專利名稱：OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。
背景技術(shù)：
老年人骨質(zhì)疏松發(fā)病率較高，全球有2億骨質(zhì)疏松患者，并且女性多于男性。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn)，美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查(NHANES III，1988 1994年)結(jié)果表明，骨質(zhì)疏松嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折，一旦患者經(jīng)歷了第一次骨質(zhì)疏松性骨折，繼發(fā)性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現(xiàn)有骨質(zhì)疏松癥患者9000萬，占總?cè)丝诘?. 1%。隨著社會老齡化的進(jìn)程，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率呈上升趨勢，預(yù)計到2050年將增加到2. 21億，那時全世界一半以上的骨質(zhì)疏松性骨折將發(fā)生在亞洲，絕大部分在中國。有學(xué) 者對1995 1996年美國骨質(zhì)疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發(fā)生數(shù)進(jìn)行調(diào)查顯示，每年發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。當(dāng)骨折發(fā)生時，患者最初的感受便是疼痛。在骨折早期治療過程中，疼痛從始至終都存在著。它不僅影響患者的治療效果，同時也直接影響肢體的功能恢復(fù)。不同類型的骨折均存在不同程度的疼痛、功能障礙、肢體腫脹，而疼痛是首先應(yīng)考慮解決的問題。因為疼痛可引起交感神經(jīng)興奮，繼而反射性抑制胃腸功能，引起食欲減退；疼痛還可影響睡眠質(zhì)量，引起體內(nèi)多種激素的釋放，產(chǎn)生相應(yīng)的病理生理改變，使機(jī)體抵抗力下降，直接影響創(chuàng)傷愈合及功能恢復(fù)。因此解除骨折患者的疼痛感是治療的重要組成部分。如果患者服用多種藥物治療骨質(zhì)疏松并止痛，容易產(chǎn)生藥物拮抗反應(yīng)；若要錯開服藥時間一方面要靠考慮藥物的半衰期，另一方面還要考慮藥物有效濃度，而且給患者造成不便。目前缺乏一種可以同時有效治療骨質(zhì)疏松和止痛的藥品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前尚無同時有效治療骨質(zhì)疏松和止痛藥品的缺陷，而提供的一種OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)按以下步驟制備一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(0GP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ；四、用載體pGEX-OGP/CTx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)。本發(fā)明中OGP-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明中OGP-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。由于骨折患者均為突然致傷，無思想準(zhǔn)備，再加上相關(guān)知識缺乏，治療過程長；患者因疼痛恐懼常呈被動體位，特別是老年骨折患者，往往會引起將來功能障礙，而且恢復(fù)期較長。本發(fā)明OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)發(fā)酵產(chǎn)生的OGP-CTx融合蛋白可治療骨質(zhì)疏松的同時止痛，對于骨質(zhì)疏松所引發(fā)骨折的患者治療效果顯著，而且由于可以明顯減輕或消除患處疼痛感，患者心理負(fù)擔(dān)小、康復(fù)快，愈后功能恢復(fù)期短。本發(fā)明用于治療骨質(zhì)疏松和止痛的OGP-CTx融合蛋白微生物制劑，不產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，使用安全。本發(fā)明OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)發(fā)酵產(chǎn)生的OGP-CTx融合蛋白共42個氨基酸。本發(fā)明采用生物基因工程手段獲得大腸桿菌BL21(DE3-0GP/CTX)。采用本發(fā)明基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)OGP-CTx融合蛋白，具有廣泛應(yīng)用前景。本發(fā)明為治療骨質(zhì)疏松和止痛奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTx)，大腸桿菌 BL21 (DE3_0GP/CTx)按以下步驟制備一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(0GP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段；二、用 BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ；三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX_6P_l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ；四、用載體pGEX-OGP/CTx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3 )，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)。本實施方式步驟四采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (OGP/CTx)酶切反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株名為大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)，大腸桿菌BL21 (DE3_0GP/CTx)按以下步驟制備 一、將含有OGP-CTx融合蛋白基因的質(zhì)粒載體pUC(OGP/CTx)用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得OGP-CTx融合蛋白的DAN片段； 二、用BamHI 和 EcoR I 雙酶切質(zhì)粒 pGEX_6P_l ； 三、OGP-CTx融合蛋白的DAN片段與經(jīng)過雙酶切的載體pGEX-6P-l進(jìn)行酶連接，然后16°C放置連接過夜，得到載體pGEX-OGP/CTx ； 四、用載體pGEX-OGP/CTx轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，選擇陽性重組子，即獲得OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/CTX)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中質(zhì)粒載體pUC (OGP/CTx)酶切反應(yīng)體系為 pUC (OGP/CTx)20 0IOXM buffer6(^1 BamHX3(il KcoR I3 ^il 不含 DNA 酶的 ddH2028^1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟二中質(zhì)粒pGEX-6P-l酶切反應(yīng)體系為 載體 pGEX-6P-l20 ^il10XM buffer6[il Bamlil3[il KcoR I3ul不含DNA酶的ddH2028^1
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟三中酶連接反應(yīng)體系為 雙酶切的載體pGEX-6P-l3 ^il融合蛋白的DNA片段D^il 10XT4 DNA 迕接!W buffer2^1 T4 DNA連接酶20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-CTx融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，其特征在于步驟一中OGP-CTx融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
全文摘要
OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株，它涉及一種融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株。解決目前尚無同時有效治療骨質(zhì)疏松和止痛藥品的缺陷。OGP-CTx融合蛋白轉(zhuǎn)基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3-OGP/CTx)按以下步驟制備一、獲得融合蛋白DAN片段；二、雙酶切質(zhì)粒；三、酶連接；四、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。本發(fā)明可用于醫(yī)藥制備領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/70GK103013901SQ201210585620
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者余瓊 申請人:黑龍江大學(xué)