專利名稱：一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。
背景技術(shù)：
:近年來，隨著偶氮染料的廣泛使用，其合成及降解過程帶來“三致”作用引起的環(huán)境污染問題也日漸嚴重，有關(guān)偶氮染料降解的研究也越來越引起人們的重視。自20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)某些細菌可以還原降解偶氮染料以來，到目前為止已發(fā)現(xiàn)多種細菌具有此功能，其中以假單胞菌、芽孢桿菌和腸道桿菌數(shù)量最多。細菌對偶氮染料的還原降解主要是通過還原酶催化偶氮鍵的打開，這是偶氮染料降解的第一步也是最關(guān)鍵的一步，這一類具有催化偶氮鍵打開使偶氮化合物還原生成芳香胺化合物功能的酶稱為偶氮還原酶。脫色希瓦氏菌Shewanella decolorationis S12是本實驗室從廣州某印染廠廢水處理系統(tǒng)的活性污泥中分離純化得到的希瓦氏菌新種，可以表達細胞質(zhì)的非特異性偶氮還原酶進行厭氧偶氮還原。但是S.decolorationis S12的生長受溫度影響較為明顯,在高溫如37°C以上或低溫15°C以下，其生長均不理想。因此需要構(gòu)建一種可以在更廣溫度范圍內(nèi)實現(xiàn)偶氮染料的脫色的工程菌，其具有更強的脫色活性和長期的存活能力，并可應用于染料廢水的處理
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明的目的是提供一種可以在更廣溫度范圍內(nèi)實現(xiàn)偶氮染料的脫色的工程菌，其具有更強的脫色活性和長期的存活能力，并可應用于染料廢水的處理的高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。本發(fā)明的高效還原偶氮染料的基因工程菌是通過以下方法構(gòu)建的，該構(gòu)建方法包括以下步驟，將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動子序列與表達載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，而得到具有雙啟動子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR，所述的NADH-偶氮還原酶基因為Genebank登錄號為EF198254所示的核苷酸序列,所述的NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子為Genebank登錄號為EF647586所不的核苷酸序列。本發(fā)明的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR在無乳糖誘導的條件下即可表達一定活性的NADH-偶氮還原酶，在乳糖誘導的條件下可高效表達NADH-偶氮還原酶，其脫色活性遠遠超過E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET_22b (+),以及基因供體菌株 S.decolorationis S12。因此本發(fā)明的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以應用于偶氮染料的脫色降解。本發(fā)明的選用的質(zhì)粒表達載體為pET_22b (+)，含有T7啟動子和Iac操縱子，可以在乳糖誘導下對插入的外源基因進行高效表達。
本發(fā)明選用的原核基因表達用的宿主菌為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，其染色體上整合有λ噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動子，控制表達T7噬菌體RNA聚合酶，從而可以識別表達載體上的T7啟動子。本發(fā)明提供的高效還原偶氮染料的基因工程菌，可用于環(huán)境污染修復領(lǐng)域中的偶氮染料廢水的脫色降解。本發(fā)明通過在DNA水平設計含有酶切位點的引物，對S.decolorationis S12基因組中NADH-偶氮還原酶基因(azoR基因，其Genebank登錄號為EF198254)的開放閱讀框及其上游啟動子(其Genebank登錄號為EF647586)序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)過酶切后與同樣經(jīng)過酶切的表達載體pET-22b (+)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而獲得高效表達NADH-偶氮還原酶基因(azoR)的基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/azoR。該基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以在更廣溫度范圍內(nèi)實現(xiàn)偶氮染料的脫色，具有更強的脫色活性和長期的存活能力，在染料廢水處理方面具有更廣闊的應用前景。

NADH-偶氮還原酶基因供體菌株S.decolorationis S12已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號為CCTCC M203093)和日本東京大學應用微生物研究所(保藏號為IAM15094T)，并已獲得了國家發(fā)明專利(專利號ZL200310112361.7)。


:圖1為質(zhì)粒pET_22b (+)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR中的重組質(zhì)粒pET_22b(+)/azoR的DNA及其PCR產(chǎn)物的電泳圖；圖2a中的B:攜帶雙啟動子的pET_22b (+) /azoR重組質(zhì)粒；圖2a中的P:pET-22b (+)質(zhì)粒；圖2a中的N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子而沒有表達pET-22b (+)的T7啟動子的對照重組質(zhì)粒；圖2a中的E:僅攜帶表達pET_22b (+)的T7啟動子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子的對照重組質(zhì)粒。圖2b中的B:pET-22b (+) /azoR重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物，圖2b中的N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子而沒有表達pET-22b (+)的T7啟動子的對照重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物；圖2b中的E:僅攜帶表達pET-22b (+)的T7啟動子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子的對照重組質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物。M =DNAMarker (5000bp, 3000bp, 2000bp, 1500bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 200bp)；圖3為基因工程菌粗酶液的SDS-PAGE電泳圖；其中B:攜帶雙啟動子的pET-22b(+)/azoR重組質(zhì)粒的基因工程菌在無誘導條件下表達蛋白；BL:攜帶雙啟動子的pET-22b(+)/azoR重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導條件下表達蛋白；P:含pET_22b(+)質(zhì)粒的基因工程菌在無誘導條件下表達蛋白；PL:含pET-22b(+)質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導條件下表達蛋白；N:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子而沒有表達pET-22b(+)的T7啟動子的對照重組質(zhì)粒的基因工程菌在無誘導條件下表達蛋白；NL:僅攜帶NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子而沒有表達pET-22b (+)的T7啟動子的對照重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導條件下表達蛋白；E:僅攜帶表達pET-22b(+)的T7啟動子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子的對照重組質(zhì)粒的基因工程菌在無誘導條件下表達蛋白；EL:僅攜帶表達pET-22b (+)的T7啟動子而沒有NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子的對照重組質(zhì)粒的基因工程菌在乳糖誘導條件下表達蛋白；M:蛋白Marker (116D，66.2D, 45D, 35D, 25D, 18.4D, 14.4D)；
圖4為不同菌株對偶氮染料莧菜紅的脫色曲線圖；E azo(L):誘導表達的基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/azoR ；E azo R:無誘導表達的基因工程菌 E.coli BL21(DE3)/azoRo 22b:菌株 E.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+) ；BL21:菌株 E.coli BL21(DE3) ；S12:菌株S.decolorationis S12。no cells:沒有加入任何菌株。
具體實施方式
:以下實施例是對本發(fā)明的進一步闡述，而不是對本發(fā)明的限制。實施例1:高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/azoR的構(gòu)建方法(I)引物設計；
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根據(jù)脫色希瓦氏菌S.decolorationis S12的依賴核黃素的NADH-偶氮還原酶，即azoR基因(其Genebank登錄號為EF198254)的開放閱讀框和上游啟動子(其Genebank登錄號為EF647586)序列，選取其上下游保守序列設計上游引物U和下游引物D，并在上游引物U的5’端加上NdeI限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列，在下游引物D的5’端加上XhoI限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列。引物U和D的堿基序列如下，下劃線部分分別為NdeI和XhoI限制性內(nèi)切酶的酶切位點序列。上游引物 U:GGAATTCCATATGTCCGCTTTTTTTCTTTTTTA下游引物D: CCGCTCGAGAACAGCTAACTTATC(2) PCR擴增基因序列及產(chǎn)物純化回收將基因供體菌株S.decolorationis S12接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)過夜。對菌液以12，000Xg離心IOmin,去上清，收集菌體。按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒的說明書操作，提取S.decolorationis S12的基因組DNA，對基因組DNA中azoR基因的開放閱讀框和上游啟動子序列進行PCR擴增。PCR擴增體系總體積為50 μ L:超純無菌水40.5 μ L，10 X PCR buffer5.0 μ L，
10.0mmol/LdNTPl.0μ L, 10.0pmol/uL 上游引物 Ul μ L，10.0pmol/uL 下游引物 Dl.0μ L,
2.5U/y L 了39酶0.5 4 1^，10叩/^1^基因組0嫩1.(^1^。94°C預變性5min后進入30個循環(huán):94°C變性 45s，55°C退火 45s，72。。延伸 Imin ;最后延伸 IOmin0按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒的說明書操作，對PCR產(chǎn)物進行純化回收。(3)限制性內(nèi)切酶雙酶切反應及產(chǎn)物純化回收將含有表達載體pET_22b (+)的大腸桿菌E.coli DH5 a /pET_22b (+)接種于含有50μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)過夜。對菌液以12，OOOXg離心lOmin，去上清，收集菌體。按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒的說明書操作，提取E.coli DH5a中質(zhì)粒pET_22b (+)的DNA。對pET_22b (+)質(zhì)粒DNA和步驟(2)獲得的PCR產(chǎn)物分別進行限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切反應。各自反應總體積為50 μ L的I XH緩沖液，添加3 μ g DNA,、各10U的NdeI和XhoI，37°C下反應3小時。pET-22b (+)質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶DNA，按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式DNA膠回收試劑盒的說明書操作，進行純化回收。azoR基因PCR產(chǎn)物的酶切產(chǎn)物，按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒的說明書操作，進行純化回收。(4)連接反應及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli連接反應總體積為10 μ L的I X緩沖液，添加azoR基因酶切產(chǎn)物
0.15μ g(0.3pmol)、pET_22b(+)質(zhì)粒 DNA 酶切產(chǎn)物 0.11 μ g(0.03pmol)、T4 連接酶 100U，添加終濃度為15%的PEG8000，16 °C恒溫過夜。制備E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞:接種E.coli BL21(DE3)單菌落于5mL LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)過夜。按照0.5%的量將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至Α_=0.4 0.6。迅速將培養(yǎng)物置于冰上30min，然后于4°C、5000 Xg離心15min，收集細胞沉淀。將細胞沉淀懸浮于30mL冰冷的0.lmol/L的CaCl2溶液中，冰浴30min。于4°C、3000 X g離心20min,收集沉淀出的細胞。用IOmL0.1mol/L的CaCl2-15%甘油懸浮細胞沉淀，按照每管200 μ L的量將感受態(tài)細胞分裝到預冷的小離心管中，在_80°C下保存。轉(zhuǎn)化:取過夜連接產(chǎn)物10 μ L加入含有200 μ LE.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞的小離心管中，冰浴30min。42°C水浴中熱擊90s以后，迅速冰浴3min。向小離心管中加入800 μ L經(jīng)過37°C預熱的LB液體培養(yǎng)基，于37°C緩慢搖動lh。取適量菌液加入16 μ L50mg/mL的X-gal和4 μ L200mg/mL的IPTG，涂布于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。(5)篩選和鑒別篩選在含有氨芐青霉素的LB平板上長出的白色抗性單菌落。將單菌落接種于含有50 μ g/mL氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)過夜。對菌液以12，OOOXg離心lOmin，去上清，收集菌體。按照上海生工生物工程技術(shù)有限公司的柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒的說明書操作，提取單菌落中的質(zhì)粒DNA。進行瓊脂糖凝膠電泳，圖2a表明篩選的單菌落含有重組質(zhì)粒pET-22b (+) /azoR(把azoR連入載體pET_22b (+)中)。對提取的質(zhì)粒DNA，利用引物U和D進行PCR擴增，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，圖2b表明篩選的單菌落質(zhì)粒中含有azoR基因。這說明了篩選的單菌落為正確構(gòu)建的基因工程菌，由此得到本發(fā)明的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR0實施例2:基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/azoR中偶氮還原酶的誘導表達(I)基因工程菌的誘導將基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)過夜。以1.5%的接種量，將過夜培養(yǎng)物接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)，在菌液A_達到0.6時，添加0.4mM的乳糖誘導，于30°C誘導4h。(2)粗酶液的制備對誘導后的菌液以12，OOOXg離心lOmin，去上清，收集菌體。用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)洗滌菌體兩次，最后重懸于用一定體積的緩沖液中，使菌液八_約為0.8。菌液于超聲波破碎儀上間隔5秒破碎5秒，總破碎時間為15分鐘。細胞破碎液經(jīng)13，000X g、4°C離心15min，上清液即為粗酶液。(3 )蛋白定量及SDS-PAGE蛋白電泳
按照天根生化科技(北京)有限公司的Bradford蛋白定量試劑盒對制備的粗酶液的蛋白含量進行定量。按照分子克隆實驗指南(第三版)方法，分別配制蛋白電泳的分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液和電泳緩沖液，制備濃縮膠濃度5%、分離膠濃度為12%，上樣的蛋白量為20μ g，室溫條件下進行60V電泳30min、100V電泳90min。電泳后凝膠置于考馬斯亮藍染色液中染色60min，在脫色液中脫色60min后，換新鮮脫色液脫色過夜后，進行電泳圖譜觀察。圖3表明基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR在無乳糖誘導的條件下即可表達一定量的NADH-偶氮還原酶，在乳糖誘導的條件下可大量表達NADH-偶氮還原酶。實施例3:不同菌株粗酶液的酶活比較按照實施例2制備誘導條件下基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR的粗酶液。將菌株 E.coli BL21(DE3)/azoR、Ε.coli BL21 (DE3)、E.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)(在E.coli BL21(DE3)轉(zhuǎn)入空載體pET_22b (+) )、S.decolorationis S12 接種于 LB 液體培養(yǎng)基中，于 37°C(S.decolorationis S12 為 30°C )、轉(zhuǎn)速 200rpm/min 的搖床中培養(yǎng)過夜。以 1.5%的接種量，分別將過夜培養(yǎng)物接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C (S.decolorationisS12為30°C )、轉(zhuǎn)速200rpm/min的搖床中培養(yǎng)至基因工程菌誘導表達培養(yǎng)所需的時間(在菌液A6tltl達到0.6時)，然后制備粗酶液。酶活測定在25°C、厭氧條件下進行，反應總體積為100 μ L。78 μ L的50mmol/L磷酸緩沖溶液(PBS，pH7.4)與15 μ L的粗酶液混合后，加入2 μ L2.5mmol/L的偶氮染料莧菜紅(終濃度為 50 μ mo I/U。加入 I μ L2mmol/L 的 FMN(終濃度 20 μ mol/L)，加入 4 μ L2.5mmol/L的NADH (終濃度100 μ mol/L)后，立即于分光光度計上連續(xù)測定染料在最大吸收波長處的吸光值隨時間的變化。偶氮染料莧菜紅的最大吸收波長為520nm。以100°C、30min滅活酶液的反應混合液為對照，酶活單位定義為以25°C、厭氧條件下每分種催化Img染料所需要的酶量為I個酶活單位(U)。酶活測定結(jié)果見表I。由表I可看出，無誘導條件下基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR的粗酶液的酶活單位與基因供體菌株S.decolorationis S12相差無幾，在誘導條件下其酶活單位大約是S.decolorationis S12的2倍。而菌株E.coliBL21(DE3)及E.coli BL21 (DE3)/pET_22b (+)的破碎細胞上清液中也檢測到一定酶活，但遠遠低于重組菌株E.coli BL21(DE3)/azoR0表1:不同菌株的粗酶液的酶活比較
權(quán)利要求
1.一種高效還原偶氮染料的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動子序列與表達載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，而得到具有雙啟動子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR,所述的NADH-偶氮還原酶基因為Genebank登錄號為EF198254所示的核苷酸序列，所述的NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子為Genebank登錄號為EF647586所示的核苷酸序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法得到的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR。
3.權(quán)利要求 2所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR在偶氮染料的脫色降解中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效還原偶氮染料的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應用。它是將NADH-偶氮還原酶基因及其上游啟動子序列與表達載體pET-22b(+)連接，然后再轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，而得到具有雙啟動子的高效還原偶氮染料的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR，所述的NADH-偶氮還原酶基因為Genebank登錄號為EF198254所示的核苷酸序列，所述的NADH-偶氮還原酶基因上游啟動子為Genebank登錄號為EF647586所示的核苷酸序列。該基因工程菌E.coli BL21(DE3)/azoR可以在更廣溫度范圍內(nèi)實現(xiàn)偶氮染料的脫色，具有更強的脫色活性和長期的存活能力，在染料廢水處理方面具有更廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/21GK103146737SQ20131007002
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者陳杏娟, 許玫英, 孫國萍 申請人:廣東省微生物研究所