專利名稱：β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶(TviCel5A)基因的克隆及表達的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于綠色木霉(Trichoderma viride)WL 0422的一種β _1，4_內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列的克隆及表達，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維素酶(Cellulase)是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單成分酶，而是由多個酶起協(xié)同作用的多酶體系，纖維素酶是由外切葡聚糖酶 (exo-cellobiohydrolases, CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases, EG)以及 β -葡聚糖苷酶(i3-glUCOsidases，BG)組成復(fù)合酶系。其中內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶系最主要的成分， 它首先作用于纖維素，隨機水解纖維素分子內(nèi)部的糖苷鍵，將纖維素鏈打斷，它對整個纖維素的降解過程中起關(guān)鍵的作用。綠色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和康寧木霉(Trichoderma koningii)等是近年來研究較多的產(chǎn)纖維素酶絲狀真菌。木霉所產(chǎn)的纖維素酶系統(tǒng)包括5種內(nèi)切葡聚糖酶，即EG I,EG II、EGIII、EGIV和EGV， 而EG II是主要作用成分。隨著纖維素酶的廣泛應(yīng)用，關(guān)于纖維素酶的研究也越來越多，目前人們已經(jīng)從20多種細菌和數(shù)種真菌中克隆得到百余個纖維素酶的基因，其中一些酶的基因核苷酸序列已被測定并在大腸桿菌和酵母中得到了表達?；虻目寺〖瓤梢灾苯佑糜谘芯棵傅慕Y(jié)構(gòu)與功能，也可為酶的合成調(diào)控與降解機制研究提供了工具與手段。畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的真核表達系統(tǒng)，其不僅具有大腸桿菌繁殖快、易于培養(yǎng)、遺傳操作簡單和易于工業(yè)化生產(chǎn)等原核生物的特點，還具有真核生物基因表達調(diào)控和蛋白修飾功能，如糖基化、蛋白磷酸化等，避免了產(chǎn)物形成包涵體，活性降低等問題?；谝陨显?，畢赤酵母是表達木霉內(nèi)切葡聚糖酶較好的系統(tǒng)之

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種T. VirideWL 0422菌株β-1，4_內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA 序列克隆，β-內(nèi)切葡聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組β-內(nèi)切葡聚糖酶的高效表達和純化方法。生物信息學(xué)分析表明，來源于Τ. viride Wi)422菌株的β-內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi Cel5A，其相應(yīng)的基因命名為Tvi cel5A。Tvi Cel5A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，具有較大的研究和應(yīng)用潛力。T. viride WL 0422菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，該菌株已于2006年在《江蘇食品與發(fā)酵》雜志的No. 1 Pg. 1公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。本發(fā)明的技術(shù)方案一種來源于T. VirideffL 0422的第5家族葡聚糖酶基因(Tvi cel5A)，其 cDNA 序列為 SEQ ID NO :1。所述的由完整cDNA推導(dǎo)的Tvi Cel5A氨基酸序列為SEQ ID NO :2。所述的重組Tvi Cel5A的活性測定方法于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH 5. 0、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0.5%的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2. 4mL，50°C預(yù)熱lOmin，在A管中加入 0. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應(yīng)15min，立即各加入2. 5mL 3'，5' —二硝基水楊酸 (DNS)試劑，在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ；冷卻后各加去離子水5mL， 搖勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從葡萄糖標準曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以葡萄糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ mol還原糖所需的酶量定義為1個β -1,4-內(nèi)切葡聚糖酶活性單位(U)。所述的Tvi Cel5A成熟肽基因的克隆和表達方法(I)Tvi Cel5A cDNA序列的克隆基于綠色木霉Tvi Cel5A成熟肽基因cDNA序列設(shè)計兩條引物PPIC9KN和pPIC9KC，擴增成熟肽基因pPIC9KN 5' -CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3 ‘，含 EcoR I 酶切位點pPIC9KC 5' -CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3 ‘，含 Not I 酶切位點按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver. 3. 0)說明書進行 RT-PCR。以 Oligo dT-Adaptor I^rimer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和pPIC9KN為引物進行第一輪PCR;以pPIC9KN和pPIC9KC為引物進行第二輪PCR。將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，并割膠回收目的條帶。(2)含編碼Tvi Cel5A成熟肽基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用EcoR I和Not I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Tvi cel5A(圖1)， 并對重組表達質(zhì)粒進行序列測定。(3)GS115/Tvi cel5A重組子的構(gòu)建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用Ml I對 pPIC9K-Tvi cel5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Tvi cel5A ；按照手冊上的標準流程進行誘導(dǎo)表達，用DNS法測定重組葡聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的目的是提供一種Τ. viride WL 0422菌株β-I，4_內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列克隆，β -內(nèi)切葡聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組β -內(nèi)切葡聚糖酶的高效表達和純化方法。生物信息學(xué)分析表明，來源于Τ. virideWL 0422菌株的β -內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi Cel5A，其相應(yīng)的基因命名為Tvi cel5A。 TviCel5A具有較好的pH穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力以及經(jīng)濟價值，也為其它葡聚糖酶的研究奠定了基礎(chǔ)。


圖1 重組質(zhì)粒pPIC9K_Tvi cel5A示意圖
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1 Tvicel5A cDNA序列的克隆以01 igo dT-Adaptor Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以
4M13 Primer M4和pPIC9KN為引物進行第一輪PCR，其反應(yīng)條件為94°C anin，30個循環(huán) (94°C 30s，54°C 30s, 72°C 45s)，72°C IOmin ；以 pPIC9KN和 pPIC9KC 為引物進行第二輪 PCR， 其反應(yīng)條件為94 °C 2min，30 個循環(huán)(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s), 72 °C IOmin0 將兩輪 PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，并割膠回收目的條帶。實施例5含編碼TviCel5A成熟肽基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建使用EcoR I和Not I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，酶切時間為4h，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下連接過夜(> 1 1)，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-Tvi cel5A(圖1)，并對重組表達質(zhì)粒進行序列測定。實施例6 GS115/Tvi cel5A的構(gòu)建、表達、產(chǎn)物純化及活性測定用Ml I對pPIC9K_Tvi cel5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)化、 篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Tvi cel5A。該工程菌用5.0%甲醇誘導(dǎo)120h， DNS法測得發(fā)酵液中重組葡聚糖酶活性達2788IU/mL。離心上清液為重組葡聚糖酶粗酶液， 經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再經(jīng)DEAE-kpharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組葡聚糖酶分子量為42kDa。該重組葡聚糖酶最適作用溫度50°C，最適作用pH 4.5，該酶在？!1 3. 5 6. 0、55°C以下穩(wěn)定。 權(quán)利要求
1.一種來源于T. VirideWL 0422的第5家族內(nèi)切葡聚糖酶基因(Tvi cel5A)，其mRNA 序列對應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO :1ο
2.由權(quán)利要求1所述的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因(Tvicel5A)編碼的β_1，4_內(nèi)切葡聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :2。
3.綠色木霉札0422Tvi Cel5A成熟肽cDNA序列的獲取方法基于綠色木霉Tvi Cel5A成熟肽基因cDNA序列設(shè)計兩條引物pPIC9KN和pPIC9KC，擴增成熟肽基因PPIC9KN 5' -CCCAAGCTTCTACTTTCTTGCGAGACACGA-3'，含 EcoR I 酶切位點PPIC9KC 5' -CGGAATTCCAGCAGACTGTCTGG-3 ‘，含 Not I 酶切位點按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)說明書進行RT-PCR ；以 Oligo dT-Adaptor Primer 為引物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；以M13 Primer M4和pPIC9KN為引物進行第一輪 PCR ；以pPIC9KN和pPIC9KC為引物進行第二輪PCR ；將兩輪PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，并割膠回收目的條帶。
4.含編碼TviCel5A成熟肽基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達方法(1)使用EcoRI和Not I對割膠回收的目的基因與pPIC9K分別進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-Tvi cel5A(圖1)， 并對重組表達質(zhì)粒進行序列測定；(2)用MlI對pPIC9K-Tvi cel5A進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Tvi cel5A;按照手冊上的標準流程進行誘導(dǎo)表達，用DNS法測定重組葡聚糖酶活性；發(fā)酵液經(jīng)冷凍離心、超濾、離子交換層析和凝膠過濾層析，獲得了電泳純的重組β_1，4-內(nèi)切葡聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種源自T.virideWL 0422菌株β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶基因cDNA序列克隆，β-內(nèi)切葡聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組β-內(nèi)切葡聚糖酶的高效表達和純化方法，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。生物信息學(xué)分析表明，來源于T.virideWL 0422菌株的β-內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶第5家族，命名為Tvi Cel5A，其氨基酸序列為SEQ ID NO2，其相應(yīng)的基因命名為Tvi cel5A。Tvi Cel5A具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，具有較大的研究和應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N15/56GK102392034SQ20111041045
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者汪俊卿, 羅秋玲, 鄔敏辰, 陳忠法, 龔燕燕 申請人:江南大學(xué)