專利名稱：馬鈴薯pinⅡ基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種馬鈴薯pin II基因啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究日新月異，轉(zhuǎn)基因作物種植面積逐年增加。轉(zhuǎn)基因作物中目的基因的表達強弱，很大程度上影響著轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用。影響基因表達的因素有很多，主要有以下五方面:核酸的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄強弱、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯效率和翻譯后修飾，其中轉(zhuǎn)錄強弱起著重要作用。調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄強弱的是啟動子，因此開發(fā)強啟動子對轉(zhuǎn)基因作物的培育具有重要意義。植物基因工程中常用的啟動子按其作用方式和功能可分為三類:組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子在所有組織中都啟動基因表達，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性；RNA和蛋白質(zhì)表達量也是相對恒定的。此類啟動子的代表性啟動子有煙草花葉病毒CaMV35S啟動子、玉米泛素基因Ubiquitin啟動子和水稻肌動蛋白基因Actin啟動子。誘導(dǎo)型啟動子在正常情況下不能啟動基因的表達,但受某些物理、化學(xué)、生物信號的刺激后，此類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，如擬南芥逆境誘導(dǎo)啟動子rd29A。在組織特異性啟動子的調(diào)控下，基因的表達往往只發(fā)生在某些特定的器官和組織，并往往表現(xiàn)發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，如煙草花粉絨氈層細胞中特異表達基因啟動子TA29?？共∠x基因越來越多的應(yīng)用于農(nóng)作物，使作物產(chǎn)量得到了大幅度的提高。為了提高這些抗病蟲基因在轉(zhuǎn)基因作物中的表達，多是使用異源組成型強啟動子調(diào)控表達，如CaMV35S。由于CaMV35S啟動子來源于病毒，從生物安全角度考慮，其在一定程度上影響了轉(zhuǎn)基因作物的推廣。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，多基因轉(zhuǎn)化成為植物基因工程研究的新熱點，亟待開發(fā)更多有效的啟動子。因此直接從植物克隆高效表達的啟動子具有重要的應(yīng)用價值。 馬鈴薯蛋白酶抑制劑II (PIN II)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，主要存在于馬鈴薯、西紅柿等茄科植物中。該蛋白編碼基因表達具有多樣性:在儲藏器官如馬鈴薯塊莖、西紅柿果實中是組成型表達，而在葉片中是誘導(dǎo)表達，可響應(yīng)多種理化誘導(dǎo)信號，如機械損傷、蟲害、熱刺激、電刺激、茉莉酸、乙烯、脫落酸、蔗糖、系統(tǒng)素等。馬鈴薯蛋白酶抑制劑II的mRNA在損傷處理3-4小時后開始積累，9小時時達到峰值，然后逐漸下降；馬鈴薯蛋白酶抑制劑II蛋白在損傷處理4小時后即可檢測到，并逐漸增加，可在最高值保持數(shù)天。馬鈴薯蛋白酶抑制劑II蛋白編碼基因不僅在損傷部位誘導(dǎo)表達，而且可以在損傷部位的遠端誘導(dǎo)表達?；隈R鈴薯蛋白酶抑制劑II基因的表達特性，克隆研究該基因啟動子具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有高效啟動活性的馬鈴薯pin II基因啟動子及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的馬鈴薯pin II基因啟動子，其核苷酸序列為:i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID N0.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本發(fā)明還提供含有上述啟動子的表達盒。本發(fā)明還提供含有上述啟動子的載體，所述載體為植物表達載體，例如植物雙元表達載體等。本發(fā)明還提供含有上述表達盒或載體的宿主細胞。本發(fā)明還提供含有上述啟動子的轉(zhuǎn)化植物細胞。本發(fā)明還提供馬鈴薯pin II基因啟動子在調(diào)控下游基因表達中的應(yīng)用，優(yōu)選下游基因為GUS基因。本發(fā)明進一步提供馬鈴薯pin II基因啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。例如，可以將目的基因可操作地連接到馬鈴薯Pin II基因啟動子之下，構(gòu)建得到表達盒，進一步可將該表達盒導(dǎo)入植物表達載體，將獲得的重組表達載體通過比如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法以及花粉管通道等方式轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。從而可以通過引入抗蟲、抗病、抗逆等基因，培育出抗蟲、抗病、抗逆植物，提高植物抗蟲、抗病和/或抗逆活性。本發(fā)明的啟動子可用于制備本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)基因植物，用于控制外源或內(nèi)源基因的表達，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，如煙草、擬南芥等。本發(fā)明從克隆馬鈴薯pin II基因啟動子入手，通過對馬鈴薯pin II基因啟動子結(jié)構(gòu)和序列的分析，驗證了馬鈴薯Pin II基因啟動子的功能。將本發(fā)明的啟動子構(gòu)建成GUS融合表達載體，轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥。GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活性測定結(jié)果均表明，本發(fā)明提供的啟動子能啟動GUS基因的表達，具有強啟動子活性，為植物抗逆基因工程研究提供了新的啟動子元件，也為下一步植物遺傳改良和產(chǎn)業(yè)化研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明實施例1中馬鈴薯pin II啟動子PCR擴增結(jié)果。圖2為本發(fā)明實施例2中載體pCAMBIA1300-pin I1-GUS的構(gòu)建流程示意圖。圖3為本發(fā)明實施例4中轉(zhuǎn)基因煙草幼苗染色分析結(jié)果。圖4為本發(fā)明實施例5中轉(zhuǎn)基因煙草葉片和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片GUS酶活定量分析結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規(guī)方法進行或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。實施例1馬鈴薯pin II基因啟動子的克隆

根據(jù)登錄號X04118在GenBank中查詢馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因核酸序列。根據(jù)此核酸序列設(shè)計引物擴增馬鈴薯pin II啟動子片段。設(shè)計的引物為:正向引物5’-AACTGCAGCCCAATTCAAAGAACTTG-3’ (SEQ ID N0.2)，5’ 端引入 PstI 酶切位點，反向引物5’ - CGCGGATCCTTAATTAGTACTGCCTCT-3’ (SEQ ID N0.3)，5’ 端引入 BamHI 酶切位點。以馬鈴薯基因組DNA為模板，PCR擴增pin II啟動子序列，得到928bp的PCR產(chǎn)物(圖1)。PCR反應(yīng)體系:
權(quán)利要求
1.馬鈴薯pinII基因啟動子，其特征在于，其核苷酸序列為: i)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID N0.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述啟動子的表達盒。
3.含有權(quán)利要求1所述啟動子的載體。
4.含有權(quán)利要求2所述表達盒或權(quán)利要求3所述載體的宿主細胞。
5.權(quán)利要求1所述的啟動子在調(diào)控下游基因表達中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，下游基因為GUS基因。
7.權(quán)利要求1所述啟動子在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用， 其特征在于，所述植物為煙草、擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明涉及馬鈴薯pinⅡ基因啟動子及其應(yīng)用，該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本發(fā)明從克隆馬鈴薯pinⅡ基因啟動子入手，通過對馬鈴薯pinⅡ基因啟動子結(jié)構(gòu)和序列的分析，驗證了馬鈴薯pinⅡ基因啟動子的功能。將本發(fā)明的啟動子構(gòu)建成GUS融合表達載體，轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥。GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活性測定結(jié)果均表明，本發(fā)明提供的啟動子能啟動GUS基因的表達，具有強啟動子活性，為植物抗逆基因工程研究提供了新的啟動子元件，也為下一步植物遺傳改良和產(chǎn)業(yè)化研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/10GK103146704SQ20131006948
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者王國英, 張生學(xué), 劉允軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所