一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的雙標(biāo)簽載體及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，提供一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的雙標(biāo)簽載體及方法，該方法包括pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建、人源SENP2催化域蛋白的制備、pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體構(gòu)建、pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和復(fù)性純化等步驟，得到目標(biāo)蛋白。本發(fā)明將Sumo和Intein這兩種標(biāo)簽整合到同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，可以同時(shí)利用這兩種標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì)，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)最大程度地免受蛋白酶的降解。本發(fā)明可用于大規(guī)模低成本地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模蛋白質(zhì)藥物的純化和復(fù)性，高通量蛋白質(zhì)抗原表達(dá)，和已有蛋白質(zhì)藥物的長(zhǎng)效化改造。
【專利說(shuō)明】一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的雙標(biāo)簽載體及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的雙標(biāo)簽 載體及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 自基因重組技術(shù)發(fā)明以來(lái)（Hannig, G.，and Makrides, S. C. (1998) · Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 16, 54 - 60.),重組蛋白質(zhì)多肽藥物逐漸取代了傳統(tǒng)來(lái)源的蛋白 質(zhì)藥物，比如人重組胰島素基本已經(jīng)完全取代來(lái)自動(dòng)物胰臟的胰島素來(lái)治療糖尿病 (EP2374888A1，EP0437320A1)。目前重組蛋白質(zhì)藥物的市場(chǎng)已經(jīng)在全球范圍內(nèi)達(dá)1400億美 元，而且隨著抗體藥以及其他蛋白類新藥的發(fā)現(xiàn)，這個(gè)市場(chǎng)持續(xù)以高增長(zhǎng)率維持相當(dāng)長(zhǎng)的 一段時(shí)間。
[0003] 重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)也從早期在大腸桿菌宿主中表達(dá)，演化到現(xiàn)在可以在從原 核到真核細(xì)胞，乃至人體細(xì)胞中表達(dá)，滿足一系列不同蛋白質(zhì)的表達(dá)需求。但大腸桿菌仍然 是科研和工業(yè)市場(chǎng)上的首選，其顯著特點(diǎn)是表達(dá)量高（50%總蛋白以上），生長(zhǎng)快（20-30分 鐘細(xì)胞分裂一次），分子生物學(xué)操作簡(jiǎn)單，體系成熟。對(duì)于表達(dá)來(lái)自原核或者溶解度高的蛋 白質(zhì)多肽，大腸桿菌具有首選的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。但是對(duì)于很多來(lái)自真核或者人源的蛋白質(zhì)，在大 腸桿菌中的高產(chǎn)量可溶性表達(dá)是個(gè)難題，很多蛋白質(zhì)的表達(dá)都是以包涵體的形式存在。
[0004] 包涵體是蛋白質(zhì)在大腸桿菌中高速表達(dá)或者沒(méi)有正確的翻譯后修飾導(dǎo)致的蛋白 質(zhì)聚集體。雖然其中的蛋白質(zhì)沒(méi)有活性，但可以屏蔽的蛋白酶的水解而保存完整的序列。如 果有合適的復(fù)性手段就可以完美的解決這個(gè)矛盾。
[0005] 但包涵體蛋白質(zhì)復(fù)性目前仍然被認(rèn)為是世界性難題（ValIe jo, L F.，and Rinas, U. (2004). Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microbial Cell Factories 3，lL)〇 每一 個(gè)蛋白質(zhì)的復(fù)性方法都不盡相同，很難有通用的方法，而且一般主流復(fù)性手段如稀釋 復(fù)性的產(chǎn)率很低，后續(xù)純化工藝難度大。根據(jù)目前蛋白質(zhì)復(fù)性數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)（http:// refold, med. monash. edu. au/)，稀釋復(fù)性的產(chǎn)率一般位于1 %到20%之間，不同蛋白質(zhì)復(fù) 性的效率不一樣且難以預(yù)測(cè)，這給重組人源蛋白質(zhì)藥物的大規(guī)模、低成本生產(chǎn)帶來(lái)很大 的困難。因此在過(guò)去幾十年的蛋白質(zhì)復(fù)性技術(shù)發(fā)展過(guò)程中，科學(xué)家們發(fā)明出多種復(fù)性方 法，包括稀釋法、透析法、柱上復(fù)性以及各種復(fù)性添加劑的開發(fā)（Coutard，B.，Danchin，E. G. J. , Oubelaid, R. , Canard, B. , and Bignon, C. (2012). Single pH buffer refolding screen for protein from inclusion bodies. Protein Expression and Purification 82, 352 - 359.
[0006] Vallejo, L. F. , and Rinas, U. (2004). Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microbial Cell Factories 3,11.
[0007] Vincentelli, R. , Canaan, S. , Campanacci, V. , Valencia, C. , Maurin, D. , Frass inetti, F. , Scappucini-Calvo, L. , Bourne, Y. , Cambillau, C. , and Bignon, C. (2004). High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein Science 13, 2782 - 2792.)。單就復(fù)性成本來(lái)說(shuō)，柱上復(fù)性成本最高，而且需要扎實(shí)的蛋白 質(zhì)純化工藝知識(shí)。但從蛋白質(zhì)折疊數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)來(lái)看，柱上復(fù)性一般都可以給出更好的復(fù) 性效率。
[0008] 對(duì)于目前主流的蛋白質(zhì)藥物生產(chǎn)工藝還是直接純化外源表達(dá)的蛋白質(zhì)作為藥 物。但也有很多蛋白質(zhì)藥物經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾之后被發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)的半衰期大大延長(zhǎng)，可能 原因有修飾屏蔽掉血液中內(nèi)源蛋白酶的降解或者修飾之后分子量的增加降低了被腎小球 過(guò)濾的速率。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾也是復(fù)雜的工程問(wèn)題（Roberts, M. J.，Bentley, M. D.，and Harris, J. M. (2002). Chemistry for peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews 54,459 - 476.)。最早的修飾是通過(guò)自由氨基簡(jiǎn)單的f禹聯(lián)，這種修飾隨 機(jī)性大，無(wú)法獲得均一的化學(xué)修飾。后來(lái)科學(xué)家又開始采用引入半胱氨酸到蛋白質(zhì)序列中， 這個(gè)未形成二硫鍵的半胱氨酸可以提供位點(diǎn)特異性修飾。不過(guò)額外的氨基酸引入不能對(duì)所 有的蛋白質(zhì)都有效，難以兼顧既不影響蛋白質(zhì)藥物自身的活性又可以方便地化學(xué)修飾。
[0009] SUMO標(biāo)簽從開始應(yīng)用到蛋白質(zhì)表達(dá)純化之后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)這種標(biāo)簽不但可以完 全從目標(biāo)蛋白上被特異的蛋白酶SENP剪切掉，而且還可以幫助目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)性（Butt, T. R. , Edavettal, S. C. , Hall, J. P. , and Mattern, M. R. (2005). SUMO fusion technology for difficult-t〇-express proteins. Protein Expression and Purification 43, 1-9.
[0010] Kong, B. , and Guo, G. L. (2011). Enhanced In Vitro Refolding of Fibroblast Growth Factor 15with the Assistance of SUMO Fusion Partner. PLoS ONE 6,e20307.)〇 另外Intein標(biāo)簽一直被用來(lái)作為蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是可以在無(wú)需酶催化的條件 下與目標(biāo)蛋白發(fā)生自剪切反應(yīng)（Carvajal-Valle jos, P. , Pallisse, R. , Mootz, H. D. , and Schmidt, S. R. (2012). Unprecedented rates and efficiencies revealed for new natural split inteins from metagenomic sources. J. Biol. Chem.
[0011] Xu, M. Q. , and Evans Jr, T. C. (2001). Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins. Methods 24,257 - 277·)，而且不會(huì)留下任何 Intein標(biāo)簽上的序列。其另外一個(gè)特性就是，如果Intein是位于目標(biāo)蛋白的C端，自剪切之 后可以在目標(biāo)蛋白質(zhì)末端引入一個(gè)thioester活性基團(tuán)。這種活性基團(tuán)可以特異性地與親 核攻擊基團(tuán)比如半胱氨酸側(cè)鏈自由巰基（-SH)發(fā)生反應(yīng)，這種反應(yīng)被稱為Native Chemical Ligation。也就是說(shuō)這種化學(xué)反應(yīng)可以在保持一般蛋白質(zhì)活性的緩沖液中進(jìn)行。反應(yīng)程度 接近100 %而且特異性強(qiáng)。
[0012] 因此，目前的科研和生產(chǎn)中需要將這兩種標(biāo)簽整合到同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒載體，再最 終獲得位點(diǎn)特異性修飾的目標(biāo)蛋白質(zhì)并將其純化的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的 方法，該方法可用于大規(guī)模低成本地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)藥物的純化和復(fù)性。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0015] -種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體，所述雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體的出發(fā) 載體是IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，所述雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體包含有至少一個(gè)目標(biāo)蛋白N端的 Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ ID No. 2)和目標(biāo)蛋白C端的Intein的DNA序列；所述 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體優(yōu)選為pTWINl質(zhì)粒載體，也可以為pGEX質(zhì)粒載體。
[0016] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0017] 一種用于長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的蛋白，翻譯得到所述蛋白的DNA序列中 包括 SEQ ID No. 3。
[0018] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0019] 一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，包括如下步驟：
[0020] pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建步驟：將Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ ID No. 2)連接入已酶切掉目標(biāo)蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體， 得到pSumo-Intein質(zhì)粒載體；
[0021] 人源SENP2催化域蛋白的制備步驟：將SENP2催化域的DNA序列（包括SEQ ID No. 3)連接入pGEX4Tl質(zhì)粒載體，得到SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體；再將所述SENP2-pGEX4Tl 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、收集純化處理，得到人源SENP2催化域蛋 白；
[0022] 目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟：將目標(biāo)DNA連接入所述 pSumo-Intein質(zhì)粒載體，得到pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體；
[0023] pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和復(fù)性純化步驟：將所述 pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、裂解和消化處理、 孵育處理、復(fù)性處理、自剪切處理、酶切處理、洗脫處理，得到目標(biāo)蛋白。
[0024] 進(jìn)一步地，所述目標(biāo)DNA為proinsulin突變體的DNA序列（包括SEQ ID No. 4) 或GLPl類似物exendin-4突變體的DNA序列（包括SEQ ID No. 5)。
[0025] 進(jìn)一步地，所述人源SENP2催化域蛋白的制備步驟中，
[0026] 所述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取所述SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基 中發(fā)酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液；
[0027] 所述收集純化處理為：先進(jìn)行裂解和消化處理：將所述誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀， 將該沉淀用裂解液懸浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再進(jìn)行 純化處理：將所述消化液離心取上清，在該上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再離心，保留沉 淀，再將該沉淀清洗、洗脫，得到洗脫上清液，即為所述人源SENP2催化域蛋白的溶液。
[0028] 進(jìn)一步地，所述pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和純化復(fù) 性步驟中，
[0029] 所述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培 養(yǎng)基中發(fā)酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液；
[0030] 所述裂解和消化處理為：將所述誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀，將該沉淀用裂解液懸浮， 并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；
[0031] 所述孵育處理為：將所述消化液離心后取沉淀，向該沉淀中加入尿素和二硫蘇糖 醇，得到孵育液；
[0032] 所述復(fù)性處理為：向所述孵育液中加入IMAC樹脂，再加入含有尿素的復(fù)性緩沖 液，清洗后得到復(fù)性樹脂復(fù)合物；
[0033] 所述自剪切處理為：向所述復(fù)性沉淀中加入含有2-巰基乙基磺酸鈉的自剪切緩 沖液，清洗后得到自剪切樹脂復(fù)合物；
[0034] 所述酶切處理為：向所述自剪切樹脂復(fù)合物中加入含有所述人源SENP2催化域蛋 白SENP2的酶切緩沖液，得到酶切樹脂復(fù)合物；
[0035] 所述洗脫處理為：將所述酶切樹脂復(fù)合物清洗后，加入洗脫緩沖液，離心后取上 清，得到目標(biāo)蛋白的溶液。
[0036] 進(jìn)一步地，所述pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建步驟中，所述Sumo3的標(biāo)簽的DNA 序列（包括SEQ ID No. 2)通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng)合成的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 6-15。
[0037] 進(jìn)一步地，所述人源SENP2催化域蛋白的制備步驟中，所述人源SENP2催化域的 DNA序列（包括SEQ ID No. 3)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng)合成 的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 26-43。
[0038] 進(jìn)一步地，所述目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟中，所述 Proinsulin突變體的DNA序列（包括SEQ ID No. 4)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述 Assembly PCR 反應(yīng)合成的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 16-21。
[0039] 進(jìn)一步地，根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特 征在于：所述目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟中，所述對(duì)GLPl類似物 Exendin-4突變體的DNA序列（包括SEQ ID No. 5)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述 Assembly PCR 反應(yīng)合成的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 22-25。
[0040] 柱上復(fù)性純化修飾一體化系統(tǒng)如圖1所示?；诒景l(fā)明方法的大規(guī)模蛋白質(zhì)純化 工藝如圖2所示。
[0041] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果：
[0042] 1、本發(fā)明將Sumo和Intein這兩種標(biāo)簽整合到同一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，通過(guò)SapI酶 切位點(diǎn)可以插入任意一段目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)序列，使得Sumo標(biāo)簽和Intein標(biāo)簽分別位于 目標(biāo)蛋白質(zhì)的N端和C端。這種設(shè)計(jì)不但可以同時(shí)利用這兩種標(biāo)簽的優(yōu)勢(shì)，還可以在大腸 桿菌中表達(dá)時(shí)最大程度地免受蛋白酶的降解。在這種表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)的蛋白質(zhì)如果是以 包涵體的形式表達(dá)，可以在包涵體初步純化之后再進(jìn)行IMAC柱上復(fù)性和酶切。最終經(jīng)過(guò) SENP剪切和Intein自剪切之后獲得的目標(biāo)蛋白一定是復(fù)性成功且可溶的，而且C端引入的 thioester鍵可以通過(guò)與半胱氨酸修飾的脂肪酸或者聚乙二醇進(jìn)行自然化學(xué)連接（Native Chemical Ligation)，從而最終獲得位點(diǎn)特異性修飾的目標(biāo)蛋白質(zhì)。本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)蛋 白質(zhì)表達(dá)純化修飾工藝來(lái)說(shuō)取得了巨大的工藝創(chuàng)新和簡(jiǎn)化，將常規(guī)至少三步蛋白質(zhì)純化過(guò) 程簡(jiǎn)化成一步IMAC變性純化，而且這一步IMAC還整合了柱上復(fù)性過(guò)程以及柱上酶切之后 的 Native Chemical Ligation。
[0043] 2、本發(fā)明促進(jìn)新型蛋白質(zhì)表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建。創(chuàng)新的雙標(biāo)簽設(shè)計(jì)可以允許外源蛋 白質(zhì)在大腸桿菌中以包涵體的形式大量表達(dá)，表達(dá)量超過(guò)總蛋白50%以上，5L的發(fā)酵初 步研究表明可以達(dá)到5g/L的發(fā)酵量。如此高的發(fā)酵量可以滿足糖尿病類蛋白質(zhì)藥物的大 劑量需求。按照當(dāng)前的工藝條件線性放大，5個(gè)1000L的發(fā)酵罐連續(xù)循環(huán)發(fā)酵就可以貢獻(xiàn) IOOOkg/年的生產(chǎn)量，滿足1000萬(wàn)病人一年的用藥量。
[0044] 3、本發(fā)明促進(jìn)柱上復(fù)性工藝的整合。正是由于柱上復(fù)性技術(shù)的使用才能夠進(jìn)行大 規(guī)模高產(chǎn)量的包涵體表達(dá)蛋白質(zhì)藥物。相比傳統(tǒng)方法5%左右的復(fù)性比率，柱上復(fù)性可以實(shí) 現(xiàn)70-90%的復(fù)性比率，經(jīng)過(guò)復(fù)性緩沖液優(yōu)化之后可能達(dá)100%的復(fù)性比率。單在這一步工 藝就可以極大地降低純化損失，提高效率。
[0045] 4、本發(fā)明有利于位點(diǎn)特異性化學(xué)修飾技術(shù)。成品的蛋白質(zhì)藥物如果不經(jīng)修飾，體 內(nèi)的半衰期之后幾分鐘到幾小時(shí)，比如：治療糖尿病的胰島素半衰期是6個(gè)小時(shí)，GLPl是幾 分鐘。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾之后，一般是對(duì)其進(jìn)行PEG修飾，可以成本延長(zhǎng)它們的半衰期，比如已 知GLPl經(jīng)過(guò)修飾之后半衰期可以延長(zhǎng)至7天，胰島素預(yù)期也可以提高到2-3天。
[0046] 5、本發(fā)明可用于大規(guī)模低成本地實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模蛋白質(zhì)藥物的 純化和復(fù)性，高通量蛋白質(zhì)抗原表達(dá)，和已有蛋白質(zhì)藥物的長(zhǎng)效化改造。結(jié)合我們發(fā)明的蛋 白質(zhì)位點(diǎn)特異性聚乙二醇（PEG)修飾及高效蛋白質(zhì)復(fù)性及純化技術(shù)，我們可以實(shí)現(xiàn)低成本 大規(guī)模生產(chǎn)長(zhǎng)效蛋白質(zhì)類藥物，特別是針對(duì)治療糖尿病的蛋白質(zhì)多肽藥物的生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1 :柱上復(fù)性純化修飾一體化系統(tǒng)示意圖。
[0048] 圖2 :基于本發(fā)明方法的大規(guī)模蛋白質(zhì)純化工藝示意圖。
[0049] 圖3 :實(shí)施例2中的SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0050] 圖4 :實(shí)施例1中的pSumo-Intein質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0051] 圖5 :實(shí)施例3中的表達(dá)proinsulin突變體或者GLPl類似物突變體的 pSumo-proinsulin/GLPl-Intein 質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)不意圖。
[0052] 圖6 :實(shí)施例4中的Proinsulin突變體蛋白的復(fù)性純化結(jié)果。蛋白質(zhì)在BL21RP菌 株中以包涵體形式表達(dá)，條帶1-6分別是未誘導(dǎo)的細(xì)菌裂解液，ImM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)的裂解 液，不溶性組分（含包涵體），可溶組分，IMAC穿透液，經(jīng)過(guò)GST柱純化的Proinsulin。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 本發(fā)明提供一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體，其出發(fā)載體是 pTWINl質(zhì)粒載體或者其他IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，包含有至少一個(gè)目標(biāo)蛋白N端的 Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（SEQ ID No. 2)和目標(biāo)蛋白C端的Intein的DNA序列。
[0054] 本發(fā)明提供翻譯得到一種用于長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的蛋白的DNA序列 中包括 SEQ ID No. 3。
[0055] 本發(fā)明提供一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，包括如下步驟：
[0056] 步驟一、pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建：將Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ ID No. 2)連接入已酶切掉目標(biāo)蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的，得到 pSumo-Intein 質(zhì)粒載體。
[0057] Sumo 的標(biāo)簽的 DNA 序列（SEQ ID No. 2)通過(guò) Assembly PCR 反應(yīng)合成，Assembly PCR反應(yīng)合成的Overlap引物序列為SEQ ID NO. 6-15。
[0058] 具體地說(shuō)，本步驟通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot. org/)獲得人Sumo3 蛋白的序列（P55854)，再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http://genomes. urv. es/0PHMIZER/)得到 Sumo3 的 DNA 序列（SEQ ID No. 1)。在此基礎(chǔ)上取其 7-276bp 作 為sumo3tag序列（SEQ ID No. 2)。然后再通過(guò)基因合成這段序列，并將pTWINl(NEB)中的 目標(biāo)蛋白N端Intein序列直換為Sumo3的標(biāo)簽的DNA序列，同時(shí)保留目標(biāo)蛋白C端Intein 序列；通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證得到序列正確的pSumo-Intein質(zhì)粒克隆。本步驟也可以采用pGEX質(zhì) 粒載體作為出發(fā)載體。
[0059] 本步驟也可以將pTWINl質(zhì)粒載體的目標(biāo)蛋白的C端Intein的DNA序列、Sumo3 標(biāo)簽的DNA序列，分別接入其他任何IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，并分別位于目標(biāo)蛋白的 C端和N端，以得到pSumo-Intein質(zhì)粒載體。
[0060] 步驟二、人源SENP2催化域蛋白的制備：將SENP2催化域的DNA序列（包括SEQ ID No. 3)連接入pGEX4Tl質(zhì)粒載體，得到SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體；再將SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒 載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、收集純化處理，得到人源SENP2催化域蛋白；
[0061] 該人源SENP2催化域的DNA序列（SEQ ID No. 3)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成， Assembly PCR 反應(yīng)合成的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 26-43。
[0062] 上述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā) 酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液；
[0063] 上述收集純化處理為：先進(jìn)行裂解和消化處理：將上述誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀， 將該沉淀用裂解液懸浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再進(jìn)行 純化處理：將消化液離心取上清，在該上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再離心，保留沉淀，再 將該沉淀清洗、洗脫，得到洗脫上清液，即為人源SENP2催化域蛋白的溶液。
[0064] 具體地說(shuō)，本步驟通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot. org/)獲得人SENP2 蛋白的序列（Q9P0U3)，再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http://genomes. urv.es/0PIlMIZER/)得到 SENP2 催化 domain (362-589aa)的 DNA 序列（SEQ ID No. 3)。將 這段通過(guò)基因合成得到的序列克隆到GST表達(dá)系統(tǒng)pGEX4Tl中，再采用電轉(zhuǎn)化將SENP2催 化domain在大腸桿菌BL21 (DE3) CodonPlus-RP中表達(dá)，并用IPTG誘導(dǎo)之后采用GST親和 純化。
[0065] 步驟三、目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建：將目標(biāo)DNA連接入 pSumo-Intein質(zhì)粒載體，得到pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體。
[0066] 該目標(biāo)DNA為proinsulin突變體的DNA序列（SEQ ID No. 4)或GLPl類似物 exendin-4 突變體的 DNA 序列（SEQ ID No. 5)。
[0067] Proinsulin 突變體的 DNA 序列（SEQ ID No. 4)，通過(guò) Assembly PCR 反應(yīng)合成， Assembly PCR 反應(yīng)合成的 Overlap 引物序列為 SEQ ID NO. 16-21。
[0068] 對(duì) GLPl 類似物 Exendin-4 突變體的 DNA 序列（SEQ ID No. 5)，通過(guò) Assembly PCR 反應(yīng)合成，Assembly PCR反應(yīng)合成的Overlap引物序列為SEQ ID NO. 22-25。
[0069] 具體地說(shuō)，本步驟中通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot. org/)獲得人 Proinsulin蛋白的序列（P01308)，然后得到原核表達(dá)突變體，包括A鏈和B鏈的序列，中 間用KR作為linker序列分開；再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http:// genomes. urv.es/0PTIMIZER/)的DNA序列（SEQ ID No. 4);再將這段通過(guò)基因合成得到的 序列克隆到pSumo-Intein中。
[0070] 對(duì)GLPl類似物Exendin4采用類似的方法克隆到pSumo-Intein質(zhì)粒中通過(guò) Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GLPl蛋白的序列（P26349)，然后取其氨基酸序列48-86得到原核 表達(dá)突變體。再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http://genomes.urv.es/ OPTIMIZER/)得到其DNA序列（SEQ ID No. 5);再將這段通過(guò)基因合成得到的序列克隆到 pSumo-Intein 中。
[0071] 步驟四、pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和復(fù)性純化：將 pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、裂解和消化處理、 孵育處理、復(fù)性處理、自剪切處理、酶切處理、洗脫處理，得到目標(biāo)蛋白。
[0072] 上述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培 養(yǎng)基中發(fā)酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液；
[0073] 上述裂解和消化處理為：將誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀，將該沉淀用裂解液懸浮，并加 入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；
[0074] 上述孵育處理為：將消化液離心后取沉淀，向該沉淀中加入尿素和二硫蘇糖醇，得 到孵育液；
[0075] 復(fù)性處理為：向孵育液中加入IMAC樹脂，再加入含有尿素的復(fù)性緩沖液，清洗后 得到復(fù)性樹脂復(fù)合物；
[0076] 上述自剪切處理為：向復(fù)性樹脂復(fù)合物中加入含有2-巰基乙基磺酸鈉的自剪切 緩沖液，清洗后得到自剪切樹脂復(fù)合物；
[0077] 上述酶切處理為：向自剪切樹脂復(fù)合物中加入含有人源SENP2催化域蛋白SENP2 的酶切緩沖液，得到酶切樹脂復(fù)合物；
[0078] 上述洗脫處理為：將酶切樹脂復(fù)合物清洗后，加入洗脫緩沖液，離心后取上清，得 到目標(biāo)蛋白的溶液。
[0079] 具體地說(shuō)，本步驟表達(dá)Proinsulin突變體/Exendin4突變體的pSumo-Intein 質(zhì)粒被電轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3) CodonPlus-RP中，篩選到陽(yáng)性克隆后搖瓶培養(yǎng)并采用IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)。變性溶解的包涵體在IMAC親和柱上純化，然后梯度降低變性劑的濃度以使得 Proinsulin 復(fù)性。之后米用 2-mercaptoethanes μ lfonic acid(MESNA)激活 Intein 自剪 切，進(jìn)一步清洗之后再用SENP2酶切，再將目標(biāo)蛋白洗脫。
[0080] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照試劑制 造廠家所建議的條件。
[0081] 實(shí)施例I :pSumo_Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0082] (1)、通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人源化Sumo3蛋白的序列（P55854)，再利用蛋白質(zhì) 序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http://genomes. urv. es/0PTIMIZER/)得到Sumo3的DNA 序列（SEQ ID No. 1)。在此基礎(chǔ)上取其7-276bp作為sumo3tag的序列（SEQ ID No. 2)，同 時(shí)該段序列還包含一點(diǎn)6 XHis標(biāo)簽的序列以便于后期進(jìn)行IMAC親和變性純化。
[0083] (2)、接下來(lái)對(duì)優(yōu)化過(guò)的DNA序列設(shè)計(jì)分段式引物（Gene Design, http ://54. 235. 254. 95/gd/)進(jìn)行基因合成：
[0084] 合成反應(yīng)是通過(guò) Assembly PCR 反應(yīng)（Marchand, J. A.，and Peccoud, J. (2012) · Building block synthesis using the polymerase chain assembly method. Methods Mol. Biol. 852, 3 - 10.)來(lái)完成的。該分段式引物的序列0PM和TPM如SEQ ID NO. 6-15所 示。所有設(shè)計(jì)的Overlap引物（即分段式引物）通過(guò)Sigma公司合成并溶解在水溶液中 形成100 μ M的母液。按照Marchand等人的方法準(zhǔn)備template primer mix (TPM) (SEQ ID NO. 7-14)和outer primer mix(OPM)(SEQ ID NO. 6,15) :TPM所有引物的濃度是300nM，0PM 的所有引物濃度是3 μ M。首先進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)液包括12. 5 μ I HotStar Taq master mix 2X (含有：2· 5μ IlOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0· 5μ I dNTPs(10mM 母液），0· 5μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2·5μ I TPM和10μ 1無(wú) 核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水；反應(yīng)條件是95 °C 15分鐘，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘；然后25個(gè)循 環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘；最后72 °C 3分鐘。
[0085] 將第一輪反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物1 :4稀釋，然后取2μ 1與12. 5μ I HotStar Taq master mix 2Χ(含有：2· 5μ1 IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0·5μ1 dNTPs (IOmM母液）， 0·5μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2·5μ I OPM 和10μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水混合。之后進(jìn)行第二輪PCR，其條件與第一輪條件相 同。PCR產(chǎn)物與GelRed緩沖液混合，然后在1. 5%的瓊脂糖電泳中分離，并切膠純化，純 化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up試劑盒。然后再進(jìn)行TOPO cloning(Life Technologies公司）和測(cè)序鑒定，挑選序列正確的克隆，得到sumo-TOPO質(zhì)粒載體。
[0086] (3)、用NdeI和NcoI (fermentas公司）與該sumo-TOPO質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng),得到含 Sum〇3的標(biāo)簽的DNA片段，然后將該DNA片段再與經(jīng)過(guò)同樣兩種酶消化的pTWINl (NEB公司） 進(jìn)行連接反應(yīng)，即將該DNA片段插入pTWINl質(zhì)粒載體的NdeI、NcoI酶切位點(diǎn)之間。該連接 反應(yīng)液包含Ιμ? pTWINl，3yl sumo片段，Ιμ? IOX 緩沖液，Ιμ? T4DNA ligase，4yl水。 室溫連接20分鐘后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlBlue。挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定，得到pSumo-Intein 質(zhì)粒載體，大小為7003b ;該pSumo-Intein質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。
[0087] 本步驟也可以采用pGEX質(zhì)粒載體等其他IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體作為出發(fā)載 體；還可以將pTWINl質(zhì)粒載體的目標(biāo)蛋白的C端Intein的DNA序列、Sumo3標(biāo)簽的DNA序 列，分別接入其他任何IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，并分別位于目標(biāo)蛋白的C端和N端，以 得到pSumo-Intein質(zhì)粒載體。
[0088] 實(shí)施例2 :人源SENP2催化域蛋白的制備
[0089] (1)、通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人SENP2蛋白的序列（Q9P0U3)，再利用蛋白質(zhì)序 列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（ http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到SENP2催化域 (362_ 589aa)的 DNA 序列（SEQ ID No. 3);
[0090] (2)、接下來(lái)對(duì)優(yōu)化過(guò)的DNA序列設(shè)計(jì)分段式引物（Gene Design, http ://54. 235. 254. 95/gd/)進(jìn)行基因合成：
[0091] 該分段式引物的序列OPM和TPM如SEQ ID NO. 26-43所示。合成反應(yīng)是通過(guò) Assembly PCR 反應(yīng)（Marchand, J. A.，and Peccoud, J. (2012). Building block synthesis using the polymerase chain assembly method. Methods Mol. Biol. 852, 3 - 10.)來(lái)完 成的。所有設(shè)計(jì)的Overlap引物（即分段式引物）通過(guò)Sigma合成并溶解在水溶液中形 成 IOOuM 的母液。按照 Marchand 等人的方法準(zhǔn)備 template primer mix(TPM)(SEQ ID NO. 27-42)和 outer primer mix (OPM) (SEQ ID NO. 26,43) :TPM 所有引物的濃度是 300nM， 0PM的所有引物濃度是3μ M。首先進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)液包括12. 5μ I HotStar Taq master mix 2X(含有：2· 5μ IlOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0·5μ1 dNTPs (IOmM 母液）， 0· 5 μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9 μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2· 5 μ I TPM和 10 μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水；反應(yīng)條件是95°c 15分鐘，55°C 30秒，72°C 1分鐘；然后 25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分鐘；最后72°C 3分鐘。
[0092] 將第一輪反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物1 :4稀釋，然后取2μ 1與12. 5μ I HotStar Taq master mix 2Χ(含有：2· 5μ1 IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0·5μ1 dNTPs (IOmM母液）， 0·5μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2·5μ I OPM 和10μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水混合。之后進(jìn)行第二輪PCR，其條件與第一輪條件相 同。PCR產(chǎn)物與GelRed緩沖液混合，然后在1. 5%的瓊脂糖電泳中分離，并切膠純化，純 化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up試劑盒；然后再進(jìn)行TOPO cloning(Life Technologies公司）和測(cè)序鑒定，挑選序列正確的克隆，得到SENP2-T0P0質(zhì)粒載體。
[0093] (3)、再將SENP2-T0P0質(zhì)粒載體，再對(duì)之進(jìn)行sub-cloning到GST表達(dá)系統(tǒng) PGEX4T1 中：
[0094] 采用BamHI和EcoRI從TOPO質(zhì)粒中剪切得到含SENP2的DNA片段，然后再與經(jīng)過(guò) 同樣酶消化的PGEX4T1載體連接，即將該含SENP2的DNA片段插入pGEX4Tl載體的酶切位 點(diǎn) BamHI 和 EcoRI 之間，得到 SENP2-pGEX4Tl 質(zhì)粒載體，大小為 5650bp。SENP2-pGEX4Tl 質(zhì) 粒載體的結(jié)構(gòu)如圖3所示。連接條件與參見實(shí)施例1。
[0095] (4)、先采用電轉(zhuǎn)化將SENP2-pGEX4T 1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) CodonPlus-RP中誘導(dǎo)表達(dá)：挑取SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在IL LB media中開 始37°C，230rpm發(fā)酵，等到0D600達(dá)到I. 0之后，加入ImM IPTG并在18°C，230rpm過(guò)夜誘 導(dǎo)表達(dá)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液；；
[0096] (5)、再收集純化人源SENP2催化域蛋白：
[0097] a、裂解和消化處理：第二天，于4000rpm，30分鐘離心取大腸桿菌細(xì)胞沉淀，用 IOml 裂解液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100)充分懸浮，并加入溶菌酶 (lysozyme)至0. 5mg/ml降解細(xì)胞壁，冰上孵育30分鐘；待溶液粘稠后放到-80°C冷凍20 分鐘，然后再室溫化冰，如此再重復(fù)兩次；最后加入全能核酸酶（Benzonase) (10U/ml)消化 DNA，得到大腸桿菌細(xì)胞消化液；
[0098] b、純化處理：然后再于14000rpm，30分鐘離心大腸桿菌細(xì)胞消化液取上清；在上 清中加入500 μ 1谷胱甘肽珠 （Glutathione Beads (GE Lifesciences公司）），4°C搖床孵育 10分鐘，離心去除上清；將沉淀用IOml冰上預(yù)冷的裂解液清洗三遍，最后加入350 μ 1洗脫 緩沖液（含有：IOOmM Tris pH 8,15mg/ml還原型谷胱甘肽（Glutathione))洗脫，收集上 清，得到上述人源SENP2催化域蛋白的溶液；采用Pierce公司的protein assay 660nm試 劑盒測(cè)量該溶液的蛋白濃度，約為0. 3mg/ml。
[0099] 實(shí)施例3 :Proinsulin和GLPl類似物在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建
[0100] (I)、pSumo-proinsulin-Intein 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0101] a、通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得人Proinsulin蛋白的序列（P01308)，然后通過(guò)程序 得到原核表達(dá)突變體，該突變體的序列是通過(guò)將Insulin的B鏈和A鏈的序列之間用KR作 為linker序列分開，形成B鏈-KR-A鏈的結(jié)構(gòu)；再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化 服務(wù)（ http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)得到其 DNA 序列（SEQ ID No. 4)。
[0102] b、再對(duì)上述優(yōu)化過(guò)的DNA序列設(shè)計(jì)分段式引物（Gene Design, http ://54. 235. 254. 95/gd/)進(jìn)行基因合成：
[0103] 合成反應(yīng)是通過(guò) Assembly PCR (Marchand, J. A.，and Peccoud, J. (2012) · Building block synthesis using the polymerase chain assembly method. Methods Mol. Biol. 852, 3 - 10.)來(lái)完成的。該分段式引物的序列OPM和TPM如SEQ ID NO. 16-21。 所有設(shè)計(jì)的Overlap引物通過(guò)Sigma合成并溶解在水溶液中形成IOOuM的母液。按照 Marchand等人的方法準(zhǔn)備template primer mix(TPM) (SEQ ID NO. 17-20)和outer primer mix (OPM) (SEQ ID NO. 16, 21) :TPM所有引物的濃度是300nM，0PM的所有引物濃度是3 μ Μ。 首先進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)液包括12. 5 μ I HotStar Taq master mix 2Χ (含有：2. 5 μ I IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0· 5 μ I dNTPs (IOmM 母液），0· 5 μ I HotStar Taq 聚合酶 (Qiagen)，9μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2. 5μ I TPM和10μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙 蒸水；反應(yīng)條件是95 °C 15分鐘，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘；然后25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 °C 30 秒，55 °C 30秒，72 °C 1分鐘；最后72 °C 3分鐘。
[0104] 將第一輪反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物1 :4稀釋，然后取2μ 1與12. 5μ I HotStar Taq master mix 2Χ(含有：2· 5μ1 IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0·5μ1 dNTPs (IOmM母液）， 0· 5 μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9 μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2· 5 μ I OPM和 ?〇μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水混合。之后進(jìn)行第二輪PCR，其條件與第一輪條件相同。 PCR產(chǎn)物與GelRed緩沖液混合，然后在1. 5%的瓊脂糖電泳中分離，并切膠純化。純化采 用Macherey-Nagel公司的PCR clean up試劑盒純化。然后再進(jìn)行Τ0Ρ0 cloning(Life Technologies公司）和測(cè)序鑒定，挑選序列正確的克隆，得到Proinsulin-TOPO質(zhì)粒載體。
[0105] c、然后用SapI酶切Proinsulin-TOPO質(zhì)粒載體，得到含有proinsulin突變體的 DNA片段，再與同樣經(jīng)過(guò)SapI消化的實(shí)施例1得到的pSumo-Intein質(zhì)粒載體連接，即將含 有proinsulin突變體的DNA片段插入pSumo-Intein質(zhì)粒載體的SapI位點(diǎn)之間；再轉(zhuǎn)化， 挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定，得到pSumo-proinsulin-Intein質(zhì)粒載體，大小為7120bp。
[0106] (2)、pSumo-GLPl-Intein 質(zhì)粒載體的構(gòu)建
[0107] a、對(duì)GLPl 類似物 exendin-4 (SEQ ID NO. 5)采用類似的方法克隆到 pSumo-Intein 質(zhì)粒中：通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GLPl蛋白的序列（P26349)，然后取其氨基酸序列48-86 得到原核表達(dá)突變體；再利用蛋白質(zhì)序列反翻譯以及密碼子優(yōu)化服務(wù)（http://genomes. urv. es/0PHMIZER/)得到其 DNA 序列（SEQ ID No. 5)。
[0108] b、再對(duì)優(yōu)化過(guò)的DNA序列設(shè)計(jì)分段式引物（Gene Design, http ://54. 235. 254. 95/gd/)進(jìn)行基因合成：
[0109] 合成反應(yīng)是通過(guò) Assembly PCR (Marchand, J. A.，and Peccoud, J. (2012) · Building block synthesis using the polymerase chain assembly method. Methods Mol. Biol. 852, 3 - 10.)來(lái)完成的。該分段式引物序列如SEQ ID NO. 22-25。
[0110] 所有設(shè)計(jì)的Overlap引物通過(guò)Sigma公司合成并溶解在水溶液中形成100 μ M的 母液。按照 Marchand 等人的方法準(zhǔn)備 template primer mix (TPM) (SEQ ID NO. 23-24)和 outer primer mix(0PM)(SEQ ID Ν0·22,25) :TPM所有引物的濃。C是300nM，0PM的所有引物 濃度是3 μ Μ。首先進(jìn)行第一輪PCR，反應(yīng)液包括12. 5 μ I HotStar Taq master mix 2Χ (含 有：2. 5 μ I IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0· 5 μ I dNTPs (IOmM 母液），0· 5 μ I HotStar Taq 聚合酶（Qiagen)，9 μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2. 5 μ I TPM和10 μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋 白酶的雙蒸水。反應(yīng)條件是95°C 15分鐘，55°C 30秒，72°C 1分鐘；然后25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循 環(huán)為95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分鐘；最后72°C 3分鐘。
[0111] 將第一輪反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物I :4稀釋，然后取2μ 1與12. 5μ I HotStar Taq master mix 2Χ(含有：2· 5μ1 IOxThermoPol 緩沖液（NEB)，0·5μ1 dNTPs (IOmM母液）， 0·5μ I HotStar Taq聚合酶（Qiagen)，9μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水），2·5μ I OPM 和10μ 1無(wú)核酸酶無(wú)蛋白酶的雙蒸水混合。之后進(jìn)行第二輪PCR，其條件與第一輪條件相 同。PCR產(chǎn)物與GelRed緩沖液混合，然后在1.5 %的瓊脂糖電泳中分離，并切膠純化。純 化采用Macherey-Nagel公司的PCR clean up試劑盒。然后再進(jìn)行TOPO cloning(Life Technologies公司）和測(cè)序鑒定，挑選序列正確的克隆，得到GLP1-T0P0質(zhì)粒載體。
[0112] c、然后用SapI酶切GLP1-T0P0質(zhì)粒載體，得到含有GLPl突變體的DNA片段，再與 同樣經(jīng)過(guò)SapI消化的實(shí)施例1得到的pSumo-Intein質(zhì)粒載體連接，即將含有GLPl突變體 的DNA片段插入pSumo-Intein質(zhì)粒載體的SapI位點(diǎn)之間；再轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒 定，得到pSumo-GLPl-Intein質(zhì)粒載體，大小為7078bp。
[0113] 本實(shí)施例構(gòu)建的2種質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖5所示，。
[0114] 實(shí)施例4 :兩種雙標(biāo)簽表達(dá)載體在大腸桿菌中的原核表達(dá)和復(fù)性純化
[0115] (I)、Proinsulin雙標(biāo)簽表達(dá)載體在大腸桿菌中的原核表達(dá)和復(fù)性純化
[0116] a、誘導(dǎo)表達(dá)處理：表達(dá)Proinsulin的pSumo-Intein質(zhì)粒（即：實(shí)施例3得到的 pSumo-proinsulin-Intein 質(zhì)粒載體）被電轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3) CodonPlus-RP 中，篩選到陽(yáng)性 克隆后搖瓶培養(yǎng)并采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：挑取pSumo-proinsulin-Intein質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克 隆在IL LB media中開始37°C，230rpm發(fā)酵，等到0D600達(dá)到1.0之后，加入ImM IPTG并 在37°C，230rpm誘導(dǎo)4小時(shí)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液。
[0117] b、裂解和消化處理：然后于4000rpm，30分鐘離心取大腸桿菌細(xì)胞沉淀，用IOml 裂解緩沖液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100)充分懸浮，并加入溶菌酶 (lysozyme)至0. 5mg/ml降解細(xì)胞壁，冰上孵育30分鐘；待溶液粘稠后放到-80°C冷凍20 分鐘，然后再室溫化冰，如此再重復(fù)兩次；最后加入全能核酸酶（Benzonase) (10U/ml)消化 DNA，得到大腸桿菌消化液。
[0118] c、孵育處理：于14000rpm，30分鐘離心大腸桿菌消化液，分離可溶性組分（上清） 和不溶性組分（沉淀）；將不溶性組分再以每6ml加入4. 2g尿素（Urea)以獲得最終濃度 大約是6M Urea的溶液，然后再加入終濃度為IOmM的二硫蘇糖醇（DTT)(母液IM DTT，100 倍稀釋），于室溫孵育8小時(shí)以獲得孵育液，即為充分溶解的包涵體的溶液。
[0119] d、復(fù)性處理：將上述孵育液約20ml中加入Iml IMAC樹脂（resin) (Qiagen公 司），室溫結(jié)合10分鐘，2000RPM，1分鐘離心收集上清作為穿透組分；然后分別用IOml含 有 4M 尿素（Urea)，2M Urea 和 0· 5M Urea 的復(fù)性緩沖液（還含有 IOmM tris pH 10. 5, IOmM glycine, ImM cysteine, IOmM cystine)孵育樹脂（即前次離心后的沉淀）各20分鐘后于 2000RPM，1分鐘離心去除上清，得到復(fù)性樹脂復(fù)合物。
[0120] e、自剪切處理：然后向復(fù)性樹脂復(fù)合物中（即前次離心后的沉淀）加入lml2_巰 基乙基磺酸鈉（MESNA)自剪切緩沖液（50mM MESNA，50mM tris pH 8,150mM NaCl)在 4°C 孵育24小時(shí)，然后再用20ml清洗緩沖液（50mM tris pH7. 5, 150mM NaCl)清洗兩次各5分 鐘，并在每次清洗之后用2000RPM，1分鐘離心去除上清。
[0121] f、酶切處理：然后向上述復(fù)性樹脂復(fù)合物（即前次離心后的沉淀）加入Iml SENP2 酶切緩沖液（30yg/ml SENP2,50mM tris pH 7. 5，150mM NaCl)進(jìn)行酶切（該 SENP2 是將 實(shí)施例2得到的人源SENP2催化域蛋白稀釋后得到），酶切條件是室溫4小時(shí)，得到酶切樹 脂復(fù)合物。
[0122] g、洗脫處理：然后用清洗緩沖液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl)將酶切樹脂復(fù) 合物清洗兩次各5分鐘，并在每次清洗之后用2000RPM，1分鐘離心去除上清；最后，再向樹 脂中（即前次離心后的沉淀）加入800 μ 1洗脫緩沖液（500mM咪唑（Imidazole)，50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl)，再于2000RPM，1分鐘離心，取上清，該上清為Proinsulin突變體蛋白 的溶液；如此，Proinsulin突變體蛋白就被洗脫下來(lái)作為復(fù)性洗脫組分。
[0123] h、檢測(cè)：為了檢測(cè)誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)表達(dá)處理前后各取Iml菌液，離心取上清后加入 100 μ I Laemmli上樣緩沖液溶解所有蛋白質(zhì)，分別作為未誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)裂解液；最后所 有組分都在15%的SDS-PAGE電泳上分離之后，采用GelCode Blue Stain染色（Pierce公 司）。結(jié)果如圖6所示。通過(guò)比較IPTG誘導(dǎo)條帶和未誘導(dǎo)條帶（條帶2和1相比）可以看 出經(jīng)過(guò)ImM IPTG誘導(dǎo)之后可以明顯看出誘導(dǎo)表達(dá)的外源雙標(biāo)簽融合蛋白（含proinsulin 突變體）。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)之后，融合蛋白的表達(dá)量占總蛋白含量的32.7%。通過(guò)比較條帶3和 4可以發(fā)現(xiàn)，絕大部分融合蛋白表達(dá)屬于不可溶組分，作為包涵體形式表達(dá)。經(jīng)過(guò)變性溶解 IMAC親和純化之后，穿透組分中基本沒(méi)有融合蛋白，表明IMAC親和純化結(jié)合效率很高，沒(méi) 有發(fā)生泄露。最終經(jīng)過(guò)復(fù)性純化酶切之后可以得到單一條帶純度的目標(biāo)蛋白，經(jīng)過(guò)Image J 定量之后純度有89. 8%。如果通過(guò)調(diào)節(jié)Imidazole濃度梯度還可以進(jìn)一步提高純度。
[0124] (2)、ExendiM雙標(biāo)簽表達(dá)載體在大腸桿菌中的原核表達(dá)和復(fù)性純化
[0125] a、表達(dá) Exendin4 的 pSumo-Intein 質(zhì)粒（即：實(shí)施例 3 得到的 pSum〇-GLPl_Intein 質(zhì)粒載體）被電轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)CodonPlus-RP中，篩選到陽(yáng)性克隆后搖瓶培養(yǎng)并采用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)：挑取pSumo-GLPl-Intein質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在IL LB培養(yǎng)基中開始 37°C，230rpm發(fā)酵，等到0D600達(dá)到LO之后，加入ImM IPTG并在37°C，230rpm誘導(dǎo)4小 時(shí)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液。
[0126] b、裂解和消化處理：然后于4000rpm，30分鐘離心取大腸桿菌細(xì)胞沉淀，用IOml 裂解緩沖液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100)充分懸浮，并加入溶菌酶 (lysozyme)至0. 5mg/ml降解細(xì)胞壁，冰上孵育30分鐘；待溶液粘稠后放到-80°C冷凍20 分鐘，然后再室溫化冰，如此再重復(fù)兩次；最后加入全能核酸酶（Benzonase) (10U/ml)消化 DNA，得到大腸桿菌消化液。
[0127] c、孵育處理：于14000rpm，30分鐘離心大腸桿菌消化液，分離可溶性組分（上清） 和不溶性組分（沉淀）；將不溶性組分再以每6ml加入4. 2g尿素（Urea)以獲得最終濃度 大約是6M Urea的溶液，然后再加入終濃度為IOmM的二硫蘇糖醇（DTT)(母液IM DTT，100 倍稀釋），于室溫孵育8小時(shí)以獲得孵育液，即為充分溶解的包涵體的溶液。
[0128] d、復(fù)性處理：將上述孵育液約20ml中加入Iml IMAC樹脂（resin) (Qiagen公 司），室溫結(jié)合10分鐘，2000RPM，1分鐘離心收集上清作為穿透組分。然后分別用IOml含 有 4M尿素（Urea)，2M Urea 和 0· 5M Urea 的復(fù)性緩沖液（還含有 IOmM tris pH 10. 5, IOmM glycine, ImM cysteine, IOmM cystine)孵育樹脂（即前次離心后的沉淀）各20分鐘后于 2000RPM，1分鐘離心去除上清，得到復(fù)性樹脂復(fù)合物。
[0129] e、自剪切處理：然后向復(fù)性樹脂復(fù)合物中（即前次離心后的沉淀）加入lml2_巰 基乙基磺酸鈉（MESNA)自剪切緩沖液（50mM MESNA，50mM tris pH 8，150mM NaCl)在4°C孵 育24小時(shí)，然后再用20ml清洗緩沖液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl)清洗兩次各5分 鐘，并在每次清洗之后用2000RPM，1分鐘離心去除上清。
[0130] f、酶切處理：然后再向自剪切樹脂復(fù)合物中（即前次離心后的沉淀）加入Iml SENP2 酶切緩沖液（30yg/ml SENP2,50mM tris pH 7.5，150mM NaCl)進(jìn)行酶切（該 SENP2 是將實(shí)施例2得到的人源SENP2催化域蛋白稀釋后得到），酶切條件是室溫4小時(shí)，得到酶 切樹脂復(fù)合物。
[0131] g、洗脫處理：然后用清洗緩沖液（50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl)將酶切樹脂復(fù) 合物清洗兩次各5分鐘，并在每次清洗之后用2000RPM，1分鐘離心去除上清；最后，再向樹 脂中（即前次離心后的沉淀）加入800 μ 1洗脫緩沖液（500mM咪唑（Imidazole)，50mM tris pH 7. 5, 150mM NaCl)，再于2000RPM，1分鐘離心，取上清，該上清為Exendin-4突變體蛋白 的溶液；就這樣，Exendin-4突變體蛋白就被洗脫下來(lái)作為復(fù)性洗脫組分。
[0132] h、檢測(cè)：為了檢測(cè)誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)表達(dá)處理前后各取Iml菌液，離心取上清后加入 100 μ I Laemmli上樣緩沖液溶解所有蛋白質(zhì)分別作為未誘導(dǎo)和IPTG誘導(dǎo)裂解液。最后所 有組分都在15%的SDS-PAGE電泳上分離之后，采用GelCode Blue Stain染色（Pierce公 司），最后可以得到與上述pSumo-insulin-Intein質(zhì)粒載體相似的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1. 一種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體，其特征在于：所述雙標(biāo)簽質(zhì)粒 載體的出發(fā)載體是IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，所述雙標(biāo)簽質(zhì)粒載體包含有至少一個(gè)目標(biāo) 蛋白N端的Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ IDNo. 2)和目標(biāo)蛋白C端的Intein的DNA 序列；優(yōu)選地，所述IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體為pTWINl質(zhì)粒載體或pGEX質(zhì)粒載體。
2. -種用于長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的蛋白，其特征在于：翻譯得到所述蛋白的 DNA序列中包括SEQ ID No. 3。
3. -種長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟： pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建步驟：將Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ ID No. 2) 連接入已酶切掉目標(biāo)蛋白的N端的Intein的DNA序列的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒載體，得到 pSumo-Intein 質(zhì)粒載體； 人源SENP2催化域蛋白的制備步驟：將SENP2催化域的DNA序列（包括SEQ ID No. 3) 連接入PGEX4T1質(zhì)粒載體，得到SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體；再將所述SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載 體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、收集純化處理，得到人源SENP2催化域蛋白； 目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟：將目標(biāo)DNA連接入所述 pSumo-Intein質(zhì)粒載體，得到pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體； pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和復(fù)性純化步驟：將所述 pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)處理、裂解和消化處理、 孵育處理、復(fù)性處理、自剪切處理、酶切處理、洗脫處理，得到目標(biāo)蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述目標(biāo) DNA為proinsulin突變體的DNA序列（包括SEQ ID No. 4)或GLP1類似物exendin-4突變 體的DNA序列（包括SEQ ID No. 5)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述 人源SENP2催化域蛋白的制備步驟中， 所述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取所述SENP2-pGEX4Tl質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā) 酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液； 所述收集純化處理為：先進(jìn)行裂解和消化處理：將所述誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀，將該 沉淀用裂解液懸浮，并加入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液；再進(jìn)行純化 處理：將所述消化液離心取上清，在該上清中加入谷胱甘肽珠，孵育后再離心，保留沉淀，再 將該沉淀清洗、洗脫，得到洗脫上清液，即為所述人源SENP2催化域蛋白的溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于： pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體在表達(dá)宿主菌的表達(dá)和純化復(fù)性步驟中， 所述誘導(dǎo)表達(dá)處理為：挑取pSumo-目標(biāo)DNA-Intein質(zhì)粒載體的陽(yáng)性克隆在LB培養(yǎng)基 中發(fā)酵，再加入IPTG誘導(dǎo)，得到誘導(dǎo)表達(dá)液； 所述裂解和消化處理為：將所述誘導(dǎo)表達(dá)液離心取沉淀，將該沉淀用裂解液懸浮，并加 入溶菌酶孵育，再加入全能核酸酶消化，得到消化液； 所述孵育處理為：將所述消化液離心后取沉淀，向該沉淀中加入尿素和二硫蘇糖醇，得 到孵育液； 所述復(fù)性處理為：向所述孵育液中加入IMAC樹脂，再加入含有尿素的復(fù)性緩沖液，清 洗后得到復(fù)性樹脂復(fù)合物； 所述自剪切處理為：向所述復(fù)性樹脂復(fù)合物中加入含有2-巰基乙基磺酸鈉的自剪切 緩沖液，清洗后得到自剪切樹脂復(fù)合物； 所述酶切處理為：向所述自剪切樹脂復(fù)合物中加入含有所述人源SENP2催化域蛋白 SENP2的酶切緩沖液，得到酶切樹脂復(fù)合物； 所述洗脫處理為：將所述酶切樹脂復(fù)合物清洗后，加入洗脫緩沖液，離心后取上清，得 到目標(biāo)蛋白的溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述 pSumo-Intein質(zhì)粒載體的構(gòu)建步驟中，所述Sumo的標(biāo)簽的DNA序列（包括SEQ ID No. 2) 通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng)合成的Overlap引物序列為SEQ ID NO. 6-15。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述 人源SENP2催化域蛋白的制備步驟中，所述人源SENP2催化域的DNA序列（包括SEQ ID No. 3)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng)合成的Overlap引物序列為 SEQ ID NO. 26-43。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述 目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟中，所述Proinsulin突變體的DNA序列 (包括SEQ ID No. 4)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng)合成的Overlap 引物序列為SEQ ID NO. 16-21。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物表達(dá)復(fù)性修飾的方法，其特征在于：所述 目標(biāo)DNA在pSumo-Intein系統(tǒng)中的質(zhì)粒構(gòu)建步驟中，所述對(duì)GLP1類似物Exendin-4突變 體的DNA序列（包括SEQ ID No. 5)，通過(guò)Assembly PCR反應(yīng)合成，所述Assembly PCR反應(yīng) 合成的Overlap引物序列為SEQ ID NO. 22-25。
【文檔編號(hào)】C07K14/62GK104263747SQ201410486804
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月22日
【發(fā)明者】程永升, 吳雪萍 申請(qǐng)人:程永升, 吳雪萍