一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括氨基酸溶液配制、捕食線蟲真菌培養(yǎng)和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官誘導(dǎo)步驟。其中：a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸為纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的誘導(dǎo)步驟中采用捕食線蟲真菌的分生孢子，并通過氨基酸溶液進行浸泡的方式進行捕食器官的誘導(dǎo)。本發(fā)明的優(yōu)點在于：通過培養(yǎng)和收集捕食線蟲真菌的孢子，利用纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸溶液進行侵泡，能夠誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生大量的捕食器官。本發(fā)明方法操作簡單，重復(fù)性好，能夠獲得大量的捕食器官，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
【專利說明】一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法，屬于應(yīng)用微生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】:
[0002]植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，全球每年由于植物寄生線蟲所引起的農(nóng)作物經(jīng)濟損失高達1570億美元(Abad et al.，2008)。在我國，線蟲危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、小麥、水稻、林木和中藥材等幾乎所有的經(jīng)濟作物，成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的限制因子之一。目前對植物線蟲病害的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的影響以及寄生線蟲抗藥性的增加，使其應(yīng)用逐步受到限制，因此采用線蟲天敵進行生物防治日益受到研究人員的關(guān)注(劉杏忠等，2004 ;楊曉野等，2004 ；Moosavi andZare, 2012)。
[0003]捕食線蟲真菌(Nematode-trapping fungi)是線蟲的重要天敵之一，對于自然界中線蟲種群數(shù)量的控制具有重要的調(diào)節(jié)作用。捕食線蟲真菌根據(jù)形態(tài)學(xué)特征分為節(jié)叢抱屬(Arthrobotrys spp.)、單頂抱屬(Monacrosporium spp.)和隔指抱屬(Dactylella spp.)(張克勤等，2006)。這一類特殊類群真菌的營養(yǎng)菌絲能夠特化形成粘性菌網(wǎng)、粘球和收縮環(huán)等捕食器官，完成對植物寄生線蟲的捕捉和侵染過程(張克勤等，2006 ；Yang et al.，2012)。因此，捕食線蟲真菌是開發(fā)高效線蟲生防制劑的重要資源(Nordbring-Hertz, 2004 ；Moosavi and Zare, 2012)。捕食器官是真菌捕捉和侵染線蟲的重要武器，捕食器官形成的數(shù)量與真菌的捕食效率密切相關(guān)。目前，部分捕食線蟲真菌已經(jīng)被開發(fā)成為生防制劑用于植物寄生線蟲的生物防治(劉杏忠等，2004)，但是由于土壤抑菌作用等抑制了真菌孢子的萌發(fā)和捕食器官的形成，現(xiàn)有的線蟲生防制劑存在防效不高和防效不穩(wěn)的現(xiàn)象，嚴重的限制了線蟲生防制劑的推廣和應(yīng)用。因此，闡明捕食器官形成的分子機制對于高效生防制劑的開發(fā)具有十分重要的意義。
[0004]捕食器官的形成是捕食線蟲真菌侵染線蟲的必要條件之一，在實驗室培養(yǎng)條件下，大多數(shù)捕食線蟲真菌的捕食器官能通過線蟲誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時也能通過線蟲提取液、線蟲激素和小肽等誘導(dǎo)產(chǎn)生(Yang et al.，2011 ；Hsueh et al.，2013)。盡管前期有人報道氨基酸能夠誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)產(chǎn)生捕食器官(Frimanet al.，1985 ;王瑞等，2008)，但他們主要是通過在培養(yǎng)基中添加氨基酸進行誘導(dǎo)，每個平板中捕食器官形成的數(shù)量不到350個，而本發(fā)明的方法是利用合適濃度的氨基酸溶液浸泡捕食線蟲真菌的孢子，并把孢子涂布于水瓊脂平板，每個平板產(chǎn)生的捕食器官數(shù)量最多能夠達到1600個以上。
[0005]經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本
【發(fā)明內(nèi)容】
相同文獻的公開報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法，迅速獲得大量的捕食器官，為進一步研究捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料，同時也為高效線蟲生防制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[0007]本發(fā)明涉及的氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和谷氨酸)為實驗室常規(guī)實驗用品，能從國內(nèi)外市場購買得到。本發(fā)明涉及的捕食線蟲真菌，如寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysoligospora)和環(huán)捕節(jié)叢孢(Arthrobotrys brochopaga)為常規(guī)實驗用真菌,能從國內(nèi)外的微生物保藏機構(gòu)購買得到。
[0008]本發(fā)明在常規(guī)方法基礎(chǔ)上改進而成。本發(fā)明實現(xiàn)的步驟如下:
[0009]1.氨基酸溶液的配制
[0010]I)實驗用品:滅菌去離子水、滅菌三角瓶、燒杯、0.22 μ m的濾膜、無菌醫(yī)用注射器、及磁力攪拌器。
[0011]2)配制方法:準確稱 取0.5g氨基酸(纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸)，放入燒杯中；用量筒準確量取IOOmL滅菌去離子水，倒入上述燒杯中，磁力攪拌使氨基酸充分溶解；用0.22 μ m的無菌濾膜對上述氨基酸溶液進行過濾除菌，濾液裝入事先滅菌的三角瓶中，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?；用時稀釋得到不同終濃度(0.005，0.05和0.lg/L)的氨基酸溶液。
[0012]2.誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制
[0013]水瓊脂培養(yǎng)基:用于氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官。每1000mL去離子水，加入20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0014]3.捕食線蟲真菌的培養(yǎng)(以捕食線蟲真菌的模式菌株寡孢節(jié)叢孢A.0ligospora為例)
[0015]I)培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基和CMA培養(yǎng)基的組成和配制方法如下:
[0016]PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g，切塊、煮沸30分鐘，6層紗布過濾收集上清液，加入葡萄糖20g，加水補充體積到1000mL，121°C滅菌20分鐘。
[0017]CMA培養(yǎng)基:稱取20g玉米粉，加入1000mL去離子水，煮沸(100°C ) 20分鐘，用6層紗布過濾收集液體，加入20g瓊脂，121°C滅菌20分鐘。
[0018]2)寡孢節(jié)叢孢的活化和孢子培養(yǎng):保存的寡孢節(jié)叢孢菌種在PDA培養(yǎng)基上進行活化。按上述方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0019]4.捕食線蟲真菌孢子的收集(以寡孢節(jié)叢孢A.0ligospora為例)
[0020]I)實驗用品:滅菌去離子水、滅菌玻璃珠、及滅菌漏斗(4層擦鏡紙)。
[0021]2)操作步驟:為了不影響后續(xù)的誘導(dǎo)實驗，在收集過程中要避免孢子萌發(fā)，所以整個過程要在冰上操作。
[0022]①往培養(yǎng)寡孢節(jié)叢孢孢子的三角瓶中加入滅菌去離子水(8mL/瓶)，然后加入6-8個滅菌玻璃珠(直徑0.3-0.4cm)，振蕩2-3min ；
[0023]②用移液器將三角瓶中的液體轉(zhuǎn)移至裝有無菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)過濾；
[0024]③向上述三角瓶中再次加入8mL滅菌去離子水，用相同方法重洗一次孢子，液體轉(zhuǎn)移至同一漏斗內(nèi)過濾；
[0025]④將濾液轉(zhuǎn)移至另一裝有無菌擦鏡紙的漏斗內(nèi)再次過濾；[0026]⑤將第④步獲得的濾液用移液器轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，12000rpm/min,離心2min ；
[0027]⑥孢子懸液的濃縮:每250mL三角瓶中培養(yǎng)的孢子，得到的孢子懸液最終濃縮至lmL，然后用血球計數(shù)板觀察計數(shù)，計算孢子的濃度。
[0028]5.捕食線蟲真菌捕食器官的誘導(dǎo)(以寡孢節(jié)叢孢A.0ligospora為例)
[0029]I)水瓊脂平板:為了便于后續(xù)觀察捕食器官的形成，水瓊脂板不宜倒的太厚，每個平板(直徑為9cm)的培養(yǎng)基體積為15-16mL。
[0030]2)將寡孢節(jié)叢孢孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，取ImL孢子懸液于Eppendorf 管中，12000rpm/min,離心 2min ；
[0031]3)小心吸去上清，實驗組往沉淀中加入360 μ L配好的氨基酸溶液，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照組，分別取等量加入孢子沉淀中，然后用移液器反復(fù)吹打，使孢子均勻懸??；
[0032]4)將上述裝有孢子懸液的Eppendorf管冰浴20min ；
[0033]5)冰浴后的孢子懸液用移液器吹打均勻，然后加到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，每個樣品3個平行，之后用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平板于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生，觀察拍照并統(tǒng)計捕食器官的數(shù)量。
[0034]與以往的報道相比，本發(fā)明有以下幾個特點:
[0035]I)特定氨基酸能夠有效誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生大量的捕食器官(最多可達到1600個/平皿，圖1)；
[0036]2)傳統(tǒng)方法大多采用真菌菌絲體進行誘導(dǎo)，而本發(fā)明采用捕食線蟲真菌的分生孢子進行誘導(dǎo)；
[0037]3)特定氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法具有簡單易行、重復(fù)性好和可控性強的特點。
[0038]4)氨基酸是單一化合物，誘導(dǎo)真菌產(chǎn)生捕食器官的同時不會像線蟲或線蟲提取物一樣激活其他的生物學(xué)途徑，為進一步研究捕食線蟲真菌捕食器官形成的分子機制提供了良好的實驗材料。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0039]圖1為纈氨酸(Val)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
[0040]圖2為纈氨酸(Val)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
[0041]圖3為亮氨酸(Leu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
[0042]圖4為亮氨酸(Leu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
[0043]圖5為谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
[0044]圖6為谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官。
【具體實施方式】:
[0045]以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。本發(fā)明的實施例所用方法同
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法。[0046]實施例一:纈氨酸(Val)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0047]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0048]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述孢子的收集方法，收集寡孢節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的纈氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生(圖1)。
[0049]實施例二:纈氨酸(Val)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0050]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環(huán)捕節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0051]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環(huán)捕節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的纈氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環(huán))產(chǎn)生(圖2)。
[0052]實施例三:亮氨酸(Leu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0053]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0054]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生(圖3)。
[0055]實施例四:亮氨酸(Leu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0056] 按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環(huán)捕節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0057]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環(huán)捕節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，OOO個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的亮氨酸溶液(0.005，0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環(huán))產(chǎn)生(圖4)。
[0058]實施例五:谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0059]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的寡孢節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0060]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所所描述孢子的收集方法，收集寡孢節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(三維菌網(wǎng))產(chǎn)生(圖5)。
[0061]實施例六:谷氨酸(Glu)誘導(dǎo)捕食線蟲真菌環(huán)捕節(jié)叢孢產(chǎn)生捕食器官
[0062]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述的方法配制CMA培養(yǎng)基，然后分裝到250mL三角瓶中(40mL/瓶)，用紗布外加報紙封口，121°C滅菌20分鐘。滅菌的培養(yǎng)基室溫放置2天，讓殘留在瓶壁和培養(yǎng)基表面的水分盡量散失。無菌條件下，用打孔器取相同大小的環(huán)捕節(jié)叢孢菌塊接種于上述CMA固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14天，以得到大量的孢子。
[0063]按照
【發(fā)明內(nèi)容】
部分所描述孢子的收集方法，收集環(huán)捕節(jié)叢孢的孢子，將孢子懸液的濃度調(diào)到大約10，000個/mL，然后按所描述的方法用不同濃度的谷氨酸溶液(0.005，
0.05和0.lg/L)重新懸浮孢子，同時以生理鹽水和無菌去離子水作為對照，冰浴后的孢子懸液混勻后加入到事先倒好的水瓊脂平板上，120 μ L/皿，用滅菌的涂布棒將平板上的孢子懸液涂布均勻，最后將平皿靜置于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天，實驗組有大量的捕食器官(收縮環(huán))產(chǎn)生(圖6)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用氨基酸誘導(dǎo)捕食線蟲真菌產(chǎn)生捕食器官的方法，包括氨基酸溶液配制、捕食線蟲真菌培養(yǎng)和孢子收集、氨基酸溶液浸泡孢子和捕食器官誘導(dǎo)步驟；其特征在于:a.氨基酸溶液的配制中所用氨基酸為纈氨酸、亮氨酸或谷氨酸；b.捕食器官的誘導(dǎo)步驟中采用捕食線蟲真菌的分生孢子，并通過氨基酸溶液進行浸泡的方式進行捕食器官的誘導(dǎo)。
【文檔編號】A01P5/00GK104004668SQ201410271485
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】楊金奎, 蘇浩, 趙勇, 張克勤 申請人:云南大學(xué)