本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種來源于象耳豆根結(jié)線蟲的Mesp1蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
：象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyneenterolobii)是一類固著型內(nèi)寄生植物病原線蟲，最早在我國海南分布，但其寄主范圍廣泛，適應性強，并可克服Mi抗原基因的抗性，同時不被最具控制植物根結(jié)線蟲生防前景的穿刺巴氏桿菌(Pasteuriapenetrans)寄生，因此象耳豆根結(jié)線蟲對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害巨大，一旦發(fā)生大面積擴散或定殖，將會造成毀滅性災難。近年來隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國設施栽培面積已接近6000萬畝，保護地適宜的溫度和國內(nèi)頻繁的種苗調(diào)運為象耳豆根結(jié)線蟲入侵內(nèi)陸地區(qū)提供了有利條件，目前已在北京、山東、湖南等地發(fā)現(xiàn)了此線蟲，這給我國農(nóng)作物生產(chǎn)帶來重大威脅。由于對象耳豆根結(jié)線蟲致病機理研究很少，傳統(tǒng)的防治方法存在特異性差、副作用大、防效有限等突出問題。RNA干擾作為一種新的防治策略及技術，為抗線蟲基因工程帶來新的突破。RNA干擾抗線蟲的主要方案為：構(gòu)建靶標為線蟲寄生致病相關基因的RNA干擾載體，將RNA干擾載體導入植物中表達雙鏈RNA(dsRNAs)或小干擾RNA(siRNAs)，經(jīng)口針取食進入線蟲體內(nèi)，引發(fā)系統(tǒng)性RNA干擾反應，導致線蟲寄生、發(fā)育、代謝、運動等相關功能出現(xiàn)障礙甚至死亡，從而使轉(zhuǎn)基因植物實現(xiàn)對寄生線蟲的抗性。因此，挖掘象耳豆根結(jié)線蟲的新基因，研究其對耳豆根結(jié)線蟲寄生、致病、發(fā)育的作用機制，將其作為靶標培育抗線蟲的植物，具有重大的前景和價值。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種來源于象耳豆根結(jié)線蟲的Mesp1蛋白及其編碼基因和應用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，獲自象耳豆根結(jié)線蟲，命名為Mesp1蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a3)將(a1)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與根結(jié)線蟲的寄生和/或致病和/或發(fā)育相關的由(a1)衍生的蛋白質(zhì)；(a4)將(a2)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與根結(jié)線蟲的寄生和/或致病和/或發(fā)育相關的由(a2)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a3)或(a4)中的蛋白質(zhì)便于純化和檢測，可在由序列表中序列1或序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a3)或(a4)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(a3)或(a4)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2或序列4所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼Mesp1蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。編碼Mesp1蛋白的基因命名為Mesp1基因。Mesp1基因具體為如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；(b2)編碼區(qū)如序列表中序列4所示的DNA分子；(b3)在嚴格條件下與以上(b1)或(b2)所述DNA分子雜交且編碼Mesp1蛋白的DNA分子；(b4)與以上(b1)或(b2)所述DNA分子具有90％以上同源性且編碼Mesp1蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。含有Mesp1基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有Mesp1基因的重組表達載體。所述表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于微彈轟擊的載體等。使用Mesp1基因構(gòu)建重組表達載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用Mesp1基因構(gòu)建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于鑒定及篩選，可對所用表達載體進行加工，如加入表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。從轉(zhuǎn)基因安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因。所述重組表達載體為重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1。重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1為：以表達載體pGWB402為骨架，具有Mesp1基因。重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1的構(gòu)建方法具體包括如下步驟：(1)構(gòu)建如下重組質(zhì)粒pJLsmart-Mesp1：在入門載體pJLsmart的SmaⅠ酶切位點插入Mesp1基因；(2)取重組質(zhì)粒pJLsmart-Mesp1和表達載體pGWB402，進行LR重組反應，得到重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1。本發(fā)明還保護Mesp1蛋白的應用，為如下(c1)至(c3)中的至少一種：(c1)調(diào)控根結(jié)線蟲的寄生能力；(c2)調(diào)控根結(jié)線蟲的致病能力；(c3)調(diào)控根結(jié)線蟲的發(fā)育。本發(fā)明還保護抑制Mesp1基因表達的干擾載體。所述干擾載體具體可為：具有特異DNA片段的重組質(zhì)粒：所述特異DNA片段自上游至下游依次包括如下區(qū)段：DNA分子a、間隔序列和DNA分子b。DNA分子a如序列表的序列7所示。DNA分子b如序列表的序列8第1至300位核苷酸所示。DNA分子b第1至300位核苷酸與DNA分子a反向互補。所述干擾載體更具體可為：以載體pCAMBIA3301為骨架，NcoⅠ和XhoⅠ位點之間具有DNA分子a，PstⅠ和BstEⅡ位點之間具有DNA分子b。干擾載體的構(gòu)建方法具體包括如下步驟：(1)構(gòu)建如下重組質(zhì)粒Ⅰ：以載體pSAT5為骨架載體，在NcoⅠ和XhoⅠ位點之間插入DNA分子甲(DNA分子甲為序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子)，在PstⅠ和KpnⅠ位點之間插入DNA分子乙(DNA分子乙為序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子)；(2)構(gòu)建如下重組質(zhì)粒Ⅱ①取重組質(zhì)粒Ⅰ，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BstEⅡ進行雙酶切，回收小片段；②取載體pCAMBIA3301，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BstEⅡ進行雙酶切，回收載體骨架。③將步驟①得到的小片段與步驟②得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Ⅱ(干擾載體)。本發(fā)明還保護抑制Mesp1基因表達的RNA(干擾RNA)。干擾RNA如序列表的序列9和/或如序列表的序列10所示。本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將所述干擾載體或所述干擾RNA導入出發(fā)植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物對根結(jié)線蟲的抗性高于所述出發(fā)植物。所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述出發(fā)植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護用于抑制Mesp1基因表達的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應用；所述產(chǎn)品功能為抑制根結(jié)線蟲對植物的寄生和/或抑制根結(jié)線蟲對植物的致病和/或抑制根結(jié)線蟲發(fā)育。所述抑制Mesp1基因表達的物質(zhì)具體可為所述干擾載體或所述干擾RNA。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護用于抑制Mesp1蛋白活性的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應用；所述產(chǎn)品功能為抑制根結(jié)線蟲對植物的寄生和/或抑制根結(jié)線蟲對植物的致病和/或抑制根結(jié)線蟲發(fā)育。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。以上任一所述根結(jié)線蟲具體可為象耳豆根結(jié)線蟲。食道腺在線蟲與寄主互作致病過程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)寄生致病相關基因均在線蟲食道腺表達，編碼產(chǎn)生分泌蛋白，再經(jīng)由口針穿刺和注射進入植物細胞內(nèi)，發(fā)揮寄生致病相關的復雜功能。本發(fā)明提供的Mesp1基因，從組織特異性來看在亞腹食道腺表達，從時間特異性來看在象耳豆根結(jié)線蟲的四齡幼蟲時期表達量較高。在煙草葉片上瞬時表達Mesp1蛋白可以抑制由小鼠促細胞凋亡蛋白BAX誘發(fā)的細胞程序性壞死。擬南芥介導的RNAi試驗表明，干擾線蟲Mesp1基因表達會明顯降低線蟲致病力以及線蟲的正常發(fā)育，表明此基因與象耳豆根結(jié)線蟲寄生及在植物體內(nèi)的發(fā)育相關，是一個重要的靶標基因。本發(fā)明對于象耳豆根結(jié)線蟲致病機理研究以及抗線蟲植物制備具有重大價值。附圖說明圖1為實施例2的結(jié)果。圖2為實施例3的結(jié)果。圖3為實施例4的結(jié)果。圖4為實施例5中平均每株植株上的根結(jié)數(shù)目。圖5為實施例5中平均每株植株的根中的線蟲數(shù)目。圖6為實施例5中接種象耳豆根結(jié)線蟲20天后植株根中的線蟲照片。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。提及“象耳豆根結(jié)線蟲”的文獻如下：【標題】：MELOIDOGYNE-ENTEROLOBIIN-SP(MELOIDOGYNIDAE),AROOT-KNOTNEMATODEPARASITIZINGPACARAEARPODTREEINCHINA；【作者】：YANG,B.；EISENBACK,J.D.；【來源】：JOURNALOFNEMATOLOGY,1983,15(3),381-391。入門載體pJLsmart(即文獻中的“entryvectorpJLSmart”)：參考文獻：JohannesMathieu,NormanWarthmann，F(xiàn)rankKu¨ttner,andMarkusSchmid；ExportofFTProteinfromPhloemCompanionCellsIsSufficientforFloralInductioninArabidopsis；CurrentBiology17,1055–1060,June19,2007。表達載體pGWB402：參考文獻：TsuyoshiNAKAGAWA等；ImprovedGatewayBinaryVectors:High-PerformanceVectorsforCreationofFusionConstructsinTransgenicAnalysisofPlants；Biosci.Biotechnol.Biochem.,71(8),2095-2100,2007。載體pSAT5(即文獻中的“pSAT5.nosP.RNAi”)：參考文獻：MeryDafny-Yelin,Sang-MinChung,EllenL.Frankman,andTzviTzfira；pSATRNAInterferenceVectors:AModularSeriesforMultipleGeneDown-RegulationinPlants；PlantPhysiology,December2007,Vol.145,pp.1272–1281。實施例中所用的煙草為本生煙。實施例1、Mesp1蛋白以及Mesp1基因的發(fā)現(xiàn)1、取接種象耳豆根結(jié)線蟲45-60天的番茄根系，洗凈后挑取卵塊在無菌水中孵化3天，離心收集新鮮的二齡幼蟲約l0-20μL。2、液氮冷凍，組織研磨器破碎樣品，用Trizol(Invitrogen)法提取總RNA，用RecombinantDNaseI(Takara)消化總RNA中參雜的基因組DNA，然后采用SuperScriptTMⅢReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)進行反轉(zhuǎn)錄，得到象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲cDNA。3、以cDNA為模板，采用上游引物Mesp1_F和下游引物Mesp1_R擴增Mesp1基因。上游引物Mesp1_F：5’-ATGTCCATCTTCCTTACTTCTGCTC-3’；下游引物Mesp1_R：5’-TCACATTTTCATAGTACAAGCCTTC-3’。擴增體系：ddH2O14.8μL，5×HFPCRbuffer5.0μL，2.5mMdNTPs2.0μL，Mesp1_F1.0μL，Mesp1_R1.0μL，cDNA1.0μL，PhusionDNApolymerase(NEB)0.2μL，總體系25.0μL。擴增條件：94.0℃預變性5min，94.0℃變性30s，58.0℃退火30s，72.0℃延伸1min，共35個循環(huán)，72.0℃保溫10min后終止反應。4、取全部擴增產(chǎn)物，加入6×loadingbuffer，然后進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳，采用GenStar膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，與pMD18-T(Takara)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，以前述引物進行PCR鑒定得到陽性克隆，陽性克隆以載體通用引物測定擴增序列。測序結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物中具有序列表的序列2所示的開放閱讀框，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列表的序列1命名為Mesp1蛋白，將其編碼基因命名為Mesp1基因。實施例2、Mesp1對植物免疫反應的抑制作用一、構(gòu)建重組質(zhì)粒1、取入門載體pJLsmart，用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ進行酶切，得到線性化載體。2、將序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子與步驟1得到的線性化載體進行連接，得到重組質(zhì)粒pJLsmart-Mesp1。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pJLsmart-Mesp1進行結(jié)構(gòu)描述如下：在入門載體pJLsmart的SmaⅠ酶切位點插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列3所示的蛋白質(zhì)。3、取重組質(zhì)粒pJLsmart-Mesp1和表達載體pGWB402，進行LR重組反應，得到重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pGWB402-Mesp1進行結(jié)構(gòu)描述如下：以表達載體pGWB402為骨架，具有序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。用序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子代替序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，按照以上步驟進行操作，得到重組質(zhì)粒pGWB402-eGFP。序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子為eGFP基因。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pGWB402-eGFP進行結(jié)構(gòu)描述如下：以表達載體pGWB402為骨架，具有序列表的序列5所示的雙鏈DNA分子。用序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子代替序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子，按照以上步驟進行操作，得到重組質(zhì)粒pGWB402-BAX。序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子為BAX基因(序列6所示的BAX基因編碼小鼠促細胞凋亡蛋白)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pGWB402-BAX進行結(jié)構(gòu)描述如下：以表達載體pGWB402為骨架，具有序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。二、制備重組農(nóng)桿菌懸浮緩沖液：溶劑為pH5.6、10mMMES緩沖液，含10mMMgCl2和0.2mMAS。將pGWB402-Mesp1導入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，然后用懸浮緩沖液懸浮重組農(nóng)桿菌，得到菌懸液，命名為Mesp1菌懸液(OD600nm＝0.4)。將pGWB402-eGFP導入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，然后用懸浮緩沖液懸浮重組農(nóng)桿菌，得到菌懸液，命名為eGFP菌懸液(OD600nm＝0.4)。將pGWB402-BAX導入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌，然后用懸浮緩沖液懸浮重組農(nóng)桿菌，得到菌懸液，命名為BAX菌懸液(OD600nm＝0.4)。三、Mesp1對植物免疫反應的抑制作用1、取煙草葉片，靠近葉柄的第一排兩個注射孔(注射孔1和注射孔4)注射懸浮緩沖液(每孔50微升)，中間一排的兩個注射孔(注射孔2和注射孔5)注射Mesp1菌懸液(每孔50微升)，底部一排的兩個注射孔(注射孔3和注射孔6)注射eGFP菌懸液(每孔50微升)，靜置孵育24h。2、完成步驟1后，在葉脈右側(cè)縱排的三個注射孔(注射孔4、注射孔5和注射孔6)中注射BAX菌懸液(每孔50微升)，靜置孵育5天。3、完成步驟2后，觀察煙草葉片的壞死情況。結(jié)果見圖1。葉片上共注射Mesp1菌懸液和BAX菌懸液的部位沒有出現(xiàn)黑褐色過敏性壞死癥狀，葉片上共注射懸浮緩沖液和BAX菌懸液的部位出現(xiàn)明顯黑褐色過敏性壞死癥狀，葉片上共注射eGFP菌懸液和BAX菌懸液的部位出現(xiàn)明顯黑褐色過敏性壞死癥狀，葉片上單獨注射Mesp1菌懸液的部位、葉片上單獨注射eGFP菌懸液的部分和葉片上單獨注射菌體懸浮液的部位均未出現(xiàn)任何過敏性壞死癥狀。進行五次重復試驗，結(jié)果一致。結(jié)果表明，BAX引起細胞程序性死亡，而Mesp1可以抑制由BAX引起的細胞程序性死亡，進而表明Mesp1參與了抑制植物免疫反應的過程。實施例3、Mesp1基因的組織定位以DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII(Roche)對象耳豆根結(jié)線蟲二齡幼蟲進行原位雜交實驗。結(jié)果見圖2。雜交結(jié)果顯示反義探針有雜交信號，雜交信號位于亞腹食道腺，表明Mesp1基因可能為亞腹食道腺細胞表達。實施例4、Mesp1基因的表達譜采用實時熒光定量PCR分析Mesp1基因在象耳豆根結(jié)線蟲的各個發(fā)育期(卵、寄生前二齡幼蟲、寄生期二齡幼蟲、三齡幼蟲、四齡幼蟲和成熟雌蟲)的表達差異情況。實時熒光定量采用的引物如下：Mesp1-qRT-F：5'-GCTTGATCACGCGGATACCA-3'；Mesp1-qRT-R：5'-GCAATCGCCTGAACCCTCTG-3'。以tubulin為內(nèi)參基因，分別進行三次生物學重復實驗，采用2-△△Ct法分析結(jié)果。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，相對于卵時期的表達量，Mesp1基因在侵染后的四齡期表達量極顯著的上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為5.62倍。Mesp1基因可能參與巨大細胞的維持。實施例5、干擾載體的構(gòu)建及其在培育抗線蟲寄生的植物中的應用一、干擾載體的構(gòu)建1、構(gòu)建重組質(zhì)粒Ⅰ以載體pSAT5為骨架載體，在NcoⅠ和XhoⅠ位點之間插入特異DNA分子甲(特異DNA分子甲為序列表的序列7所示的雙鏈DNA分子)，在PstⅠ和KpnⅠ位點之間插入特異DNA分子乙(特異DNA分子乙為序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子)。特異DNA分子乙第1至300位核苷酸與特異DNA分子甲反向互補。2、構(gòu)建重組質(zhì)粒Ⅱ(1)取重組質(zhì)粒Ⅰ，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BstEⅡ進行雙酶切，回收小片段。(2)取載體pCAMBIA3301，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和BstEⅡ進行雙酶切，回收載體骨架。(3)將步驟(1)得到的小片段與步驟(2)得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Ⅱ。重組質(zhì)粒Ⅱ即干擾載體。根據(jù)測序結(jié)果，對干擾載體進行結(jié)構(gòu)描述如下：以載體pCAMBIA3301為骨架，NcoⅠ和XhoⅠ位點之間具有所述特異DNA分子甲，PstⅠ和BstEⅡ位點之間具有所述特異DNA分子乙第1至300位核苷酸。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、將干擾載體導入根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、通過蘸花法將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，采用0.5‰的ppt除草劑噴霧篩選，收集T1代種子。T1代種子長成的植株即為T1代植株。將T1代植株自交并收獲種子，即為T2代種子。T2代種子長成的植株即為T2代植株。將T2代植株自交并收獲種子，即為T3代植株。T2代種子長成的植株即為T3代植株。對于某一T1代植株來說，如果其抽樣檢測的后代(T2代植株和T3代植株)均為PCR鑒定陽性，該T1代植株及其后代為一個純合的轉(zhuǎn)基因株系。PCR鑒定的方法：提取基因組DNA，采用Mesp1-qRT-F和Mesp1-qRT-R組成的引物對進行PCR擴增，如果得到178bp的擴增產(chǎn)物，PCR鑒定為陽性。隨機取3個純合的轉(zhuǎn)基因株系(Mesp1-1st-2株系、Mesp1-1st-3株系、Mesp1-1st-5株系)進行步驟四。三、轉(zhuǎn)空載體植物的獲得用載體pCAMBIA3301代替干擾載體進行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體株系。四、進行線蟲寄生致病能力體內(nèi)干擾研究試驗植株：Mesp1-1st-2株系的T3代植株、Mesp1-1st-3株系的T3代植株、Mesp1-1st-5株系的T3代植株、轉(zhuǎn)空載體株系的T3代植株、哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型擬南芥用Col或COL表示)。每個株系25株。試驗方法如下：1、取在MS培養(yǎng)基平板上生長的試驗植株(萌發(fā)一周)，轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基質(zhì)(培養(yǎng)基質(zhì)即1體積份營養(yǎng)土和1體積份蛭石混合得到的)的容器中，每個容器移栽1株。2、在培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)3周后，在每個容器中的培養(yǎng)基質(zhì)中接種300頭象耳豆根結(jié)線蟲。3、接種象耳豆根結(jié)線蟲20天后，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。各個株系中，平均每株植株上的根結(jié)數(shù)目見圖4。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，三個轉(zhuǎn)基因株系的根結(jié)數(shù)目分別減少了55.30％、41.75％和48.16％。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，轉(zhuǎn)空載體株系的根結(jié)數(shù)目沒有顯著差異。各個株系中，平均每株植株的根中的線蟲數(shù)目見圖5。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，三個轉(zhuǎn)基因株系根中的線蟲數(shù)目分別減少63.40％、53.51％和53.30％。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，轉(zhuǎn)空載體株系根中的線蟲數(shù)目沒有顯著差異。接種象耳豆根結(jié)線蟲20天后，植株根中的線蟲照片見圖6。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，三個轉(zhuǎn)基因株系中線蟲發(fā)育情況明顯變慢。結(jié)果表明，對象耳豆根結(jié)線蟲中的Mesp1基因進行干擾會導致線蟲致病能力指標——根結(jié)數(shù)及根內(nèi)線蟲數(shù)明顯下降，說明Mesp1基因在象耳豆根結(jié)線蟲與寄主互作致病過程中發(fā)揮重要功能。SEQUENCELISTING<110>中國農(nóng)業(yè)大學<120>來源于象耳豆根結(jié)線蟲的Mesp1蛋白及其編碼基因和應用<130>GNCYX162320<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>174<212>PRT<213>象耳豆根結(jié)線蟲<400>1MetSerIlePheLeuThrSerAlaLeuLeuIleIleSerMetIleAla151015MetThrGluGlyAlaGlyAspArgSerAlaSerThrSerThrGlyCys202530ThrThrTyrPheGlyMetLeuAspHisAlaAspThrLysGluAsnAsn354045LysArgLysThrPheLysProAsnValGluAsnIleSerAsnThrLeu505560LysValThrGlyGlyAlaThrPheSerAsnThrSerValAlaLeuVal65707580ValGlyAsnGluValLeuCysMetAlaLysThrGluGlySerGlyAsp859095CysGlyMetArgAsnGluAlaLeuThrGlyThrMetLysPhePheIle100105110SerGluAsnIleIleValGluValProPheLysAspValPhePhePhe115120125ThrAspAsnLysCysValIleGlnLeuValSerTyrAsnValGlyThr130135140HisGluThrLeuLeuLysIleAsnAspValAspPheLysIleThrAla145150155160ThrAspLysLysIleSerProLysAlaCysThrMetLysMet165170<210>2<211>525<212>DNA<213>象耳豆根結(jié)線蟲<400>2atgtccatcttccttacttctgctcttctaatcatttcaatgattgctatgaccgaggga60gcaggcgatcgaagcgcttcaacctctactggttgtacaacctattttggaatgcttgat120cacgcggataccaaggaaaataacaaaaggaaaactttcaaacccaacgttgaaaacata180tccaacaccttgaaagtgactggtggggctacgtttagcaatacctcggtggctttggtt240gtcggtaatgaggtgttatgtatggctaagacagagggttcaggcgattgcggaatgcgc300aacgaagcgttgactggaactatgaaatttttcatttctgagaatattattgttgaggtt360ccattcaaagacgtttttttcttcaccgacaacaagtgtgtcatccagcttgtaagctac420aatgttggaacgcatgaaactcttctcaaaattaatgatgtcgacttcaaaattaccgct480actgacaagaaaatttccccgaaggcttgtactatgaaaatgtga525<210>3<211>155<212>PRT<213>人工序列<400>3MetAlaGlyAspArgSerAlaSerThrSerThrGlyCysThrThrTyr151015PheGlyMetLeuAspHisAlaAspThrLysGluAsnAsnLysArgLys202530ThrPheLysProAsnValGluAsnIleSerAsnThrLeuLysValThr354045GlyGlyAlaThrPheSerAsnThrSerValAlaLeuValValGlyAsn505560GluValLeuCysMetAlaLysThrGluGlySerGlyAspCysGlyMet65707580ArgAsnGluAlaLeuThrGlyThrMetLysPhePheIleSerGluAsn859095IleIleValGluValProPheLysAspValPhePhePheThrAspAsn100105110LysCysValIleGlnLeuValSerTyrAsnValGlyThrHisGluThr115120125LeuLeuLysIleAsnAspValAspPheLysIleThrAlaThrAspLys130135140LysIleSerProLysAlaCysThrMetLysMet145150155<210>4<211>468<212>DNA<213>人工序列<400>4atggcaggcgatcgaagcgcttcaacctctactggttgtacaacctattttggaatgctt60gatcacgcggataccaaggaaaataacaaaaggaaaactttcaaacccaacgttgaaaac120atatccaacaccttgaaagtgactggtggggctacgtttagcaatacctcggtggctttg180gttgtcggtaatgaggtgttatgtatggctaagacagagggttcaggcgattgcggaatg240cgcaacgaagcgttgactggaactatgaaatttttcatttctgagaatattattgttgag300gttccattcaaagacgtttttttcttcaccgacaacaagtgtgtcatccagcttgtaagc360tacaatgttggaacgcatgaaactcttctcaaaattaatgatgtcgacttcaaaattacc420gctactgacaagaaaatttccccgaaggcttgtactatgaaaatgtga468<210>5<211>720<212>DNA<213>人工序列<400>5atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggac60ggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctac120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttc300ttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctg360gtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcac420aagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaac480ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgcc540gaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccac600tacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa720<210>6<211>579<212>DNA<213>人工序列<400>6atggacgggtccggggagcagcttgggagcggcgggcccaccagctctgaacagatcatg60aagacaggggcctttttgctacagggtttcatccaggatcgagcagggaggatggctggg120gagacacctgagctgaccttggagcagccgccccaggatgcgtccaccaagaagctgagc180gagtgtctccggcgaattggagatgaactggacagcaatatggagctgcagaggatgatt240gctgacgtggacacggactccccccgagaggtcttcttccgggtggcagctgacatgttt300gctgatggcaacttcaactggggccgcgtggttgccctcttctactttgctagcaaactg360gtgctcaaggccctgtgcactaaagtgcccgagctgatcagaaccatcatgggctggaca420ctggacttcctccgtgagcggctgcttgtctggatccaagaccagggtggctgggaaggc480ctcctctcctacttcgggacccccacatggcagacagtgaccatctttgtggctggagtc540ctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctga579<210>7<211>300<212>DNA<213>人工序列<400>7atggcaggcgatcgaagcgcttcaacctctactggttgtacaacctattttggaatgctt60gatcacgcggataccaaggaaaataacaaaaggaaaactttcaaacccaacgttgaaaac120atatccaacaccttgaaagtgactggtggggctacgtttagcaatacctcggtggctttg180gttgtcggtaatgaggtgttatgtatggctaagacagagggttcaggcgattgcggaatg240cgcaacgaagcgttgactggaactatgaaatttttcatttctgagaatattattgttgag300<210>8<211>307<212>DNA<213>人工序列<400>8ctcaacaataatattctcagaaatgaaaaatttcatagttccagtcaacgcttcgttgcg60cattccgcaatcgcctgaaccctctgtcttagccatacataacacctcattaccgacaac120caaagccaccgaggtattgctaaacgtagccccaccagtcactttcaaggtgttggatat180gttttcaacgttgggtttgaaagttttccttttgttattttccttggtatccgcgtgatc240aagcattccaaaataggttgtacaaccagtagaggttgaagcgcttcgatcgcctgccat300ggtcacc307<210>9<211>300<212>RNA<213>人工序列<400>9auggcaggcgaucgaagcgcuucaaccucuacugguuguacaaccuauuuuggaaugcuu60gaucacgcggauaccaaggaaaauaacaaaaggaaaacuuucaaacccaacguugaaaac120auauccaacaccuugaaagugacugguggggcuacguuuagcaauaccucgguggcuuug180guugucgguaaugagguguuauguauggcuaagacagaggguucaggcgauugcggaaug240cgcaacgaagcguugacuggaacuaugaaauuuuucauuucugagaauauuauuguugag300<210>10<211>300<212>RNA<213>人工序列<400>10cucaacaauaauauucucagaaaugaaaaauuucauaguuccagucaacgcuucguugcg60cauuccgcaaucgccugaacccucugucuuagccauacauaacaccucauuaccgacaac120caaagccaccgagguauugcuaaacguagccccaccagucacuuucaagguguuggauau180guuuucaacguuggguuugaaaguuuuccuuuuguuauuuuccuugguauccgcgugauc240aagcauuccaaaauagguuguacaaccaguagagguugaagcgcuucgaucgccugccau300當前第1頁1 2 3