專利名稱：一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒及其制備方法與用途。具體涉及一種用于標(biāo)記生物素化核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，標(biāo)記后用于多種生物及非生物分子的富集、分離及檢測的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備與應(yīng)用；或用于蛋白、核酸、細(xì)胞等的磁性標(biāo)記物，作為快速富集手段，用于多種生物及非生物分子的分離、純化及檢測的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2003年8月14日的中國專利“一種組裝型磁性復(fù)合微粒及其制備方法與應(yīng)用”，專利申請?zhí)?3153486.4，公告號CN1580765A，是一種組裝型Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒，用于生物分子標(biāo)記。這種組裝型金磁復(fù)合微粒粒度較均一，單分散性好，穩(wěn)定性好，有較好的磁響應(yīng)性和對生物分子的可修飾性。其缺點或不足是組裝型Fe3O4/Au超順磁性復(fù)合微粒不能直接用于多種生物分子的標(biāo)記，標(biāo)記量少，對生物分子的富集能力相對較低，從而使檢測的靈敏度相對較低；且生物分子的直接標(biāo)記易使生物分子部分變性失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒及其制備方法與用途，其解決了背景技術(shù)中標(biāo)記量少，對生物分子的富集能力相對較低，從而使檢測的靈敏度相對較低，且生物分子的直接標(biāo)記易使生物分子部分變性失活的技術(shù)問題。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒，包括組裝型金磁復(fù)合微粒1，其特殊之處在于所述組裝型金磁復(fù)合微粒1的外層包覆有親和素/鏈親和素生物分子2。
上述親和素/鏈親和素生物分子2為高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子。
上述組裝型金磁復(fù)合微粒1的粒徑以0.05-100μm為宜，在外層包覆蛋白親和素/鏈親和素后，其粒徑變化不大。
一種制備上述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的方法，其特殊之處在于該方法的實現(xiàn)步驟如下1)取組裝型金磁復(fù)合微粒；2)用平衡鹽溶液進(jìn)行平衡(1)將平衡鹽溶液放入離心管，使組裝型金磁復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中；(2)用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，棄上清；具體可平衡三次；3)加入1mg/ml 300μl的高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子；恒溫下，一邊振蕩、混勻，一邊進(jìn)行反應(yīng)；4)進(jìn)行磁性分離，棄上清；以緩沖液清洗三次；5)加入封閉劑，封閉20-120分鐘；6)以500μl 0.02M的磷酸鹽緩沖液pH＝7.4清洗三次即可。
上述平衡鹽溶液可采用0.02-0.2M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸鹽緩沖液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸鹽緩沖液，pH＝7.0-7.6；上述清洗的緩沖液可采用500μl 0.02M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和0.15M的NaCl的緩沖液。
上述平衡鹽溶液中以加入0.1-1.0M的NaCl為佳。
上述封閉劑可采用1-10％的脫脂奶粉，或1-5％的牛血清白蛋白BSA，或0.2-2.0％的明膠等。
上述恒溫振蕩反應(yīng)的溫度為室溫至37℃，以37℃為宜；反應(yīng)時間10-30分鐘，以20分鐘為宜。
一種如上所述的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的用途，其特殊之處在于該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于標(biāo)記生物素化生物分子及生物素化非生物材料。標(biāo)記后用于生物分子及非生物分子的富集、分離、純化及檢測。生物素化生物分子可為生物素化核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等。
一種如上所述的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的應(yīng)用，其特殊之處在于該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于標(biāo)記蛋白、核酸、細(xì)胞；標(biāo)記后用于抗原-抗體、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配體-受體生物分子相結(jié)合的反應(yīng)；或用于微生物的生物分子富集、分離、純化及檢測；或用于食品污染、細(xì)胞分離、mRNA純化的生物分子富集、分離、純化劑檢測。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1.本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒生物素結(jié)合容量高。其游離生物素結(jié)合活性可達(dá)700-5000pmol。例如，每毫克鏈親和素磁性復(fù)合微粒可結(jié)合高達(dá)5000pmol的游離生物素，每毫克鏈親和素磁性復(fù)合微?？山Y(jié)合的生物素化寡核苷酸探針大于800pmol。
2.以親和素/鏈親和素生物分子作為組裝型金磁復(fù)合微粒的包覆物，具有高生物素結(jié)合活性，可減少生物分子的變性失活，并可起到偶聯(lián)放大的作用，為檢測提高靈敏度，增強其生物分子富集能力。
3.本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微?？芍苯佑脕順?biāo)記生物素化核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，是一種通用性磁性復(fù)合載體，可避免對不同標(biāo)記物的固定化方法的選擇。
4.本發(fā)明以組裝型金磁復(fù)合微粒為載體，固定化鏈親和素后，利用鏈親和素與生物素化配基之間強的相互作用，可將核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等生物分子通過簡單的生物素化，一步固定于金磁復(fù)合微粒上，制備方法簡便、快捷，一般只需20分鐘即可完成。
5.本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒采用一步固定法制備，可節(jié)省大量昂貴的生物試劑。
6.本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微?？捎糜跇?biāo)記生物素化核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等任何生物素化分子，用作蛋白、核酸、細(xì)胞等的磁性標(biāo)記物，非常適用于核酸、蛋白質(zhì)等生物及非生物樣品的富集與分離，核酸雜交于檢測，抗原-抗體免疫學(xué)檢測等生物體的檢測，以及環(huán)境監(jiān)測、食品安全檢測等。
7.由于親和素/鏈親和素具有較高的磁響應(yīng)性和較大的生物分子固定化容量，通過簡單的磁分離裝置，就可對捕獲至復(fù)合微粒表面的物質(zhì)進(jìn)行富集、分離和純化，或用于核酸純化和細(xì)胞分離。
8.本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于生物分析檢測，可提高生物分析檢測的靈敏度和特異性，使檢測過程更為簡便。無需借助昂貴的檢測儀器，大大降低了檢測成本。


圖1為組裝型金磁復(fù)合微粒的剖面結(jié)構(gòu)模式圖；圖2為本發(fā)明親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的剖面模式圖；圖3為本發(fā)明鏈親和素包被容量的曲線圖；
圖4為本發(fā)明鏈親和素磁珠結(jié)合生物素化寡核苷酸探針前后的紫外吸收曲線圖。
附圖標(biāo)號說明1-組裝型金磁復(fù)合微粒，2-親和素/鏈親和素生物分子。I-代表結(jié)合前寡核苷酸探針紫外吸收OD260nm處的光密度值，II-代表結(jié)合后寡核苷酸探針紫外吸收OD260nm處的光密度值，III-代表磁粒清洗后洗滌液的光吸收曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒由內(nèi)層的組裝型金磁復(fù)合微粒1和包覆于其外層的親和素/鏈親和素生物分子2構(gòu)成。親和素/鏈親和素生物分子2為高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子。組裝型金磁復(fù)合微粒1的粒徑采用0.05-100μm，在外層包覆親和素/鏈親和素生物分子2后，其粒徑變化不大。
本發(fā)明的親和素/鏈親和素生物分子2通過簡單的物理吸附一步法固定于組裝型金磁復(fù)合微粒1上。親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒制備方法的步驟如下1.取100μl、5mg的組裝型金磁復(fù)合微粒，粒徑為0.05-100μm。
2.用平衡鹽溶液進(jìn)行平衡1)將平衡鹽溶液放入離心管，使組裝型金磁復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中；2)用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，棄上清。
平衡鹽溶液可采用0.02-0.2M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液Tris-HCl，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸鹽緩沖液PBS，pH＝7.0-7.6；或N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸鹽緩沖液HEPES等。在平衡鹽溶液中以加入0.1-1.0M的NaCl為佳。具體以平衡三次為宜。
3.加入1mg/ml的高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子300μl，在恒溫下，一邊振蕩混勻，一邊進(jìn)行反應(yīng)。具體可采用恒溫振蕩器，溫度為室溫至37℃，以37℃為宜；反應(yīng)時間為10-30分鐘，一般以20分鐘為宜。
4.用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，棄上清。以500μl 0.02的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和0.15M的NaCl清洗。
5.加入封閉劑，封閉20-120分鐘。封閉劑可采用1-10％的脫脂奶粉，或1-5％的BSA，或0.2-2.0％的明膠等。
6.以500μl 0.02M的磷酸鹽緩沖液pH＝7.4清洗三次備用。
本發(fā)明親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的用途該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于標(biāo)記生物素化生物分子及生物素化非生物材料。生物素化生物分子可為生物素化核酸、抗原、抗體、酶、多肽、多糖等。
該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于抗原-抗體、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配體-受體等生物分子相結(jié)合的反應(yīng)；或用于細(xì)菌、病毒等臨床致病微生物的生物分子富集、分離、純化及檢測；或用于食品污染、細(xì)胞分離、mRNA純化的生物分子富劑、分離、純化劑檢測。
實施例1，本發(fā)明鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法1.取0.02M的Tris-HCl緩沖液，其中加有0.15M的NaCl。
2.用緩沖液對100μl、5mg組裝型金磁復(fù)合微粒平衡三次。
平衡過程將組裝型金磁復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中，磁性分離后，棄上清。
3.加入0.5mg/ml高生物素結(jié)合活性的鏈親和素生物分子300ul，振蕩混勻，37℃恒溫下，反應(yīng)20分鐘。
4.磁性分離棄上清，以500μl 0.02的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和0.15M的NaCl清洗實施例2，本發(fā)明鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于連結(jié)生物素化寡核苷酸探針1)取500μl的0.01M Tris-Hcl含1M NaCl的緩沖液，2)對500μg鏈親和素磁性復(fù)合微粒進(jìn)行平衡。平衡三次，磁性分離后，棄上清。
3)加入生物素化寡核苷酸探針200μl，即1.5nmol，以同等量探針為空白以測定結(jié)合前溶液的OD值，室溫放置20分鐘；4)磁性分離留上清測定結(jié)合后溶液的OD值，用0.01M Tris-Hcl含0.15M NaCl的緩沖液清洗三次，分別磁性分離留上清測定清洗后的OD值。
實施例3，本發(fā)明鏈親和素磁性復(fù)合微粒表面連結(jié)生物素化羊抗人IgG，用于免疫檢測1)取0.01M Tris-HCl含0.15M NaCl緩沖液100μl，2)對100μl鏈親和素磁性復(fù)合微粒進(jìn)行平衡。平衡三次，磁性分離后棄上清。
3)加入100μl生物素化羊抗人IgG。
4)37℃恒溫下反應(yīng)30分鐘，用0.01M的PBS洗滌三次，備用5)加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG，37℃恒溫下反應(yīng)30分鐘。
6)磁性分離，用0.01M的PBS清洗2-3次。
7)加入50μ1四甲基聯(lián)苯胺和50μl過氧化氫，反應(yīng)后以100μl 2M的硫酸終止，測定可見區(qū)450nm處的光密度值(OD450nm值)。
權(quán)利要求
1.一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒，包括組裝型金磁復(fù)合微粒(1)，其特征在于所述組裝型金磁復(fù)合微粒(1)的外層包覆有親和素/鏈親和素生物分子(2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒，其特征在于所述的親和素/鏈親和素生物分子(2)為高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒，其特征在于所述的組裝型金磁復(fù)合微粒(1)的粒徑為0.05-100μm。
4.一種權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于該方法的實現(xiàn)步驟如下1)取組裝型金磁復(fù)合微粒；2)用平衡鹽溶液進(jìn)行平衡(1)將平衡鹽溶液放入離心管，使組裝型金磁復(fù)合微粒分散于平衡鹽溶液中；(2)用磁性分離器進(jìn)行磁性分離，棄上清；3)加入1mg/ml 300μl的高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子；恒溫下，一邊振蕩、混勻，一邊進(jìn)行反應(yīng)；4)進(jìn)行磁性分離，棄上清；以緩沖液清洗三次；5)加入封閉劑，封閉20-120分鐘；6)以500μl 0.02M的磷酸鹽緩沖液pH＝7.4清洗三次即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于所述的平衡鹽溶液為0.02-0.2M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的磷酸鹽緩沖液，pH＝7.0-7.6；或0.02-0.2M的N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸鹽緩沖液，pH＝7.0-7.6；所述清洗的緩沖液為500μl0.02M的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸pH＝7.4含有10mM的乙二胺四乙酸二鈉鹽和0.15M的NaCl的緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于所述的平衡鹽溶液中加有0.1-1.0M的NaCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于所述的封閉劑為1-10％的脫脂奶粉，或1-5％的牛血清白蛋白BSA，或0.2-2.0％的明膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的制備方法，其特征在于所述恒溫振蕩反應(yīng)的溫度為室溫至37℃，反應(yīng)時間10-30分鐘。
9.一種權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的用途，其特征在于該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于標(biāo)記生物素化生物分子及生物素化非生物材料；標(biāo)記后用于生物分子及非生物分子的富集、分離、純化及檢測。
10.一種權(quán)利要求1所述親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒的用途，其特征在于該親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒用于標(biāo)記蛋白、核酸、細(xì)胞；標(biāo)記后用于抗原-抗體、DNA-DNA、DNA-寡核苷酸、配體-受體生物分子相結(jié)合的反應(yīng)；或用于微生物的生物分子富集、分離、純化及檢測；或用于食品污染、細(xì)胞分離、mRNA純化的生物分子富集、分離、純化劑檢測。
全文摘要
一種親和素/鏈親和素磁性復(fù)合微粒及其制備方法與用途。其產(chǎn)品由內(nèi)層的組裝型金磁復(fù)合微粒和包覆于外層的親和素/鏈親和素生物分子構(gòu)成。制備時用平衡鹽溶液對組裝型金磁復(fù)合微粒進(jìn)行平衡；加入高生物素結(jié)合活性的親和素/鏈親和素生物分子，恒溫下振蕩混勻，反應(yīng)；磁性分離，清洗即可。本發(fā)明解決了背景技術(shù)中通用性較差，標(biāo)記量少，易使生物分子變性失活的技術(shù)問題。本發(fā)明可直接用于標(biāo)記生物素化生物分子及生物素化非生物材料，標(biāo)記后用于生物分子及非生物分子的富集、分離、純化及檢測等。本發(fā)明產(chǎn)品具有高生物素結(jié)合活性，可提高生物分析檢測的靈敏度和特異性。制備方法簡捷，可節(jié)省大量昂貴的生物試劑。檢測過程更為簡便。
文檔編號G01N33/543GK1952659SQ20051009621
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月19日
發(fā)明者崔亞麗, 陳超, 張志鋒, 崔婷, 唐一通, 張彩峰 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司