專利名稱：β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶催化域(Aor Xyn10BC)基因的克隆及表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186菌株的一種新型10家族木聚糖酶催化域(Aor XynlOBC)基因完整cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶催化域基因工程菌的構(gòu)建及重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在自然界中植物細(xì)胞壁是一個(gè)巨大的碳水化合物倉(cāng)庫(kù)，半纖維素約占植物干重的 33%，是除纖維素之外最為豐富的多糖。木聚糖是半纖維素最主要的成分之一，廣泛存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁和胞間層中。木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其主鏈由以β-1，4-糖苷鍵相連的木糖殘基構(gòu)成，當(dāng)主鏈被取代后可形成包含阿拉伯糖、葡糖醛酸、甲基葡糖醛酸、乙?；⑽乎；癙-香豆素等取代基的側(cè)鏈。木聚糖的這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其完全降解需要眾多酶的共同參與才能完成，其中能夠水解木聚糖主鏈的木聚糖酶在整個(gè)水解過(guò)程中起最重要的作用。內(nèi)切 β-1，4- -木聚糖酶(3-l，4-D_endoxylanase，EC 3. 2. 1.8)是木聚糖酶的主要組分之一，它能夠從木聚糖主鏈的內(nèi)部切割β _1，4糖苷鍵形成寡聚木糖和少量木糖。 木聚糖酶在自然界分布很廣，研究較多的是微生物產(chǎn)生的木聚糖酶，已報(bào)道能合成木聚糖酶的微生物有細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母菌等。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析， 可將其分為不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。目前木聚糖酶已在造紙、食品、能源、飼料以及環(huán)境等領(lǐng)域體現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值，雖然每年都有數(shù)目龐大的新的木聚糖酶被發(fā)現(xiàn)，但實(shí)際上大多數(shù)微生物中木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)量都不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。而隨著基因工程的發(fā)展，運(yùn)用分子生物學(xué)方法對(duì)木聚糖酶進(jìn)行改造將加速木聚糖酶在各領(lǐng)域中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型10家族木聚糖酶催化域cDNA序列的克隆和分析， 木聚糖酶催化域基因工程菌的構(gòu)建及重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，為該基因的異源高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)，也為其他木聚糖酶研究奠定基礎(chǔ)。根據(jù)Bernard Henrissat等提出的糖苷水解酶分類法，絕大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶第10和11家族。生物信息學(xué)分析表明該基因所編碼的木聚糖酶屬于A.0ryZae CICC 40186中發(fā)現(xiàn)的一種10家族木聚糖酶的催化域，命名為iVor XynlOBC，其相應(yīng)的基因命名為iVor xynlOBC.本發(fā)明的技術(shù)方案一種來(lái)源于A. oryzae CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因(Aor xynlOBC)，其 cDNA 序列為 SEQ ID NO :1。所述的由cDNA推導(dǎo)的iVor XynlOBC氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組木聚糖酶的活性測(cè)定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 4. 6、檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制的質(zhì)量
3濃度為0.5%的樺木木聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C預(yù)熱lOmin，在A管中加入0. ImL 適當(dāng)稀釋的酶液，50°C準(zhǔn)確反應(yīng)15min;立即各加入2. 5mL 3' ,5' - 二硝基水楊酸(DNS) 試劑，在B管中再補(bǔ)加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻； 540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的還原糖 (以木糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生 1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)木聚糖酶活性單位(IU)。所述的iVor xynlOBC cDNA序列的克隆和表達(dá)方法(I)Aor xynlOBC cDNA序列的克隆基于我們申請(qǐng)的《β _1，4-內(nèi)切木聚糖酶 (Aor XynlOB)基因的克隆及序列分析》及預(yù)測(cè)的催化域，設(shè)計(jì)兩條引物XynlOBC-Fl和 XynlOBC-Rl Xyn 10BC-F1 5' -GAGCTGGTCTGCATGACGC-3‘Xyn 10BC-R1 5' -CAAAACCTCCAAAATGCC-3‘提取A.oryzae CICC 40186 的總 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與 PUCm-T載體連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序，得到 Aor xynlOBC cDNA 序列。(2)含編碼iVor XynlOBC成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基于上述得到的^Vor xynlOBCcDNA序列以及預(yù)測(cè)的催化域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物Xynl0BC_F。和XynlOBC-R。，擴(kuò)增成熟肽
基因XynlOBC-F0 5' -CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3‘，含 Xho I 酶切位點(diǎn)XynlOBC-R0 5' -GCGGCCGCCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和Xynl0BC_F。為引物進(jìn)行第一輪PCR ；以XynlOBC-F。和XynlOBC-I 。為引物進(jìn)行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用 1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉(zhuǎn)化 JM109,經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的pUCm-T-xynlOBC與一種改造的pPIC9KM質(zhì)粒均用Xho I和 Not I進(jìn)行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒 pPIC9KM-xynlOBC(圖1)，并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(9)GS115/xynlOBC重組子的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Ml I對(duì) pPIC9KM-xynlOBC進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/XynlOBC;按照手冊(cè)上的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用DNS法測(cè)定重組木聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，獲得了電泳純的重組木聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種新型10家族木聚糖酶基因cDNA序列的克隆及分析，木聚糖酶工程菌GS115/XynlOBC的構(gòu)建，以其重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，為該基因的異源高效表達(dá)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明來(lái)源于米曲霉CICC 40186的該木聚糖酶催化域?qū)儆谔擒账饷傅?0家族，命名為^Vor XynlOBC，其相應(yīng)的基因命名為iVor xynlOBC。Aor XynlOBC具有較好的pH穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1 重組質(zhì)粒pPIC9KM_xynlOBC的構(gòu)建示意圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例IAor xynlOBC cDNA序列的克隆以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 禾口 XynlOBC-Fl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR 擴(kuò)增(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s, 51 °C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)，以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為引物進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增 (940C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，51°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉(zhuǎn)化JM109， 經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。實(shí)施例2含編碼木聚糖酶催化域成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以O(shè)ligo dT-Adaptor Primer為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4 和 XynlOBC-Fl 為引物進(jìn)行第一輪 PCR (94 "C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94 "C 30s,51 "C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)；以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為引物第二輪PCR(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，51°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-xynlOBC)，轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序正確的pUCm-T-xynlOBC與pPIC9KM質(zhì)粒均用Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在iMDNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9KM-XynlOBC， 并對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。實(shí)施例3 GS115/xynlOBC的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用Ml I對(duì)pPIC9KM-xynlOBC進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/xynlOBC。該工程菌用0. 5%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá)20IU/mL。離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-S印harose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為50kDa。該重組木聚糖酶最適作用溫度60°C，在溫度50°C以下穩(wěn)定；最適作用pH 5. 5，在 pH 4.0 7. 5穩(wěn)定。
權(quán)利要求
1.一種源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、歸屬于糖苷水解酶第10家族的新型木聚糖酶催化域基因，其cDNA的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO :1。
2.如權(quán)利要求1所述的新型木聚糖酶催化域(AorXynlOBC)，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
3.A. oryzae CICC 40186 Aor xynlOBC cDNA 序列的獲取方法基于我們申請(qǐng)的《β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(Aor XynlOB)基因的克隆及序列分析》及預(yù)測(cè)的催化域，設(shè)計(jì)兩條引物XynlOBC-Fl和XynlOBC-Rl XynlOBC-Fl 5' -GAGCTGGTCTGCATGACGC-3‘XynlOBC-Rl 5' -CAAAACCTCCAAAATGCC-3‘以 A. orvzae CICC 40186 總 RNA 為模板，Oligo dT-Adaptor Primer 為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和XynlOBC-Fl為引物進(jìn)行第一輪PCR(94°C 2min ； 30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s,51°C 30s, 72°C 90s ；72°C IOmin)；以 XynlOBC-Fl 和 XynlOBC-Rl 為弓丨物進(jìn)行第二輪 PCR(94°C 2min ;30 個(gè)循環(huán)，94°C 30s，51°C 30s，72°C Imin ； 72 °C IOmin)；目的條帶經(jīng)克隆、測(cè)序得到Aor xynlOBC cDNA序列。
4.A. oryzae CICC 40186木聚糖酶催化域基因工程菌的構(gòu)建和表達(dá)方法(1)構(gòu)建含編碼AorXynlOBC成熟肽基因的表達(dá)質(zhì)粒基于上述得到的木聚糖酶催化域基因cDNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物XynlOBC-F。和XynlOBC-R。，獲得已去除信號(hào)肽基因序列的催化域成熟肽基因XynlOBC-F0 5' -CTCGAGAAAAGAGCTGGTCTGCATGACGC-3 ‘，含 Xho I 酶切位點(diǎn)XynlOBC-R0 5' -GCGGCCGCTTACAAAACCTCCAAAATGCC-3 ‘，含 Not I 酶切位點(diǎn)以合成的cDNA第一條鏈為模板，M13 Primer M4和XynlOBC-F。為引物進(jìn)行第一輪 PCR(94 °C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C 90s ；72 °C IOmin)；以 XynlOBC-F。 和 XynlOBC-R。為引物第二輪 PCR(94°C 2min ；30 個(gè)循環(huán)，94 °C 30s, 51 °C 30s, 72 °C Imin ； 72°C IOmin)；將第二輪PCR的目的條帶進(jìn)行克隆、測(cè)序；測(cè)序正確的pUCm-T-xynlOBC與一種改造后的pPIC9KM質(zhì)粒均用Bio I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9KM-XynlOBC，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定；(2)GS115/xynlOBC的構(gòu)建、表達(dá)、產(chǎn)物純化及活性測(cè)定用MlI對(duì)pPIC9KM_xynlOBC 進(jìn)行線性化，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子 GS115/xynlOBC ；該工程菌用0. 5%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測(cè)得發(fā)酵液中重組木聚糖酶活性達(dá) 20IU/mL ；離心上清液為重組木聚糖酶粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過(guò)濾層析純化，純化后經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，并顯示重組木聚糖酶分子量為50kDa。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186的新型10家族木聚糖酶催化域基因cDNA序列的克隆及分析、質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。生物信息學(xué)分析表明該木聚糖酶催化域?qū)儆谔擒账饷傅?0家族，命名為Aor Xyn10BC，其氨基酸序列為SEQ ID NO2，相應(yīng)的基因命名為Aor xyn10BC。這為該基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。本發(fā)明還公開(kāi)了木聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組木聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法。作為一種新型酶制劑，該木聚糖酶具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為其它木聚糖酶的研究奠定了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102492707SQ20111041039
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者劉曉彤, 李劍芳, 殷欣, 羅秋玲, 鄔敏辰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)