專利名稱：制備光學(xué)活性胺衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)立體選擇地還原亞胺衍生物來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物的方法，該光學(xué)活性胺衍生物用作合成各種藥物的原料或中間體。
背景技術(shù)：
除了下述報(bào)道以外，對(duì)有關(guān)通過(guò)立體選擇地還原亞胺衍生物來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物的方法知之甚少。非專利文獻(xiàn) 1 =Tetrahedron Asymmetry, 19,93-96,2008Reduction of N-benzylidenebenzylamine by Acetobacterium woodi然而，由于N-亞芐基苯甲胺(N-benzylidenebenzylamine)的還原產(chǎn)物沒(méi)有手性， 所以還不清楚該反應(yīng)的立體選擇性。此外，近平滑假絲酵母還原N-((E)-N-(1-苯基亞乙基)苯胺衍生物的效率非常低，因此并不適于工業(yè)應(yīng)用。另外，還沒(méi)有鑒別出負(fù)責(zé)所述亞胺還原的酶。另一方面，已知下面的方法可用于制備2-甲基吡咯烷非專利文獻(xiàn)2 :Acta. Pharm. Suec.，15，255-263,1978使用酒石酸，通過(guò)光學(xué)拆分外消旋2-甲基吡咯烷來(lái)制備手性2-甲基吡咯烷的方法，其中，外消旋2-甲基吡咯烷是使用硼氫化鈉還原2-甲基-1-吡咯啉來(lái)制備的。非專利文獻(xiàn)3 J. Org. Chem.，54，209-216，1989。制備2-甲基吡咯烷的方法，其中，使用亞硫酰氯將L-脯氨酸衍生的L-脯氨醇(L-prolinol)的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槁然鶊F(tuán)；用芐氧基羰基保護(hù)氮原子；然后使用三正丁基氫錫(tributyltin hydride)，通過(guò)基于自由基(radical)的還原來(lái)制備(R)-I-芐氧基羰基-2-甲基吡咯烷，然后進(jìn)行脫保護(hù)。專利文獻(xiàn)1 :W02005/073388制備2-甲基吡咯烷的方法，其中光學(xué)活性1，4_戊二醇轉(zhuǎn)變?yōu)槎撬狨?，并通過(guò)與胺反應(yīng)進(jìn)行環(huán)化。然而，所有這些方法均具有下面的問(wèn)題-過(guò)程長(zhǎng)；-使用危險(xiǎn)的氫化物試劑；-以及由于通過(guò)拆分方法制備產(chǎn)物，因此產(chǎn)率不超過(guò)50%[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)][非專利文獻(xiàn)][非專利文獻(xiàn) 1]Tetrahedron Asymmetry, 19,93-96(2008)[非專利文獻(xiàn) 2] Acta. Pharm. Suec.，15，255-263 (1978)[非專利文獻(xiàn) 3]J. Org. Chem.，54，209-216 (1989)[專利文獻(xiàn)][專利文獻(xiàn) l]W02005/073388

發(fā)明內(nèi)容
[本發(fā)明要解決的問(wèn)題]本發(fā)明的目的是提供由亞胺衍生物來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供微生物和酶，這些微生物和酶能夠使用亞胺衍生物作為底物來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)分離編碼具有目標(biāo)性質(zhì)的酶的DNA來(lái)獲得重組體。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供使用重組體來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物的方法。[解決問(wèn)題的方法]本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，從而發(fā)現(xiàn)了符合上述這些先進(jìn)需要的方法。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以使用微生物的立體選擇地進(jìn)行還原的能力，通過(guò)立體選擇地還原亞胺衍生物來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物。如上所述，已知涉及立體選擇地還原亞胺衍生物的生物合成的酶。然而，所有已知的酶都與代謝有關(guān)。因此，當(dāng)酶用于制備藥物中間體或諸如此類的物質(zhì)時(shí)，不能預(yù)期工業(yè)應(yīng)用需要的底物特異性和活性。尤其是，沒(méi)有利用還原環(huán)狀烷基亞胺衍生物(例如2-甲基-ι-吡咯啉)來(lái)制備光學(xué)活性環(huán)狀烷基胺衍生物的合適方法。因此，令人非常驚訝的是發(fā)現(xiàn)了具有底物特異性和催化活性的微生物，其適于制備藥物等的中間體。更意外的是，微生物的立體選擇地還原亞胺的能力十分地高，并且滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。例如，鏈霉菌(Str印tomycessp. )GF3546是具有解決上述問(wèn)題的有用性質(zhì)的微生物。本發(fā)明人利用大量GF3546的培養(yǎng)物來(lái)制備無(wú)細(xì)胞提取物，然后通過(guò)進(jìn)行下述步驟成功地純化了亞胺還原酶-使用苯基瓊脂糖凝膠(Wienylwpharose)的疏水色譜；和-使用MonoQ的離子交換色譜。此外，本發(fā)明人分離了編碼亞胺還原酶的DNA，然后制備了高水平表達(dá)該酶的重組細(xì)菌，從而完成了本發(fā)明。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了下述制備光學(xué)活性胺的方法。本發(fā)明還涉及可用于該方法的微生物和亞胺還原酶，包含編碼這種酶的DNA的多核苷酸，制備該酶的方法。[1] 一種亞胺還原酶，其具有下述物理化學(xué)性質(zhì)(1) (5)(1)活性以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡(jiǎn)寫為NADPH)-依賴性方式還原2-甲基-1-吡咯啉從而產(chǎn)生(S)-2-甲基吡咯烷，和以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡(jiǎn)寫為NADP+)-依賴性方式氧化(S)-2-甲基吡咯烷，從而產(chǎn)生2-甲基-1-吡咯啉；(2)輔酶依賴性使用NADPH作為還原反應(yīng)的輔酶，使用NADP+作為氧化反應(yīng)的輔酶；(3)最適pH值針對(duì)還原為pH 7. 4 8. 0，針對(duì)氧化為pH 10. 5 ；(4)最適溫度針對(duì)還原為；35 45 °C ；和(5)分子量利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(在下文簡(jiǎn)寫為SDS-PAGE) 約為30500，利用凝膠過(guò)濾法約為81500 ；[2] 一種亞胺還原酶，其具有[1]項(xiàng)的物理化學(xué)性質(zhì)(1)和0)，并且其由下面 (a) (e)中所述的任意多核苷酸編碼(a)包括SEQ ID NO 2所述的核苷酸序列的多核苷酸；
(b)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括在SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQ IDNO 2所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQ ID NO :3所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性；[3]制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質(zhì)接觸[1]或[2] 項(xiàng)的亞胺還原酶、產(chǎn)生該亞胺還原酶的微生物和其處理物；以及回收式(II)代表的光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物
式(I)
權(quán)利要求
1.一種亞胺還原酶，其具有下述物理化學(xué)性質(zhì)(1) (5)(1)活性以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡(jiǎn)寫為NADPH)-依賴性方式還原2-甲基-1-卩比咯啉從而產(chǎn)生(S)-2-甲基吡咯烷，和以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(在下文簡(jiǎn)寫為NADP+)-依賴性方式氧化(S) -2-甲基吡咯烷，從而產(chǎn)生2-甲基-1-吡咯啉；(2)輔酶依賴性使用NADPH作為還原反應(yīng)的輔酶，使用NADP+作為氧化反應(yīng)的輔酶；(3)最適pH值針對(duì)還原為pH7. 4 8. 0，針對(duì)氧化為pH 10. 5 ；(4)最適溫度針對(duì)還原為35 45°C ；和(5)分子量利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(在下文簡(jiǎn)寫為SDS-PAGE)約為30500，利用凝膠過(guò)濾法約為81500。
2.一種亞胺還原酶，其具有權(quán)利要求1的物理化學(xué)性質(zhì)(1)和O)，并且其由下面 (a) (e)中所述的任意多核苷酸編碼(a)包括SEQID NO 2所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括SEQID NO :3所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括在SEQID NO :3所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQIDNO 2所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID NO :3所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
3.制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質(zhì)接觸，所述酶活性物質(zhì)為權(quán)利要求1或2所述的亞胺還原酶、產(chǎn)生該亞胺還原酶的微生物和其處理物；以及回收式(II)代表的光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物
4.制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，該方法包括下述步驟 使式(I)代表的亞胺衍生物與至少一種選自下述的酶活性物質(zhì)接觸，所述酶活性物質(zhì)為能夠立體選擇地還原所述化合物的微生物的培養(yǎng)物、菌體和其處理物；以及回收式(II)代表的光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物式(II):
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中式(I)的化合物是下式(III)代表的亞胺衍生物，式 (II)的化合物是式(IV)代表的胺衍生物
6.權(quán)利要求5所述的制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，其中式(III)代表的化合物是2-甲基-1-吡咯啉，式(IV)代表的化合物是2-甲基吡咯烷。
7.權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，其中所述微生物屬于鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)。
8.權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，其中所述微生物是鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)。
9.權(quán)利要求4 6中任一項(xiàng)所述的制備光學(xué)活性S-異構(gòu)體胺衍生物的方法，其中所述微生物是鏈霉菌NITE P-593。
10.一種多核苷酸，其編碼具有權(quán)利要求1的物理化學(xué)性質(zhì)(1)和的的亞胺還原酶，其是下面多核苷酸中的任意多核苷酸(a)包括SEQID NO 2所述的核苷酸序列的多核苷酸；(b)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括SEQID NO :3所述的氨基酸序列；(c)編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)包括在SEQID NO :3所述的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列；(d)在嚴(yán)格條件下與DNA雜交的多核苷酸，其中該DNA包括SEQIDNO 2所述的核苷酸序列；以及(e)編碼氨基酸序列的多核苷酸，其中該氨基酸序列與SEQID NO :3所述的氨基酸序列具有80%或更高的序列同一性。
11.一種重組載體，其插入有權(quán)利要求10所述的多核苷酸。
12.權(quán)利要求11所述的重組載體，其還插入有編碼脫氫酶的多核苷酸，所述脫氫酶能夠使用NADP+作為輔酶催化氧化還原反應(yīng)。
13.權(quán)利要求12所述的載體，其中所述脫氫酶是葡糖脫氫酶。
14.權(quán)利要求12所述的重組載體，其中所述葡糖脫氫酶來(lái)源于枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)。
15.一種轉(zhuǎn)化體，其以能表達(dá)的方式保持權(quán)利要求10所述的多核苷酸或權(quán)利要求12所述的載體。
16.制備由權(quán)利要求10所述的多核苷酸所編碼的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化體并回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)使能夠立體選擇地還原亞胺衍生物的微生物培養(yǎng)物、微生物菌體或其處理物與亞胺衍生物作用來(lái)制備光學(xué)活性胺衍生物，然后回收所產(chǎn)生的光學(xué)活性胺衍生物。本發(fā)明中獲得的光學(xué)活性胺衍生物作為藥物的原料是有用的。本發(fā)明能夠制備例如式(IV)代表的光學(xué)活性化合物(式中，R基團(tuán)代表具有1～3個(gè)碳原子的烷基；以及n代表1～4的整數(shù))。
文檔編號(hào)C12P17/10GK102197141SQ200980142858
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月1日
發(fā)明者吉田豐和, 山本浩明, 木本訓(xùn)弘, 石田浩一, 長(zhǎng)澤透 申請(qǐng)人:大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社