專利名稱：一種重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列及其重組載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的重 組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列和含有該重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的重組載體。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)又稱甲殼素，化學(xué)名為(l,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-(3-D-葡萄糖，是由 N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)p-l，4-糖苷鍵連接而成的天然高分子氨基多糖類化合物， 廣泛存在于低等植物菌類、藻類的細(xì)胞和甲殼動(dòng)物蝦、蟹、昆蟲外殼以及高等 植物的細(xì)胞壁中。自然界中幾丁質(zhì)年生物合成量近一百億噸，其中10%來(lái)自于 海洋，是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源，但遺憾的是這一資源未被 充分利用而作為廢物自然流失，不僅造成了巨大的浪費(fèi)，而且還導(dǎo)致了嚴(yán)重的 環(huán)境污染。大量的廢棄幾丁質(zhì)資源由于沒(méi)有行之有效的處理方法或因處理效果 不好長(zhǎng)期存在于自然環(huán)境中，在一定條件下會(huì)發(fā)生化學(xué)的、物理的或生物的轉(zhuǎn) 化，對(duì)周圍環(huán)境造成一定的影響。污染成分不僅通過(guò)水、氣、土壤、食物鏈等 途徑污染環(huán)境，成為大氣、水體和土壤環(huán)境污染的"源頭"；同時(shí)又是各種病源微 生物的孽生地和繁殖場(chǎng)，形成病源型污染，嚴(yán)重危害人體健康。如何充分利用 這些幾丁質(zhì)資源，使之變廢為寶，消除其對(duì)環(huán)境的污染，成為目前急需解決的 重要問(wèn)題。
近年來(lái)人們逐漸發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)的中間降解產(chǎn)物幾丁寡糖具有區(qū)別于單糖的某 些獨(dú)特的生理功能增強(qiáng)人體免疫機(jī)能；促進(jìn)脾臟抗體的形成；抗腫瘤及抑制 腫瘤轉(zhuǎn)移；降低膽固醇和血脂的含量；抗血栓、降血壓、降血糖、抗凝血、抗菌和抑菌等生物活性并能選擇性地活化和增殖人體腸道內(nèi)的有益菌；消除體內(nèi) 霉素，調(diào)節(jié)生理機(jī)能，延緩衰老；強(qiáng)化肝臟機(jī)能，阻礙病原菌生長(zhǎng)繁殖和排除 體內(nèi)重金屬等，已被科學(xué)界列為人的生命第六要素，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的陽(yáng)離 子動(dòng)物性膳食纖維，在醫(yī)藥、保健、化工、食品、環(huán)境和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛 的應(yīng)用前景，附加值高，因此幾丁寡糖的生產(chǎn)己成為開(kāi)發(fā)利用幾丁質(zhì)原料的一 條重要途徑。
幾丁質(zhì)可通過(guò)酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度難以控制，降解 產(chǎn)物主要為單糖，降解過(guò)程中產(chǎn)生的含硫酸或鹽酸的廢水直接排放或加堿中和 后排放到環(huán)境中，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的二次污染。酶法降解具有反應(yīng)條件溫和， 能耗低，無(wú)需昂貴設(shè)備和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因而具有良好的應(yīng)用前景。幾丁 質(zhì)可通過(guò)幾丁質(zhì)降解酶系作用而降解。根據(jù)反應(yīng)初級(jí)產(chǎn)物類型和水解切口位置 的不同，幾丁質(zhì)降解酶系可分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶、外切幾丁質(zhì)酶和幾丁二糖酶。 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)鏈的內(nèi)部切割P-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生幾丁寡糖；外切幾丁質(zhì) 酶從幾丁質(zhì)鏈的非還原性末端依次切割卩-l，4糖苷鍵，產(chǎn)生幾丁單糖；幾丁二糖 酶則專一性的將幾丁二糖降解為幾丁單糖，因此研制高效廉價(jià)的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 是催化幾丁質(zhì)降解成幾丁寡糖的關(guān)鍵所在。
巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展成為一種高效的外源蛋白基因優(yōu)秀 表達(dá)系統(tǒng)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定、高分泌、易適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵和培養(yǎng)成 本低等優(yōu)點(diǎn)。為了能夠提高內(nèi)切幾丁質(zhì)酶蛋白的表達(dá)量，本專利首先根據(jù)巴斯 德畢赤酵母基因組中各種氨基酸密碼子的使用頻率，設(shè)計(jì)合適的引物，采用PCR 技術(shù)合成了基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列，然后 構(gòu)建了含有該目的基因序列的表達(dá)載體pSECH，最后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)至表達(dá)量 高，易于純化以及容易適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的巴斯德畢赤酵母中，構(gòu)建高分泌型內(nèi)切幾丁質(zhì)酶巴斯德畢赤酵母工程菌，實(shí)現(xiàn)高效廉價(jià)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的 產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，經(jīng)濟(jì)、生態(tài)環(huán)境效益將非常明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的重組
內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列，其堿基序列如SEQIDNO.l所示。
本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種含有上述重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的重組 載體和由該重組載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母宿主。
本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)，利用PCR合成了基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏 愛(ài)性的重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因，構(gòu)建了微生物表達(dá)載體，再將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)至 表達(dá)量高，易于純化以及容易適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的巴斯德畢赤酵母中， 構(gòu)建高分泌型內(nèi)切幾丁質(zhì)酶工程菌，可實(shí)現(xiàn)高效廉價(jià)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)業(yè)化生 產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景，


圖1表示重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列的獲 得
根據(jù)巴斯德畢赤酵母密碼子的偏愛(ài)性和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的基因序列，設(shè)計(jì)以下 引物
F,:5，-GAATTCGCTAGTGGTTACGCTAACGCTGTTTACTTTACTAACTGGGGTATTTACGGT-3，
F2:5，-ACTGGGGTATTTACGGTCGTAACTTTCAACCACAAAACCTTGTTGCTT CTGATATTACT-3，
F3:5，-TGTTGCTTCTGATATTACTCATGTTATTTACTCTTTTATGAACTTTCAAG CTGATGGTACT-3，
F4:5，-TTCAAGCTGATGGTACTGTTGTTTCTGGTGATGCTTACGCTGATTACC AAAAGCATTAC-3，
F5:5，-ATTACCAAAAGCATTACGATGATGATTCTTGGAACGATGTTGGTAACA ACGCTTACGGT-3'
F6:5，-GTAACAACGCTTACGGTTGTGTTAAGCAACTTTTTAAGTTGAAGAAG GCTAACCGTAAC國(guó)3'
FW-AGAAGGCTAACCGTAACTTGAAGGTTATGCTTTCTATTGGTGGTTGGA CTTGGTCTACT-3"
F8:5，-GTTGGACTTGGTCTACTAACTTTCCATCTGCTGCTAGTACTGATGCTA ACCGTAAGAAC陽(yáng)3，
F9:5,-ATGCTAACCGTAAGAACTTTGCTAAGACTGCTATTACTTTTATGAAGG ATTGGGGTTTT-3,
F10:5，-TGAAGGATTGGGGTTTTGATGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCA GCTGATGATACT-3，
Fu:5，-ACCCAGCTGATGATACTCAAGCTACTAACATGGTTCTTCTTCTTAAGG AAATTCGTTCT-3，
F12:5，-TTAAGGAAATTCGTTCTCAACTTGATGCTTACGCTGCTCAATACGCTC CAGGTTACCAT畫3'F13:5，-ACGCTCCAGGTTACCATTTTCTTCTTTCTATTGCTGCTCCAGCTGGTC CAGAACATTAC-3，
F14:5，-CAGCTGGTCCAGAACATTACTCTTTTCTTCATATGTCTGATCTTGGTC AAGTTCTTGAT-3，
R,:5，-AGCGGCCGCTTAGTTAAGACCACTACGAATGTTATCGTATTGAGAGTT
R2:5，-TTATCGTATTGAGAGTTTGGGTAACCAAGCAAGTTTTGAGTAGAATCA AGACTACCAAG-3，
R3:5，-GAATCAAGACTACCAAGAGCTCTATGACTAGTACCAATCAAAGAATC AGAACCAGTCTT國(guó)3，
R4:5，國(guó)GAATCAGAACCAGTCTTATCAGCAGAAGCTTCCCAAAACATACTACC ACCAAGACCAAG畫3，
R5:5，-CTACCACCAAGACCAAGGTTCTTAAGGTAAGAAACCTTAGTGTTAAT CATAGCTGGAGT-3，
R6:5,誦TTAATCATAGCTGGAGTATCAAAAGAAATAAGTTCCTTACTACTTGGA TCGTAACTGTA-3,
R7:5，-CTTGGATCGTAACTGTAGTAAGCTTGAGCAGTAGAATCGTATTGAAC AGTAGCACCAGC-3，
Rg:5，曙TGAACAGTAGCACCAGCCTTTGGAAGAACCTTGTAATCCCAAATACC GTTTTCCCAACT-3，
R9:5，-ATACCGTTTTCCCAACTACCAGAACCAATACCACTGTAAGTTTGACCA ATACCACCAGT-3，
R10:5，-TGACCAATACCACCAGTACTTTCAAAAGAACGACCGTAAATTGGCATACCAAGAACAAT-3，
Rn:5，陽(yáng)GGCATACCAAGAACAATCTTACTAGCTGGAACACCACCCTTAATGTA ATCCTTAATAGC-3，
R，2:5,-ATGTAATCCTTAATAGCTTGATCAGTGTTGTATGGAGAAGAGTTAGA GTTAGATGGGTT畫3，
R13:5，-TTAGAGTTAGATGGGTTAGCAAACAAGTTAGCATCATGACCAGAGTA ACTACTCCAAGA-3'
R14:5，-GAGTAACTACTCCAAGAACCAGCGTAATCGTAAGCCATAAGGTTAAC GTAATCAAGAACTTGACCAA-3 ，
其中正向引物為F,-F",反向引物為RrR"。引物F,與F2， F2與Fs， F3與F4, F4與F" F5與F6， F6與F ， F"7與Fg， F^F9， F^F10， Fw與Fu， Fn與F^， F12 與Fu， Fu與F"以及引物R,與R2， R2與R3， R3與R4， R4與R5, Rs與R6， Re與R7， R7與Rs, Rg與R9， R9與Rh)， Rh)與Rh， Ru與Ru， R^與Ri3， 1113與1114之間分別存 在長(zhǎng)度為17-20nt的相同序列片段。
將上述引物混合，各條引物的濃度為lOpM，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的基因序列。
PCR反應(yīng)體系為(25pl): 10xPCR Buffer 2.5fil， MgCl2 1.5^1， dNTP 1^1， DNA 2pl， Taq酶0.25pl，引物混合物2nl，雙蒸水14.75^1。
反應(yīng)參數(shù)為94。C5min， (94。C45s， 55。C45s， 72°C lmin)共30個(gè)循環(huán)，最后 在72'C延伸10min，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物送上海生工生物 工程有限公司測(cè)序，所得序列如SEQIDNO.l所示，經(jīng)DNA序列比對(duì)分析，該 序列測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列結(jié)果一致。由SEQ ID NO.l編碼的重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。實(shí)施例2.重組巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
用i^o及I和ATod分別雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和原始表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，瓊脂 糖凝膠電泳回收目的條帶，用T4DNA連接酶連接回收的目的條帶，得到真核表 達(dá)載體pSECH，用CaCb法42-C熱激90秒將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a。利用 Kana抗性篩選單菌落。所選轉(zhuǎn)化克隆酶切鑒定和DNA測(cè)序測(cè)定證明克隆正確 后送上海生物工程有限公司測(cè)序，具體操作流程見(jiàn)圖l。 實(shí)施例3.重組巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選
將鑒定正確的重組表達(dá)載體pSECH質(zhì)粒DNA經(jīng)內(nèi)切酶Xbal線性化處理， 電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。電擊結(jié)束后，立即加入lml預(yù)冷的lmo1/1山梨醇， 3000rpm離心5min，菌體重懸于400pl預(yù)冷的lmo1/1山梨醇中，取200jil涂布 于MD平板(1.34%酵母氮堿，4xl(rV。生物素，2%葡萄糖，2%瓊脂糖)上， 3(TC培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。隨機(jī)挑取菌落點(diǎn)種到含不同濃度抗生素G418 (0， 0.25mg/ml， 0.50mg/ml， 0.75mg/ml,1.00mg/ml，1.50mg/ml， 1.75mg/ml， 2.00mg/ml， 3.00mg/ml， 4.00mg/ml)的YPD平板上，30。C培養(yǎng)2 5d， 每天 檢查菌落生長(zhǎng)情況。根據(jù)生長(zhǎng)情況快速篩選出G418抗性較高的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化 子。測(cè)定酶活條件用1%膠態(tài)幾丁質(zhì)作為底物，pH二7緩沖液，37'C反應(yīng)1小 時(shí)，加入3mL DNS，10(TC反應(yīng)10min中止反應(yīng)，迅速用冷水冷卻，離心取上清 測(cè)定其OD540nm值。酶活定義pH=7緩沖液環(huán)境，37°C，每分鐘催化膠態(tài)幾 丁質(zhì)生成lmg NAG(乙酰氨基葡萄糖)定義為一個(gè)酶活單位。根據(jù)該測(cè)定方法， 測(cè)得篩選的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的酶活為837U/mL。
本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，以上的實(shí)施例僅是用來(lái)說(shuō)明本 發(fā)明，而并非作為對(duì)本發(fā)明的限定，只要在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，對(duì)以上所述 實(shí)施例的變化、變型都將落在本發(fā)明權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。序列表
〈110〉浙江工商大學(xué)
〈120> —種重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列及其重組載體
〈130>
〈160> 30
〈170〉 Patentln version 3.2
〈210〉 1
〈211〉 1185 〈212〉腿
〈213〉 木霉(Trichoderma)
〈400〉 1
gaattcgctagtggttacgctaacgctgtttactttactaactggggtatttacggtcgt60
aactttcaactgttgcttctgatattactcatgttatttactcttttatg120
aactttcaagctgatggtactgttgtttctggtgatgcttacgctgattaccaaaagcat180
tacgeitgatgattcttggaacgatgttggtaacaacgcttacggttgtgttaagcaactt240
tttaagttgaagaaggctaaccgtaacttgaaggttatgctttctattggtggttggact300
tggtctactaactttccatctgctgctagtactgatgctaaccgtaagaactttgctaag360
actgctattacttttatgaaggattggggttttgatggtattgatgttgattgggaatac420
ccagctgatgatactcaagctactaacatggttcttcttcttssggasattcgttctcaa柳cttgatgcttacgctgctcaatacgctccaggttaccattttcttctttc tattgctgct540
ccagctggtcC3g3aC3tt3ctcttttcttcatatgtctgatcttggtca agttcttgat600
tacgttaacctt3tggCtt3cgattacgctggttcttggsgtagttactc tggtcatgat660
gctaacttgtttgctaacccatctaactctaactcttctccatacaacac tgatcaagct720
attaaggattacattaagggtggtgttccagctagtaagattgttcttgg tatgccaatt780
tacggtcgttcttttgaaagtactggtggtattggtcaaacttacagtgg tattggttct840
ggtagttgggaaaacggtatttgggattacaaggttcttccaaaggctgg tgctactgtt900
caatacgattctactgctcaagcttactacagttacgatccaagtagtaa ggaacttatt960
tcttttgatactccagctatg3tt3glC3Ct犯ggtttcttacctt肪gaa ccttggtctt1020
ggtggt3gt3tgttttgggaagcttctgctgataagactggttctgattc tttgattggt1080
actagtcatagagctcttggtagtcttgattctactcaaaacttgcttgg ttacccaaac1140
tctcaatacgataacattcgtagtggtcttaactaagcggccgca1185
<210〉 2 〈211〉 390 <212〉 PRT
〈213〉 木霉(Trichoderma) <400〉 2
Phe Ala Ser Gly Tyr Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly lie
15 10 15
Tyr Gly Arg Asn Phe Gin Pro Gin Asn Leu Val Ala Ser Asp lie Thr
20 25 30
His Val lie Tyr Ser Phe Met Asn Phe Gin Ala Asp Gly Thr Val Val 35 40 45Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Asp Tyr Gin Lys His Tyr Asp Asp Asp Ser
50
55
60
Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gin Leu Phe
65
70
75
80
Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser lie Gly
85
90
95
Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala
100
105
110
Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys Thr Ala lie Thr Phe Met Lys Asp Trp
115
120
125
Gly Phe Asp Gly lie Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Asp Thr
130
135
140
Gin Ala Thr Asn Met Val Leu Leu Leu Lys Glu lie Arg Ser Gin Leu
145
150
155
160
Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Ser
165
170
175
lie Ala Ala Pro Ala Gly Pro Glu His Tyr Ser Phe Leu His Met Ser
180
185
190
Asp Leu Gly Gin Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr
195
200
205
Ala Gly Ser Trp Ser Ser Tyr Ser Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala
210
215
220
Asn Pro Ser Asn Ser Asn Ser Ser Pro Tyr Asn Thr Asp Gin Ala lie<formula>formula see original document page 13</formula>〈211〉 57 <212> DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 3
gaattcgcta gtggttacgc taacgctgtt tactttacta actggggtat ttacggt 57
<210> 4
〈211> 59 <212〉腿 <213>人工序列
<400〉 4
actggggtat ttacggtcgt aactttcaac cacaaaacct tgttgcttct gatattact 59
<210> 5
<211> 61
〈212> 隱 〈213〉人工序列
<400〉 5
tgttgcttct gatattactc atgttattta ctcttttatg aactttcaag ctgatggtac 60 t 61〈210> 6
<211〉 59
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈400〉 6
ttcaagctga tggtactgtt gtttctggtg atgcttacgc tgattaccaa aagcattac 59
〈210〉 7
〈211> 59
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
〈400〉 7
attaccaaaa gcattacgat gatgattctt ggaacgatgt tggtaacaac gcttacggt 59
<210> 8
〈211> 59
〈212〉 腿 <213>人工序列
〈400〉 8
gtaacaacgc ttacggttgt gttaagcaac tttttaagtt gaagaaggct aaccgtaac 59
15<210> 9
<211> 59 〈212>腿 〈213>人工序列
〈400〉 9
卿aggctaa ccgtaacttg aaggttatgc tttctattgg tggttggact tggtctact 59
<210> 10
〈211> 59
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈400〉 10
gttggacttg gtctactaac tttccatctg ctgctagtac tgatgctaac cgtaagaac 59
〈210〉 11
<211〉 59 <212>腿 <213>人工序列
〈400〉 11
atgctaaccg taagaacttt gctaagactg ctattacttt tatgaaggat tggggtttt 59<formula>formula see original document page 17</formula>〈210〉 15
<211> 59
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈400〉 15
acgctccagg ttaccatttt cttctttcta ttgctgctcc agctggtcca gaacattac 59
〈210〉 16
<211> 59
〈212〉 腿 〈213>人工序列
<400> 16
cagctggtcc agaacattac tcttttcttc atatgtctga tcttggtcaa gttcttgat 59
〈210〉 17
<211> 48
<212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 17
agcggccgct tagttaagac cactacgaat gttatcgtat tgagagtt 48<210〉 18
<211> 59
〈212> DNA <213>人工序列
<400> 18
ttatcgtatt gagagtttgg gtaaccaagc aagttttgag tagaatcaag actaccaag 59
<210> 19
<211> 59
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 19
gaatcaagac taccaagagc tctatgacta gtaccaatca aagaatcaga accagtctt 59
<210> 20
〈211〉 59
<212> 腿 〈213〉人工序列
<400〉 20
gaatcagaac cagtcttatc agcagaagct tcccaaaaca tactaccacc aagaccaag 59〈210〉 21
〈211> 59
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 21
ctaccaccaa gaccaaggtt cttaaggtaa gaaaccttag tgttaatcat agctggagt 59
<210> 22
<211> 59 <212>纖 〈213>人工序列
<400> 22
ttaatcatag ctggagtatc aaaagaaata agttccttac tacttggatc gtaactgta 59
<210> 23
〈211> 59
〈212〉 ■ <213>人工序列
<400> 23
cttggatcgt aactgtagta agcttgagca gtagaatcgt attgaacagt agcaccagc 59〈210〉 24
<211〉 59 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈400〉 24
tgaacagtag caccagcctt tggaagaacc ttgtaatccc aaataccgtt ttcccaact 59
〈210〉 25
〈211> 59
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 25
ataccgtttt cccaactacc agaaccaata ccactgtaag tttgaccaat accaccagt 59
〈210〉 26
<211> 59 <212〉腿 〈213>人工序列
〈400〉 26
tgaccaatac caccagtact ttcaaaagaa cgaccgtaaa ttggcatacc aagaacaat 59〈210〉 27
〈211〉 59
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<400> 27
ggcataccaa gaacaatctt actagctgga acaccaccct taatgtaatc cttaatagc 59
<210> 28
<211> 59
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400> 28
atgtaatcct taatagcttg atcagtgttg tatggagaag agttagagtt agatgggtt 59
<210> 29
<211> 59 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈400〉 29
ttagagttag atgggttagc aaacaagtta gcatcatgac cagagtaact actccaaga 59<210> 30
〈211〉 67
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
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gagtaactac tccaagaacc agcgtaatcg taagccat33 ggttaacgta atcaag肪ct 60 tgaccaa 6權(quán)利要求
1.一種重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO.1所示。
2. —種含有權(quán)利要求1中所述重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的重組載體，其特征在于， 在質(zhì)粒pSECH中包含有SEQIDNO.l核苷酸序列。
3. 一種由權(quán)利要求2所述重組載體轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母宿主。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列和含有該重組基因的重組載體。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物技術(shù)，利用PCR合成了基于巴斯德畢赤酵母密碼子偏愛(ài)性的重組內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因序列，將該基因序列克隆至載體pPIC9K中，得到真核表達(dá)載體pSECH。通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115，根據(jù)生長(zhǎng)情況快速篩選抗性較高的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，可實(shí)現(xiàn)高效廉價(jià)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/56GK101307319SQ200810061979
公開(kāi)日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2008年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月6日
發(fā)明者平 于, 勵(lì)建榮, 唐云平 申請(qǐng)人:浙江工商大學(xué)