本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術領域，具體涉及一種殺根結線蟲的桔綠木霉snef1910及代謝產(chǎn)物及應用。
背景技術：
根結線蟲(meloidogyne)是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲。由于設施農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中連作障礙、致害成災現(xiàn)象較為普遍，根結線蟲病害為害的問題日益嚴重，對農(nóng)作物造成很大的產(chǎn)量損失，嚴重時甚至絕收。
根結線蟲的防治方法主要有化學藥劑防治法和微生物防治法，化學藥劑防治法主要是采用阿維菌素、福氣多等化學農(nóng)藥，這種方法雖然有效，但是對土壤和農(nóng)作物傷害較大，不利于長期使用。微生物防治法主要是利用微生物對根結線蟲的毒殺作用，對植物和環(huán)境的影響較小，是現(xiàn)代農(nóng)藥的主要發(fā)展方向。
然而目前市面上缺少既可以防治這種病害、又對環(huán)境沒有危害的生防菌劑。再者，現(xiàn)有技術實施的本質(zhì)是微生物以及對土壤微生物成分的持續(xù)改善作用，這種生物農(nóng)藥市面上則更加稀少，亟待研發(fā)。
為了在防治根結線蟲病害的同時改善土壤微環(huán)境，我們有必要開發(fā)一種可以有效防治根結線蟲的新功能菌株及生防菌劑，旨在減少根結線蟲病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的損失。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種殺根結線蟲的桔綠木霉snef1910及代謝產(chǎn)物及應用，該桔綠木霉snef1910經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物對農(nóng)作物進行灌根處理后，能夠抑制農(nóng)作物根結線蟲的危害，在制備殺死根結線蟲的生防菌劑中具有良好的應用前景。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種具有殺根結線蟲活性的桔綠木霉snef1910，所述桔綠木霉snef1910的分類命名為桔綠木霉(trichodermacitrinoviride)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13569，保藏日期為2017年3月10日。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種由所述的桔綠木霉snef1910在制備殺死根結線蟲的生物防治菌劑中的應用。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種由所述的桔綠木霉snef1910制備成的殺根結線蟲的代謝產(chǎn)物。
本發(fā)明的第四個目的是提供一種由所述的殺根結線蟲代謝產(chǎn)物在制備殺死根結線蟲的生物防治菌劑中的應用。
本發(fā)明的第五個目的是提供一種所述的殺根結線蟲代謝產(chǎn)物的制備方法，將桔綠木霉snef1910的試管菌種活化后，接種至pd液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)，然后將得到的種子液接種于pd液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)5d后，得到殺根結線蟲真菌代謝產(chǎn)物；
每升所述pd液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小塊，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
優(yōu)選的，上述制備方法中，所述種子培養(yǎng)的條件為：25～28℃，120～150r/min搖床發(fā)酵5d。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明提供了一種具有殺根結線蟲活性的桔綠木霉snef1910，可以制成用于殺死根結線蟲的生物防治菌劑，可以有效防治農(nóng)作物的根結線蟲傷害，效果顯著，且能夠改善土壤微環(huán)境，同時能夠促進植物生長，在防治農(nóng)作物根結線蟲傷害方面具有良好的應用前景。
生物材料保藏信息說明
1、桔綠木霉snef1910，已于2017年3月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為cgmccno.13569，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，分類命名為桔綠木霉(trichodermacitrinoviride)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明中桔綠木霉snef1910的菌落形態(tài)圖。
具體實施方式
下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但應當理解本發(fā)明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。本發(fā)明以下實施例中，若沒有特殊說明，所用試劑皆可在市場上購買得到，若沒有特殊說明，所涉及的方法皆為常規(guī)方法。
本發(fā)明提供了一種具有殺根結線蟲的桔綠木霉snef1910，下面結合相關實驗數(shù)據(jù)，說明本發(fā)明桔綠木霉snef1910的菌落形態(tài)、基因結構特征以及其殺線蟲活性。
一、菌落形態(tài)特征
桔綠木霉snef1910的菌落形態(tài)如圖1所示。
在pda固體培養(yǎng)基上黑暗條件下培養(yǎng)72h，菌落半徑為82～90mm。在pda上，大多數(shù)菌株的菌落表面產(chǎn)生分生孢子處沒有游離的氣生菌絲，多數(shù)情況下菌落邊緣部位會形成寬的分生孢子帶，分生孢子黃綠色至深綠色，有時候產(chǎn)生黃色色素。
所述桔綠木霉snef1910的培養(yǎng)條件如下：
斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)固體培養(yǎng)基(1l)配方：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，再加入17-20g瓊脂，最后蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
斜面培養(yǎng)方法：27℃培養(yǎng)4d。
二、基因結構特征
對所述桔綠木霉snef1910的its序列進行pcr擴增及測序，結果如下：cggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaccaacctaaaactcttattgtataccccctcgcgggtttttttataatctgagcctttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggccctcccttagcgggtggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcata。
將測得的上述its序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi進行同源性搜索比對，并使用blastn2.2.31系統(tǒng)在genbank中進行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)序列相似度最高的為trichodermacitrinoviride菌株，序列相似度為100％，表明該菌株屬于桔綠木霉。
三、本發(fā)明還提供了一種利用桔綠木霉snef1910制備殺根結線蟲代謝產(chǎn)物的方法。
該方法具體如下：將桔綠木霉snef1910的試管菌種活化后，接種至250ml三角瓶(每瓶裝150mlpd液體發(fā)酵培養(yǎng)基)中進行種子培養(yǎng)，所述種子培養(yǎng)的條件為：25～28℃，120～150r/min搖床發(fā)酵5d；然后將得到的種子液接種于30l發(fā)酵罐的pd液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)5d后，得到殺根結線蟲代謝產(chǎn)物。
每升所述馬鈴薯葡萄糖(pd)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小塊，稱取200g，煮沸半小時，四層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min，自然ph。
四、桔綠木霉snef1910制備成的代謝產(chǎn)物的殺根結線蟲活性實驗
1、制備試驗制劑
將上述“三”中制備的殺根結線蟲代謝產(chǎn)物，通過12000r/min離心15min除去孢子與菌絲體，收集上清液，得到處理后發(fā)酵液，備用。
2、供試根結線蟲
采自遼寧省鐵嶺市李千戶鎮(zhèn)營盤村大棚發(fā)病嚴重的番茄根系，經(jīng)鑒定為南方根結線蟲(meloidogyneincognita)，用鑷子挑取飽滿成熟的卵囊，放入盛有無菌水的滅菌培養(yǎng)皿中，然后用0.5％naclo消毒3min，并無菌水沖洗3次，從中挑取完整且飽滿的卵囊，置入盛有適量無菌水的滅菌培養(yǎng)皿中，將其放入28℃的恒溫箱中培養(yǎng)，3d后將孵化出的二齡幼蟲j2接種到溫室內(nèi)易感病的番茄根部進行擴繁。將擴繁獲得的卵囊采用淺盤法孵化出j2，制備成根結線蟲懸浮液50條/50μl。
3、室內(nèi)殺根結線蟲活性實驗
將950μl的處理后發(fā)酵液分別加入到不同的1ml貝式小皿中，并且每個里加入50條j2(50μl線蟲懸浮液)，以pd液體培養(yǎng)基、清水分別作為對照，重復3次試驗。分別在24h、48h、96h觀察根結線蟲死亡情況，計算校正死亡率，采用naclo刺激法來判斷根結線蟲的死活。實驗結果如表1所示：
由表1可知，本發(fā)明在室內(nèi)殺線蟲活性試驗中，桔綠木霉snef1910的處理后發(fā)酵液在24h、48h、72h的校正死亡率分別達到了86.0％、96.0％和100％；而pd液體培養(yǎng)基對照在24h、48h、72h的校正死亡率只有0、0.7％和0.8％，相對于清水對照來講，差異不顯著；但相對桔綠木霉snef1910來講，桔綠木霉snef1910的校正死亡率高，具有顯著性差異。
表1室內(nèi)殺根結線蟲活性試驗
4、抑制南方根結線蟲卵囊孵化試驗
(1)供試卵囊
采自遼寧省鐵嶺市李千戶鎮(zhèn)營盤村大棚發(fā)病嚴重的番茄根系，經(jīng)鑒定為南方根結線蟲(meloidogyneincognita)，用鑷子挑取飽滿成熟的卵囊，放入盛有無菌水的滅菌培養(yǎng)皿中，然后用0.5％naclo消毒3min，并無菌水沖洗3次，從中挑取完整且飽滿的卵囊，置入自制孵化池中備用。
(2)試驗方法
取新鮮飽滿大小均一的消毒卵囊，每2個消毒卵囊放入一個消毒孵化池中，再向每個孵化池里加入處理后發(fā)酵液1ml，以pd液體培養(yǎng)基、清水分別作為對照，重復3次試驗。將放有卵囊的培養(yǎng)皿置于25℃的恒溫箱中，7d后計數(shù)南方根結線蟲孵化總數(shù)，計算孵化相對抑制率。
(3)試驗結果
本發(fā)明在室內(nèi)抑制南方根結線蟲卵囊孵化試驗結果如表2所示，桔綠木霉snef1910的處理后發(fā)酵液7d后對卵孵化的相對抑制率高達69％以上。而pd液體培養(yǎng)基對照的相對抑制率只有近2％，處理后發(fā)酵液對南方根結線蟲卵囊孵化效果顯著。
表2抑制南方根結線蟲卵囊孵化試驗7d試驗觀察后結果
5、防治南方根結線蟲田間防效試驗
本試驗分別在遼寧省鐵嶺市李千戶鎮(zhèn)和遼寧省綏中縣大王廟黃家村溫室大棚進行田間防效試驗。將制備好的菌株發(fā)酵原液，稀釋50倍灌根施用，每棵番茄苗的根部灌200ml發(fā)酵液，覆土，當天禁止?jié)菜灰泼缤戤厱r隔20d、40d再以同樣的方法進行2次菌株發(fā)酵液灌根處理即可。試驗結果表明：可以促進植株生長，對根結線蟲病起到很好的抑制作用；與此同時，還起到增加田間產(chǎn)量的作用，殺根結線蟲效果比較穩(wěn)定，取得很好的防治效果。
(1)制備試驗制劑
按前述液體發(fā)酵培養(yǎng)方法制備桔綠木霉snef1910的殺根結線蟲代謝產(chǎn)物，待備用。
(2)試驗方法
本試驗分別在遼寧省鐵嶺市李千戶鎮(zhèn)營盤村和遼寧省綏中縣大王廟黃家村日光溫室大棚進行田間防效試驗，兩處溫室大棚根結線蟲均很嚴重，主栽作物番茄和黃瓜等蔬菜。番茄苗為工廠化育苗，待番茄植株生長至四葉期時移栽到試驗大棚中，完全隨機種植。在移苗當天，將制備好的殺根結線蟲代謝產(chǎn)物，稀釋50倍灌根施用，每棵番茄苗的根部灌200ml殺根結線蟲代謝產(chǎn)物，覆土，當天禁止?jié)菜?；移苗完畢時隔20d、40d再以同樣的方法進行2次菌株發(fā)酵液灌根處理即可。以未經(jīng)過灌根的番茄苗和pd液體培養(yǎng)基灌根的番茄苗為對照，在移栽后45d進行調(diào)查，將番茄植株連根挖出，保持根系完整，觀察番茄的生長效果。
(3)試驗結果
田間試驗結果顯示：對田間番茄具有明顯的促生長作用，經(jīng)過桔綠木霉snef1910代謝產(chǎn)物處理的番茄苗的根系更加發(fā)達，且田間番茄根結線蟲病的防效高達76％以上。
上述實驗表明，本發(fā)明提供的一種的桔綠木霉snef1910可以有效防治農(nóng)作物的根結線蟲傷害，效果顯著，同時能夠促進植物生長，在防治農(nóng)作物根結線蟲傷害方面具有良好的應用前景，可以制成用于殺死根結線蟲的生物防治菌劑。
盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領域內(nèi)的技術人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。