專利名稱：：用于調(diào)節(jié)止血的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和血液學(xué)的領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明提供一種新型凝血因子X/Xa藥物和使用該藥物來調(diào)節(jié)需要該治療的患者中凝血級聯(lián)的方法。
背景技術(shù)：
：說明書通篇引用了若干出版物和專利文獻(xiàn)以便描述本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的狀態(tài)。這些引用文獻(xiàn)中的每個引用文獻(xiàn)以引用的方式結(jié)合在本文中，如同其在本文中全文列出。凝血的酶為胰蛋白酶樣酶，胰蛋白酶樣酶屬于具有糜蛋白酶樣折疊的蛋白酶的Sl肽酶家族。凝血蛋白酶含有彼此高度同源且與消化的祖絲氨酸蛋白酶高度同源的催化域。結(jié)構(gòu)同源性/一致性如此之大(>70%)以致凝血酶的催化域中的殘基根據(jù)胰凝乳蛋白酶原中的相應(yīng)殘基來進(jìn)行編號。凝血酶作為無活性前體(酶原)在血液中循環(huán)，其需要蛋白水解裂解來激活。與激活后所產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶相比，酶原具有大約10,000倍或更小的蛋白水解活性。在血管損傷位點(diǎn)啟動凝血導(dǎo)致一系列的反應(yīng)，其中酶原通過特異蛋白水解裂解而轉(zhuǎn)化成蛋白酶并且形成用于連續(xù)反應(yīng)的酶。這使血細(xì)胞激活，使可溶纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不可溶的纖維蛋白，從而形成凝塊。通過與用作"自殺"底物的循環(huán)蛋白酶抑制劑或那些識別活性酶的蛋白酶抑制劑起反應(yīng)來移除過量蛋白酶。因此，凝血酶原的蛋白水解激活是凝血級聯(lián)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)特點(diǎn)。雖然凝血酶原中的某些在它們各自的激活反應(yīng)中在兩個或兩個以上的位點(diǎn)裂解，但形成蛋白酶需要在單個位點(diǎn)裂解。在這個位點(diǎn)的裂解和其結(jié)構(gòu)結(jié)果(structuralconsequence)被認(rèn)為使用基于胰凝乳蛋白酶原的同源編號系統(tǒng)和利用胰蛋白酶原和胰蛋白酶所進(jìn)行的廣泛結(jié)構(gòu)工作是最容易做到的方式。酶原到絲氨酸蛋白酶的轉(zhuǎn)化需要在Arg"(通常為Arg"與lie"之間的鍵)后面的裂解，這通常移除激活肽并暴露始于11e"的催化域中的新的N末端。一個實(shí)例為因子X到因子Xa(參看圖1和圖2)的轉(zhuǎn)化。在胰蛋白酶和因子Xa中，新的N末端序列始于l6-Vall7-Gly18-GV9。對于其它凝結(jié)酶，新的N末端序列是在同一主題上的變化。然后N末端序列折回到催化域內(nèi)且以序列特異性方式插入到n末端結(jié)合裂縫內(nèi)，這被稱作"分子性欲(molecularsexuality)"。參看圖2。因此，具有交替N末端序列的變異體不太可能以相當(dāng)?shù)姆绞浇?jīng)歷分子性欲。N末端插入導(dǎo)致在催化域的內(nèi)部在11e"的a-NH2基與Asp^之間形成鹽橋。鹽橋的形成與催化域結(jié)構(gòu)中的許多變化相關(guān)聯(lián)，這些變化包括所謂的激活域的重新排列(在圖3中顯示出)；形成催化作用所需的氧陰離子孔和形成底物結(jié)合位點(diǎn)。這些變化導(dǎo)致活性絲氨酸蛋白酶的成熟。新N末端通過分子性欲和鹽橋形成對活性蛋白酶成熟的序列特異性相互作用的關(guān)鍵貢獻(xiàn)通過以下事實(shí)顯而易見不需要裂解而激活的細(xì)菌蛋白酶利用催化域內(nèi)的另一側(cè)鏈來與Asp飄形成鹽橋；胰蛋白酶原可被激活成蛋白酶樣構(gòu)象，無需裂解但是要在非常高的插入到該裂縫內(nèi)的Ile-Val二肽濃度的情況下，盡管效率非常低；Val-Ile二肽和其它變異體的效率更低；此外，存在這樣的細(xì)菌蛋白質(zhì)的兩個實(shí)例，這些細(xì)菌蛋白質(zhì)經(jīng)由提供插入到該N末端結(jié)合裂縫內(nèi)的它們自身的N末端而破壞激活機(jī)制從而在不存在裂解的情況下激活凝血酶原。上文所概述的結(jié)構(gòu)變化為前體酶原轉(zhuǎn)化為活性絲氨酸蛋白酶提供了分子解釋。然而，與在Arg's裂解后完全激活的胰蛋白酶不同，許多凝血酶對它們的蛋白質(zhì)底物的作用非常差。雖然它們通常具有完全起作用的活性位點(diǎn)且可裂解小肽基底物，但生物底物的有效裂解常常需要輔因子蛋白質(zhì)(圖2)。在這些情況下，輔因子蛋白質(zhì)增加蛋白質(zhì)底物裂解速率數(shù)千倍。雖然尚不清楚輔因子蛋白質(zhì)起作用的機(jī)制，但它們不太可能通過使蛋白酶更類似酶且因此更加有效來起作用。關(guān)鍵點(diǎn)在于(有一個例外)輔因子選擇性地結(jié)合蛋白酶而不是相應(yīng)的酶原。舉例說來，因子Xa以高親和力與膜結(jié)合FVa結(jié)合，而酶原因子X并不結(jié)合FVa。取決于患者的狀態(tài)，可能需要研發(fā)改變的凝血級聯(lián)蛋白質(zhì)，其具有增強(qiáng)的或減弱的凝血功能。本發(fā)明的目的在于提供這種蛋白質(zhì)用作治療藥。發(fā)明概要根據(jù)本發(fā)明，提供影響FX酶原—蛋白酶轉(zhuǎn)變途徑中的調(diào)節(jié)位點(diǎn)從而驅(qū)動更加"酶原樣"FXa種類產(chǎn)生的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法有效地調(diào)節(jié)需要該治療的患者的止血。在一個實(shí)施方案中，提供調(diào)節(jié)止血的變異因子X/因子Xa酶原/蛋白酶。優(yōu)選地，該變異酶原蛋白酶由SEQIDNO:2編碼，其中SEQIDNO:2的核苷酸1684-1695可為任何氨基酸，限制條件為核苷酸1684-]686不編碼Val或Ala。更優(yōu)選地，變異酶原/蛋白酶在SEQIDNO:1中含有選自下列各修飾的至少一種修飾a)在位置16的lie為Leu、Phe、Asp或Gly;b)在位置17的Val為Leu、Ala或GIy;以及c)在位置194的Asp為Asn或Glu。還公開了編碼本發(fā)明的變異酶原/蛋白質(zhì)的核酸以及其使用方法。這些核苷酸可任選編碼細(xì)胞內(nèi)PACE/弗琳蛋白酶裂解位點(diǎn)。在又一實(shí)施方案中，核酸具有序列SEQIDNO:2，其中在位置1684-1695的核苷酸編碼選自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、lie-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly的氨基酸，所述核酸任選包含在位置2233-2235的核苷酸，其編碼選自Asn和Glu的氨基酸。還提供了在生物相容載體中包含本發(fā)明的因子Xa變異體的藥用組合物。本發(fā)明.的另一優(yōu)選方面包括治療需要該治療的患者的與止血相關(guān)的疾病的方法，該方法包括給予本文所述的治療上有效量的含有變異因子X/Xa酶原/蛋白酶的藥用組合物。這些方法應(yīng)在治療需要前凝血劑的疾病上具有功效，且這些疾病包括，但不限于，血友病A和B，與抑制劑抗體相關(guān)聯(lián)的血友病A和B,凝血因子缺乏癥，維生素K環(huán)氧化物還原酶CI缺乏癥，y羧化酶缺乏癥，與外傷、損傷、血栓形成、血小板減少、中風(fēng)、凝血病、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)相關(guān)聯(lián)的出血，過度抗凝血治療疾病，伯-蘇綜合征，Glanzman血小板無力癥(Glanzmanthromblastemia)以及貯存'池缺4員(storagepooldeficiency)。某些酶原/蛋白酶變異體可適用于治療需要抗凝血的疾病。這些疾病包括(但不限于)血栓形成、血小板減少、中風(fēng)以及凝血病。本發(fā)明的另一方面包括表達(dá)本發(fā)明的變異酶原/蛋白酶的宿主細(xì)胞以便產(chǎn)生大量的本發(fā)明的變異酶原/蛋白酶。還公開了分離的和純化酶原蛋白酶變異體的方法。附圖簡述圖1。因子X的加工。合成因子X，其帶有在其分泌前被除去的信號序列和前肽。因子X是酶原且不具有酶活性。在Argl5-Ilel6鍵裂解釋放激活肽(AP)后FX被轉(zhuǎn)化成因子Xa。圖2。酶原轉(zhuǎn)化為蛋白酶。因子X的酶原轉(zhuǎn)化為蛋白酶和因子Xa組裝進(jìn)凝血酶原酶(FXa、FVa、磷脂以及4丐離子)。這種酶將凝血酶原(II)轉(zhuǎn)化成凝血酶(IIa)。圖3。FXa的X射線結(jié)構(gòu)。標(biāo)準(zhǔn)取向的FXa的催化域。對結(jié)構(gòu)區(qū)以及重要?dú)埢幼⑨?。取自Brandstetter等人(19%)J.Biol.Chem.271:29988-29992。圖4。FX/Xa變異體的SDS-PAGE分析。4%-12%SDS-PAGE凝膠在非還原態(tài)或還原態(tài)下進(jìn)行電泳試驗(yàn)，然后用考馬斯亮藍(lán)染色。圖5。因子Xa的氨基酸(SEQIDNO:l)和核酸(SEQIDNO:2)序列。以粗體顯示出SEQI:DNO:1中所需修飾的位點(diǎn)和氨基酸位置。圖6。血友病B血漿中因子Xa活性。野生型FXa或FXall6L(2nM)被添加到血友病B血漿且在選定時間間隔稀釋樣品(O.ln.M)并在aPTT凝結(jié)測定中進(jìn)行測定。圖7。aPTT的校正。因子Xa-I16L(200嗎/kg;n=7小鼠)或PBS(n=4小鼠)經(jīng)尾靜脈注射到血友病B小鼠(C57BL)內(nèi)。在注射后5分鐘和30分鐘，收集血液并且執(zhí)行aPTT測定。紅色點(diǎn)線表示正常C57Bl/6動物的aPTT值。圖8。在血友病B小鼠中進(jìn)^f亍尾截割測定后的止血評價。損傷后利用A525用生理鹽水溶液的血紅蛋白含量來測量血液損失。小鼠(Balbc)的數(shù)目為野生型(n-7);HB-PBS(n=6);以及HB-FXall6L(n=7)。發(fā)明詳述蛋白水解是凝血的重要方面且是調(diào)節(jié)正常止血的機(jī)制中的許多機(jī)制的基礎(chǔ)。前輔因子(Procofactor)和酶原不能在很大程度上參與它們的相應(yīng)大分子酶復(fù)合物。這表明蛋白水解激活必須導(dǎo)致適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)變化，這種結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致某些位點(diǎn)的表達(dá)，這些位點(diǎn)的表達(dá)賦予酶、底物和輔因子結(jié)合能力。雖然已經(jīng)深入地研究了前輔因子和酶原激活，但是尚未完全理解蛋白水解與賦予功能的結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)之間的關(guān)系。本發(fā)明提供模型組合物和系統(tǒng)，其闡明大分子結(jié)合相互作用表達(dá)的基礎(chǔ)的分子機(jī)制，大分子結(jié)合相互作用的表達(dá)伴隨著從酶原狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。因子X(FX)1是維生素K依賴性雙鏈糖蛋白，其在凝血中起著重要作用(圖1)。這種絲氨酸蛋白酶酶原是用于外在(組織因子/FVIIa)和內(nèi)在(FVIIIa/FIXa)tenase酶復(fù)合物的底物，其裂解在FX中的Arg人Ile"剪切鍵釋放產(chǎn)生Fxa的52-氨基酸激活肽。因子Xa是負(fù)責(zé)凝血酶原至凝血酶轉(zhuǎn)化的蛋白酶(圖2)。雖然因子Xa是完全有能力的蛋白酶且具有催化機(jī)制(cata.lyticmachinery)用于凝血酶原的裂解，但它是這個反應(yīng)很差的催化劑。它在膜表面上與輔因子、因子Va的緊密結(jié)合相互作用在很大程度上增加凝血酶形成速率而不會在實(shí)質(zhì)上影響因子Xa所催化的其它反應(yīng)。預(yù)期對Argl5裂解位點(diǎn)后面的N-末端序列(Ile-Val-Gly)的變化(其導(dǎo)致次優(yōu)分子性欲)得到"酶原樣"Xa衍生物，這種"酶原樣"Xa衍生物具有減弱的蛋白水解活性或甚至不具有蛋白水解活性。預(yù)期這些4汙生物不易于受到血漿蛋白酶抑制劑(諸如抗凝血酶III)的抑制且預(yù)期不會在脈管損傷后干擾凝血的啟動，這是因?yàn)樗鼈冾A(yù)期不會與TFPI良好地結(jié)合。因子Xa緊密地結(jié)合因子Va而酶原因子X并不結(jié)合。因此，預(yù)期因子Xa的酶原樣形式更弱地結(jié)合Va,但是在足夠高的輔因子濃度被完全復(fù)活(rescue)且有效地催化凝血酶形成。預(yù)期具有這些性質(zhì)的因子Xa的酶原樣形式用作循環(huán)中的長壽命蛋白酶，它們原本會失去活性但卻在與因子Va結(jié)合時保留催化凝血酶形成的能力。它們具有用作治療用前凝血劑的潛力，治療用前凝血劑回避級聯(lián)中其它凝結(jié)因子的缺乏而不會有與輸注全功能野生型FXa相關(guān)聯(lián)的有害效應(yīng)。I.定義在上文中且貫穿說明書和權(quán)利要求書使用涉及本發(fā)明的生物分子的各種術(shù)語。短語"變異酶原/蛋白酶"是指有修飾的FX酶原或FXa蛋白酶,其被進(jìn)行基因改變使得它的蛋白酶活性，在轉(zhuǎn)化成FXa時，在不存在特定輔因子的情況下減小或?yàn)?酶原樣"(例如，對活性位點(diǎn)的結(jié)合親和力小于在野生型分子中所觀察到的親和力)。顯然，在存在適當(dāng)輔因子的情況下會恢復(fù)這種親和力/活性，輔因子包括(但不限于)因子Va。在母體FX分子中的氨基酸改變的優(yōu)選位點(diǎn)包括位置16的異亮氨酸取代，在位置17的纈氨酸取代和在位置194的天冬氨酸取代，限制條件為在位置16的氨基酸不是纈氨酸或丙氨酸。短語"與止血相關(guān)的疾病"是指出血性疾病，諸如血友病A和B，具有抑制抗體的血友病A和B患者，凝血因子VII、IX和X、XI、V、XII、II缺乏癥，血管性血友病因子，組合FV/FVin缺乏癥，維生素K環(huán)氧化物還原酶C1缺乏癥，Y羧化酶缺乏癥；與外傷、損傷、血栓形成、血小板減少、中風(fēng)、凝血病、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)相關(guān)聯(lián)的出血；與肝素、低分子量肝素、五糖、法華林、小分子抗血栓藥(即，F(xiàn)xa抑制劑)相關(guān)聯(lián)的過度抗凝血；以及血小板疾病，諸如伯-蘇綜合4正、Glanzman血小豐反無力癥(Glanzmanthromblastemia)以及貯存性疾病諸如深靜脈血栓形成、與心血管疾病狀態(tài)或惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)的血栓形成、留置導(dǎo)管或其它創(chuàng)外科手術(shù)所導(dǎo)致的血栓形成和與諸如狼瘡的自身免疫疾病相關(guān)聯(lián)的血栓形成。酶原/蛋白酶變異體也可對具有由多種疾病狀態(tài)所引起的彌散性血管內(nèi)凝血或消耗性凝血病的患者提供必要的止血。關(guān)于本發(fā)明的核酸，有時候使用"分離的核酸"。這個術(shù)語在用于DNA時是指與一些序列分離的DNA分子，在該DNA分子所起源的生物體的天然基因組中該DNA分子與這些序列緊鄰(在5'和3'的方向)。舉例說來，"分離的核酸，，可包括插入到載體(諸如質(zhì)?；虿《据d體)內(nèi)或整合到原核生物或真核生物的.DNA內(nèi)的DNA或cDNA分子。關(guān)于本發(fā)明的RNA分子，術(shù)語"分離的核酸"主要是指用上文所定義的分離的DNA分子所編碼的RNA分子?；蛘?，該術(shù)語可指與其自然狀態(tài)中(即，在細(xì)胞中或在組織中)相關(guān)聯(lián)的RNA分子充分地分離的RNA分子，使得其以"實(shí)質(zhì)上純"(術(shù)語"實(shí)質(zhì)上純"在下文中定義)的形式存在。關(guān)于蛋白質(zhì)，在本文中有時使用術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)"或"分離的且純化的蛋白質(zhì)"。這個術(shù)語主要是指通過本發(fā)明的分離的核酸分子的表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；蛘?，這個術(shù)語可指與其自然地相關(guān)聯(lián)的其它蛋白質(zhì)充分分離以便以"實(shí)質(zhì)上純，，的形式存在的蛋白質(zhì)。術(shù)語"啟動子區(qū)"是指基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其可在編碼區(qū)的5'側(cè)或3'側(cè)，或在編碼區(qū)內(nèi)、或在內(nèi)含子內(nèi)。術(shù)語"載體"是指小載體DNA分子，DNA序列可插入到這個小載體DN.A分子內(nèi)用于引入到宿主細(xì)胞內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)其將被復(fù)制。"表達(dá)載體，，是專門載體，其含有在宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的必要調(diào)節(jié)區(qū)的基因或核酸序列。術(shù)語"可操作地連接(opemblylinked)"表示將編碼序列的表達(dá)所必需的調(diào)節(jié)序列置于DNA分子中相對于該編碼序列的適當(dāng)位置以便實(shí)現(xiàn)編碼序列的表達(dá)。這個相同的定義有時會用于表達(dá)載體中編碼序列和轉(zhuǎn)錄控制元件(例如，啟動子、增強(qiáng)子和終止元件)的排列。這個定義有時也用于第一核酸分子和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中產(chǎn)生雜交的核酸分子。術(shù)語"實(shí)質(zhì)上純"是指包含按重量計(jì)至少50%至60%相關(guān)化合物(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白質(zhì)等)的制劑。更優(yōu)選地，制劑包括按重量計(jì)至少75%的相關(guān)化合物，且最優(yōu)選地包括按重量計(jì)90%至99%的相關(guān)化合物。通過對于相關(guān)化合物適當(dāng)?shù)姆椒▉頊y量純度(例如，色譜方法、瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC分析等)。其中短語"基本上由...組成"當(dāng)提及特定核苷酸序列或氨基酸序列時表示具有給定SEQIDNO:的性質(zhì)的序列。舉例而言，當(dāng)提及氨基酸序列使用該短語時，該短語包括該序列本身和不影響序列的基本特征和新型特征的分子修飾。如本文所用的"寡核苷酸"是指本發(fā)明的引物和探針，且被定義為包括兩個或兩個以上(優(yōu)選地，超過三個)核糖核普酸或脫氧核糖核苷酸的核酸分子。寡核苷酸的確切大小將取決于各種因素和寡核普酸的特定應(yīng)用。如本文所用的術(shù)語"探針"是指寡核普酸、聚核苷酸或核酸，可以是RNA也可以是DNA,可以是在純化的限制酶消化中自然發(fā)生的也可以是通過合成產(chǎn)生，其能夠與具有與探針互補(bǔ)的序列的核酸退火或特異地雜交。探針可為單鏈或雙鏈。探針的確切長度將取決于多種因素，包括溫度、探針的來源和使用方法。舉例說來，對于診斷應(yīng)用，取決于粑序列的復(fù)雜性，寡核苦酸凈笨針通常含有1.5至25個或更多的核苷酸，但是其也可含有更少的核苷酸。在這里選擇探針以"實(shí)質(zhì)上，，與特定靶核酸序列的不同鏈互補(bǔ)。這表示探針必須充分地互補(bǔ)以便能夠在一組預(yù)定條件下與它們各自的耙鏈"特異雜交，，或退火。因此，探針序列無需反映靶的確切互補(bǔ)序列。舉例說來，非互補(bǔ)核苷酸片段可附接到探針的5'端或3'端，且探針序列的其余部分與靶鏈互補(bǔ)?；蛘撸热籼结樞蛄信c其特異地退火的耙核酸的序列具有充分的互補(bǔ)性，非互外卜堿基或更長的序列可散布于探針內(nèi)。術(shù)語"特異地雜交，，是指充分互補(bǔ)序列的兩個單鏈核酸分子之間的允許在本領(lǐng)域的一般使用的預(yù)定條件下進(jìn)行這種雜交(有時被稱作"實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)")的結(jié)合性。特定而言，該術(shù)語是指寡核苷酸與含于本發(fā)明的單鏈DNA或RNA分子內(nèi)的實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)序列的雜交，基本上排除寡核普酸與非互補(bǔ)序列的單4連核酸的雜交。如本文所用的術(shù)語"引物"用于指寡核普酸(或?yàn)镽NA或?yàn)镈NA，或?yàn)閱捂溁螂p鏈，或者源自生物系統(tǒng)，由限制酶消化產(chǎn)生，或者當(dāng)置于適當(dāng)環(huán)境下時通過合成產(chǎn)生)能夠在功能上用作模板依賴性核酸合成的引發(fā)劑。當(dāng)被提供適當(dāng)核酸模板、核酸的適當(dāng)核苷三磷酸前體、聚合酶、適當(dāng)輔因子和諸如適當(dāng)溫度和pH的條件時，可通過聚合酶或類似活性的作用在引物的3'末端添加核苦酸以延伸引物從而得到引物延伸產(chǎn)物。引物的長度可基于特定條件和應(yīng)用要求而不同。舉例說來，在診斷應(yīng)用中，寡核苷酸引物的長度通常為15至25個或更多的核芬酸。引物必須與所需模板具有充分的互補(bǔ)性以引導(dǎo)所需延伸產(chǎn)物的合成，即，能夠以適當(dāng)方式與所需模板鏈退火，這種退火方式足以提供適當(dāng)并置的引物的3'羥基部分以用于由聚合酶或類似酶啟動合成。不需要引物序列代表所需模板的精確互補(bǔ)物。舉例說來，非互補(bǔ)核苷酸序列可附接到在互補(bǔ)情況與其不同的互補(bǔ)引物的5'端部?；蛘?，倘若引物序列與所需模板鏈的序列具有充分的互補(bǔ)性以在功能上提供用于延伸產(chǎn)物合成的模板引物復(fù)合物，非互補(bǔ)堿基可散布于寡核苷酸引物序列內(nèi)。關(guān)于核酸或氨基S殳序列之間的比較，在本文中使用術(shù)語"百分比一致性，，。常常使用計(jì)算機(jī)程序來比較核酸和氨基酸序列，該程序?qū)⒑怂峄虬被鵖吏序列加以比對從而限定這二者之間的不同。出于本發(fā)明的目的，4吏用GCGWisconsinPackageX反本(GCGWisconsinPackageversion)9.(其可從GeneticsComputerGroupinMadison,Wisconsin購買到)來執(zhí)行核酸序列的比較。為了方便起見，預(yù)期使用該程序所規(guī)定的默認(rèn)參數(shù)(空位形成罰分(gapcreationpenalty)-l2,空位延伸罰分(gapextensionpenalty)=M)來比較序列一致性?；蛘撸媚J(rèn)參數(shù)i吏用空位比對(gappedalignment)4吏用NationalCenterforBiotechnologyInformation所提供的Blastn2.0程序(參看萬維網(wǎng)(worldwideweb)ncbi.nlm.nih.gov/blast/;Altschul等人，1990，JMolBiol215:403-410)來確定核酸序列與氨基酸序列之間的一致性和相似性。II.編碼變異酶原-蛋白酶的核酸分子和多肽的制備A.核酸分子可通過使用重組DNA技術(shù)方法來制備編碼本發(fā)明的變異酶原/蛋白酶的核酸分子。核酸序列信息的可及性(availability)允許通過多種手段來制備本發(fā)明的分離的核酸分子。舉例說來，編碼酶原/蛋白酶多肽的核酸序列可使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案從適當(dāng)生物來源分離出來。本發(fā)明的核酸可以DNA形式維持在任何適宜克隆載體中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，克隆體維持在質(zhì)?？寺◇w/表達(dá)載體中，諸如pBluescript(Stratagene,LaJolla，CA),其在適合的大腸埃希氏菌宿主細(xì)胞中繁殖。或者，核酸可維持于適合于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的載體中。在翻譯后修飾影響酶原/蛋白酶功能(例如，因子Xa)的情況下，優(yōu)選地在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)該分子。'在一個實(shí)施方案中，可經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)蛋白水解裂解位點(diǎn)的插入來進(jìn)一步修飾編碼因子X酶原變異體的核酸。為了在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)"激活的"酶原樣FXa變異體，細(xì)胞內(nèi)蛋白水解裂解位點(diǎn)可插入于變異體FX酶原中位置Argl5與16之間。這些裂解位點(diǎn)包括Arg-Lys-Arg或Arg-Lys-Arg-Arg-Lys-Arg。這些裂解位點(diǎn)被細(xì)胞中的蛋白酶(PACE/類弗林蛋白酶樣酶)有效地識別出并且被移除。這得到經(jīng)過加工的變異體FX(a)，其中分子上重鏈開始的部位現(xiàn)在位置16開始。在所述位置引入這個裂解位點(diǎn)將允許FX到FXa的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化。在另一實(shí)施方案中，可移除整個52氨基酸激活肽且細(xì)胞內(nèi)蛋白酶裂解位點(diǎn)可被引入到其產(chǎn)生變異體FXa的位置。最后，這些類型的修飾允許變異體FX的"活性"加工形式從表達(dá)有修飾的變異體FX的細(xì)胞分泌。裂解的因子(cleavedfactor)的分泌排除了在血液凝結(jié)期間或蛋白質(zhì)分離后對于蛋白水解裂解的需要。本發(fā)明的編碼變異酶原/蛋白酶的核酸分子包括cDNA、基因組DNA、RNA和可為單鏈或雙鏈的它的片段。因此，本發(fā)明提供寡核苷酸(DNA或RNA的有義鏈或反義鏈)，其具有能夠與本發(fā)明的核酸分子的至少一個序列雜交的序列。這樣的寡核苷酸適用作檢測酶原/蛋白酶表達(dá)的探針。B.蛋白質(zhì)根據(jù)已知方法，可以多種方式來制備本發(fā)明的全長或變異酶原/蛋白酶多肽?？赏ㄟ^免疫親和純化法純化來自適當(dāng)來源(例如，表達(dá)酶原/蛋白酶的轉(zhuǎn)化細(xì)菌或動物培養(yǎng)細(xì)胞或組織)純化蛋白質(zhì)。然而由于在任何時候在給定細(xì)胞類型中可能存在的蛋白質(zhì)的低含量，這并不是優(yōu)選的方法。編碼變異酶原/蛋白酶多肽的核酸分子的可及性允許使用本領(lǐng)域中已知的體外表達(dá)方法來產(chǎn)生酶原/蛋白酶。舉例而言，cDNA或基因可被克隆到適當(dāng)體外轉(zhuǎn)錄載體(諸如pSP64或pSP65)內(nèi)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，之后為在適合的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)(諸如在小麥胚芽或兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物)中進(jìn)行無細(xì)胞翻譯。體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)可從(例如)PromegaBiotech,Madison,Wisconsin或BRL，Rockville,Maryland購買到?；蛘撸鶕?jù)優(yōu)選實(shí)施方案，可通過在適合的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)而產(chǎn)生較大量的"酶原/蛋白酶"。舉例說來，編碼變異因子Xa的DNA分子的部分或全部可(例如)插入到適于在細(xì)菌纟田胞(諸如大腸埃希氏菌)或哺乳動物細(xì)胞(諸如CHO或海拉細(xì)胞)中表達(dá)的質(zhì)粒載體內(nèi)。或者，在優(yōu)選實(shí)施方案中，可產(chǎn)生包含酶原/蛋白酶的標(biāo)記融合蛋白質(zhì)(taggedfbsionprotein)。這樣的酶原/蛋白酶-標(biāo)記融合蛋白質(zhì)被DNA分子的部分或全部進(jìn)行編碼，在校正密碼子閱讀框中連接(ligate)至編碼所需多肽標(biāo)記的一部分或全部的核苷S吏序列，所需多肽標(biāo)記的一部分或全部被插入到適于在細(xì)菌細(xì)胞(諸如大腸埃希氏菌)或真核細(xì)胞(諸如，但不限于酵母和哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)的質(zhì)粒載體內(nèi)。節(jié)元件，其被定位以便允許該DNA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。表達(dá)所需要的該等調(diào)節(jié)元件包括(但不限于)啟動子序列、轉(zhuǎn)錄啟動序列以及增強(qiáng)子序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的方法來純化在重組原核或真核系統(tǒng)中基因表達(dá)所產(chǎn)生的變異酶原/蛋白酶蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用市場上可購買到的表達(dá)/分泌系統(tǒng)，由此重組蛋白質(zhì)^1表達(dá)且之后從宿主細(xì)胞分泌出來以從周圍介質(zhì)容易地純化。如果不使用表達(dá)/分泌載體，那么替代方法涉及通過親和力分離來純化重組蛋白質(zhì)，諸如通過與特異地結(jié)合到重組蛋白質(zhì)或鎳柱的抗體的免疫學(xué)相互作用來分離在它們的N-末端或C末端標(biāo)記有6-8個組氨酸殘基的重組蛋白質(zhì)。替代標(biāo)記可包括FLAG表位、GST或血凝素表位。這些方法通常被熟練技術(shù)人員使用?？筛鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)程序來分析通過上述方法所制備的酶原/蛋白酶蛋白質(zhì)。舉例說來，這些蛋白質(zhì)可根據(jù)已知的方法經(jīng)受氨基酸序列分析。如上文所討論的那樣，產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多肽的簡便方式是通過在表達(dá)系統(tǒng)中使用核酸來表達(dá)編碼它的核酸。用于本發(fā)明的方法的多種表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。因此，本發(fā)明還涵蓋用于形成多肽的方法(如所公開的那樣)，該方法包括從編碼該多肽(一般為核酸)的核酸表達(dá)。這可能通過在造成或允許多肽產(chǎn)生的適當(dāng)條件下培養(yǎng)含有這種載體的宿主細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。也可在體外系統(tǒng)中(諸如在網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物中)產(chǎn)生多肽。m.酶原/蛋白酶蛋白質(zhì)和編碼酶原/蛋白酶的核酸的使用根據(jù)本發(fā)明可使用編碼具有改變的蛋白酶活性的多肽的變異酶原/蛋白酶核酸(例如)作為治療劑和/或預(yù)防劑(蛋白質(zhì)或核酸)，其調(diào)節(jié)凝血級聯(lián)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)因子X/Xa酶原/蛋白酶分子可增強(qiáng)凝血且提供有效的止血。A.變異酶原/蛋白酶多肽在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，可經(jīng)由輸注(優(yōu)選地經(jīng)由靜脈內(nèi)注射)來向患者給予在生物相容性載體中的變異酶原/蛋白酶多肽。本發(fā)明的變異酶原/蛋白酶可任選嚢封于脂質(zhì)體內(nèi)或與其它^^脂或膠束混合以增強(qiáng)分子穩(wěn)定性。酶原/蛋白酶可單獨(dú)地給予或與已知能調(diào)節(jié)止血的其它藥物(例如，因子V、因子Va或它的衍生物)組合地給藥?？捎舍t(yī)師考慮多種生理變量(包括ia不限于，患者的條件和血液動力學(xué)狀態(tài))來確定其中要傳遞酶原/蛋白酶多肽的適當(dāng)組合物。非常適合于不同應(yīng)用的多種組合物和給藥途徑是本領(lǐng)域中熟知的且將在下文中展開描述。含有純化的因子X/Xa類似物的制劑含有生理學(xué)上可接受的基質(zhì)且優(yōu)選地被配制為藥用制劑?？墒褂脤?shí)質(zhì)上已知的先前技術(shù)方法來配制該制劑，其可與含有鹽(諸如NaCl、CaCl2)和氨基酸(諸如甘氨酸和/或賴氨酸)且pH范圍為6至8的緩沖液混合。在需要之前，含有因子X/Xa類似物的純化的制劑可以成品溶液(fmishedsolution)或凍千或深低溫冷凍形式貯存。優(yōu)選地，該制劑以凍干形式貯存且使用適當(dāng)?shù)闹亟ㄈ芤喝芙獬赡繖z透明的溶液。提供。根據(jù)本發(fā)明的制劑特別地穩(wěn)定，即，其可在應(yīng)用之前保持為溶解的形式持續(xù)較長的時間。根據(jù)本發(fā)明的制劑含有與因子XIa或其衍生物(其能夠?qū)⒁蜃覺類似物激活成因子Xa或因子Xa類似物)組合的因子X類似物，該制劑可以組合制劑的形式提供，該組合制劑包括保持固定在基質(zhì)上的因子XIa的容器(可能為小型柱或補(bǔ)充有蛋白酶的注射器)和含有具有因子X類似物的藥用制劑的容器。為了激活因子X類似物，含有因子X類似物的溶液(例如)可被壓在固定的蛋白酶上。在制劑的貯存期間，含有因子X類似物的溶液優(yōu)選地在空間上與蛋白酶分開。根據(jù)本發(fā)明的制劑可與蛋白酶貯存于同一容器中但這些組分通過不可滲透的分隔物在空間上分開，不可滲透的分隔物可在制劑給藥之前容易地移除。溶液也可貯存于單獨(dú)的容器中且在臨給藥前使它們彼此接觸。因子X類似物可被在臨使用前(即，在向患者給藥前)被激活成因子Xa?？赏ㄟ^使因子X類似物與固定的蛋白酶接觸或通過混合含有蛋白酶的溶液(一方面)與因子X類似物(另一方面)來進(jìn)行激活。因此,可能單獨(dú)地在溶液中維持兩種組分且通過適當(dāng)輸注裝置來將它們混合，其中，這些組分在它們通過該裝置時彼此接觸且因此被激活成因子Xa或因子Xa類似物，因此患者可以接受因子Xa和另外地負(fù)責(zé)激活的絲氨酸蛋白酶的混合物。在這種情況下，尤其重要的是要注意劑量，因?yàn)榻z氨酸蛋白酶的附加給藥也激活內(nèi)源因子X,其可能會縮短凝血時間。根據(jù)本發(fā)明的制劑可被提供為以單組分制劑形式的具有因子Xa活性的藥用制劑或以多組分制劑形式的與其它因子組合的藥用制劑。在將純化的蛋白質(zhì)加工成藥用制劑之前，純化的蛋白質(zhì)經(jīng)受常規(guī)質(zhì)量控制并被制成治療用表現(xiàn)形式(therapeuticformofpresentation)。特別地，在重組制造期間，測試純化的制劑是否存在細(xì)胞核酸以及源自表達(dá)栽體的核酸，優(yōu)選地使用諸如在EP0714987中所描述的方法。本發(fā)明的另一特點(diǎn)涉及提供一種制劑，該制劑含有具有高穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性的因子Xa類似物且該制劑特別地不含無活性因子X/Xa類似物中間體和自我蛋白酶解降解產(chǎn)物且該制劑可通過使上文所述類型的因子X類似物激活且將其配制成適當(dāng)制劑而產(chǎn)生。該藥用制劑可含有在.0-1000(ig/kg之間的劑量，更優(yōu)選地在大約10-250(ig/kg之間且最優(yōu)選地在10與75)Lig/kg之間的劑量，其中40昭/kg的變異因子X多肽是特別優(yōu)選的劑量?；颊呖稍谂R床上出現(xiàn)流血時立即被治療?；蛘撸颊呖稍诿恳恍r至三小時接受靜脈快速輸注，或如果觀察到顯著的改善，每日一次輸注本文所述的變異因子Xa。B.編碼酶原/蛋白酶的核酸-根據(jù)本發(fā)明，編碼酶原/蛋白酶的核酸可用于多種目的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供用于調(diào)節(jié)凝血的核酸傳遞載體(即，表達(dá)載體)，其中表達(dá)載體包括如本文所述的編碼變異酶原/蛋白酶多肽或它的功能片段的核酸序列。將編碼酶原/蛋白酶的表達(dá)載體給予患者導(dǎo)致酶原/蛋白酶多肽的表達(dá)，酶原/蛋白酶多肽用于改變凝血級聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明，編碼酶原/蛋白酶的核酸序列可如本文所述編碼酶原/蛋白酶多肽，酶原/蛋白酶多肽的表達(dá)增強(qiáng)止血。在優(yōu)選實(shí)施方案中，酶原/蛋白酶核酸序列編碼人因子Xa多肽變異體。包含變異體X/Xa酶原/蛋白酶核酸序列的表達(dá)載體可單獨(dú)地給藥或與適用于調(diào)節(jié)止血的其它分子組合地給藥。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)載體或治療劑的組合可單獨(dú)地給予患者或以藥學(xué)上可接受的生物相容組合物給予患者。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含編碼變異酶原/蛋白酶變異體的核酸序列的表達(dá)載體是病毒載體?？稍诒景l(fā)明中使用的病毒載體包括(但不限于)腺病毒載體(具有或不具有組織特異性啟動子/增強(qiáng)子)、多種血清型(例如，AAV-2、AAV-5、AAV-7和AAV-8)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體和雜交AAV載體、慢病毒載體和假型慢病毒栽體[例如，埃博拉病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和貓免疫缺陷病毒(FIV)]、單純皰滲病毒載體、痘苗病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，提供用于包含編碼變異酶原/蛋白酶的核酸序列或它的功能片段的病毒載體的給藥的方法。在本發(fā)明的方法中使用的腺病毒載體優(yōu)選地包括腺病毒載體DNA的至少基本部分。如本文所述的那樣，在這些l^病毒載體給藥后的變異酶原/蛋白酶多肽的表達(dá)用于調(diào)節(jié)止血。在本文所述的變異因子Xa的情形下，該給藥增強(qiáng)蛋白酶的促凝活性。發(fā)現(xiàn)重組腺病毒載體廣泛地用于多種基因治療應(yīng)用。它們對于這些應(yīng)用的效用在很大程度上是由于在多種器官情況下所實(shí)現(xiàn)的高效率的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移。腺病毒顆?？捎欣赜米鞒浞只騻鬟f的載體。這些病毒粒子具有這些應(yīng)用所需要的多種特點(diǎn)，包括與為雙鏈DNA無包被病毒相關(guān)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和諸如對于人呼吸系統(tǒng)和胃腸道的向性(tr叩ism)的生物特點(diǎn)。而且，已知腺病毒感染通過受體介導(dǎo)胞吞作用而感染很多種細(xì)胞類型。腺病毒的感染導(dǎo)致人包括輕度感冒狀癥狀的最小疾病狀態(tài)證明了腺病毒載體的整體安全性。由于它們的較大的大小(大約36千堿基)，腺病毒基因組非常適合于用作基因治療載體，因?yàn)樗鼈兛稍谝瞥龔?fù)制所必需的腺病毒基因和非必需區(qū)域后容納外來DNA的4翁入。這樣的取代致使病毒載體的復(fù)制功能和感染性減弱。值得注意的是，腺病毒已被用作用于基因治療和用于外源基因表達(dá)的載體。關(guān)于用于基因治療的腺病毒栽體的使用的更詳細(xì)的討論，參見Berkner,1988,Biotechniques6:616-629和Trapnell，1993,AdvancedDrugDeliveryReviews12:185-199。需要引入載體，載體可提供(例如)所需基因的多個拷貝和因此更大量的該基因的產(chǎn)物。改進(jìn)的腺病毒載體和產(chǎn)生這些載體的方法在許多參考文獻(xiàn)、專利和專利申請中更詳細(xì)地描述，包括Mitani和Kubo(2002,CurrGeneTher.2(2):]35-44);Olmsted-Davis等人(2002，HumGeneTherl3(11):1337-47);Reynolds等人(2001，NatBiotechnol.19(9):838-42);美國專利第5,998,205號(其中提供包含多個DNA拷貝的腫瘤特異性復(fù)制載體)；第6，22S,646號(其中描述了無輔助病毒的完全缺陷的腺病毒載體)；第6,093,699號(其中提供用于基因治療的載體和方法)；第6,100,242號(其中，轉(zhuǎn)基因插入復(fù)制缺陷病毒載體有效地用于外周血管疾病和心臟病的體內(nèi)基因治療)；以及國際專利申請第WO94/17810號和第WO94/23744號。對于某些應(yīng)用，表達(dá)載體還可包括調(diào)節(jié)元件，調(diào)節(jié)元件用于驅(qū)動在特定細(xì)胞或組織類型中的表達(dá)。這些調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且被Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1992)深入地討論。在本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中加入組織持異性調(diào)節(jié)元件提供對于變異酶原/蛋白酶的或其功能片段表達(dá)的至少部分組織向性。舉例而言，在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子控制下包括編碼變異酶原/蛋白酶的核酸序列的El刪除型5腺病毒載體可有利地用于本發(fā)明的方法中。產(chǎn)生腺病毒載體的示范性方法已在人胚腎細(xì)胞系293(Graham等人，1977,J.Gen.Virol.36:59-72)中產(chǎn)生了用于重組基因表達(dá)的腺病毒載體。這種細(xì)胞系允許腺病毒2(Ad2)和在El功能方面存在缺陷的腺病毒5突變體(因?yàn)槠浒ㄏ俨《?基因組的左端)生長且因此表達(dá)E1蛋白質(zhì)。整合到293細(xì)胞的細(xì)胞基因組內(nèi)的El基因在多個水平表達(dá)，這些表達(dá)水平便于將這些細(xì)胞用作表達(dá)系統(tǒng)，在表達(dá)系統(tǒng)中，為了擴(kuò)增病毒載體，從病毒載體刪除了這些基因。293細(xì)胞已廣泛地用于El突變體的分離和繁殖，用于不依賴輔助病毒的克隆和用于腺病毒載體的表達(dá)。因此，諸如293細(xì)胞系的表達(dá)系統(tǒng)在反式提供基本的病毒功能且因此能夠繁殖病毒載體，其中，外源核酸序列取代E1基因。參看Young等人，腺病毒，Ginsberg編，PlenumPress,NewYorkandLondon(1984),第125-172頁.。非常適合于腺病毒載體繁殖的其它表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如，海拉細(xì)胞)且已在其它地方評述。本發(fā)明還包括用于調(diào)節(jié)止血的方法，包括向個體的細(xì)胞提供編碼變異酶原/蛋白酶多肽的核酸傳遞載體且允許細(xì)胞在表達(dá)酶原/蛋白酶多肽的條件下生長。通過前面的討論，可以看出酶原/蛋白酶多肽和表達(dá)酶原/蛋白酶多肽的核酸載體可用于治療與異常凝血相關(guān)的疾病。C.藥用組合物本發(fā)明的表達(dá)載體可加入到藥用組合物內(nèi)，藥用組合物可被傳遞到受試者以便允許產(chǎn)生具有生物活性的蛋白質(zhì)(例如，變異酶原/蛋白酶多肽/或其功能片段或衍生物)。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，包含足夠的遺傳物質(zhì)以使得受體能夠產(chǎn)生治療上有效量的變異酶原/蛋白質(zhì)多肽的藥用組合物可影響受試者的止血。或者，如上文所討論的那樣，有效量的變異因子X多肽可被直接輸注到需要該治療的患者內(nèi)。組合物可單獨(dú)給藥或者與至少一個其它試劑(諸如為穩(wěn)定化化合物)組合地給藥，其可在任何無菌生物相容藥用載體中給藥，生物相容性藥用載體包括(但不限于)生理鹽水、緩沖生理鹽水、葡萄糖和水。組合物可單獨(dú)地給予患者或與影響止血的其它試劑(例如，輔周子)組合地給予患者。在優(yōu)選實(shí)施方案中，藥用組合物還含有藥學(xué)上可接受的賦形劑。這些賦形劑包括自身并不誘發(fā)針對接受該組合物的個體的有害的免疫反應(yīng)且可不產(chǎn)生異常毒性地給藥的任何藥劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑包括(但不限于)液體，諸如水、生理鹽水、甘油、糖和乙醇。藥學(xué)上可接受的鹽也可包括于其內(nèi)，例如無機(jī)鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；以及有機(jī)酸鹽，諸如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽等。此外，在該等載體中可存在助劑，諸如潤濕或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.,第]8版，Easton，Pa.[1990])中提供藥學(xué)上可接受的賦形劑的全面討論。適合于胃腸外給藥的藥用制劑可在水溶液中配制，優(yōu)選地在生理學(xué)上相容的緩沖液中，諸如Hanks溶液、Ringed容液或生理學(xué)上緩沖的生理鹽水。水性注射懸浮液可舍有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，諸如羧曱基纖維素納、山梨醇或葡聚糖。此外，可將活性化合物的懸浮液適當(dāng)?shù)嘏渲茷橛托宰⑸鋺腋∫骸：线m的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，諸如芝麻油或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯或脂質(zhì)體。任選，懸浮液也可含有合適的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解度以允許高濃度溶液的制劑的試劑。藥用組合物可被提供為鹽且可由多種酸形成，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽在水溶劑或其它質(zhì)子溶劑中的溶解度傾向于高于相應(yīng)的自由堿基形式。在其它情況下，優(yōu)選制劑可為凍千粉，其可含有下列物質(zhì)中的任一種或全部l-50mM組氨酸、0.1%-2%蔗糖和2-7%甘露醇，pH范圍4.5至5.5，其在使用之前與緩沖液組合。在制備藥用組合物后，它們可被置放于適當(dāng)容器中且被貼上標(biāo)簽用于治療。對于含有酶原/蛋白酶的載體或多肽的給藥，這些標(biāo)簽可包括給藥的量、頻率和方法。適用于本發(fā)明的藥用組合物包4舌組合物，其中含有有效量的活性成份來實(shí)現(xiàn)預(yù)期的治療目的。熟練的醫(yī)生能夠使用本發(fā)明中所提供的技術(shù)和指導(dǎo)來確定治療上有效的劑量。治療劑量將取決于(除了其它因素之外)受試者的年齡和一般條件，異常凝血顯型的嚴(yán)重性以及調(diào)節(jié)變異酶原/蛋白酶多肽的表達(dá)水平的控制序列的強(qiáng)度。因此，對于人來說治療上有效量將屬于相對較寬的范圍，這個范圍可由醫(yī)師基于個別患者對于基于載體的酶原/蛋白酶治療的反應(yīng)來確定。D.給藥變異因子X多肽(單獨(dú)地或與其它試劑組合地)可如上文所述在適當(dāng)生物載體中輸注到患者內(nèi)。包含編碼變異酶原/蛋白酶或其接合片段的核酸序列的本發(fā)明的表達(dá)栽體可通過多種方式(參看下文)給予患者以實(shí)現(xiàn)并維持預(yù)防上和/或治療上有效的酶原/蛋白酶多肽水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定具體方案來將本發(fā)明的酶原/蛋白酶編碼表達(dá)載體用于特定患者的治療用藥。用于產(chǎn)生腺病毒載體和向患者給藥的方案在美國專利第5,998,205號、第6，228，646號、第6，093，699號、第6，00,242號和國際專利申請第WO94/17810號和第WO94/23744號中描述，這些專利和專利申請以其全文引用的方式結(jié)合到本文中?？赏ㄟ^任何已知的方式向患者給予本發(fā)明的變異酶原/蛋白酶編碼腺病毒載體。一般可使用常規(guī)注射器經(jīng)由注射在體內(nèi)直接傳遞藥用組合物，但也可以構(gòu)想到其它傳遞方法，諸如對流增強(qiáng)型傳遞(參看，例如專利第5,720,720號)。就此而言，組合物可在皮下、表皮、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、框內(nèi)、#占膜內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、經(jīng)口、肝內(nèi)或肌肉內(nèi)傳遞。其它給藥方式包括口服和肺部給藥、栓劑和透皮應(yīng)用。專門研究凝血障礙的患者治療的臨床醫(yī)生可基于多種標(biāo)準(zhǔn)確定包含酶原/蛋白酶核酸序列的腺病毒載體的最佳給藥途徑，包括(但不限于)患者的條件和治療的目的(例如，增強(qiáng)凝血或減輕凝血)。本發(fā)明還涵蓋包含編碼變異酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的AAV載體。本發(fā)明還提供包括編碼變異酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的慢病毒或假型慢病毒載體。本發(fā)明還涵蓋包含編碼變異酶原/蛋白酶多肽的核酸序列的棵質(zhì)?；虮磉_(dá)載體。實(shí)施例1變異因子XA酶原/蛋白酶為了實(shí)現(xiàn)激活而對前體血漿蛋白質(zhì)的蛋白水解加工是凝血的標(biāo)志(hallmark)。用于這種類型的激活機(jī)制的范式(paradigm)是在糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶家族中酶原到蛋白酶轉(zhuǎn)變。在高度保守位點(diǎn)的鍵裂解(Argl5-Ilel6;糜蛋白酶編號系統(tǒng))顯露出(unmask)用作Aspl94的分子內(nèi)配體的新N末端(圖2)。這種新鹽橋?qū)е孪铝星樾位蚺c下列情形相關(guān)所謂"激活域"，由SI特異性口袋、氧陰離子洞、自我催化水解環(huán)和鈉結(jié)合位點(diǎn)組成的表面環(huán)的構(gòu)象變化和排序(圖3)。關(guān)于胰蛋白酶系統(tǒng)有文獻(xiàn)確切記錄(welldocumented)Ile16-Aspl94內(nèi)鹽橋形成是變構(gòu)地鍵合至SI特異性位點(diǎn)；即，在一個位點(diǎn)的變化影響另一4立點(diǎn)，反之亦然。有文獻(xiàn)確切記錄對于絲氨酸蛋白酶，特別是對于糜蛋白酶和胰蛋白酶，酶原到活性酶在結(jié)構(gòu)水平轉(zhuǎn)變的基本原理且這些實(shí)例用作絲氨酸蛋白酶家族的范式。一般方面可^f皮總結(jié)成如下(參看圖2):l)酶原的結(jié)構(gòu)(大約80°/。至85%)相對地類似于蛋白酶；2')在高度保守的N末端(例如，11el6-Val-Gly-Glyl9)釋放后引發(fā)該轉(zhuǎn)變；3)新的自由a-氨基(Ilel6)埋入到疏水環(huán)境中且它的a-氨基氮與Aspl94形成內(nèi)部鹽橋；4)在酶原激活時Aspl94的位置顯著地改變，旋轉(zhuǎn)大約170。；以及5)這個內(nèi)部鹽橋?qū)е乱韵虑樾位蚺c以下情形相關(guān)所謂"激活域'，，由殘基16-19、142-153、184-194和216-223組成且部分地包含Slif爭異性孑立點(diǎn)(nomenclatureofSchechterandBerger(]967)Bochem.Biophys.Res.Comm.43:694-702)和氧離子洞的表面外露環(huán)的構(gòu)象變化。各種研究表明酶原和成熟酶以平衡形式存在，且Keq-108,有利于酶原。Bode和他的同事已經(jīng)詳盡地驗(yàn)證胰蛋白酶原在強(qiáng)配體結(jié)合到Sl特異性口袋或?qū)lel6裂縫具有強(qiáng)親和力的合適配體時可采取活性胰蛋白酶樣結(jié)構(gòu)。這種不裂解Arg/Lysl5-Ile16鍵的誘導(dǎo)的額外實(shí)例包括鏈激酶與纖溶酶原的結(jié)合，葡萄糖菌凝固酶與凝血酶原的結(jié)合和近來描述的自身抗體與凝血酶原的結(jié)合(Madoiwa等人(200)Blood97:3783-3789)。總體上這些石開究表明絲氨酸蛋白酶，即使以其酶原形式，可根據(jù)各種環(huán)境條件(即，與酶原的強(qiáng)配體結(jié)合)采取蛋白酶樣功能。眾所周知，F(xiàn)X的激活導(dǎo)致絲氨酸蛋白酶域中較大的構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化伴隨著蛋白酶以更大親和力結(jié)合Sl導(dǎo)向探針和膜結(jié)合FVa(l-6)?？刂平z氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)變的總分子機(jī)制一般被假定為遵循胰蛋白酶系統(tǒng)的分子機(jī)制。然而，并非是總是這種情況。單鏈tPA采用不同的分子策略來維持其酶原樣狀態(tài)(8-n)。對凝血所涉及的酶原/蛋白酶對(特別是FVII/FVIIa)所做的分析表明與胰蛋白酶系統(tǒng)(12)相比，在這種轉(zhuǎn)變中存在若干不同之處。雖然FXa上的若干結(jié)構(gòu)決定子是所謂激活域的一部分，但目前尚不清楚這些位點(diǎn)的形成是否與酶原到蛋白酶轉(zhuǎn)變直接相關(guān)。然而，近來描述的酶原FX的模型暗示這些元件中的若千元件在酶原(13)中可能是無序的(disordered)。酶原模型與活性酶的比較顯示出組成Ca2+(Asp70-Glu80)、Na+(Alal83-Aspl94;Gly219-Gly226)和自我催化水解環(huán)(Thrl44-Argl50)的殘基在酶原到蛋白酶的轉(zhuǎn)變時在其骨架位置經(jīng)歷較大的變化。由于已有文獻(xiàn)記錄，至少對于胰蛋白酶原/胰蛋白酶，Sl特異性位點(diǎn)和11el6-Asp194的形成變構(gòu)地相關(guān)，因此合理地假設(shè)激活域的其它元件也與酶原到蛋白酶轉(zhuǎn)變相關(guān)。在本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來測試以下,i設(shè)通過對位置16、17或194做出變化使Ilel6-Asp194內(nèi)部鹽橋失穩(wěn)來改變活性位點(diǎn)裂縫，造成所得變異體為"酶原樣'，的。還々￡-沒這些變化將變構(gòu)地調(diào)節(jié)FVa結(jié)合。材津+和方法因子Xa的表達(dá)雖然關(guān)于的rFX的表達(dá)在文獻(xiàn)中已有若干報(bào)道，但大多數(shù)依賴截短版本(truncatedversion)或并未提供足夠的表征(]5-20)。我們在HEK293細(xì)胞中表達(dá)rFX的初步嘗試得到條件培養(yǎng)基的1-2mgrFX/L范圍的表達(dá)水平；然而，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生物質(zhì)的僅10%至40%被完全y-羧化(21)。其余物質(zhì)顯示未y-羧化。利用維生素K依賴性前肽對于羧化酶的不同結(jié)合親和力且假設(shè)由于凝血酶原前肽展示對于羧化酶的最低的親和力，交換FX的前肽(最高親和力)與凝血酶原的前肽可通過允許更大的底物周轉(zhuǎn)(turnover)而增加y-羧化(22、23)。使用這種新的載體，選擇H:EK293細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體，將其擴(kuò)增，且通過免疫親和力色譜來純化rFX。自羥基磷灰石的磷酸鹽洗脫液用于將羧化物質(zhì)與非羧化物質(zhì)分開。與使用天然FX前肽的10%至40%相比，現(xiàn)從超過30個穩(wěn)定細(xì)胞系所獲得的結(jié)果表明平均大約80%至90%的rFX被完全丫-羧化。這些結(jié)果近來—皮發(fā)表且這種策略隨后被至少一個其它實(shí)驗(yàn)室采用(24，25)。因此，使用這種新的表達(dá)系統(tǒng)，現(xiàn)能產(chǎn)生毫克量(來自大約IOL條件培養(yǎng)基的15-25mg完全y-羧化rFX)的蛋白質(zhì)用于詳細(xì)結(jié)構(gòu)/功能研究。酶測定利用對硝基笨基對胍基安息香酸酯(IIa)或熒光素單-對胍基安息香酸酯(FXa)通過活性位點(diǎn)滴定來確定酶濃度(26、27)。如先前所述的樣，從SpectrozymeFXa、S-2222或S-2765的初始水解速率來測量在存在或不存在各種抑制劑情況下的FXa顯色底物活性。將通過初始速率數(shù)據(jù)與適當(dāng)方程式的最小二乘擬合來確定動力學(xué)參數(shù)。FXa變異體的產(chǎn)生4吏用定點(diǎn)突變i式劑盒(Quick-changesite-directedmutagenesiskit)(Stratagene)來產(chǎn)生FX突變體且整個FXcDNA被測序以驗(yàn)證產(chǎn)物的身份(identity)。使用Lipofectamine-2000將各種質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后48小時，收集培養(yǎng)基且使用FX特異EUSA來確定FX抗原水平并且在用RVV-X或用組織因子-FVIIa激活前通過顯色測定來評價FXa活性。結(jié)果在表！中概述了沿著酶原-蛋白酶轉(zhuǎn)變途徑分布的FXa種類的產(chǎn)生。瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果表明產(chǎn)生了一系列FXa變異體，這些FXa變異體具有可變的活性量，范圍在約25%至<1%。假設(shè)這些活性差異可能反映FX變異體，F(xiàn)X變異體沿著酶原至蛋白酶轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)化為不同的程度。換言之，取決于在位置16、17或194的氨基酸，Ilel6-Aspl94內(nèi)部鹽橋穩(wěn)定為不同的程度。選擇這些變異體中的三個(rFXal16L、FXall6G和FXaV17A)來進(jìn)一步表征。表1:用RVV-X和TF-FVIIa的各種rFX變異體激活用RVV-X激活FX用TF-FVIla激活FX構(gòu)建體a|FXl(.nM)%Wt-抗原bFXa活性c%wtFXa活性e%wl(nM)(nM)rwt-FX54.07100,0010.95100.0018.905泄OOlle16—Leu24,8846,030.255.000.572S.57"e16—Phe49.4891.510,010,08O細(xì)0.02Ile16—Asp12.0422.270.010.22O細(xì)0.00Ile16—Gly27.8851.56O.000.050.0370.38Val17—Leu28.1852.121,2221.333細(xì)30.48Va"7卄A，a55.881D3.360,343.021.0295.27Val17—Gly47.7688.340,020，210.0360.22Asp13"Asn17.3232.040.030.790.0000.00Asp19"Glu30.9757.290.020,270.00D0.00a抗原水平從FX特異性ELISA計(jì)算且被表達(dá)為nMFXbFX活性水平是基于用給定FX變異體的RVV-X或TF-FVIIa激活后肽基底物水解速率且將初始水解速率與FXa標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較c。/。wt值是基于與wt-FXa活性水平的比較。這些值被調(diào)整用于抗原水平。形成HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定細(xì)胞系且從10L的條件培養(yǎng)基純化這些酶原中的每個酶原(]4、24)。利用RVV-X來激活這些變異體且隨后用凝膠過濾色語來純化(14、24)。在圖4中示出激活前和激活后(還原和未還原)的變異體的SDS-PAGE。首先集中注意力于評估使用靶向FXa的這個區(qū)域的特異性探針對這些變異體中每個變異體的活性位點(diǎn)環(huán)境做出的改變。使用肽基底物和活性位點(diǎn)導(dǎo)向探針?biāo)M(jìn)行的動力學(xué)研究表明FXall6L和FXaV17A具有減弱的結(jié)合這些探針的能力(Km或Ki增加15至25倍)而與野生型FXa(血漿來源的和重組的)相比，催化作用的速率(kcat)減小3倍(表2和表3)。因子Xa116G并不受到所;險(xiǎn)查的這些探針中的任一個探針的抑制且其顯色活性嚴(yán)重減弱(500至1000倍)，排除動力學(xué)參數(shù)的計(jì)算。這些數(shù)據(jù)符合內(nèi)部鹽橋形成(Ilel6-Aspl94)的失穩(wěn)影響在Sl特異性位點(diǎn)結(jié)合的構(gòu)思。與這些結(jié)果相反，F(xiàn)Xall6L和FXaV17A組裝到凝血酶原酶中幾乎完全恢復(fù)肽基底物的Km而Kcat仍減小3倍，表明FVa結(jié)合可挽^:在活性位點(diǎn)的結(jié)合(表2和表3)。令人意外地，當(dāng)組裝到凝血酶原酶中時甚至I16G的Km值也幾乎完全恢復(fù)(與野生型FXa相比3倍增加)；然而，發(fā)現(xiàn)kcat減小60倍。表2:顯色底物裂解的動力學(xué)常數(shù)雄神類/^/se。士SZ)因子Xa215±13.571.6±3.53x57.3±3.10.28±0.05凝血酶原rwtFXa88.8±11.4rFXavl7A1377±332rFXa亂15x1149±244rFXa'16G1608±423<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>對于其中使用自由因子Xa的實(shí)驗(yàn)，利用增加濃度的SpectrozymeFXa來培育2.0nM野生型或6.0nM突變體因子Xa且對于其中采用凝血酶原酶的實(shí)驗(yàn)用30nM因子Va、50jaMPCPS和增加濃度的底物(10至500mM)來培育5.0nM的野生型或突變體因子。通過監(jiān)視在405nm隨著時間的吸光率來評價顯色活性。擬合常數(shù)誤差表示95%的置信限度。與這些資料一致，使用凝血酶原所進(jìn)行的動力學(xué)研究顯示出對于這些組裝進(jìn)凝血酶原酶中的每一個變異體所獲得的Km值基本上等效于野生型酶，而Kcat值減小到與顯色底物相同的程度(表4)?？傊?，我們的這些結(jié)果表明對于FX,酶原到蛋白酶轉(zhuǎn)變僅影響Sl位點(diǎn)的形成，但也很大程度上有助于FVa結(jié)合位點(diǎn)的形成。由于這些FXa變異體至FVa的直接結(jié)合挽救了在Sl位點(diǎn)的結(jié)合，變構(gòu)鍵合可能存在于這些位點(diǎn)之間?？偲饋碚f，這些研究說明了將酶原修飾為蛋白酶的轉(zhuǎn)變途徑的獨(dú)特方式且顯示出了發(fā)展酶原樣形式酶的一種可能方式，酶原樣形式酶在強(qiáng)配體結(jié)合諸如輔因子蛋白質(zhì)后被"激活"。表3:FXa和凝血酶原酶抑制的動力學(xué)常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>rwtFXa0.050±0.00248.6±0.60.28士0.01rFXavi7A5x0.295±0.0133x191±6.44x0.05±0.001rFXall6L0.209±0.005143±9.00.09±0.003表4:凝血酶原裂解的動力學(xué)常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>利用顯色底物和活性位點(diǎn)導(dǎo)向抑制劑所獲得的結(jié)果表明酶原樣的FXa變異體以減弱的親和力結(jié)合到活性位點(diǎn)探針。然而，這些變異體組裝到凝血酶原酶中顯著地改進(jìn)了活性位點(diǎn)探針的親和力，暗示出FVa結(jié)合可4免救在活性位點(diǎn)的結(jié)合。下面研究反過程是否也可行，對酶原樣活性位點(diǎn)的占據(jù)影響與FVa的結(jié)合。為了評估這種作B殳，測量FVa與FXaI16L與FXaV17A的結(jié)合常數(shù)。為了達(dá)成這個目的，在存在合成磷脂小嚢和Ca"離子的情況下利用無活性wtFXa的熒光衍生物來培育FVa。復(fù)合物的形成導(dǎo)致熒光信號僅相對于熒光FXa增加。然后添加逐漸增加濃度的非熒光FX,如果其可結(jié)合FVa,那么置換熒光FXa，導(dǎo)致熒光信號的減少。作為對照，添加S195AFXa作為竟?fàn)巹?。這個突變體是無活性的，因?yàn)槠淙鄙俅呋?lián)體的Ser，但是對于FVa具有較高的親和力(表5)。相反，與FXaS195A相比，添加FXaI16L或FXaV17A，這些酶原樣變異體對于FXa的親和力顯著地減小(表5)。下面檢查FXall6L的活性位點(diǎn)的共價占據(jù)是否能夠恢復(fù)與FVa的結(jié)合。為此，利用不可逆的抑制劑(EGR-氯曱基酮)修飾野生型FXa和FXall6L的活性位點(diǎn)，然后重復(fù)實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)顯示出活性位點(diǎn)阻斷的FXall6L以與野生型活性位點(diǎn)阻斷的FXa相同的親和力結(jié)合'FVa膜。這表明酶原樣FXa活性位點(diǎn)的占據(jù)對與FVa的結(jié)合具有直接影響。表5:凝血酶原酶組裝的平衡結(jié)合常數(shù)&士》SD副134士0.177.25±0.6513.81土1.07180±0.42.92±0.20基于酶原樣FXa衍生物在不存在FVa的情況下與活性位點(diǎn)導(dǎo)向探針和抑制劑具有較差的反應(yīng)性，但當(dāng)變異體組裝到凝血酶原酶中時顯然接近正?；钚缘挠^察，下面評價Fxall6L在血漿環(huán)境中的活性。血友病A(未顯示出數(shù)據(jù))或B血漿中摻入(spike)野生型FXa以校正這些血漿的凝結(jié)時間(aPTT);0.1nMwtFXa給出大約32秒的凝結(jié)時間。添加相同濃度的Fxall6L給出大約42秒的凝結(jié)時間，其為相對于wtFXa的大約50%至大約70%的活性，暗示出酶原樣變異體在血漿中具有幾乎正常的凝結(jié)活性。之后監(jiān)視野生型FXa和FXall6L在血友病B血漿中的半衰期。向HB血漿添加蛋白質(zhì)且在不同的時間點(diǎn)，提取混合物的等分試樣且在基于aPTT的測定中進(jìn)行測定。HB血漿的結(jié)果顯示出野生型FXa的相對殘余活性被很快地(<22分鐘)抑制。相反，F(xiàn)xal16L的活性持續(xù)更久的時間，且具有>2小時的估計(jì)半衰期。對于血友病A血漿發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。這些結(jié)果暗示出可能調(diào)節(jié)酶的特征使得其在血漿中具有較長的半衰期且可校正血友病血漿的凝結(jié)時間。下面評價酶原樣FXall6L在血友病的鼠模型中調(diào)節(jié)止血的能力(Schlachterman等人，J.Thromb.Hae歸st"3,2730-2737)。血友病B小鼠的aPTT值(C57BL/6)大約為50至55秒。因子Xall6L(200昭/kg;n=7)或PBS(n=4)經(jīng)由血友病B小鼠的尾靜脈注射。在選定的時間點(diǎn)(5和30分鐘)收集血液且對所有樣品執(zhí)行aPTT。如圖7所示，F(xiàn)Xall6L的輸注導(dǎo)致將aPTT完全才交正為正常動物中可見的水平。這種效應(yīng)維持至少30分鐘，表明分子具有相對較長的體內(nèi)半衰期。PBS的輸注僅具有邊際效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)與上文的體外血漿實(shí)驗(yàn)一致且表明FXall6L和可能其它酶原樣FXa變異體確實(shí)可以有效地調(diào)節(jié)體內(nèi)止血。為了進(jìn)一步測試FXall6L在體內(nèi)的有效性，檢查這種分子在血友病B小鼠尾部受傷后能否4交正血友病B小鼠的出血時間(Schlachterman等人，2005,J.Thromb.Haemost.,3,2730-2737)。在切割尾部的遠(yuǎn)端部分后10分鐘的時段期間測量失血量。在這種類型的測定中，在尾部受傷后，在正常野生型Balb-c小鼠(n=7)的血液損失最小,PBS注射的(n=6)血友病B小鼠(Balbc)中的血液損失量相當(dāng)大(quitesubstantial)(圖8)。相反，在尾部受傷后，450嗎/kg的FXall6L的注射顯著地減小失血總量(n=7)。總之，這些數(shù)據(jù)提供FXaI16L具有改進(jìn)血友病A或B患者中止血的能力的證據(jù)。參考文獻(xiàn)1.Furie,B.andFurie,B.C.(1976)SpectralchangesinbovinefactorXassociatedwithactivationbythevenomcoagulantproteinViperarusselli(與蛇毒凝血蛋白質(zhì)Viperarusselli所致的激活相關(guān)聯(lián)的牛因子X的光譜變化).乂歷o/.C7^附.251，6807-6814.2.Robison,D.,Furie,B.,Furie,B.C.,andBing,D.H.(1980)ActivesiteofbovinefactorX.Characterizationusingsubstitutedbenzamidinesascompetitiveinhibitorsandaffinity-labelingreagents(牛因子X的活性位點(diǎn)。使用取代的苯甲脒作為竟?fàn)幮砸种苿┖陀H和力標(biāo)記試劑的表征).《/&'o/.C/7em.255,2014-2021.3.Keyt,B.，F(xiàn)urie,B.C.，andFurie,B.(1982)StructuraltransitionsinbovinefactorXassociatedwithmetalbindingandzymogenactivation.Studiesusingconformational-specificantibodies(與金屬結(jié)合和酶原激活相關(guān)聯(lián)的牛因子X的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。使用構(gòu)象特異性抗體的研究).J.i5/o/.C7e/7.257，8687-8695.4.Persson,E.,Valcarce,C.，andStenflo,J.(1991)They-carboxyglutamic,acidandepidermalgrowthfactor-likedomainsoffactorX.EffectofisolateddomainsonprothrombinactivationandendothelialcellbindingoffactorX(丫-羧基谷氨酉交和因子X的表皮生長因子樣域。分離的域?qū)δ冈せ詈鸵蜃覺的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的效應(yīng)).J傷o/C/zew266，2458.5.Pe簡n,E.，Hogg,P.J.,andStenflo,J.(993)EffectsofCa2+bindingontheproteasemoduleoffactorXaanditsinteractionwithfactorVa:evidencefortwoGla-independentCabindingsitesinfactorXa(Ca"結(jié)合對因子Xa的蛋白酶模塊的作用和其與因子Va相互作用因子Xa中兩個不依賴Gla的Ca"結(jié)合位點(diǎn)的證據(jù)).C/z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的變異酶原/蛋白酶的核酸，所述核酸任選編碼細(xì)胞內(nèi)PACE/弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸，其具有序列SEQIDNO:2;其中在位置1684-1695的所述核苷酸編碼選自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、Ile-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly的所述氨基酸，所述核酸任選包含在位置2233-2235的核苷酸，其編碼選自Asn或Glu的氨基酸。6.—種根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸所編碼的變異酶原/蛋白酶。7.—種藥用組合物，其在生物相容性載體中包含才艮據(jù)權(quán)利要求3所述的因子Xa變異體。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸，其被克隆到表達(dá)載體內(nèi)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的載體，其選自腺病毒載體、腺病毒相關(guān)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、質(zhì)粒和慢病毒載體。10.—種用于治療需要所述治療的患者的與止血相關(guān)的疾病的方法，包括給予在生物上可接受的栽體中的治療上有效量的根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶原/蛋白酶。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述變異體是前凝血劑且所述疾病選自血友病A和B,與抑制抗體相關(guān)聯(lián)的血友病A和B，凝血因子缺乏癥，維生素K環(huán)氣化物還原酶C1缺乏癥，y羧化酶缺乏癥，與外傷、損傷、血栓形成、血小板減少、中風(fēng)、凝血病、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)相關(guān)聯(lián)的出血，過度抗凝血治療疾病，伯-蘇綜合征，Glanzman血小板無力癥以及貯存池缺損。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述凝血因子是選自下列因子中至少一個因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子xn、因子n和血管性血友病因子。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述過度抗凝血治療疾病是由于肝素、低分子量肝素、五糖、華法林、小分子抗血栓藥和FXa抑制劑的給藥造成。14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述變異體是抗凝血劑且所述疾病選自血栓形成、血小板減少、中風(fēng)和凝血病。15.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中在SEQIDNO:2中位置16、17、18的所述氨基酸選自Leu-Val-Gly、Gly-Val-Gly、Ile-Ala-Gly、Phe-Val-Gly和Ile-Gly-Gly且在位置194的氨基酸選自Asn和Glu。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述變異體以大約10-500嗎/kg的劑量一天至少靜月永內(nèi)給藥一次。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述變異體以大約10-"0嗎/kg的劑量一天至少靜月永內(nèi)給藥一次。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述變異體被嚢封于脂質(zhì)體中或與磷脂或與膠束混合。19.一種表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶原/蛋白酶變異體的宿主細(xì)胞。20.根據(jù)權(quán)利要求3所述的變異酶原/蛋白酶，其中所述變異體展示對于活性位點(diǎn)較低的結(jié)合親和力，當(dāng)與適當(dāng)輔因子結(jié)合時可以恢復(fù)所迷結(jié)合親和力。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的變異體，其中所述輔因子是因子Va。全文摘要本發(fā)明公開了因子Xa變異體和其使用方法。文檔編號A61K38/36GK101356192SQ200680050779公開日2009年1月28日申請日期2006年11月15日優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日發(fā)明者R·M·卡米爾申請人:費(fèi)城兒童醫(yī)院