專利名稱：一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子及其在提高植物養(yǎng)分利用效率更具體的說是在提高植物中氮素利用效率方面的用途。
背景技術：
在農(nóng)作物生長的過程中，為了提高產(chǎn)量挖掘農(nóng)作物的生產(chǎn)潛力，農(nóng)民會大量使用化肥，特別是大量施用氮肥。據(jù)報道，我國有著不到世界10%的耕地，但是氮肥使用量卻占世界的近30%。國際合作委員會農(nóng)業(yè)面源污染控制課題組研究得出我國氮肥施用量的一半在被農(nóng)作物吸收之前就以氣體形態(tài)逸失到大氣中或從排水溝渠流失到水體環(huán)境中。目前我國作物氮素利用率只有30-35%，而發(fā)達國家則高達45%，大量未被作物吸收利用的氮肥進入環(huán)境，不但造成資源浪費，增加生產(chǎn)氮肥的能源消耗，還增加了農(nóng)民的投入，而且在很多地方已經(jīng)引起了地下水污染和江河湖泊的富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。為了改變這一現(xiàn)狀， 目前生產(chǎn)上采用氮素利用率高的作物品種，或是在保證作物產(chǎn)量基礎上，減少氮肥的使用量等等方式，但無論是哪種方式其目的都是為了提高氮肥的利用率，減少浪費和環(huán)境污染。利用生物技術途徑是提高作物氮素利用率的重要途徑之一。通過轉(zhuǎn)基因過表達與氮素吸收或利用直接相關的基因在提高植物的氮素利用率方面已取得了一定的進展(Habash 等，Ann. Appl. Biol.，2001，138 :83-89 ；Ying Zhou 等，TAG, 2009，118 1381-1390)，效果比較明顯的是用作物自身的Antiquitin啟動子驅(qū)動丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的表達(Good 等，Can. J. Bot.，2007，85 252-262，實驗材料為油菜；Shrawat 等，2008，Plant Biotechnology Journal，6 :722_732，實驗材料為水稻)，轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜在達到同樣的最高產(chǎn)量時，轉(zhuǎn)基因油菜的氮肥使用量僅為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?0%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種來源于小麥(Triticumaestivum)Antiquitin(TaAntl)基因的啟動子(命名為TaAntlpro)及其在提高植物養(yǎng)分利用效率更具體的說是在提高植物氮素利用效率方面的用途。本發(fā)明提供的一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子，其特征在于具有下列 DNA序列之一1)序列表中SEQ ID NO 1所示的DNA序列；2)將序列表中SEQ ID NO 1所示的DNA序列在5‘端或3'端截去一段后的序列， 其功能不變，只是活性有些改變或沒有改變；3)將序列表中SEQ ID NO=I所示的DNA序列經(jīng)過一個或幾個堿基的取代和/或缺失和/或添加但功能并未改變的DNA序列。含有上述TaAntlpr0的表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。一種含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于該表達盒由所述的來源于小麥Antiquitin基因的啟動子、編碼目的基因的DNA序列和一個轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列構成；來源于小麥Antiquitin基因的啟動子以功能性方式與編碼目的基因的DNA 序列連接，且所述編碼目的基因的DNA序列與一個轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列連接。所述含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于構建的目的基因可以是需要表達的任何基因，在本發(fā)明中優(yōu)選的目的基因為GUS基因或與養(yǎng)分代謝有關的基因。所述含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于構建的目的基因為與氮磷代謝有關的基因，這些基因涉及養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)運和利用等過程。所述含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于構建的目的基因為與氮代謝有關的基因，可選自硝酸轉(zhuǎn)運蛋白、氨轉(zhuǎn)運蛋白、硝酸還原酶、谷胺酰胺合成酶、天門冬酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Alanineaminotransferase，下文簡稱AlaAT)基因，但并不限于這些基因。所述含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于構建的目的基因為與氮代謝有關的水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因。所述含有來源于小麥Antiquitin基因啟動子的表達盒，其特征在于使用的轉(zhuǎn)錄終止序列可從大量的轉(zhuǎn)錄終止序列中進行選擇，比如NOS終止序列、35S終止序列等。含有所述TaAntlpro的重組表達載體、重組菌和轉(zhuǎn)基因細胞系也屬于本發(fā)明保護的范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含所述TaAntlpro的重組表達載體?？捎玫闹参锉磉_載體種類很多，比如 PAHC15、pAHC18、pAHC25、pCAMBIA0390、pCABIA2201、pCAMBIA3301、 PBI121或其它衍生植物表達載體。用現(xiàn)有的分子生物學方法可以構建多種含所述 TaAntlpro 的重組表達載體，比如 pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT 等。為便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植株進行篩選或鑒定，在構建含所述TaAntlpro的重組表達載體中可帶有抗性篩選基因或標記基因，比如BAR基因、卡那霉素基因、GUS基因、 GFP基因等；從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮也可以不帶抗性篩選基因或標記基因，直接用PCR 或逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。本發(fā)明還提供了一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子在提高植物養(yǎng)分利用率尤其是氮素利用率方面的用途，其特征在于利用所述重組表達載體轉(zhuǎn)化目的植物，從中篩選出養(yǎng)分利用效率尤其是氮素利用效率提高的轉(zhuǎn)基因植株。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，具體可以是煙草。一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子在提高植物氮素利用率方面的用途， 其特征在于用重組表達載體pCAMBIA0390-TaAnt Ipro-AlaAT轉(zhuǎn)化煙草葉片，抗性再生植株經(jīng)PCR檢測和不同氮素水平的營養(yǎng)液培養(yǎng)，篩選出氮素利用效率提高的轉(zhuǎn)基因后代。所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化目的植物的方法可以通過農(nóng)桿菌介導、花粉管介導或基因槍轟擊等常規(guī)轉(zhuǎn)基因手段進行。用本發(fā)明的方法利用農(nóng)桿菌把所述含有來源于小麥Antiquitin基因的啟動子的重組表達載體pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT轉(zhuǎn)化煙草葉片，陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株的平均生物量顯著高于對照44%，說明本發(fā)明的TaAntlpro在培養(yǎng)養(yǎng)分高效利用的轉(zhuǎn)基因植物方面有廣泛應用前景。


圖1是轉(zhuǎn)pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT抗性轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測圖譜圖中M為分子量標準；-ck為未作轉(zhuǎn)化的煙草；+ck為轉(zhuǎn)化用的質(zhì)粒；AlaAT為轉(zhuǎn)化后得到的抗性煙草。圖2是pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus抗性轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測圖譜圖中M為分子量標準；-ck為未作轉(zhuǎn)化的煙草；+ck為轉(zhuǎn)化用的質(zhì)粒；AlaAT為轉(zhuǎn) pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT得到的抗性煙草；GUS 為轉(zhuǎn)pCAMBIA0390-TaAntlpro_Gus 得到的抗性煙草。圖3為轉(zhuǎn)pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus抗性轉(zhuǎn)基因煙草植株⑶S染色情況圖中A為TaAntlpr0驅(qū)動目的基因在煙草地上部養(yǎng)分運輸組織中表達；B為TaAntlpr0 驅(qū)動目的基因在煙草根尖表達；C為非轉(zhuǎn)基因煙草，沒有GUS染色信號。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式實施例中所用試劑如無特別說明均購自上海生工生物工程技術有限公司，所用引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。實施例1 小麥Antiquitin基因啟動子的克隆利用水稻的Antiquitin基因的cDNA序列(序列登錄號AK060757)在 NCBI (National Center for Biotechnology Information) ^ig Φ ^if Blast
檢索到一個小麥Antiquitin基因的cDNA序列(AK330832. 1)，該cDNA全長2109bp，編碼區(qū)1530bp,與水稻Antiquitin基因編碼區(qū)的序列相似性為90 %，小麥Antiquitin基因起始密碼子ATG上游有192bp的5'未翻譯區(qū)，未能檢索到與小麥Antiquitin基因?qū)幕蚪M序列。為得到小麥Antiquitin基因的啟動子序列，把上述小麥Antiquitin cDNA起始密碼子ATG上游的192bp的序列提交到中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所賈繼增老師建立的小麥基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果比上一條長度為22. 6kb的小麥基因組序列，該基因組序列包括有小麥Antiquitin基因的啟動子序列，根據(jù)該序列設計了一對擴增Antiquitin基因啟動子的引物，為便于后續(xù)的重組表達載體的構建，在2個引物的5' 分別添加了不同的酶切位點和保護堿基，具體的引物序列為W-4 ALDH Pl上:AATTAAGC IIGAGCCCGTGCGTTCCTTCCTATCT(下劃線部分為添加的 HindIII 酶切位點，W-4ALDH Pl 下 AATACCCGGGATGGTGGGCGGGTTGGTTCT (下劃線部分為添加的Sma I酶切位點，并在上海生工生物工程)有限公司對這2條引物進行了合成。利用上述引物對小麥品種中國春的基因組DNA進行PCR擴增。采用25 μ 1的反應體系，其中含有 IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 1. 5mMMgCl2,pH 9. 0，每種 dNTP 0. ImM，正反向引物各0. 4 μ M，1. 2UPfu Taq DNA聚合酶和約IOOng的基因組DNA。擴增參數(shù)為94°C 4分鐘，94 V 45秒，65 °C 45秒，72 °C 1.5分鐘，30個循環(huán)，72 °C 7分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，得到1條與設計擴增長度相一致的電泳條帶，對該電泳條帶用天根生化科技(北京)有限公司試劑盒進行純化并將純化產(chǎn)物克隆到該公司的PBS-T克隆載體上，測序后得出，PCR擴增序列與設計引物時參照的小麥基因組序列只有3個堿基的差別， 證實了擴增得到的序列是小麥Antiquitin基因的啟動子序列，該啟動子序列(起始密碼子 ATG的上游序列)長度為1118bp，將其命名為序列表中的SEQ ID NO :1。實施例2 水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(AlaAT)編碼序列的克隆在NCBI數(shù)據(jù)庫中用“rice AlaAT”進行Blast檢索，從中查到一個水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的完整mRNA，其登錄號為AB007405. 1,該序列全長1821bp，其中的編碼區(qū) 1452bp，為獲得該基因完整編碼序列的克隆，在編碼區(qū)的兩端設計了一對引物，為便于后續(xù)載體構建，在引物的5'還分別加上了不同的酶切位點，具體的引物序列為R-Ala P3-1 AATACCCGGGCAACGCTGCCGCTGAATC (下劃線部分為添加的 Sma I 酶切位點)，R-Ala P3-2 -M TTGAGCTCAAAAAGAAGGCCTGGGGAAAATC (下劃線部分為添加的Mc I酶切位點)。用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒從水稻品種中花 11號的根中提取總RNA，并用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的CDNA合成試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以得到的cDNA為模板，用引物組合R-Ala P3-1/R-Ala P3-2進行 PCR 擴增，采用 25 μ 1 的反應體系，其中含有 IOmM Tris-HCl, 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, pH 9. 0，每種dNTP 0. ImM，正反向引物各0.4 μ M，1.2 U Pfu Taq DNA聚合酶和IOng的cDNA。擴增參數(shù)為94°C 4分鐘，94°C45秒，57°C 45秒，72°C 1. 5分鐘，30個循環(huán)，72°C 7分鐘。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳分離，得到1條與目標長度一致的電泳條帶，對該電泳條帶用天根生化科技(北京)有限公司試劑盒進行純化并將純化產(chǎn)物克隆到該公司的PGM-T 克隆載體上進行測序，結(jié)果表明，目的基因的擴增長度為1577bp，與設計擴增長度完全相符，擴增片段的序列與登錄號為AB007405. 1的文獻公布的水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶mRNA的相應序列完全相同。實施例3 由小麥Antiquitin基因啟動子(TaAntlpr0)驅(qū)動的農(nóng)桿菌表達載體的構建用Hind III/EcoR I 對基礎表達載體 pAHC25 (Christensen AH 和 Quail PH, Transgenic Research, 1996,5 :213-218)進行部分雙酶切，回收含有 Ubi-Gus-Nos-Ubi-Bar-Nos元件的大小約71Λ的大片段，然后將其連接到同樣雙酶切的農(nóng)桿菌表達載體pCAMBIA-0390 (基因庫登錄號AF234291. 1)的多克隆位點上，得到標記基因為⑶S抗性篩選基因為BAR的農(nóng)桿菌表達載體pCAMBIA0390-Ubi-Gus，該表達載體大小約13. 91Λ，對此表達載體進一步用Hind ΙΙΙ/Sma I進行部分雙酶切，回收約 11.9kb的大片段，并將其與從含TaAntlpro的pBS_T克隆載體上用同樣雙酶切切下來的 TaAntlpro片段連接，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從單個抗性菌斑中用PCR篩選含有TaAntlpro和 GUS基因的重組表達載體(有的重組表達載體不含GUS基因)，將此重組表達載體命名為 pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus。該表達載體主要用于檢測TaAntlpro驅(qū)動GUS基因表達的部位。為檢驗TaAntlpro在提高植物養(yǎng)分利用效率方面的應用效果，構建了一個以水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AlaAT)為目的基因的表達載體。構建方式是通過Sma I/Sac I雙酶切用水稻的AlaAT基因置換表達載體pCAMBIA0390-TaAntlpro-Gus中的Gus基因。由于在水稻AlaAT編碼基因的中間部位也有一個Me I的酶切位點，為獲得含有完整水稻AlaAT 編碼基因的片段，對含有水稻AlaAT編碼序列的重組pGM-T載體用Sma I/Sac I進行部分雙酶切，回收大小為1. 6kb的DNA片段(該片段即含有完整的水稻AlaAT的編碼序列)，并把該片段連接到同樣雙酶切的pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus載體上，得到⑶S基因被水稻 AlaAT置換的新重組表達載體pCAMBIA0390-TaAntlprO-AlaAT，在該重組表達載體中含有的以TaAntlpro為啟動子的表達盒為TaAntlpro-AlaAT-NOS終止子片段。實施例4 小麥Antiquitin基因啟動子的功能驗證及其應用將重組表達載體pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus 和 pCAMBIA0390_TaAntIpro-AlaAT 用凍融法分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(購自行知生物科技有限公司)中，葉盤法(kience， 1985,227 :1229-1231)轉(zhuǎn)化煙草品種SRl (來源于中國國家種質(zhì)資源庫)，并用5mg/ LBiolaphos進行抗性篩選，轉(zhuǎn)化得到的抗性再生植株分別用GUS和水稻AlaAT基因的引物進行PCR檢測。AlaAT基因PCR檢測的引物及參數(shù)同實施例2 ;GUS基因PCR檢測的引物為 GUS-F :AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAC, GUS-R :ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCG，采用 25 μ 1 的反應體系，其中含有 10mMTris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2, pH 9. 0，每種 dNTP 0. ImM, 正反向引物各0. 4yM，1.2U Taq DNA聚合酶和IOOng的基因組DNA，擴增參數(shù)為94°C 4分鐘，94°C45秒，62°C 45秒，72°C 1. 5分鐘，30個循環(huán)，72°C 7分鐘，預期擴增片段的長度約 11Λ。圖1和圖2給出了兩種基因的部分PCR檢測結(jié)果，擴增片段大小與預期大小相符，說明兩種目的基因都已整合到煙草的基因組中。取部分GUS基因PCR檢測呈陽性的再生植株和部分未轉(zhuǎn)化的對照植株進行GUS染色，結(jié)果在在轉(zhuǎn)基因植株的根尖部位和地上部的輸導組織中可以看到很強的⑶S表達，在部分根毛部位和根系的輸導組織中也能看到一些GUS基因的表達，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照植株沒有檢測到這些信號(圖3)，說明克隆的小麥Antiquitin基因的啟動子具有啟動子的功能，同時還說明該啟動子驅(qū)動目的基因表達的部位具有組織特異性，這些部位與養(yǎng)分的吸收和運輸密切相關。選擇部分轉(zhuǎn)pCAMBIA0390-TaAnt Ipro-Gus 和 pCAMBIA0390-TaAntlpro_AlaAT 且大小一致的陽性轉(zhuǎn)基因幼苗在兩種低氮條件下對其生長情況進行了比較。處理方式為將兩種幼苗均移栽到裝有蛭石的同一個塑料盒中，然后向2個栽有幼苗的塑料盒中分別澆施含 9. 4mM和3mM氮素的營養(yǎng)液，在25°C和16小時光照/8小時黑暗的條件下生長23天后稱取幼苗的鮮重。含9. 4mM氮素的營養(yǎng)液為去掉了硝酸銨的1/2MS無機成分，營養(yǎng)液中未加MS 的有機成分，含3mM氮素的營養(yǎng)液是在上述含9. 4mM氮素營養(yǎng)液的基礎上，進一步把硝酸鉀的濃度降到了 3mM，為使營養(yǎng)液的鉀離子濃度保持不變，在營養(yǎng)液中又添加了 6. 4mM的氯化鉀。處理結(jié)果見表1，在兩種低氮條件下，轉(zhuǎn)pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaAT的幼苗都比轉(zhuǎn) pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus的幼苗生長速度快，在較低的氮素條件下(3mM)，鮮重的差異更加明顯，而且達到了顯著水平。轉(zhuǎn)pCAMBIA0390-TaAntIpro-Gus的幼苗與未轉(zhuǎn)化的對照差異不明顯。說明本發(fā)明確實可以用來提高植物的養(yǎng)分利用效率。表1、轉(zhuǎn)不同基因的煙草植株在兩種低氮條件下生長23天后的鮮重(克)
權利要求
1.一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子，其特征在于堿基序列為序列表中SEQ ID NO 1。
2.一種含有權利要求1所述啟動子的表達盒，其特征在于該表達盒由權利要求1所述的來源于小麥Antiquitin基因的啟動子、編碼目的基因的DNA序列和一個轉(zhuǎn)錄終止的DNA 序列構成；所述來源于小麥Antiquitin基因的啟動子以功能性方式與編碼目的基因的DNA 序列連接，且所述編碼目的基因的DNA序列與一個轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列連接。
3.根據(jù)權利要求2所述的表達盒，其特征在于構建的目的基因為與養(yǎng)分吸收利用相關的基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的表達盒，其特征在于構建的目的基因為與氮代謝相關的水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因。
5.根據(jù)權利要求4所述的表達盒，其特征在于利用該表達盒構建含有來源于小麥 Antiquitin基因的啟動子的重組表達載體。
6.根據(jù)權利要求5所述的表達盒，其特征在于構建的重組表達載體為 pCAMBIA0390-TaAntIpro-AlaATο
7.根據(jù)權利要求1所述的來源于小麥Antiquitin基因的啟動子在提高植物養(yǎng)分利用率方面的用途，其特征在于，用含有來源于小麥Antiquitin基因的啟動子的重組表達載體轉(zhuǎn)化目的植物，獲得養(yǎng)分利用效率提高的轉(zhuǎn)基因植株。
8.根據(jù)權利要求7所述的來源于小麥Antiquitin基因的啟動子在提高植物養(yǎng)分利用率方面的用途，其特征在于，用重組表達載體pCAMBIA0390-TaAntlprO-AlaAT轉(zhuǎn)化煙草葉片，抗性再生植株經(jīng)PCR檢測和不同氮素水平的營養(yǎng)液培養(yǎng)，篩選出氮素利用效率提高的轉(zhuǎn)基因后代。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來源于小麥Antiquitin基因的啟動子及其用途。所述啟動子以功能性方式與編碼目的基因的DNA序列連接，且所述編碼目的基因的DNA序列與一個轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列連接構成表達盒。通過轉(zhuǎn)基因途徑，把所述表達盒導入目的植物中，利用所述啟動子具有在植物根部和地上部養(yǎng)分輸導組織驅(qū)動目的基因表達的功能，可培育養(yǎng)分高效利用的轉(zhuǎn)基因植物尤其是氮素高效利用的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號C12N15/113GK102392023SQ20111041056
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者柴建芳, 武曉晶, 王海波 申請人:河北省農(nóng)林科學院遺傳生理研究所