dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的雙鏈RNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，所述酶含有位于雙鏈RNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)，在雙鏈RNA切割中呈現(xiàn)序列特異性。
【專利說明】dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明主題為顯示雙鏈RNA (dsRNA)序列特異性切割活性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法、獲得具有在dsRNA切割中序列選擇性改變的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶衍生物和/或變體的方法、基因構(gòu)建體、宿主細(xì)胞、編碼dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的基因在生產(chǎn)dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途、試劑盒和顯示dsRNA內(nèi)切核糖核酸水解活性的酶。
【背景技術(shù)】
[0002]分子生物學(xué)的基本工具之一為具有明確定義活性的蛋白，其用于例如基因工程、診斷學(xué)、醫(yī)學(xué)和多種產(chǎn)品的生產(chǎn)和加工工業(yè)。
[0003]DNA限制性內(nèi)切核酸酶為序列依賴性酶，其識(shí)別和切割雙鏈DNA的特定序列。還已經(jīng)知道在給定序列切割RNA的酶，然而，這樣的酶作用于RNA的單鏈位點(diǎn)。這些酶的實(shí)例包括噬菌體蛋白R(shí)egB (在序列GGAG的中間切割單鏈RNA)和核糖核酸酶Y (在富含A或AU的序列中切割單鏈RNA)。這些酶需要額外的決定因素以便有效切割，例如RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和在RegB的情況下與核糖體蛋白SI的相互作用(Lebars, 1.，等，J Biol Chem (2001) 276，13264-13272 ；Saida, F.等，(2003) Nucleic Acids Res, 31，2751-2758和Shahbabian,K.等，The EMBO Journal (2009) 28，3523 - 3533)。還嘗試了改變核糖核酸酶 Tl 和核糖核酸酶MCl 的特異性(Hoschler, K.等 J Mol Biol, (1999) 294，1231-1238 ；Numata,T.等，Biochemistry, (2003) 42，5270 - 5278)。在這兩種情況下，產(chǎn)生了特異性增強(qiáng)(從一個(gè)核苷酸到兩個(gè)核苷酸)的酶變體(Numata, T.等，Biochemistry, (2003) 42，5270-5278 ；Czaja, R.等，Biochemistry, (2004) 43，2854-2862 ；Struhalla, Μ.等Chembiochem, (2004) 5，200-205)。然而，所有這些核糖核酸酶的序列特異性仍非常有限，這使得它們不適合在與DNA限制酶的應(yīng)用相似的應(yīng)用中作為分子生物學(xué)工具。
[0004]核糖核酸酶III為切割雙鏈RNA (dsRNA)的核酸酶的原型，并且為核糖核酸酶III超家族蛋白的創(chuàng)始成員，該家族蛋白共有一個(gè)進(jìn)化上保守的催化結(jié)構(gòu)域?；诖嬖诘念~外的結(jié)構(gòu)域，它們被分為四類。第I類，即傳統(tǒng)的核糖核酸酶III酶，具有一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBD)和單一的核糖核酸酶III結(jié)構(gòu)域。第2類和第3類酶分別以Drosha和Dicer為代表，二者均包含兩個(gè)核糖核酸酶III結(jié)構(gòu)域以及單一的dsRBD。此外，屬于第2類的酶具有額外的結(jié)構(gòu)域，例如聚脯氨酸結(jié)構(gòu)域，并且屬于第3類的DExD解旋酶具有DUF283和PAZ結(jié)構(gòu)域。第4類，被稱為Mini III，包括由核糖核酸酶III結(jié)構(gòu)域單獨(dú)組成的酶。
[0005]枯草芽孢桿菌(ifeci77i/5.Mini III蛋白的天然底物為23S前-rRNA,其中該分子的3'和5'末端被除去產(chǎn)生成熟的23S rRNA。該酶的切割位點(diǎn)是已知的，然而在雙鏈前-rRNA的切割位點(diǎn)附近，23S前-rRNA的一個(gè)片段形成不規(guī)則螺旋，推測(cè)其為底物識(shí)別所必需的(Redko, Y.等，Molecular Microbiology, (2008) 68 (5)，1096-1106)。此外，Mini III的體外內(nèi)切核糖核酸水解活性被證明受與23S rRNA 3'末端結(jié)合的核糖體蛋白L3刺激。存在蛋白L3通過改變RNA的構(gòu)象促進(jìn)底物切割的間接證據(jù)(Redko，Y.等，Molecular Microbiology, (2009) 71 (5)， 1145-1154)。
[0006]對(duì)于特異的和確定的dsRNA斷裂，尚無與DNA限制性內(nèi)切核酸酶或DNA切口酶相似性質(zhì)的酶(JP 54059392 - A, 12.05.1979)。dsRNA可被來自核糖核酸酶III家族的內(nèi)切核糖核酸酶切割，但核糖核酸酶ΠΙ-dsRNA相互作用的細(xì)節(jié)未知(Herskovitz，Μ.Α.等，Molecular Microbiology, (2000) 38 (5)，1027-1033)。位點(diǎn)特異性結(jié)合和選擇性加工的標(biāo)準(zhǔn)仍不清楚(Dasgupta S.等，Molecular Microbiology, (1998) 28 (3)，629-640)。然而，非特異性dsRNA內(nèi)切核酸酶已用于產(chǎn)生短的雙鏈RNA片段(US 2006057590 - Al,
16.03.2006, NOVARTIS)。獲得在dsRNA切割中顯示序列特異性的酶將允許發(fā)展RNA操作技術(shù)的所有領(lǐng)域，并且還允許開發(fā)新研究方法、所述酶的新應(yīng)用以及由其衍生的新技術(shù)。
[0007]公開內(nèi)容
依照所描述的技術(shù)發(fā)展水平，本發(fā)明目的為克服指出的缺點(diǎn)并提供具有高度序列特異性識(shí)別和切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶。本發(fā)明目標(biāo)還為提供檢測(cè)、分離、選擇、獲得和制備這樣的序列特異性dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶及其改良變體的方法。 [0008]本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)來自核糖核酸酶III超家族的一種酶可具有切開特定dsRNA核苷酸序列的偏好，根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬該酶包含一個(gè)位于dsRNA螺旋的大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這樣的偏好只取決于dsRNA序列，并且不依賴存在無規(guī)則dsRNA螺旋結(jié)構(gòu)和/或與其它蛋白的相互作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該酶屬于核糖核酸酶III超家族，其包含在計(jì)算機(jī)模擬中形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的多肽鏈片段，能夠進(jìn)行與DNA限制性內(nèi)切核酸酶相似性質(zhì)的特異的和確定的dsRNA斷裂。
[0009]本發(fā)明的一個(gè)方面提供在dsRNA切割中顯示序列特異性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶和/或其在dsRNA切割中顯示序列特異性的衍生物和/或變體，所述酶含有位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)。在優(yōu)選的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體中，位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)含有這樣的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的氨基酸序列:其與在和dsRNA復(fù)合的內(nèi)切核糖核酸酶Mini III的結(jié)構(gòu)模型中位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng)。
[0010]在優(yōu)選的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體中，位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)與由以下片段形成的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng):來自具核梭桿菌(Fusobacterium nuclea turn)的內(nèi)切核糖核酸酶FNU片段(如SEQ ID N03中所示)和/或來自枯草芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BSU片段(如SEQ ID N04所示)和/或來自蠟樣芽孢桿菌^Bacillus cereus)的內(nèi)切核糖核酸酶BCE片段(如SEQ ID N05所示)O
[0011]dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體優(yōu)選包含來自SEQ ID NOl的枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段在dsRNA切割中顯示序列特異性，并優(yōu)選包含氨基酸取代D94R。
[0012]dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體還優(yōu)選包含來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU或來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU的片段，其在dsRNA切割中顯示序列特異性。
[0013]dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體還優(yōu)選包含來自蠟樣芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE或來自蠟樣芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE的片段，其在dsRNA切割中顯示序列特異性。
[0014]本發(fā)明下一個(gè)方面涉及獲得在dsRNA切割中顯示序列特異性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，該方法包括下列步驟:
a)選擇包含形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的氨基酸序列的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其功能變體和/或衍生物，其中所述環(huán)由dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的氨基酸序列形成，其與通過Mini III內(nèi)切核糖核酸酶和dsRNA復(fù)合體的三維模型確定的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)模型相對(duì)應(yīng)；
b)克隆編碼dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其功能變體和/或衍生物的基因或其片段，所述基因或片段包含形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的序列。
[0015]此外，獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法優(yōu)選在步驟b)后包含下一步驟C)，表達(dá)步驟b)中所獲基因或其片段編碼的蛋白，并優(yōu)選在步驟c)后還跟隨步驟d)，在該步驟中測(cè)定分離的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的序列特異性。
[0016]在獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的優(yōu)選方法中，位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)與由以下片段形成的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng):來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU的片段(如SEQ ID N03中所示)和/或來自枯草芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BSU的片段(如SEQ ID N04所示)和/或來自蠟樣芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE的片段(如SEQ ID N05所示)。
[0017]此外，本發(fā)明下一個(gè)方面涉及獲得具有對(duì)dsRNA序列特異性切割的序列選擇性改變的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶衍生物和/或變體的方法，該方法包括下列步驟:
a)對(duì)于本發(fā)明獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法中所獲的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶，在編碼與位于dsRNA大溝內(nèi)的環(huán)相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列中引入變化，顯示在dsRNA切割中的序列特異性；
b)自步驟a)所獲的核苷酸序列表達(dá)dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶衍生物和/或變體，和
c)鑒定dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶衍生物和/或變體的序列特異性改變。
[0018]在這樣的優(yōu)選方法中，dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶衍生物和/或變體的選擇性變化導(dǎo)致衍生物和/或變體在dsRNA切割中對(duì)核苷酸序列的選擇性增強(qiáng)。
[0019]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生產(chǎn)dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，該方法包括表達(dá)在dsRNA切割中顯示序列特異性的本發(fā)明dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體的步驟。
[0020]本發(fā)明還涉及這樣的基因構(gòu)建體，其包含編碼在dsRNA切割中顯示序列特異性的本發(fā)明dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體的核苷酸序列。
[0021]包含本發(fā)明基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞同樣是本發(fā)明的主題。
[0022]本發(fā)明下一個(gè)方面涉及編碼來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。在一個(gè)有益應(yīng)用中，來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU、其衍生物和/或變體包含SEQ ID N03中所示的氨基酸序列。
[0023]本發(fā)明還涉及編碼來自蠟樣芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BCE或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。來自蠟樣芽胞桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BCE、其衍生物和/或變體優(yōu)選包含SEQ ID N05所示的氨基酸序列。
[0024]本發(fā)明下一方面涉及編碼SEQ ID NOl所示的來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。編碼來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU、其衍生物和/或變體的基因優(yōu)選包含SEQ ID NOl所示的氨基酸序列，編碼來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU的基因甚至更優(yōu)選包含D94R取代。
[0025]本發(fā)明還涉及包含在dsRNA切割中顯示序列特異性的本發(fā)明dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體的試劑盒。其包含來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU和/或來自蠟樣芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BCE和/或來自草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU或其包含D94R取代的變體和/或它們?cè)赿sRNA切割中顯示序列特異性的衍生物和變體。
[0026]本發(fā)明還涉及具有dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶活性的酶及其保留序列特異性的衍生物和/或變體，所述酶包含SEQ ID NOl中所示的來自枯草芽孢桿菌的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段顯示序列特異性，并在下列共有序列內(nèi)切割dsRNA:
【權(quán)利要求】
1.一種在dsRNA切割中顯示序列特異性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶和/或其在dsRNA切割中顯示序列特異性的衍生物和/或變體，所述酶含有位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)。
2.權(quán)利要求1的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，其中位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)具有這樣的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶氨基酸序列，所述氨基酸序列與在和dsRNA復(fù)合的內(nèi)切核糖核酸酶Mini III的結(jié)構(gòu)模型中位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，其中位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)與由以下片段形成的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng):SEQ ID N03所示的來自具核梭桿菌ipusobacterium nucleaturn)的內(nèi)切核糖核酸酶FNU的片段和/或SEQ ID N04所示的來自枯草芽孢桿菌{Bacillus subtilis)的內(nèi)切核糖核酸酶BSU的片段和/或SEQ ID N05所示的來自蠟樣芽孢桿菌{Bacillus cereus)的內(nèi)切核糖核酸酶BCE的片段。
4.權(quán)利要求1-3的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，其包含SEQID NOl的來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段在dsRNA切割中顯示序列特異性。
5.權(quán)利要求4的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，特征在于其包含取代D94R。
6.權(quán)利要求1-3的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，其包含來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU或來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU的片段，所述酶或片段在dsRNA切割中顯示序列特異性。
7.權(quán)利要求1-3的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體，其包含來自蠟樣芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE或來自蠟樣芽胞桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE的片段，所述酶或片段在dsRNA切割中顯示序列特異性。
8.獲得在dsRNA切割中顯示序列特異性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，該方法包括下列步驟: a)選擇包含形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的氨基酸序列的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其功能變體和/或衍生物，其中所述環(huán)由dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的氨基酸序列形成，其與通過Mini III內(nèi)切核糖核酸酶和dsRNA的復(fù)合體的三維模型確定的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng)； b)克隆編碼dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其功能變體和/或衍生物的基因或其片段，所述酶、其功能變體和/或衍生物包含形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的序列。
9.權(quán)利要求8的獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，其中所述方法包括在步驟b)后的下一步驟C)，表達(dá)步驟b)中所獲基因或其片段編碼的蛋白。
10.權(quán)利要求9的獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，其中步驟c)后跟隨步驟d)，在步驟d)中測(cè)定分離的dsRNA內(nèi)切核糖 核酸酶的序列特異性。
11.權(quán)利要求8-10的獲得dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，其中形成位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)的氨基酸序列，與通過以下片段形成的位于dsRNA大溝內(nèi)并與其相互作用的環(huán)相對(duì)應(yīng):SEQ ID N03中所示的來自具核梭桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶FNU的片段和/或SEQ ID N04中所示的來自枯草芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BSU的片段和/或SEQ ID N05中所示的來自蠟樣芽孢桿菌的內(nèi)切核糖核酸酶BCE的片段。
12.獲得具有對(duì)dsRNA序列特異性切割的序列選擇性改變的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體的方法，該方法包括下列步驟: a)對(duì)于權(quán)利要求8-11的方法中所獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶，在編碼與位于dsRNA大溝內(nèi)的環(huán)相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列中引入變化； b)表達(dá)來自步驟a)所獲核苷酸序列的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的衍生物和/或變體，和 c)鑒定dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的衍生物和/或變體的改變的序列特異性。
13.權(quán)利要求12的方法，其中dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的衍生物和/或變體的選擇性變化導(dǎo)致衍生物和/或變體在dsRNA切割中對(duì)核苷酸序列的選擇性增強(qiáng)。
14.用于生產(chǎn)dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的方法，其中所述方法包括表達(dá)權(quán)利要求1-7的顯示dsRNA切割序列特異性的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體或通過權(quán)利要求8-11的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶或通過權(quán)利要求12-13的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的步驟。
15.一種基因構(gòu)建體，特征在于包含編碼權(quán)利要求1-7中定義的顯示dsRNA序列特異性切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體或通過權(quán)利要求8-11的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶或通過權(quán)利要求12-13的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶的核苷酸序列。
16.包含權(quán)利要求15所定 義的基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
17.編碼來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU、其衍生物和/或變體包含SEQ ID N03中所示的氨基酸序列。
19.編碼來自蠟樣芽孢桿菌dsRNA的內(nèi)切核糖核酸酶BCE或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述來自蠟樣芽胞桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BCE、其衍生物和/或變體包含SEQ ID N05的氨基酸序列。
21.編碼SEQID NOl中所示的來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU或其片段和/或其功能變體和/或衍生物的基因在生產(chǎn)顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶中的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU、其衍生物和/或變體包含SEQ ID NOl中所示的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22的用途，其中來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU包含D94R取代。
24.一種試劑盒，其中所述試劑盒包含權(quán)利要求1-7的顯示序列特異性dsRNA切割的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶、其衍生物和/或變體或通過權(quán)利要求8-11的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶或通過權(quán)利要求12-13的方法獲得的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶。
25.權(quán)利要求24的試劑盒，特征在于其包含來自具核梭桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶FNU和/或來自蠟樣芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BCE和/或來自枯草芽孢桿菌的dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶BSU或其包含取代D94R的變體和/或它們顯示序列特異性dsRNA切割的衍生物和變體。
26.具有dsRNA內(nèi)切核糖核酸酶活性的酶、其保留序列特異性的衍生物和/或變體，所述酶包含SEQ ID NOl中所示的來自枯草芽孢桿菌的氨基酸序列或氨基酸序列的片段，其中所述酶在共有序列
27.權(quán)利要求26的酶、其保留序列特異性的衍生物和/或變體，其中所述酶在共有序列
28.權(quán)利要求26-27的酶、其保留序列特異性的衍生物和/或變體，所述酶的特征在于其氨基酸序列在序列SEQ ID NOl的第94位氨基酸上包含取代D94R。
【文檔編號(hào)】C12N9/22GK103764821SQ201280027648
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月8日
【發(fā)明者】J.M.布尼基, K.J.斯科羅內(nèi)克, D.皮安卡, A.A.蘇勒 申請(qǐng)人:國(guó)際生物分子和細(xì)胞研究所