專利名稱：重組Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胸腺素α I與法氏囊五肽ΒΡ5重組融合肽，同時還涉及編碼該重組融合肽的基因，表達該融合肽的工程菌及應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
胸腺是免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官，負責細胞的分化和成熟，胸腺組織產(chǎn)生多種激素或因子，其中胸腺素α1 (Ta 1)是一種高度保守的小分子活性肽，富含酸性氨基酸，由28個氨基酸組成，Tal是由胸腺上皮細胞和胸腺內分泌細胞產(chǎn)生，廣泛存在于機體的胸腺上皮細胞、外周血、大腦、垂體、精液、濾泡液和羊水中；在某些保護細胞及激活的淋巴細胞上清中也存在著Ta 1 ;在某些腫瘤細胞中存在著相當水平的Ta 1 ;甚至在某些昆蟲、蟹、原生動物、真菌和細菌中也出現(xiàn)了類似Ta I的活性物質。除此以外，培養(yǎng)的胸腺上皮細胞、含有ProT a的人外周血細胞以及微孔小室胎胸腺上皮細胞上清中也含有高水平的Ta 1。研究表明，Tal也存在于McF_7細胞的胞漿中和結腸腺細胞的核膜上。Ta I主要作用于胸腺細胞成熟的早期和晚期，誘導T細胞分化成熟，能夠增加T細胞在各種抗原或致有絲分裂原激活后產(chǎn)生INF-a (干擾素a )、INF- Y , IL-1 (白細胞介素)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7和CSF (集落刺激因子)等多種淋巴因子的分泌，增加T細胞表面淋巴因子受體的水平。T a I能調節(jié)NK細胞的發(fā)育分化、成熟以及存活。法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽類獨有的中樞免疫器官,其功能類似于哺乳動物中的骨髓。法氏囊超濾物(IKD以下)中含有許多生物活性物質，特別是一些小肽對禽類具有免疫調節(jié)功能，能促進禽類、哺乳動物細胞的分化發(fā)育，促進免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽(BP5)是法氏囊中新分離出來的一種新的活性小肽，其氨基酸結構序列為:Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究發(fā)現(xiàn)，BP5可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，不但具有提高機體體液免疫和細胞免疫功能，還具有平衡Thl和Th2類型免疫反應的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增強劑所不具備的。由于法氏囊五肽BP5只能從雞的法氏囊組織中提取，胸腺素α I從胸腺組織中提取，來源受到很大的限制，而且其它雜蛋白含量高，純化難度大，其實際效果也受到很大程度的影響。而化學合成的胸腺素α I或法氏囊活性五肽ΒΡ5成本高，不適合田間推廣。因此采用基因工程的方法進行研究具有非常重大的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供重組T α 1-ΒΡ5融合肽。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是提供重組Ta 1-ΒΡ5融合肽，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:5所示。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T a 1-BP5融合肽的基因。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種重組Ta 1-BP5融合肽的基因，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；該融合肽基因由胸腺素a I基因和法氏囊五肽BP5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯(lián)而成，并在5’端加有腸激酶識別位點基因序列。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種重組Ta 1-ΒΡ5融合肽的工程菌，該工程菌的構建方法包括以下步驟:I)重組T a 1-BP5融合肽基因S0E-PCR擴增根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組Ta 1-BP5融合肽基因，并針對該融合肽基因設計引物Fp F2和F3,然后進行SOE-PCR擴增；將PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進行回收，回收產(chǎn)物中片段大小為114bp的為重組Ta 1-BP5融合肽基因；2)攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌的構建將重組T a 1-BP5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并將酶切的重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因和質粒載體pET32a連接，連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5 α ;提取質粒，并將重組表達質粒進行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質粒測序，命名為pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;將重組質粒pET32a_T α 1-ΒΡ5轉化進入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。所述引物F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’ ；F2:5，-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ ；

F3:5 ’ -GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3，。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組T α 1-ΒΡ5融合肽的制備方法。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種重組Ta 1-ΒΡ5融合肽的制備方法，包括以下步驟: I)將攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，當菌體濃度OD6qq=0.4-0.6時，加入IPTG進行誘導表達4 6h，IPTG終濃度為ImM ；2)將誘導表達的菌液12000rmp離心IOmin,收集沉淀,用洗漆液重懸沉淀,并超聲波裂解IOmin ;然后12000rmp離心lOmin，收集上清液；3)將上清液用Ni柱親和層析進行純化，得到N端連有硫氧還蛋白的重組Ta 1-BP5融合肽的純化產(chǎn)物；4)將步驟3)的純化產(chǎn)物通過N端帶有His標簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白后，再進行Ni柱親和層析，收集穿透峰，并用PBS進行透析，得到重組T a 1-BP5融合肽。本發(fā)明將重組Ta 1-BP5融合肽基因插入表達載體，轉化大腸桿菌，獲得高效表達重組Ta 1-BP5融合肽的基因工程菌，通過液體培養(yǎng)、純化制得的重組Ta 1-BP5融合肽，該融合肽經(jīng)N端帶有His標簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經(jīng)親和層析純化，可獲得單一的重組T a 1-BP5融合肽。本發(fā)明的目的還在于提供一種重組Ta 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。本發(fā)明所采用的技術方案還在于提供一種重組T a 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。
將重組T α 1-ΒΡ5融合肽與單獨的胸腺素α I或法氏囊五肽ΒΡ5進行免疫活性比較，結果顯示，重組的Ta 1-ΒΡ5融合肽在體外淋巴細胞增殖試驗中表現(xiàn)出比單獨的胸腺素a I和法氏囊五肽ΒΡ5更高的刺激淋巴細胞增殖的活性。本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，與疫苗配合單一胸腺素a I或疫苗配合單一法氏囊五肽BP5相比，具有更好的免疫佐劑效果，能夠有效增強機體細胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應用前景。另外，本發(fā)明的重組T a 1-BP5融合肽具有抗病毒、抗感染及抑制腫瘤生長的作用，將本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽與抗病毒、抗感染或抗腫瘤藥劑混合在一起，可以達到提高治療效果目的。本發(fā)明的重組Ta 1-BP5融合肽與疫苗通過物理或簡單混合的方法也可以制成疫苗復合物。


·圖1為重組表達質粒pET32a_T α 1-ΒΡ5的缺失酶鑒定圖；圖中，I:DL2000DNA Marker ；2 =HindIII 酶切重組質粒 pET32a_T α 1-ΒΡ5 ；3:重組質粒 pET32a_T α 1-ΒΡ5圖2為重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中不同誘導時間的SDS-PAGE電泳圖；圖中，1:低分子量蛋白質Marker ;2:誘導的大腸桿菌BL21(DE3):3:誘導Oh的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;4:誘導Ih的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ；5:誘導 2h 的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET32a_T α 1-ΒΡ5 ；6:誘導 3h的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ;7:誘導4h的重組大腸桿菌BL21 (DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ；8:誘導 5h 的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)/pET32a_T a 1-BP5 ；9:誘導 6h的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-Ta 1-BP5 ；10:誘導7h的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-Tα 1-ΒΡ5圖3為重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌BL21中的表達的SDS-PAGE分析圖；圖中，1:低分子量蛋白質Marker ;2:未誘導的大腸桿菌BL21(DE3) ;3:未誘導的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;4:誘導的重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET32a-Tα 1-ΒΡ5圖4為重組T α 1-ΒΡ5融合肽體外活性測定結果；圖5為禽流感Η9Ν2ΗΑ抗體亞型IgGl檢測結果；圖6為禽流感Η9Ν2ΗΑ抗體亞型IgG2a檢測結果；圖7為小鼠血清中細胞因子IFN- Y含量測定；圖8為小鼠血清中細胞因子IL-4含量測定；圖9為小鼠脾臟淋巴細胞增殖分析結果。
具體實施例方式實施例1、表達重組T α 1-ΒΡ5融合肽工程菌的構建1、重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因S0E-PCR擴增I)設計引物根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組T α 1-ΒΡ5融合肽基因，如下:
5， -AGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAGACTTGAAAGAA AAAAAAGAAGTTGTTGAAGAAGCTGAAAACGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTG TAT-3’ (SEQ ID NO:1)并針對該融合肽基因設計引物FpF2和F3，其中在引物F1中加上EcoRI酶切位點，引物F3中加上終止密碼子和SalI酶切位點，引物由上海Invitrongen公司合成,如下:F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’(SEQ ID N0:2)，其中下劃線部分為EcoRI酶切位點；F2:5，-GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ (SEQ ID NO:3);F,:5’-GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3，(SEQ ID NO:4)，其中下劃線部分為Sail酶切位點。2) SOE-PCR 擴增PCR 反應體系:10 X PCR Buffer5 μ L, MgCl23 μ L, IOmmoI/L 的 dNTPl μ L,終濃度為20pmol/L的引物FpF2和F3各2 μ L，TaKaRa ExTaq0.5 μ L,滅菌超純水34.5 μ L,反應總體積 50 μ L0PCR反應程序:94°C預變性2min，進入PCR循環(huán):94°C變性30s，55 °C退火lmin，72°C延伸6min，其中變性和退火共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠(Ethidium Bromide, EB) 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶，隨后按膠回收試劑盒(大連TaKaRa公司)使用說明進行回收，并對回收產(chǎn)物進行電泳鑒定，片段大小為114bp的即為重組Ta 1-BP5融合肽基因，對基因序列測定后，推導其編碼的重組T a 1-B P5融合肽為38個氨基酸。2、攜帶重組T a 1-BP5融合肽基因的工程菌的構建將重組T a 1-BP5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并置于37°C水浴2h，將酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，膠回收試劑盒進行回收鑒定。經(jīng)過酶切的重組Ta 1-BP5融合肽基因和質粒載體pET32a按摩爾比1:3的比例在4°C過夜連接。取連接產(chǎn)物加入含有100 μ L感受態(tài)DH5 α的聚丙烯離心管中，輕輕混勻后冰浴30min。將聚丙烯離心管從冰中取出后42°C熱休克90s，然后立即冰浴2min。取出加入37°C預熱的LB培養(yǎng)基800 μ L中，于37°C振搖(120rpm) 45min。取100 μ L菌液均勻涂布在含氨芐青霉素(Amp) 50 μ g/mL的瓊脂LB平板上，37°C放置20min后，倒置培養(yǎng)18h。按《分子克隆實驗指南》上的堿裂解法提取質粒。對提取的質粒用HindIII對質粒進行缺失酶鑒定，即將酶切產(chǎn)物進行DNA電泳鑒定，DNA電泳結果顯示質粒沒有被HindIII切出相應條帶，表明重組質粒已經(jīng)缺失HindIII酶切位點，如圖1所示。并將重組陽性質粒命名為pET32a-Ta 1-BP5。將重組質粒pET32a_T a 1-BP5送上海Invitrongen公司測序。采用CaCl2轉化法，將重組質粒pET32a-T α 1-ΒΡ5轉化進入大腸桿菌BL21 (DE3)中，篩選陽性克隆，即為表達重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌，命名為BL21 (DE3)/pET32a_T α 1-ΒΡ5。實施例2、重組T α 1-ΒΡ5融合肽的制備1、將表達重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌接種到3mL LB液體培養(yǎng)基(50 μ g/mL氨芐青霉素)中，于37°C振搖培養(yǎng)過夜；第二天從中取出菌液加到3mL LB液體培養(yǎng)基中，使菌體濃度達到OD6tltl 0.1后，37°C振搖培養(yǎng)，當菌體濃度OD6tltl 0.4-0.6時，加入IPTG進行誘導表達4h，IPTG的終濃度為ImM ;每隔I小時收集100 μ L菌液，對重組T α 1-ΒΡ5融合肽在大腸桿菌中不同誘導時間的表達量進行SDS-PAGE分析，如圖2所示。將菌液4000rpm離心lOmin，收集菌體，將收集的菌體用IOO μ L PBS重懸后，加等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液(100mmol/L Tris.Cl (ρΗ6.8)、200mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)、4%SDS (電泳級)、0.2% 溴酚藍及20%甘油)，100°C煮沸5min以使蛋白質變形，然后取10 μ L進行SDS-PAGE凝膠電泳，SDS-PAGE電泳凝膠的配制及電泳條件參照分子克隆手冊，具體步驟如下:I)分離膠(15%)的配制:水 3.4mL ;30% 丙烯酰胺溶液 4.0mL ；1.5M Tris.HCl(pH8.8) 2.5mL ；10%SDS0.1OmL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL0按以上順序加樣后快速灌膠，小心地在液面上覆蓋一層去離子水。在室溫下放置IOmin待膠凝固后棄取水,用吸水紙吸干。2)濃縮膠(5%)的配制:水 5.7mL ;30% 丙烯酰胺溶液 1.7mL ；1.5M Tris.HCl(ρΗ6.8) 2.5mL ；10%SDS0.1mL ；10% 過硫酸銨 0.05mL ；TEMED0.0lmL03)將濃縮膠液體混勻后覆蓋在分離膠之上，隨后插入梳子，于室溫下放置IOmin待膠凝固后，拔去梳子，向電泳槽內倒入Tris-甘氨酸電泳緩沖液(25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(電泳級)(pH8.3)、0.1%SDS)，加樣結束后接通電源。電源負極端接上槽，正極端接下槽。在濃縮膠中電壓為80V，進入分離膠中電壓調整為120V。直到樣品到達分離膠底部后關閉電源，取出凝膠，用考馬斯亮藍染色lh，隨后在脫色搖床上脫色l_2h，觀察SDS-PAGE電泳蛋白染色結果。2、將誘導表達的菌液12000rmp離心lOmin，收集菌體，用洗滌液(5mM咪唑，0.5MNaCl, 20mM Tris-HCl,pH7.9)重懸菌體，后經(jīng)超聲波裂解lOmin，12000rmp離心lOmin，收獲包涵體沉淀和上清液。SDS-PAGE電泳鑒定表達產(chǎn)物主要以可溶性表達，如圖3所示。將此上清液用Ni柱親和層析進行純化，具體操作過程如下:將樹脂搖勻后，向柱子里加入5.0mL樹脂懸液，置于室溫下使其自然沉降，確保柱床體積為2.5mL,隨后分別加入3倍體積的純水、5倍體積IXCharge buffer、3倍體積IXBinding buffer。當IXBinding buffer流到柱床底部時，向柱子里加入上清液，控制流速，以每小時25mL的流量過柱，確保蛋白能充分地結合到柱子上。接著加入25mLl XBingding buffer 進行洗漆，隨后用 15mLl XWash buffer 洗漆，最終用 15mL 的I XElute buffer洗脫蛋白，即得到重組T α 1-ΒΡ5融合肽的純化產(chǎn)物，分子量約24KDa。該融合蛋白在重組T α 1-ΒΡ5融合肽N端連有硫氧還蛋白。3、將重組T α 1-ΒΡ5融合肽的純化產(chǎn)物通過N端帶有His標簽的腸激酶切去除硫氧還蛋白，可獲得保持天然N端的重組T α 1-ΒΡ5融合肽。再次進行Ni柱親和層析，收集穿透峰，將純化的蛋白用PBS進行透析，得到純度極高分子量約4KDa的重組Ta 1-BP5融合肽。將得到的重組Ta 1-BP5融合肽在蛋白核酸測定儀(型號GeneQuant pro RNA/DNACalculator)定量后冷凍干燥。實驗例1、重組T α 1-ΒΡ5融合肽的體外活性測定米用常規(guī)方法分離小鼠淋巴細胞，置于CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)6h ;將不同濃度的重組 T α 1-BP5 融 合妝(20 μ moL/L、10 μ moL/L、5 μ moL/L、2.5 μ moL/L、l.25 μ moL/L)加入含淋巴細胞的孔中，每孔100 μ L，并設對照組(PBS、10 μ moL/L硫氧還蛋白(TRx)、10 μ moL/L標準品T α 1、10 μ moL/L BP5)，MTT法測定重組T α 1-ΒΡ5融合肽體外活性，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，本發(fā)明的重組Ta 1-ΒΡ5融合肽可顯著促進淋巴細胞的分裂、增殖，與單一的胸腺素α 1和法氏囊五肽ΒΡ5相比，本發(fā)明的重組T α 1-ΒΡ5融合肽刺激淋巴細胞增殖活性更強，且重組T α 1-ΒΡ5融合肽濃度為5 μ moL/L,20 μ moL/L時差異顯著(P< 0.05),濃度為10 μ moL/L時差異極顯著(P < 0.01)。實驗例2、重組T α 1-ΒΡ5融合肽作為免疫佐劑的效果分析將本發(fā)明的重組T α 1-ΒΡ5融合肽配合禽流感Η9Ν2滅活疫苗聯(lián)合免疫，分析其免疫增強效果。禽流感滅活疫苗(Η9Ν2亞型，SDS696株)購自乾元浩生物股份有限公司。 將6周齡雌性BALB/c小鼠分為5組，分別為滅活疫苗組、滅活疫苗+重組T α 1-ΒΡ5融合肽組、滅活疫苗+單獨胸腺素α I組、滅活疫苗+單獨法氏囊活性肽ΒΡ5組及PBS對照組，每組10只，重組T α 1-ΒΡ5融合肽、單獨胸腺T α I和單獨法氏囊活性肽ΒΡ5使用劑量均為10 μ g/鼠。采用腹膜內注射，間隔兩周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫一周后尾靜脈采血。分別測定不同組中小鼠禽流感H9N2病毒抗體亞型、血清中IL-4和IFN- Y的含量，并同時分離小鼠脾臟淋巴細胞檢測脾淋巴細胞增殖，結果如圖5-9所示。小鼠禽流感H9N2病毒抗體亞型IgG檢測結果如圖5、6所示。從圖5、6中可以看出，單獨禽流感H9N2疫苗主要誘導IgGl的產(chǎn)生，而重組Ta 1-BP5融合肽+滅活疫苗組不但能誘導高水平IgGl的產(chǎn)生，而且誘導IgG2a產(chǎn)生的能力好于單獨禽流感H9N2疫苗組。同時，重組T α 1-ΒΡ5融合肽+滅活疫苗誘導IgGl和IgG2a的能力好于滅活疫苗+單獨胸腺素α I和滅活疫苗+單獨法氏囊活性肽ΒΡ5，重組T α 1-ΒΡ5融合肽二者聯(lián)合免疫后誘導小鼠的抗體分泌水平強于其他組。小鼠血清中IL-4和IFN-Y的含量檢測結果如圖7、8所示。從圖7、8中可以看出，滅活疫苗+單獨胸腺素α I主要誘導IL-4的分泌，滅活疫苗+單獨法氏囊活性肽ΒΡ5主要誘導IFN- Y的分泌，而滅活疫苗+重組T α 1-ΒΡ5融合肽誘導IL-4和IFN- Y的分泌明顯高于滅活疫苗+單獨胸腺素α I和滅活疫苗+單獨法氏囊活性肽ΒΡ5。另外，重組T α 1-ΒΡ5融合肽能平衡兩種細胞因子的分泌。將二次加強免疫14天后的小鼠殺死，分離脾臟淋巴細胞，用大腸桿菌表達的Η9Ν2ΗΑ抗原蛋白進行刺激，然后檢測淋巴細胞的增殖情況，如圖9所示。從圖9中可以看出，使用重組Ta 1-ΒΡ5融合肽作為免疫佐劑的小鼠組淋巴細胞的增殖最強，遠遠高于其他組，其差異極顯著(P < 0.05)。
權利要求
1.重組Ta1-BP5融合肽，其特征在于，該融合肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
2.一種編碼權利要求1所述的重組Ta 1-BP5融合肽的基因，其特征在于，該融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種編碼重組Ta 1-BP5融合肽的基因，其特征在于，所述融合肽基因由胸腺素a I基因和法氏囊五肽BP5基因通過柔性連接肽Linker基因串聯(lián)而成，并在5’端加有腸激酶識別位點基因序列。
4.一種表達權利要求1所述的重組Ta 1-BP5融合肽的工程菌，其特征在于，該工程菌的構建方法包括以下步驟: 1)重組Ta 1-BP5融合肽基因SOE-PCR擴增 根據(jù)豬大腸桿菌偏嗜密碼子設計重組Ta 1-BP5融合肽基因，并針對該融合肽基因設計引物Fp F2和F3,然后進行SOE-PCR擴增；將PCR擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切下目的條帶進行回收，回收產(chǎn)物中片段大小為114bp的為重組T a 1-BP5融合肽基因； 2)攜帶重組Ta 1-BP5融合肽基因的工程菌的構建 將重組T a 1-BP5融合肽基因和質粒載體pET32a用EcoR1、Sail雙酶切，并將酶切的重組Ta 1-BP5融合肽基因和質粒載體pET32a連接，連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5 α ;提取質粒，并將重組表達質粒進行HindIII缺失酶鑒定；酶切鑒定為陽性的質粒測序，命名為pET32a-T α 1-ΒΡ5 ;將重組質粒pET32a_T α 1-ΒΡ5轉化進入大腸桿菌BL21中，篩選陽性克隆，即為表達重組T α 1-ΒΡ5融合肽的工程菌。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組Ta1-ΒΡ5融合肽基因的工程菌，其特征在于，所述引物F1:5’ -CCGGAATTCAGCGACGCTGCTGTTGACACTAGCAGCGAAATCACTACTAAAG ACTTG-3’ ； F2:5’ -GTTCGGGGTGCTGCCGCCGCCGCCGTTTTCAGCTTCTTCAACAACTTCTTTTTTTTCTTTCAAGTCTTTAGTAGT-3’ ；F3:5’ -GGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAAGTCGACTCG-3’。
6.—種如權利要求1所述的重組 T a 1-BP5融合肽在作為免疫佐劑方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了重組Tα1-BP5融合肽、基因、工程菌及應用。該重組融合肽為胸腺素α1和法氏囊五肽BP5通過柔性Linker融合而成。本發(fā)明將重組Tα1-BP5融合肽基因插入表達載體，轉化大腸桿菌，獲得高效表達重組Tα1-BP5融合肽的基因工程菌，通過液體培養(yǎng)、純化制得的重組Tα1-BP5融合肽，該融合肽經(jīng)N端帶有His標簽的腸激酶去除硫氧還蛋白，再經(jīng)親和層析純化，可獲得單一的重組Tα1-BP5融合肽。本發(fā)明的重組Tα1-BP5融合肽可作為配合疫苗使用的新型多肽免疫佐劑，能夠有效增強機體細胞免疫和體液免疫水平，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK103145853SQ20131006994
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權日2013年3月5日
發(fā)明者王臣, 馮書營, 趙戰(zhàn)勤, 牛明媚, 郭香玲, 李振華, 李小康, 劉一塵, 張春杰 申請人:河南科技大學