專利名稱：產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是Rosenfeld等于1983年發(fā)現(xiàn)的一種生物活性肽，它與降鈣素(CT)均來(lái)源于位于11號(hào)染色體的CT/CGRP基因，由于CT/CGRP基因不同的RNA編碼而翻譯成CGRP和CT，CGRP是應(yīng)DNA基因重組和分子生物技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的一種由37個(gè)氨基酸組成的生物活性多肽，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的內(nèi)源性擴(kuò)血管肽類物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)、心血管、呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系統(tǒng)具有重要作用。CGRP的舒張冠狀血管的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于P物質(zhì)，心鈉素和去甲腎上腺素(NE)，比乙酰膽堿(Ach)、5-羥色胺(5-HT)等強(qiáng)10000倍左右，比異丙腎上腺素強(qiáng)10-100倍。 犬鉤蟲抗凝血肽(anticoagulant peptide, AcAPs)是犬鉤蟲吸血時(shí),其頭腺分泌一種具有抗凝血活性的物質(zhì)，該物質(zhì)本質(zhì)是一種蛋白水解酶，具有延長(zhǎng)血漿凝血酶原時(shí)間、抑制血液凝固以及促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用。AcAPs目前應(yīng)用的有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三種重組蛋白。其中rAcAP5由77個(gè)氨基酸組成，含10個(gè)半胱氨酸，形成5對(duì)二硫鍵(C6-C50，C15-C42，C21-C37，C25-C69，C50-C63)，主要由二硫鍵決定其二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而決定其生物活性。它是Xa因子(凝血因子)的高效特異性抑制劑，阻斷凝血的共同途徑，達(dá)到抗凝血作用。AcAPs的抗凝血、抗血栓作用，使其在臨床上成為一種新的抗凝劑和抗血栓藥物。然而目前這兩種蛋白單獨(dú)作用，效果單一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其構(gòu)建方法，該菌株可以生產(chǎn)CGRP-AcAP5融合蛋白，CGRP_AcAP5融合蛋白具有治療高血壓和抗血栓雙重作用。本發(fā)明產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。上述產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、在CGRP和AcAP5融合基因內(nèi)設(shè)計(jì)一個(gè)Kpn I酶切位點(diǎn)，合成核苷酸序列如SEQID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAP5)載體；二、將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經(jīng)BamHI和EcoR I雙酶切的表達(dá)載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重組表達(dá)載體 pGEX-CGRP/AcAP5 ；
三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAP5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3 )中，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌37 °C過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I單酶切，并用空白質(zhì)粒PGEX-6P-1作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)
性重組菌。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明基因工程菌株可以生產(chǎn)CGRP_AcAP5融合蛋白，降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5之間作用互補(bǔ)且協(xié)同增效，CGRP-AcAP5融合蛋白具有抗血栓和治療高血壓雙重作用。本發(fā)明基因工程菌株生產(chǎn)的融合蛋白的純度為98%，融合蛋白表達(dá)量為38. 1%。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
具體實(shí)施方式
二具體實(shí)施方式
一所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO 1 所示。
具體實(shí)施方式
三具體實(shí)施方式
一所述產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，按以下步驟進(jìn)行一、在CGRP和AcAP5融合基因內(nèi)設(shè)計(jì)一個(gè)Kpn I酶切位點(diǎn)，由上海生工公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAP5)載體；二、將步驟一獲得的pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經(jīng)BamHI和EcoR I雙酶切的表達(dá)載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重組表達(dá)載體 pGEX-CGRP/AcAP5 ；三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAP5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌37°C過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)買自北京艾德萊生物科技有限公司)提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I單酶切，并用相應(yīng)的空白質(zhì)粒PGEX-6P-1作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性重組菌；其中大腸桿菌BL21 (DE3)為購(gòu)買得到；步驟二中pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下
[1S
pUC (CGRP/AcAP5)載體 20μΕ IOXM buffer6I^L
BamHI3 I^L
EcoR I3I^L
權(quán)利要求
1.產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株，其特征在于該基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株，其特征在于所述融合蛋白CGRP/AcAP5基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
3.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行 一、在CGRP和AcAP5融合基因內(nèi)設(shè)計(jì)一個(gè)KpnI酶切位點(diǎn)，合成核苷酸序列如SEQID NO :1所示的融合蛋白CGRP/AcAP5基因，并在融合蛋白CGRP/AcAP5基因兩端分別添加BamHI和EcoR I酶切位點(diǎn)，然后克隆在pUC57載體上，獲得pUC (CGRP/AcAP5)載體； 二、將步驟一獲得的pUC(CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切，再與同樣經(jīng)BamHI和EcoR I雙酶切的表達(dá)載體pGEX_6P_l連接，獲得融合蛋白CGRP/AcAP5基因重組表達(dá)載體 pGEX-CGRP/AcAP5 ； 三、然后將載體pGEX-CGRP/AcAP5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌37°C過夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I單酶切，并用空白質(zhì)粒PGEX-6P-1作為對(duì)照，將含有Kpn I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中pUC (CGRP/AcAP5)載體用BamHI和EcoR I雙酶切的體系如下 成分川黽 pUC (CGRP/AcAPS)載體20(iL IOxMbuffer6|iL BamEl3|iL EcoR I3|iL ddH2028|iL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴，IOh0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中表達(dá)載體PGEX-6P-1雙酶切的體系如下成分111 pGEX-6P-l20pL IO^M buffer%L·3 |JL \mJ EcoR I3|iL ddH2028jiL 酶切反應(yīng)條件37°C水浴，IOh0
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟二中連接反應(yīng)體系如下成分IIJ 5:1 _基_ CGRP/AcAP5OgL _切后 pGEX-6P-l 載體3nL T4 DNA 連接H2|iL10>-T4 DNA 連接_ buffer2pL 連接反應(yīng)條件16°C水浴，8 12h。
全文摘要
產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其構(gòu)建方法，涉及一種基因工程菌株及其構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)降鈣素基因相關(guān)肽與犬鉤蟲抗凝肽AcAP5融合蛋白基因工程菌株及其構(gòu)建方法，該菌株可以生產(chǎn)CGRP-AcAP5融合蛋白，該融合蛋白具有治療高血壓和抗血栓雙重作用。該基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAP5基因。方法一、融合蛋白CGRP/AcAP5基因的合成；二、重組表達(dá)載體的構(gòu)建；三、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ單酶切，基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的為陽(yáng)性重組菌。本發(fā)明用于生產(chǎn)具有抗血栓和治療高血壓雙重作用的融合蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/70GK103013902SQ20121058566
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)