù)進(jìn)行表達(dá)，不斷產(chǎn)生蛋 白或者免疫原性部分，從而進(jìn)一步引發(fā)機(jī)體的多種免疫應(yīng)答。為了更為清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的 范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件和方法，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Sambrook, et al. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述方法或試劑制造商提供的方法。實(shí)施例1輪狀病毒基因的密碼子優(yōu)化及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量的提筒本實(shí)施例的內(nèi)容是將輪狀病毒基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，人工合 成優(yōu)化后的基因并以腺病毒為載體，在293細(xì)胞中表達(dá)密碼子優(yōu)化后 的G1、 G2、 G3型VP7蛋白基因和VP6蛋白基因，并將其表達(dá)量與野 生型蛋白基因的表達(dá)量相比較，對(duì)密碼子優(yōu)化的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。具體 步驟如下1. 四種輪狀病毒蛋白基因密碼子的優(yōu)化按人類偏愛(ài)密碼子(參見(jiàn) http:〃www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=Homo+sapie ns+[gbpri])進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，委托上海生工生物工程公司合成了我國(guó)當(dāng)前 流行的輪狀病毒Gl、 G2、 G3型外殼蛋白VP7的優(yōu)化基因和內(nèi)殼蛋白 VP6的優(yōu)化基因，其序列分別見(jiàn)SEQIDNO:2、 4、 6或8。為了清楚地 顯示所做的修改，同時(shí)列出了未經(jīng)優(yōu)化的原始序列。優(yōu)化后的序列G+C 含量50~55%，被克隆于pUC57 (上海生工公司)載體上，分別命名為 pUC57/GlVP7 (opt)、 pUC57/G2VP7 (opt)、 pUC57/G3VP7 (opt)、 pUC57/VP6 (opt)，所有合成基因經(jīng)大連寶生物公司和上海博亞生物技 術(shù)公司測(cè)序確證正確后，用于蛋白的表達(dá)。2. 重組穿梭載體的構(gòu)建(1)穿梭載體pShuttle-CI的構(gòu)建將pCI載體(美國(guó)Promrga公司)用限制性內(nèi)切酶BglII單酶切后 用Klenow酶(Prome公司)補(bǔ)平，用Bamffl酶切；同時(shí)將pShuttle載 體用Notl酶切，同樣方法補(bǔ)平后，再用BglII酶切。利用Bamffl和BglII 酶切片段末端相互粘合的特點(diǎn)， 一平一粘連接兩個(gè)酶切片段，即將pCI 載體上的約1400bp的片段插入pShuttle載體，此時(shí)pShuttle載體上原有 的酶切位點(diǎn)殘余一個(gè)KpnI。用KpnI酶切鑒定(有1100 bp的片段為連接正確的重組載體pShuttle-CI)(圖1 )。載體pShuttle-CI總長(zhǎng)7900bp左 右，多克隆位點(diǎn)中可用的酶有Nhel、 Xhol、 Mlul、 Xbal、 Sail和Notl。 (2)將密碼子優(yōu)化的蛋白基因克隆入穿梭載體pShuttle-CI用限制性內(nèi)切酶Sal I和Mlu I雙酶切穿梭質(zhì)粒pShuttle-CI,體系為 pShuttle-CI 10pg， Sal I和Mlu I各2^1， lOx緩沖液5(il， H20 21^1。置37°C 孵育2h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時(shí)代公司)回收7900bp的載 體片段，并用稀釋電泳法粗略定量。用Sal I和Mlu I雙酶切含有密碼子優(yōu)化基因的質(zhì)粒 pUC57/GlVP7(opt)、 pUC57/G2VP7(opt)、 pUC57/G3VP7(opt)和pUC57/ VP6(opt)，反應(yīng)體系為質(zhì)粒10pg， Sal I和Mlu I.各2^1， 10x緩沖液5pl， H20 1^1。置37。C孵育2h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時(shí)代公司) 回收目的片段并對(duì)其定量。將上述載體片段pShuttle-CI分別與目的基因GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)和VP6(opt)片段進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系為 載體片段pShuttle-CI l昭，目的片段GlVP7(opt)、 G2VP7(叩t)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)各5嗎，連接緩沖液2|il; T4 DNA連接酶(TAKARA 公司產(chǎn)品)lpl;H20 7.6pl。置16""C反應(yīng)16h。取10|il連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co// DH10B感受態(tài)細(xì)胞。挑取卡那霉素(K+)抗性克隆，用含卡那霉素的LB 培養(yǎng)液培養(yǎng)12 16h后，以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，用Sal I和MM雙 酶切鑒定，得到重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CI/GlVP7(opt)、 pShuttle-CI/G2VP7(opt)、 pShuttle-CI/G3VP7(opt)和pShuttle誦CI/VP6(opt)(圖2)。 3.重組臁病毒的獲得分別取上述四種克隆有外源基因的重組腺病毒穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CI/Gl VP7(opt)、 pShuttle-CI/G2VP7(opt)、 pShuttle-CI/G3 W7(opt) 和pShuttle-Cl，6(opt)各約500ng，用Pme I (美國(guó)New England Biolabs 公司)單酶切以線性化質(zhì)粒，用無(wú)水乙醇沉淀后，溶于6|nl ddH20中備用。用線性化的重組穿梭質(zhì)粒與約100ngpAdEasy-l腺病毒骨架質(zhì)粒(美 國(guó)Stratagen公司)共同電轉(zhuǎn)化五co// BJS183(美國(guó)Stratagen公司)感受態(tài) 細(xì)胞(參見(jiàn)He TC， Zhou S， da Costa L, Yu〗，Kinzler KW, Vogelstein B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad.Sci. USA， 1998， 95: 2509-14)，取細(xì)菌懸液涂于含50jig/ml卡那霉素的 LB培養(yǎng)板中，于37"C培養(yǎng)16~20h，挑選10~20個(gè)較小的菌落，接種于 3ml含有卡那霉素(25嗎/ml)的SOC培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司.)內(nèi)， 置37。C振搖培養(yǎng)12 16h，用堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA，獲得了重組 腺病毒質(zhì)粒 pAdEasyGlVP7(opt) 、 pAdEasyG2VP7(opt)、 pAdEasyG3VP7(opt)和pAdEasyVP6(opt)，用0.7°/。瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 遷移率分析后，用pac I (美國(guó)New England Biolabs公司)酶切進(jìn)一步鑒 定，可產(chǎn)生4.5Kb或3Kb左右的片段。將所得的重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化以 氯化鈣法制備的宿主菌五.co/ZDH10B (recAl， endAl)(美國(guó)Invitrogen 公司)感受態(tài)細(xì)胞，在此宿主菌中可產(chǎn)生高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，挑取目的克 隆，經(jīng)PacI酶切鑒定(圖3)后，置-7(TC保存?zhèn)溆?。用QIAGEN Plasmid Midi Kit (德國(guó)Qiagen公司)提取重組腺病毒 質(zhì)粒，用PacI酶切后，無(wú)水乙醇沉淀回收目的DNA片段，溶于無(wú)菌 去離子水中。在轉(zhuǎn)染前24h將293細(xì)胞(美國(guó)Invitrogen公司)接種于T-12.5 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)BD公司)中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的豐度為50。/。 70。/。。將PacI 酶切線性化后的10嗎重組腺病毒DNA及3^1的Lipofectamine 2000(美 國(guó)Invitrogen公司)分別與100plM液(無(wú)抗生素、無(wú)血清的含有谷氨 酰胺及NaHC03的DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司))充分混勻， 置室溫孵育15min后，混合兩種懸液室溫繼續(xù)作用30min。在上述等待 的時(shí)間里，移去293細(xì)胞的原培養(yǎng)液，用2ml M液洗細(xì)胞2次。補(bǔ)加 800^1 M液至Lipofectamine2000-DNA的復(fù)合物中，輕輕混勻后加至洗 滌過(guò)的293細(xì)胞上，置37。C， 5。/。C02孵育5h，移去含DNA/脂質(zhì)體復(fù) 合物的培養(yǎng)液，補(bǔ)加含10%新生牛血清(美國(guó)Hyclone公司)的DMEM完 全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，第二天換為含2。/。新生牛血清的DMEM維持液， 繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后6 7天，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓等細(xì)胞病變(CPE)。 收集細(xì)胞與上清液一起-7(TC、 37。C反復(fù)凍融3次，取適量的凍融液接種 293細(xì)胞，用含2。/。新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37。C、 5% (202培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，按上述方法收病毒傳代一次。獲得的重組腺 病毒命名為rvAdGlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt) 、 rvAdG3VP7(opt)和 rvAdVP6(opt)。
分另U用 rvAdGlVP7(opt) 、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)感染293細(xì)胞，待細(xì)胞病變完全后，反復(fù)凍融3次，13,000rpm離心10min，取上清，磷鎢酸負(fù)染后在透射電子顯微鏡下觀察，可見(jiàn)呈二十面體結(jié)構(gòu)、直徑約為70nm的病毒顆粒，具有典型的腺病毒形態(tài)。4.目的蛋白的表達(dá)鑒定及表達(dá)量的比較待293細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 90%豐度時(shí)，分別接種重組腺病毒rvAd GlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)和rvAdVP6(opt)，感染 后48h刮下病變的細(xì)胞，于fC、 5000rpm離心10min，收集細(xì)胞沉淀， 用PBS洗漆細(xì)胞3次，每次4。C、 5000rpm離心10min，將細(xì)胞沉淀用200nl 含蛋白酶抑帝!j齊!j (Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Cat. No. 11 873 580 001 ，美國(guó)Roche公司)的REPA裂解液(50mmol/LPH=8.0Tris-HCl， 150mmol/L NaCl， 0.1% SDS， 1%NP40， 0.5%脫氧膽酸鈉)冰上裂解lh，于4。C、 12，000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新的eppendor滑中，按說(shuō)明書 所述的方法，用BCAtm Protein Assay Kit (Pierce公司)對(duì)提取的胞漿蛋 白進(jìn)行定量，然后加入5xSDS-PAGE電泳緩沖液，IO(TC加熱變性后，取 100嗎總蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜， 用5%脫脂奶室溫封閉2h后，用羊抗輪狀病毒多抗(Biodesign公司)1:1000 稀釋，室溫孵育2h，用含0.05。/。Tween-20的TBS緩沖液(TBST)洗滌5 6次 后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(中杉金橋公司)l:2000稀釋室 溫孵育2h。 TBST充分洗滌后，用SuperSignal⑧WestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce公司)進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示，在44kD和34kD附近有特異性的條 帶出現(xiàn)(圖4),說(shuō)明腺病毒攜帶的輪狀病毒衣殼蛋白基因在293細(xì)胞中 得到有效表達(dá)。用同一張膜重新5。/。脫脂奶室溫封閉2h后，再用兔抗肌動(dòng) 蛋白抗體(中杉金橋公司)l:1000稀釋孵育2h，用TBST洗滌5 6次后， 用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG (中杉金橋公司)l:2000稀釋室溫孵 育lh。 TBST充分洗滌后，用SuperSigna膽WestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce 公司)進(jìn)行顯色，用以檢測(cè)上樣量是否一致。由于原始基因在腺病毒中 的表達(dá)量很低，無(wú)法用Westernblot檢測(cè)，因此，將優(yōu)化基因和原始基因 的加樣量調(diào)整為約1:3 (70嗎200嗎)。G3VP7(opt)和野生型基因G3VP7 用同一張膜重新5。/。脫脂奶室溫封閉2h后，VP6(opt)和VP6用另一張膜， 其上樣量相同。再用抗肌動(dòng)蛋白抗體孵育2h，用TBST洗漆5 6次后，用 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育2h。 TBST充分洗滌后，用)和VP6(opt)的表達(dá)量均為相應(yīng)野生型 基因G3VP7和VP6的表達(dá)量的10倍以上(圖5)。而優(yōu)化基因G1VP7 (opt) 和G2VP7(opt)用Westem很容易檢測(cè)，而對(duì)應(yīng)的野生型基因G1VP7和 G2VP7多次用Westem檢測(cè)，由于表達(dá)量太低，無(wú)法檢測(cè)到。這說(shuō)明經(jīng)過(guò) 密碼子優(yōu)化的基因序列其表達(dá)量在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以顯著提高，由此 證明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是成功的。原始基因和優(yōu)化基因Western檢測(cè)結(jié)果基因名稱原始基因結(jié)果優(yōu)化基因結(jié)果優(yōu)/原G1VP7檢測(cè)不到很容易檢測(cè)到G2VP7檢測(cè)不到可檢測(cè)到G3VP7可檢測(cè)到，很弱很容易檢測(cè)到>10VP6可檢測(cè)到，很弱很容易檢測(cè)到>10實(shí)施例2密碼優(yōu)化的輪狀病毒基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)量的提高為了證明按人類細(xì)胞偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因其 表達(dá)量在昆蟲(chóng)細(xì)胞中也可以提高，在本實(shí)施例中我們以桿狀病毒為載 體，分別表達(dá)了密碼子優(yōu)化的輪狀病毒GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)和野生型G3VP7蛋白基因，在昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中 檢測(cè)基因的表達(dá)及其表達(dá)量的差異。具體步驟如下 1.桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建用EcoR I和Sal I (TAKARA公司)雙酶切桿狀病毒表達(dá)載體 pFastBac 1 (以下簡(jiǎn)稱pFB 1,美國(guó)Invitrogen公司)，體系為pFB 1 10嗎 EcoR I和Sal I各2|il， lOx緩沖液5^1, H20 23pl。置37。C孵育3h，用 天為時(shí)代公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收載體片段，并用稀釋電泳法 粗略測(cè)定其含量。同時(shí)用EcoR I和Sal I雙酶切含有優(yōu)化基因的質(zhì)粒 pShuttle-CI/GlVP7(opt)、pShuttle-CI/G2VP7(opt)、pShuttle-CI/G3VP7(opt) 和pShuttle-CI/VP6(opt)。反應(yīng)體系為質(zhì)粒IO嗎，EcoR I和Sal I各2pJU 10x緩沖液5^d，H20 16|al。置37。C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒 (天為時(shí)代公司)分別回收目的片段，并用稀釋電泳法粗略測(cè)定其含量。再用Hind III和Xhol I (TAKARA公司)雙酶切桿狀病毒表達(dá)載體 pFBl,體系為pFBl IO呢，EcoR I和Sal I各2|il， lOx緩沖液5|4 H20 31^il。 37°C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天為時(shí)代公司)回收 載體片段，用稀釋電泳法粗略測(cè)定其含量。同時(shí)用Hind III和Xhol I雙酶切含有原始基因的質(zhì)粒 pGEM(7zf+)/G3VP7。反應(yīng)體系為質(zhì)粒IO嗎，Hind III和Xhol I各2^1， 10x緩沖液5pJ， H20 16^1。置37。C孵育3h，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天 為時(shí)代公司)分別回收目的片段，用稀釋電泳法粗略測(cè)定其含量。將上述線性化的載體pFBl分別與目的基因GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)和VP6(opt)及野生型G3VP7進(jìn)行連接反應(yīng)， 反應(yīng)體系為載體pFBl l嗎、目的片段GlVP7(opt)、 G2VP7(opt)、 G3VP7(opt)、 VP6(opt)及野生型G3VP7各IO嗎，連接緩沖液2^1; T4 DNA連接酶(TAKARA公司)1^1;補(bǔ)H20至20|il， 16。C連接16h。取 10^1連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E"/ZDH10B感受態(tài)細(xì)胞。挑取Amp抗性克隆， 用含Amp的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)12 16h后，以堿裂解法小量制備質(zhì)粒，用 EcoR I和Sal I分別對(duì)pFBl/GlVP7(opt) 、 pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)和pFBl/VP6(opt)進(jìn)行雙酶切鑒定，用EcoR I對(duì) pFBl/G3VP7進(jìn)行單酶切鑒定并用Hind III和Xhol I對(duì)pFBl/G3VP7進(jìn) 行雙酶切鑒定，得到重組桿狀病毒表達(dá)載體pFBl/GlVP7(opt)、 pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)、 pFBl/VP6(opt)和pFBl/G3VP7。 2.重組桿狀病毒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)座反應(yīng)(1) Luria Agar選擇性培養(yǎng)基的制備稱取40g Luria Agar(美國(guó)Invitrogen公司)固體培養(yǎng)基溶于1L超純 水，分裝至三角瓶中，10磅高壓20min，待冷卻至50。C左右，迅速加入 卡那霉素(美國(guó)Sigma公司)、慶大霉素(美國(guó)Sigma公司)、四環(huán)素(美 國(guó)Sigma公司)、Bluo-gal(美國(guó)Invitrogen公司)和ITPG(美國(guó)Invitrogen 公司)的貯存液，使其終濃度分別為50pg/ml、 7|ag/ml、 10|ig/ml、 100嗎/ml和鄉(xiāng)g/ml。(2) 轉(zhuǎn)座反應(yīng)從-80 °C冰箱取出co/z' DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)Invitrogen公司) 置于冰上解凍，分別加入100ng重組表達(dá)載體質(zhì)粒pFBl/GlVP7(opt)、pFBl/G2VP7(opt)、 pFBl/G3VP7(opt)、 pFBl/VP6(opt)、和pFBl/G3VP7， 輕彈eppendorf管，混勻，置冰浴30 min后于42。C熱休克90 sec，置于 冰浴穩(wěn)定5 min。 加入900(al SOC培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司)，置 37。C緩慢振搖4-6 h。分別取200^1菌液涂布Luria Agar選擇性培養(yǎng)平板， 37。C避光培養(yǎng)至少48h，觀察藍(lán)白斑生長(zhǎng)情況。3. 重組Baemid DNA的分離從上述平板上分別挑取3~4個(gè)白色菌落，再分別在Lurk Agar平板 上劃線培養(yǎng)過(guò)夜，挑取仍為白色的單菌落，轉(zhuǎn)至3ml LB (卡那霉素 50pg/ml，慶大霉素7ng/ml，四環(huán)素10fig/ml)培養(yǎng)液中，于37'C振搖 培養(yǎng)24h。取1.0ml培養(yǎng)物，15000rpm瞬時(shí)離心收集菌體，加入0.3ml 溶液1[15麵ol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 10讓ol/LEDTA, 100 ng/ml RNase A (美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品)]重懸菌體，加入0.3ml溶液II (0.2NNaOH， 1% SDS)混勻，室溫放置5min，加入0.3ml 3mol/L的乙酸鉀(pH5.5)，混 勻，置冰浴5 10min。 13,000 rpm離心10 min，取上清，加入0.8ml異 丙醇，混勻后，置冰浴5 10min， 13,000 rpm離心15min，沉淀用70% 乙醇洗滌，置室溫干燥，溶于50plTE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl， lmmol/L EDTA， pH8.0)中，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為重組 Bacmid質(zhì)粒模板按1:25稀釋后取lpl ; M13正鏈引物[gttttcccagtcacgac]0.5(X1 ( TAKARA公司合成)；M13負(fù)鏈引物(caggaaacagctatgac) 0.5jil ( TAKARA公司合成)；La Tag PCR Buffer 2.5(il; dNTP (TAKARA公司)2^1; La Tag酶(TAKARA公司)0.5(^1; 補(bǔ)H20至25pl。設(shè)置PCR反應(yīng)進(jìn)程如下94.0。C5min后，進(jìn)行如下30 個(gè)循環(huán)94.0。C45s; 55.0。C45s; 72.0°C 5min，然后72.0°C 10min;共 30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，取5pl PCR產(chǎn)物行0.7n/。瓊脂糖電泳，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)在2500bp和4000bp之間有很明亮的條帶，說(shuō)明目的片斷成功插入了(圖6)。4. 重組桿狀病毒的獲得昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9的培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(杭州四季青公司)和RS. (青霉素100U/ml，鏈霉素lOOpg/ml,華北制藥廠)的Grace培養(yǎng)基(美 國(guó)Invitrogen公司)。在轉(zhuǎn)染前24h，將細(xì)胞傳至T12.5細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美 國(guó)BD公司)中，待細(xì)胞長(zhǎng)至約30~40%豐度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)準(zhǔn)備下列溶液溶液A: 2嗎重組Bacmid DNA與95|il無(wú)血清無(wú)抗生素的 Grace培養(yǎng)基混合，溶液B: 10|il Celifectin 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen 公司)與90pl無(wú)血清、無(wú)抗生素的Grace培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司) 混合；將上述溶液A與溶液B混合，輕彈管壁混勻，窒溫孵育30min。 在等待的時(shí)間內(nèi)，用2ml無(wú)血清無(wú)抗生素的Grace培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次， 每瓶加入2ml無(wú)血清、無(wú)抗生素的Grace培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染混合物孵育結(jié) 束后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入細(xì)胞中。置27'C孵育5h后，去除轉(zhuǎn)染液， 換為含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)于27-C培養(yǎng)過(guò)夜。次日換為含 2%胎牛血清的維持液，置27。C培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，Sf9細(xì)胞出現(xiàn)CPE 后，收獲轉(zhuǎn)染上清，分裝至無(wú)菌凍存管中，此即為含重組病毒的原代毒 種，置4"C或-80'C保存。將此病毒感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增傳代。電鏡下 可見(jiàn)典型的桿狀病毒形態(tài)。 5.目的蛋白的表達(dá)鑒定及表達(dá)量的比較待Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)至30X 40X豐度時(shí)，分別接種等量(MOI=5)重組 桿狀病毒rvBacGlVP7(opt) 、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3VP7(opt)、 rvBacVP6(opt)和rvBacG3VP7 。感染48h后用細(xì)胞刮子刮下病變的Sf9細(xì) 胞，用PBS洗滌后，將細(xì)胞沉淀用200nl含蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Cat No. 11 873 580 001，美國(guó)Roche公司)的RIPA裂解 液(50mmol/LTris-HCl， 150mmol/LNaCl， 0.1% SDS, 1%NP40， 0.5% 脫氧膽酸鈉)置冰上裂解lh,于4"C 12,000 rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移 至另一新的eppendor滑中，按照說(shuō)明書所述的方法，用BCA Protein Assay Kit(Pierce公司)對(duì)提取的胞漿蛋白進(jìn)行定量后，加入5xSDS-PAGE 電泳緩沖液，煮沸5min后，取100嗎總蛋白行12。/。SDS-PAGE電泳。電 泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶室溫封閉211后，加入羊抗輪 狀病毒蛋白抗體(Biodesign公司)1:1000稀釋于4。C孵育過(guò)夜。用含 0.05。/oTween-20的TBS緩沖液(TBST)洗滌5 6次后，用辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記的兔抗羊IgG (中杉金橋公司)l:2000稀釋于室溫孵育2h。經(jīng)TBST 充分洗滌后，用SuperSigna跑WestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce公司)進(jìn) 行顯色。結(jié)果顯示，在44kD和34kD附近有濃集的特異性條帶出現(xiàn)(圖7)， 說(shuō)明桿狀病毒攜帶的輪狀病毒衣殼蛋白基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中得到高效表 達(dá)。用同一張膜重新5Q/。脫脂奶室溫封閉2h后，再用兔抗肌動(dòng)蛋白(actin)抗體(中杉金橋公司)l:1000稀釋孵育2h，用TBST洗滌5 6次后，用辣 根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG(中杉金橋公司)l:2000稀釋室溫孵育2h。 經(jīng)TBST充分洗滌后，用SuperSignal⑧WestPico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce公 司)進(jìn)行顯色。所有樣品肌動(dòng)蛋白的蛋白條帶粗細(xì)基本一致，說(shuō)明上樣 量的一致。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，分別用TotalLab軟件進(jìn)行半定量掃描，結(jié)果顯 示密碼子優(yōu)化基因G3VP7(opt)的表達(dá)量明顯高于野生型基因(G3VP7)， 是后者表達(dá)量的5 10倍。這說(shuō)明密碼子經(jīng)過(guò)優(yōu)化的基因序列在昆蟲(chóng)細(xì)胞 中也可以顯著提高表達(dá)量，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是成功的?！?10>王健偉<120>密碼子優(yōu)化的輪狀病毒蛋白的編碼核苷酸序列、其重組體及其應(yīng)用<130> CP扁0594BC< 8<170> Patentln version 3.3<210〉 1<211> 894<212〉 DNA<213> 人(Homo sapiens)〈400> 1atggactacaatttttgttaatttctgtagcattatttgccttaactaaa60gctcagaactatggacttaatataccaa/taacaggatcaatggatactgtatactccaat120tctactcaagaaggagtatttctaacatccacattatgtttgtattatccaactg膽gca180agtaatcaaatcagtgatggtg幼tggaa汪gactcattatcgcaaatgtttcttacaaaa240ggttggccaacaggatcagtctattttaaagagtactcaaatattgttgatttttccgtt300gatcceicaatttataacttagtactaatgaagtatgatcaaaatcttgaa360ttagatatgtcagaattagctgatttgatattgaatgaatggttatgtaatccaatggat420attattaccaacaatcgggagaatcaaataagtggatatcaatgggatca480tcgtgtactgtgaaagtgtgtccactgaatacacaaacgttgggaataggttgtcaaaca540acgaatgtagactcatttgaaacagttgctgagaatgaaaeiatteLgctgLtagtggatgtc600gttgatgggaaataaatttgacaactacgacatgtactattcgaaattgt660aagaagttaggtccaagagagaatgtagctgt汪atacaagttggtggctctaatatatta720gacataacagcggatccaacgactaatccacaaattgagagaatgatgagagtgaattgg780aaaagatggtggcaagta/tttt"actettattaatcagattgtacaggtt840atgtccaaaagatcaagatcattaaattctgctgcgttttattatagagtatag894<210> 2 <211〉 894 〈212> MA <213〉人工序列<400〉 2 atggactaca tcatttacagattcctgctcatcagcgtggccctgttcgccctgaccaag60gcccagaactacggcctgaacatccccattaccggcagcatggacaccgtgtacagcaac120agcacccagg agggcgtgttcctgaccagcaccctgtgcctgtactatcctaccgaggcc180agcaaccaga tcagcgacggcgagtggaaggacagcctgagccagatgttcctgaccaag240ggctggcccaccggcagcgtgtacttcaaggagtacagcaacatcgtggacttcagcgtg30023gaccctcagctgtactgcgactac幼tctggtgctgatgagaacctggag360ctggacatgagcgagctggccgacctgattctgaacgagtggctgtgcaaccccatggac420at,caccctgta.ttactatcaacagagcggcgaga.gcaa.caagtggatcagcatgggcagc480tcctgcaccgtgaaggtgtgccctctgaacacCCagSLCCCtgggcatt.ggctgccagaca540accaacgtggacagcttcgagaccgtggccgagaatgagaagctggccatcgtggacgtc600gtggacggcattaaccacaagatcaacctgacaaccac犯cctgcaccatC2Lgaaactgc660gccccagagagaacgtggccgtgatccaggtgggcggaagcaacatcctg720gacatcaccgccgaccctaccacaaatcctcagatcgagagaatgatgagagtgaactgg780aagagatggtggcaggtgttctacaccatcgtggactacatcaaccagatcgtgcaggtg840atgagcaagagaagc卿agcctgaatagcgctgccttctactatagagtgtga8943894 DNA人(Ho邁o sapiens) <■> 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1. 一種DNA分子，其中含有密碼子優(yōu)化的編碼輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白的全長(zhǎng)蛋白或其免疫原性部分的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述核苷酸序列為SEQIDNO:2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8 。
3. —種重組載體，其中含有權(quán)利要求1或2的核苷酸序列。
4. 權(quán)利要求3的重組載體，其中所述載體為腺病毒載體或桿狀病毒 載體。
5. 權(quán)利要求3的重組載體，其為rvAdGlVP7(opt)、 rvAdG2VP7(opt)、 rvAdG3VP7(opt)、 rvAdVP6(opt)、 rvBacGlVP7(opt)、 rvBacG2VP7(opt)、 rvBacG3 VP7(opt)或rvBacVP6(opt)。
6. —種宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求3 — 5之一的重組載體。
7. 權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，其為Sf9細(xì)胞或293細(xì)胞。
8. —種提高輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分的表 達(dá)量的方法，該方法包括在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6或7的宿主 細(xì)胞并獲得輪狀病毒VP7蛋白或VP6蛋白或者其免疫原性部分。
9. 權(quán)利要求域2的DNA分子和權(quán)利要求沖的重組載體作為疫苗的 用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及密碼子優(yōu)化的輪狀病毒VP6或VP7蛋白的編碼核苷酸序列、含有該序列的重組載體以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及通過(guò)輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因密碼子的優(yōu)化提高蛋白表達(dá)量的方法及其在免疫學(xué)上的用途。
文檔編號(hào)C12N15/46GK101245350SQ20071007934
公開(kāi)日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2007年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月17日
發(fā)明者弋 束, 濤 洪, 敏 王, 王健偉 申請(qǐng)人:王健偉