一種紅菇凝集素的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術中功能蛋白制備方法，具體地說，涉及一種紅菇凝集素的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]紅葫隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、紅葫目、紅葫科、紅葫屬(沿真菌，是一種美味的野生菌根性食藥兼用真菌。該紅菇多年來一直是容縣暢銷名產(chǎn)，成為人們饋贈親朋好友的佳品。由于此菇生境特殊，目前尚未能人工栽培，野生紅菇的價格年年攀升，野生紅菇的開發(fā)與利用已成為國內(nèi)外學者們的研宄熱點。
[0003]凝集素一類具有特異糖結合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結合的非催化結構域，廣泛存在于各種植物、動物、人體的組織器官、真菌和某些病毒中。凝集素最顯著的特點是具有細胞凝集能力，不僅能凝集紅細胞、腫瘤細胞、淋巴細胞、細菌、病毒等，還能特異性識別并結合細菌、病毒、腫瘤細胞表面的糖結構從而抵制其生長，因此凝集素被廣泛用于病原菌的防治、腫瘤的治療、含糖基生物大分子的檢測等方面。
[0004]紅菇含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有關紅菇凝集素的所道。而本發(fā)明通過浸提、沉淀、透析脫鹽、離子交換層析、凝膠層析等過程獲得了紅菇凝集素并具有抑菌活性，因此本發(fā)明在于紅菇活性成分多方位開發(fā)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種紅菇凝集素的制備方法及應用，通過本發(fā)明通過浸提、沉淀、透析脫鹽、離子交換層析、凝膠層析等過程獲得了紅菇凝集素并具有抑菌活性，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0006]本發(fā)明的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，包括以下的工藝步驟:
(I)凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入適量的磷酸鹽緩沖液，于2?6°C中浸提24?48h，四層紗布過濾，濾液經(jīng)8000?12000r/min于4°C下離心20?40min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至75%?80%飽和度，4°C下靜默12?24h，于4°C下以8000?12000r/min速度離心30?60min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。
[0007](2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，將活力峰部分收集，透析除鹽，冷凍干燥。
[0008](3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將活力峰部分收集，透析，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。
[0009]上述步驟(1)、(2)所述的磷酸鹽緩沖液指的是pH值為7.2的內(nèi)含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸緩沖液。
[0010]上述步驟(I)中浸提時的液料比為10:1。
[0011]上述步驟(2)洗脫峰共有4個，其中活力峰指的是第4個洗脫峰。
[0012]上述步驟(3)中將收集到的活力峰經(jīng)過SephadexG-1OO分子篩層析后得到3個蛋白峰，其中活力峰指的是第2個蛋白峰。
[0013]上述步驟(3)獲得的紅菇凝集素具有抑菌活性。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點是:將紅菇子實體粉碎，加入磷酸緩沖液低溫浸提，然后加入硫酸銨沉淀，再經(jīng)離心透析脫鹽，通過DEAE離子交換層析、SephadexG-1OO凝膠層析等純化步驟獲得紅菇凝集素(RLN)。利用本發(fā)明提供的方法制備得到的紅菇凝集素具有抗菌活性，因此本發(fā)明在利于紅菇活性成分多方位開發(fā)利用。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明一種紅菇凝集素的制備方法及應用的凝血活性檢測示意圖。
[0016]圖2為本發(fā)明一種紅菇凝集素的制備方法及應用的抑菌活性示意圖。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，不是對本發(fā)明的限制。
[0018]實施例1
(O凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.015mol/L, pH7.2，內(nèi)含0.15mol/L NaCl )，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入磷酸鹽緩沖液(液料比為10:1)，于2°C中浸提30h，四層紗布過濾，濾液經(jīng)10000r/min于4°C下離心20min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至75%飽和度，4°C下靜默12h，于4°C下以8000r/min速度離心45min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。
[0019](2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，收集第4個洗脫峰部分透析除鹽，冷凍干燥。
[0020](3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將收集第2個蛋白峰部分透析脫鹽，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。
[0021]對紅菇凝集素進行抑菌活性檢測(平板培養(yǎng)法)。
[0022]實施例2
(O凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.015mol/L, pH7.2，內(nèi)含0.15mol/L NaCl )，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入磷酸鹽緩沖液(液料比為10:1 )，于4°C中浸提48h，四層紗布過濾，濾液經(jīng)8000r/min于4°C下離心40min，棄沉淀，收集上清液。加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下靜默30h，于4°C下以12000r/min速度離心30min，收集沉淀物。加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品。
[0023](2)DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，收集第4個洗脫峰部分透析除鹽，冷凍干燥。
[0024](3) SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管。將收集第2個蛋白峰部分透析脫鹽，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。
[0025]對紅菇凝集素進行抑菌活性檢測(平板培養(yǎng)法)。
【主權項】
1.一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于包括以下工藝步驟: 凝集素粗品的提取:紅菇子實體稱重、粉碎、加入少量的磷酸鹽緩沖液，于高速組織搗碎機中搗碎，然后加入適量的磷酸鹽緩沖液，于2?6°C中浸提24?48h，四層紗布過濾，濾液經(jīng)8000?12000r/min于4°C下離心20?40min，棄沉淀，收集上清液，加入固體硫酸錢至75%?80%飽和度，4°C下靜默12?24h，于4°C下以8000?12000r/min速度離心30?60min，收集沉淀物，加入少量的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，透析除鹽，檢測凝血活性，冷凍干燥，得到紅菇凝集素粗制品； DEAE離子交換層析:取步驟(I)所得的紅菇凝集素粗制品，用磷酸鹽緩沖液重新溶解，上樣于DEAE-纖維柱，上樣前柱材料先用磷酸鹽緩沖液平衡三個柱體積，然后以含有0.6mol/L NaCl的pH值為7.2的磷酸緩沖液以流速為30ml/h速度洗脫，將活力峰部分收集，透析除鹽，冷凍干燥； SephadexG-1OO凝膠層析:用蒸餾水平衡柱子，洗脫液為pH值為7.2的0.15mol/L的磷酸緩沖液，流速為40ml/h，3ml/tube約5min收集I管，將活力峰部分收集，透析，冷凍干燥得到紅菇凝集素(RLN)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于步驟(1)、(2)所述的磷酸鹽緩沖液指的是pH值為7.2的內(nèi)含0.15mol/L NaCl的0.015mol/L的磷酸緩沖液。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于步驟(I)中浸提時的液料比為10:1。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于步驟(2)洗脫峰共有4個，其中活力峰指的是第4個洗脫峰。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于步驟(3)中將收集到的活力峰經(jīng)過SephadexG-100分子篩層析后得到3個蛋白峰，其中活力峰指的是第2個蛋白峰。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其特征在于步驟(3)獲得的紅菇凝集素具有抑菌活性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅菇凝集素的制備方法及應用，其制備方法首先將紅菇子實體粉碎，加入磷酸緩沖液低溫浸提，然后加入硫酸銨沉淀，再經(jīng)離心透析脫鹽，通過DEAE離子交換層析、SephadexG-100凝膠層析等純化步驟獲得紅菇凝集素（RLN）。利用本發(fā)明提供的方法制備得到的紅菇凝集素具有抗菌活性，因此本發(fā)明在于紅菇活性成分多方位開發(fā)利用。
【IPC分類】C07K1-36, C07K14-375, C07K1-34, A61P31-00, C07K1-18
【公開號】CN104817633
【申請?zhí)枴緾N201510199934
【發(fā)明人】梁鈞淞, 莫昭展, 韋敏, 甘耀坤
【申請人】玉林師范學院
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月25日