專利名稱：一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程、蛋白質(zhì)工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種DNA分子的合成、突變、重組和載體構(gòu)建技術(shù)，尤其涉及一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
鏈霉親和素(Streptavidin,SA)是由阿維丁鏈霉菌(Streptomyces avidinii)培養(yǎng)過程中分泌的一種小分子非糖基化蛋白質(zhì)，全長編碼區(qū)183個氨基酸(aa)，包含24aa的信號肽(見序列表中SEQ ID No: 1)，成熟分子159aa (見序列表中SEQ ID No: 2)。菌體外的天然活性形式為從13 139aa的成熟肽(見序列表中SEQ ID No: 3)，分子量15kD，其天然形式為同源四聚體，分子量60kD，SA的成熟活性結(jié)構(gòu)為127個氨基酸的多肽，稱為SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.Stapley首先發(fā)現(xiàn)并報道。本世紀(jì)以來，SA由于其與生物素(Biotin，又稱維生素H、輔酶R)有極高的親和力和特異性而受到國際生物學(xué)和醫(yī)學(xué)界的高度重視。SA對其配體生物素的親和力(10_16 M/L)比已知的抗原-抗體的親和力(10_7 10_12 M/L)高4 6個數(shù)量級。高親和力和高特異性并不是SA的唯一特性，SA與Biotin的結(jié)合速度極快，即便是在極低濃度和4°C環(huán)境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化幾乎不影響生物功能。SA-Biotin復(fù)合物可以耐受變性劑(如6M鹽酸胍)、去垢劑(如SDS)、90°C高溫和3 IlpH環(huán)境。與其他靶向標(biāo)簽(如Halo-Tag和SNAP-Tag)相比，SA有更多便利，不論是體外或體內(nèi)，其可借助大腸桿菌的生物素連接酶(E.coli biotin ligase)將其配體標(biāo)記到目標(biāo)蛋白。SA的這些特性，引發(fā)了科學(xué)家對SA和其配體Biotin進(jìn)行各種生物改造的興趣。野生型SA (WtSA)分子與Biotin的結(jié)合速度(on-rate)雖然很快,但結(jié)合力不夠穩(wěn)定持久(high off-rate),這對需要連續(xù)長時間觀察的動態(tài)實驗(如細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域)與影像研究較為不利。另一方面，WtSA與生物素的異乎尋常的親和力(10_16mole/L)，又使得分離制備時，需要變性條件下洗脫。盡管WtSA對生物素的親和力極高，但其對某些極具用途的生物素衍生物，如2-亞氨基生物素，則結(jié)合力不夠理想(兼容性不理想)，這也提出了對SA進(jìn)行分子改造的必要。盡管過去20年來，已經(jīng)報道有200多種突變型SA (mtSA)，但關(guān)于SA突變后提高結(jié)合穩(wěn)定性的研究很少。2012年，Mark Howarth, Oxford (GB)公開了穩(wěn)定性結(jié)合SA突變體研究(美國專利申請?zhí)?US 2012/0214970 Al)，測試并保護(hù)了 3個雙位點突變體S52G/R53D, S52G/R53N, S52G/R53S (見序列表中 SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5，SEQ ID No: 6)，指出該類突變體的主體序列必須在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128與野生型SA相同。早在2000 年，R.Charles Cantor (Boston University)對 SA 的親和兼容性進(jìn)行了研究，公開了 2個SA的突變體(EP0977770 Al )，它們是N23A、S27E或S27D (見序列表中SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8)， 該突變體對Biotin的親和力降低了至少10個數(shù)量級，提高了對2-亞氨基生物素(2-1minobiotin)和Diaminobiotin的親和力，可用于分離2-亞氨基生物素化的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提出一種全人工基因合成的密碼子優(yōu)化和突變引入的親和兼容性鏈霉親和素突變體SA128m4及其制備方法，親和兼容性鏈霉親和素突變體SA128m4既有兼容性親和力，又有低的解離速度(off-rate)。本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn):
一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，所述親和兼容性鏈霉親和素突變體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所示。優(yōu)選的，上述的一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，其中:所述親和兼容性鏈霉親和素突變體包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D。一種上述的親和兼容性鏈霉親和素突變體的制備方法，包括以下步驟:
O已知的具有127個氨基酸的鏈霉親和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作為起始密碼安置，形成128個氨基酸序列，并在其中引入兩個氨基酸的定點突變:S·52G、R53D，以及兩個氨基酸的換位突變:Y22N、N23Y，得到的128個氨基酸的突變序列如序列表中SEQ ID N0:9所示；
2)將所述128個氨基酸的突變序列經(jīng)DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化(E.coli class II)，并且在其5’ -端添加了 NcoI酶切位點，3’_端添加終止密碼TAA和XhoI酶切位點，在上下游酶切位點外側(cè)各加4個保護(hù)堿基，DNA合成儀合成10條寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11 20所示；
3)將所述10條寡核苷酸引物通過PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列編碼128個氨基酸的突變序列，命名為SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D ；
4)構(gòu)建原核表達(dá)工程載體pET28a-SA128m4；
5)構(gòu)建原核表達(dá)工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4 ；
6)原核表達(dá)工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的擴增、誘導(dǎo)表達(dá)；
7)SA128m4的提取與純化；
8)SA128m4的生物活性測定，所述SA128m4的突變包含Y22N、N23Y、S52G、R53D，由于已知S52G、R53D突變可以使得結(jié)合穩(wěn)定性加強，解離(off-rate)速度變慢，而新的Y22N、N23Y的轉(zhuǎn)位突變則使得SA與Biotin氫鍵結(jié)合的空間位置發(fā)生變化，抑制了 SA對Biotin的過高親和力，提高了對Biotin衍生物(2-1minobiotin, 2-亞氨基生物素)的親和力。本發(fā)明的突出效果為:本發(fā)明提供了一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法，親和兼容性鏈霉親和素突變體SA128m4結(jié)合了 SA (S52G，R53D)突變的結(jié)合穩(wěn)定性(low off-rate)和SA (N23A，S27D)的親和兼容性，降低了對生物素的親和力，提高了對生物素衍生物(如2-亞氨基生物素)的親和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分離、純化，其產(chǎn)物可用作親和色譜填料制備。以下便結(jié)合實施例附圖，對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步的詳述，以使本發(fā)明技術(shù)方案更易于理解、掌握。


圖1是重組表達(dá)載體pET28a_SA128m4的物理結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例:
本實施例提供一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法。1.全人工基因合成和突變引入
1.1已知的具有127個氨基酸的鏈霉親和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作為起始密碼安置，形成128個氨基酸序列，并在其中引入兩個氨基酸的定點突變:S52G、R53D，以及兩個氨基酸的換位突變:Y22N、N23Y，得到的128個氨基酸的突變序列(SEQ ID N0:9)；
1.2將上述128個氨基酸的突變序列經(jīng)美國國家生化信息中心(NCBI)網(wǎng)上軟件DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列,上述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化(E.coli classII)，并且在其5’ -端添加了 NcoI酶切位點，3’ -端添加終止密碼TAA和XhoI酶切位點，在上下游酶切位點外側(cè)各加4個保護(hù)堿基，DNA合成儀合成10條寡核苷酸引物(SEQ IDNO: 11 20)；
1.3將上述10條 寡核苷酸引物通過PCR合成人工DNA序列為403個堿基對的脫氧核糖核酸，所述人工DNA序列編碼128個氨基酸的突變序列，命名為SA128m4 (SEQ ID N0:21),包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D (SEQ ID N0:9)；
1.4將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)盤古基因科技(蘇州)有限公司的TOPO克隆載體TopFast pACK4a-Bs,挑取單克隆擴增、PCR鑒定重組體；
1.5通過DNA序列分析獲得了序列正確的SA128m4克隆(命名為pACK4a_SA128m4)。2.亞克隆技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體
2.1用Ncol/Xhol雙酶切消化pACK4a-SA128m4，瓊脂糖電泳和膠回收法回收SA128m4目的片段，同法用Ncol/Xhol處理pET28a載體，膠回收純化；
2.2 T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)菌，挑取單菌落鑒定陽性克??；
2.3測序分析驗證插入片段正確，取得pET28a-SA128m4重組表達(dá)載體(如圖1所示)；
2.4用該載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)菌，取得表達(dá)菌株BL21-pET28a_SA128m4。3.測試表達(dá)
3.1LB培養(yǎng)基擴增表達(dá)菌株BL21-pET28a-SA128m4，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件:IPTG
0.lmMole/L，25°C誘導(dǎo) 4 小時；
3.2取ImL菌液，離心收集菌體，PBS洗滌I次，0.5mL PBS重懸浮，超聲裂解菌體；
3.3在4°C，12，000RPM,離心15min，保留上清和沉淀，分別上樣SDA-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色-脫色，觀察表達(dá)條帶。SA128m4的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的8%，其中可溶性表達(dá)>90%。4.SA128m4蛋白質(zhì)純化4.1 LB+M9培養(yǎng)基2L，搖瓶擴菌至OD ^ 0.5 ；
4.2加IPTG誘導(dǎo)(0.1mMoIe/L), 25°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時；
4.3收集菌體，超聲破碎菌體，離心收集上清；
4.4飽和硫酸銨(加至80%)共沉淀，離心收集沉淀，去離子水重懸；
4.5分子篩Siiphadex G-50,分選加脫鹽，5%甘油水溶液洗柱，收集SA128m4蛋白組份，20mM磷酸鹽緩沖液，pH5.0 (含IOmM NaCl, 5%甘油)透析平衡；
4.6Mono S陽離子交換層析:20mM憐酸鹽緩沖液,ρΗ5.0(含IOmM NaCl, 5% Glycerol)平衡離子交換柱，上樣，5倍柱體積平衡液淋洗，20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0(含IOOmM NaCl,5% Glycerol)，洗脫目標(biāo)產(chǎn)物 SA128m4 ；
4.7Mono Q陰離 子交換層析:pH8.5, 20mM的Tris-Cl緩沖液(含5% Glycerol)平衡色譜柱，將上一步收集的SA組份以柱平衡液透析平衡后上柱，5倍柱體積淋洗，離子梯度洗脫 SA (20mM 的磷酸鹽緩沖液，pH8.5,200mM NaCl)；
4.8Sephadex G-200凝膠過濾層析(60cmX 5cm)，收集合并含有SA的活性峰，并對其含量，純度進(jìn)行鑒定，超濾濃縮。5.SA128m4 活性測定
BioCORE 100 生物傳感器測定親和力，SA128m4 與 Biotin 的 Kd = 1.52 X 1(T8M/L，與2-亞氨基生物素的Kd = 1.23X 1(T6M/L。SA128m4 的比活性(Specific Activity)達(dá)到 14.8U/mg (wtSA 的比活性為 13 16U/mg, IU 結(jié)合 Biotin lM-g) SA128m4與生物素結(jié)合的半壽期為12小時(據(jù)報道，wtSA為6.6小時，單體SA(Monomeric SA)為 3 分鐘)。本發(fā)明尚有多種實施方式，凡采用等同變換或者等效變換而形成的所有技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，其特征在于:所述親和兼容性鏈霉親和素突變體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所/Jn ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種親和兼容性鏈霉親和素突變體，其特征在于:所述親和兼容性鏈霉親和素突變體包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D。
3.一種基于權(quán)利要求1所述的親和兼容性鏈霉親和素突變體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O已知的具有127個氨基酸的鏈霉親和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作為起始密碼安置，形成128個氨基酸序列，并在其中引入兩個氨基酸的定點突變:S52G、R53D，以及兩個氨基酸的換位突變:Y22N、N23Y，得到的128個氨基酸的突變序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 2)將所述128個氨基酸的突變序列經(jīng)DNAWorks逆翻譯成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密碼子經(jīng)DNAWorks優(yōu)化，并且在其5’-端添加了 NcoI酶切位點，3’-端添加終止密碼TAA和XhoI酶切位點，在上下游酶切位點外側(cè)各加4個保護(hù)堿基，DNA合成儀合成10條寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11 20所示； 3)將所述10條寡核苷酸引物通過PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列編碼128個氨基酸的突變序列，命名為SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D ； 4)構(gòu)建原核表達(dá)工程載體pET28a-SA128m4； 5)構(gòu)建原核表達(dá)工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4 ；` 6)原核表達(dá)工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的擴增、誘導(dǎo)表達(dá)； 7)SA128m4的提取與純化； 8)SA128m4的生物活性測定。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法，所述親和兼容性鏈霉親和素突變體的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，包含4個氨基酸的突變，分別為Y22N、N23Y、S52G、R53D。本發(fā)明提供了一種親和兼容性鏈霉親和素突變體及其制備方法，降低了對生物素的親和力，提高了對生物素衍生物(如2-亞氨基生物素)的親和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分離、純化，其產(chǎn)物可用作親和色譜填料制備。
文檔編號C12N15/70GK103242435SQ201310069078
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者李萬波, 黃勇, 陜婧婧, 管春愛, 賈翔 申請人:盤古基因科技(蘇州)有限公司