專利名稱：賴氨酰氧化酶和loxl2的催化結構域的制作方法
技術領域：
本申請涉及酶學和分子生物學領域。
背景技術：
結締組織提供構架使身體的細胞和器官駐留其中。脊椎動物中結締組織的主要成分是胞外基質。胞外基質的兩種主要結構組分是多糖和纖維狀蛋白，多糖形成膠狀基質，而纖維狀蛋白包埋在所述基質中。這些纖維狀蛋白中最常見的兩種是膠原蛋白和彈性蛋白。膠原蛋白纖維由膠原纖維的自締合形成，膠原纖維自身通過三螺旋膠原分子的交聯(lián)而形成。這種交聯(lián)由賴氨酰氧化酶(LOX)和相關酶(“賴氨酰氧化酶樣”或“L0XL”)催化，所有這些酶都含有催化域使賴氨酸和羥賴氨酸殘基的e-氨基團脫氨導致肽基賴氨酸轉化成肽基-a -氨基己二酸-S -半醛(醛賴氨酸)。醛賴氨酸殘基能彼此自發(fā)縮合，導致膠原分子的交聯(lián)。胞外基質在多種病理(包括，例如纖維化和轉移)中的作用已日益突出。參見例如，WO 01/83702(2001 年 11 月 8 日)；W0 2004/047720(2004 年 6 月 10 日)；WO 2007/126457(2007 年 8 月 11 日)；US 2006/0127402(2006 年 6 月 15 日)；US2007/0225242(2007 年 9 月 27 日)；US 2009/0053224(2009 年 2 月 26 日)；US2009/0104201(2009 年 4 月 23 日);Csiszar (2001)Prog. Nucleic Acid Res. and Molec.Biol. 70 :1-32 ;Kirschmann 等(2002) Cancer Research 62:4478-4483。由于賴氨酸氧化酶和賴氨酰氧化酶樣酶在胞外基質形成中通過交聯(lián)膠原起關鍵作用，它們代表了重要的治療靶標。因此，需要篩選這些膠原交聯(lián)酶的抑制劑的方法，鑒定結合這些酶的分子的方法，以及用于不同治療用途(例如，傷口愈合)的膠原交聯(lián)活性的來源。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供來自人和小鼠的賴氨酰氧化酶(LOX)和賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)酶的分離的催化域，以及編碼這些催化域的核酸。因此，提供下列肽以及編碼這些肽的核酸人LOX催化域，人L0XL2催化域，鼠LOX催化域和鼠L0XL2催化域。因此，本發(fā)明提供I.包含人賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO 1)2.包含編碼人賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ ID NO 2)3.包含人賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO 3)
4.包含編碼人賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQID NO 4)5.包含鼠賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO 5)6.包含編碼鼠賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQ ID NO 6)7.包含鼠賴氨酰氧化酶樣2(L0XL2)催化域的氨基酸序列的多肽。(SEQ ID NO 7)8.包含編碼鼠賴氨酰氧化酶樣2(L0XL2)催化域的核苷酸序列的多核苷酸。(SEQID NO 8)還提供Ia.包含如本文所述(SEQ ID NO 1)人賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分 氨基酸序列，而不含人LOX催化域外序列的多肽。2a.所含核苷酸序列編碼如本文所述(SEQ ID NO 2)人賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分，而不編碼人LOX催化域外序列的多核苷酸。3a.包含如本文所述(SEQ ID NO 3)人賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的全部或部分氨基酸序列，而不含人L0XL2催化域外序列的多肽。4a.所含核苷酸序列編碼如本文所述(SEQ ID NO 4)人賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的全部或部分，而不編碼人L0XL2催化域外序列的多核苷酸。5a.包含如本文所述(SEQ ID NO 5)鼠賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分氨基酸序列，而不含鼠LOX催化域外序列的多肽。6a.所含核苷酸序列編碼如本文所述(SEQ ID NO 6)鼠賴氨酰氧化酶(LOX)催化域的全部或部分，而不編碼鼠LOX催化域外序列的多核苷酸。7a.包含如本文所述(SEQ ID NO 7)鼠賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的全部或部分氨基酸序列，而不含鼠L0XL2催化域外序列的多肽。8a.所含核苷酸序列編碼如本文所述(SEQ ID NO 8)鼠賴氨酰氧化酶樣2 (L0XL2)催化域的全部或部分，而不編碼鼠L0XL2催化域外序列的多核苷酸。還提供包含前述核酸和/或多核苷酸的表達載體。這些表達載體可選含有啟動子(例如，T7啟動子、T3啟動子、SP6啟動子、大腸桿菌(E. coli) RNA聚合酶啟動子、CMV啟動子、SV40啟動子、PGK啟動子、EF-I a啟動子)，轉錄終止信號(例如，SV40終止信號)，剪接位點(例如，SV40剪接位點、￠-珠蛋白剪接位點)，核糖體結合位點，信號序列(例如，免疫球蛋白K信號序列)，表位標簽(例如，myc)，純化標簽(例如，His6),復制起點和藥物選擇標記。本文公開的表達載體中也可有編碼接頭氨基酸和/或包含限制性酶識別位點的接頭序列，或任何其它類型的接頭序列。因此，本發(fā)明還提供9. 一種多肽，其包含人LOX催化域的全部或部分氨基酸序列，不含人LOX催化域外氨基酸序列，還含有信號序列、表位和His6純化標簽中的一種或多種；例如，包含信號肽、人LOX催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的多肽(如SEQ ID NO :9)。10.編碼實施方式9所述多肽的多核苷酸；例如，包含編碼信號肽、人LOX催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的序列的多核苷酸(如SEQ ID NO 10)。11.包含實施方式10所述多核苷酸的表達載體。
12.如實施方式11所述的表達載體,還包含啟動子、藥物篩選標記和復制起點中任一種、任意組合或其全部。13. 一種多肽，其包含人L0XL2催化域的全部或部分氨基酸序列，不含人L0XL2催化域外氨基酸序列，還含有信號序列、表位標簽和His6純化標簽中的一種或多種；例如，包含信號序列、人L0XL2催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的多肽(如SEQ ID NO 11)。14.編碼實施方式13所述多肽的多核苷酸；例如，包含編碼信號序列、人L0XL2催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的序列的多核苷酸(如SEQ ID NO : 12)。15.包含實施方式14所述多核苷酸的表達載體。16.如實施方式15所述的表達載體,還包含啟動子、藥物篩選標記和復制起點中任一種、任意組合或其全部。17. 一種多肽，其包含鼠LOX催化域的全部或部分氨基酸序列，不含鼠LOX催化域、外氨基酸序列，還含有信號序列、表位和His6純化標簽中的一種或多種；例如，包含信號序列、鼠LOX催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的多肽(如SEQ ID NO : 13)。18.編碼實施方式17所述多肽的多核苷酸；例如，包含編碼信號序列、鼠LOX催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的序列的多核苷酸(如SEQ ID NO 14)。19.包含實施方式18所述多核苷酸的表達載體。20.如實施方式19所述的表達載體,還包含啟動子、藥物篩選標記和復制起點中任一種、任意組合或其全部。21. 一種多肽，其包含鼠L0XL2催化域的全部或部分氨基酸序列，不含鼠L0XL2催化域外氨基酸序列，還含有信號序列、表位標簽和His6純化標簽中的一種或多種；例如，包含信號序列、鼠L0XL2催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的多肽(如SEQ ID NO 15)。22.編碼實施方式21所述多肽的多核苷酸；例如，包含編碼信號序列、鼠L0XL2催化域、myc表位標簽和His6純化標簽的序列的多核苷酸(如SEQ ID NO 16)。23.包含實施方式22所述多核苷酸的表達載體。24.如實施方式23所述的表達載體,還包含啟動子、藥物篩選標記和復制起點中任一種、任意組合或其全部。附圖
簡要說明圖I顯示由轉染了 phLOXMCD表達載體的HEK293細胞表達人賴氨酰氧化酶(hLOX)蛋白的催化域。顯示通過免疫印跡分析6株穩(wěn)定轉染的細胞系(編號23至28)。左圖顯示含各獲自所述6株細胞系的未稀釋生長培養(yǎng)基(凈CM)樣品(15ul)的聚丙烯酰胺凝膠的免疫印跡。中圖顯示可溶性胞內物質的分析，而右圖顯示不溶性胞內物質的分析。對于這些圖，各泳道含有來自約IO5個細胞的物質。所有印跡用小鼠抗-His5 —抗探測，然后與HRP偶聯(lián)驢抗小鼠二抗反應。HRP活性用Chemi-Glow. 試劑(阿爾法新技術公司(AlphaInnotech)，加利福尼亞州圣萊安德羅)顯示。加工后催化域的預測分子量為26. 9kD。各圖中標為“ + ”的泳道包括含His6序列的蛋白，用作抗-His5抗體的陽性對照。圖2顯示轉染了 phL0XL2MCD表達載體的HEK293細胞表達人賴氨酰氧化酶樣2(hL0XL2)蛋白的催化域。左圖顯示一些穩(wěn)定轉染細胞系(由各泳道頂部數(shù)字標示)的全細胞裂解液的免疫印跡，各泳道含有來自約IxlO5個細胞的物質。右圖顯示含各獲自六個細胞系(由數(shù)字標示)的未稀釋生長培養(yǎng)基(15 U I凈CM)樣品的聚丙烯酰胺凝膠免疫印跡。所有印跡用小鼠抗-His5 —抗探測，然后與HRP偶聯(lián)驢抗小鼠二抗反應。HRP活性用Chemi-Glow 試劑(阿爾法新技術公司，加利福尼亞州圣萊安德羅)顯示。加工后催化域的預測分子量為31kD。左圖中標為“ + ”的泳道包括含His6序列的蛋白，用作抗-His5抗體的陽性對照。圖3顯示由轉染了 pmLOXMCD表達載體的HEK293細胞表達鼠賴氨酰氧化酶(mLOX)蛋白的催化域。顯示通過免疫印跡對5株穩(wěn)定轉染細胞系(編號為4、9、12、18和19)的分析。左圖顯示含各獲自6株細胞系的未稀釋生長培養(yǎng)基(凈CM)樣品(15ul)的聚丙烯酰胺凝膠的免疫印跡。右圖顯示對這6株中5株的可溶性和不溶性胞內部分的分析，各泳道含有來自約IO5個細胞的物質。所有印跡用小鼠抗-His5 —抗探測，然后與HRP偶聯(lián)驢抗小鼠二抗反應。HRP活性用Chemi-Glow 試劑(阿爾法新技術公司，加利福尼亞州圣萊安德羅)顯示。加工后催化域的預測分子量為27kD。圖4顯示人和鼠LOX催化域在分泌和氨基酸序列上的差異。詳見實施例10。
圖5顯示分離的人L0XL2催化域在Amplex Red試驗中的試齒靈(resorufin)生成時程(由590nm的吸光度測定)。詳見實施例12。圖6顯示本發(fā)明中各種多肽的氨基酸序列的比對，包括衍生自人(hLOX、hLOXLl、hL0XL2等)和小鼠(mLOX和mL0XL2)的多肽。氨基酸殘基的編號在所示的最N-末端殘基處始于“1”，且不必與本領域常規(guī)一致。星號表示所有顯示的多肽在該位置的氨基酸均相同，冒號“”表示保守性氨基酸取代，而單點”表示半保守性氨基酸取代，均按照歐洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)提供的 ClustalW2 程序。圖7顯示本發(fā)明中各種多肽的氨基酸序列的比對，僅包括衍生自人的那些多肽。編號和圖例與圖6所用相同。發(fā)明詳述除非另有說明，本文的實施采用細胞生物學、毒理學、分子生物學、生物化學、細胞培養(yǎng)、免疫學、腫瘤學、重組DNA領域和相關領域中的標準方法和常規(guī)技術，所述方法和技術在本領域技術范圍內。這些技術描述于文獻中并因而本領域技術人員可用。參見例如Alberts, B.等“Molecular Biology of the Cell (《細胞分子生物學》)”,第5版,紐約州紐約市的加蘭德科學出版社(Garland Science), 2008 ；Voet, D.等“Fundamentalsof Biochemistry Life at the Molecular Level (《基礎生物化學分子水平的生命》)”第3版,新澤西州霍博肯的約翰威利出版社(John WiIey&Sons), 2008 ;Sambrook, J.等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual (《分子克隆實驗室手冊》)”第3版,冷泉港實驗出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2001 ；Ausubel, F.等，“CurrentProtocols in Molecular Biology (《新編分子生物學實驗指南》)”紐約的約翰威利出版社，1987,定期更新；Freshney, R. I. , “Culture of Animal Cells A Manual of BasicTechnique (《動物細胞培養(yǎng)基本技術手冊》)”第4版，新澤西州薩默塞特的約翰威利出版社,2000 ,Methods in Enzymology (《酶學方法》)”叢書,加利福尼亞州圣地亞哥的學術出版社(Academic Press)。賴氨酰氧化酶型酶本文所用術語“賴氨酰氧化酶型酶”或“賴氨酰氧化酶”指含催化域催化賴氨酸和羥賴氨酸殘基的e -氨基氧化脫氨的蛋白家族成員，該氧化脫氨導致肽基賴氨酸轉變成肽基-a -氨基己二酸-S -半醛(醛賴氨酸)并釋放化學計量量的氨和過氧化氫
權利要求
1.包含人LOX(SEQID NO :1)催化域的氨基酸序列的多肽，所述多肽不含有位于人LOX催化域外的序列。
2.包含編碼權利要求I所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:2所示的核苷酸序列。
4.包含人L0XL2(SEQID NO :3)催化域的氨基酸序列的多肽，所述多肽不含有位于人L0XL2催化域外的序列。
5.包含編碼權利要求4所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
6.如權利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:4所示的核苷酸序列。
7.包含鼠L0X(SEQID NO :5)催化域的氨基酸序列的多肽，所述多肽不含有位于鼠LOX催化域外的序列。
8.包含編碼權利要求7所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
9.如權利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID NO 6所示的核苷酸序列。
10.包含鼠L0XL2(SEQID NO :7)催化域的氨基酸序列的多肽，所述多肽不含有位于鼠L0XL2催化域外的序列。
11.包含編碼權利要求10所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
12.如權利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:8所示的核苷酸序列。
13.包含信號序列、人LOX的催化域、表位標簽和純化標簽的多肽，所述多肽不含有位于人LOX催化域外的序列。
14.如權利要求13所述的多肽，其特征在于，所述信號序列是免疫球蛋白K信號序列。
15.如權利要求13所述的多肽，其特征在于，所述表位標簽是myc標簽。
16.如權利要求13所述的多肽，其特征在于，所述純化標簽是His6標簽。
17.如權利要求13所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQID N0:9中所示序列。
18.包含編碼權利要求13所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
19.如權利要求18所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:10所示的核苷酸序列。
20.包含權利要求18所述多核苷酸的表達載體。
21.包含權利要求19所述多核苷酸的表達載體。
22.包含信號序列、人L0XL2的催化域、表位標簽和純化標簽的多肽，所述多肽不含有位于人L0XL2催化域外的序列。
23.如權利要求22所述的多肽，其特征在于，所述信號序列是免疫球蛋白K信號序列。
24.如權利要求22所述的多肽，其特征在于，所述表位標簽是myc標簽。
25.如權利要求22所述的多肽，其特征在于，所述純化標簽是His6標簽。
26.如權利要求22所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQID NO=Il中所示序列。
27.包含編碼權利要求22所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
28.如權利要求27所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:12所示的核苷酸序列。
29.包含權利要求27所述多核苷酸的表達載體。
30.包含權利要求28所述多核苷酸的表達載體。
31.包含信號序列、鼠LOX的催化域、表位標簽和純化標簽的多肽，所述多肽不含有位于鼠LOX催化域外的序列。
32.如權利要求31所述的多肽，其特征在于，所述信號序列是免疫球蛋白K信號序列。
33.如權利要求31所述的多肽，其特征在于，所述表位標簽是myc標簽。
34.如權利要求31所述的多肽，其特征在于，所述純化標簽是His6標簽。
35.如權利要求31所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQID NO 13中所示序列。
36.包含編碼權利要求31所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
37.如權利要求36所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:14所示的核苷酸序列。
38.包含權利要求36所述多核苷酸的表達載體。
39.包含權利要求37所述多核苷酸的表達載體。
40.包含信號序列、鼠L0XL2的催化域、表位標簽和純化標簽的多肽，所述多肽不含有位于鼠L0XL2催化域外的序列。
41.如權利要求40所述的多肽，其特征在于，所述信號序列是免疫球蛋白K信號序列。
42.如權利要求40所述的多肽，其特征在于，所述表位標簽是myc標簽。
43.如權利要求40所述的多肽，其特征在于，所述純化標簽是His6標簽。
44.如權利要求40所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列為SEQID NO 15中所示序列。
45.包含編碼權利要求40所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
46.如權利要求45所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有SEQID N0:16所示的核苷酸序列。
47.包含權利要求45所述多核苷酸的表達載體。
48.包含權利要求46所述多核苷酸的表達載體。
全文摘要
本文公開了人和小鼠的LOX和LOXL2蛋白的分離催化域的氨基酸序列和編碼核苷酸序列。還提供了這些分離催化域的制備方法和用途。
文檔編號C07K14/435GK102712683SQ201080047979
公開日2012年10月3日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權日2009年8月21日
發(fā)明者S·麥克考雷, V·史密斯 申請人:吉聯(lián)亞生物科技有限公司