本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種酪蛋白磷酸肽的標(biāo)簽肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides)(以下簡(jiǎn)稱：CPPs)是經(jīng)單一酶或復(fù)合酶系水解牛酪蛋白后產(chǎn)物分布于α_s1、α_s2、β以及κ酪蛋白中的不同區(qū)域。它可以用于各種營(yíng)養(yǎng)、保健食品中，能有效提高人體對(duì)鈣、鐵、鋅等二價(jià)礦物質(zhì)的攝入量以及吸收和利用率。市場(chǎng)上出現(xiàn)了大量添加CPPs的嬰幼兒配方奶粉，由于不同加工工藝等原因造成產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，但又沒(méi)有建立準(zhǔn)確有效的評(píng)價(jià)檢測(cè)方法。

目前普遍采用乙醇沉淀法、電泳法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定酪蛋白磷酸肽。

授權(quán)公告號(hào)為CN103792298B的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的檢測(cè)方法，該方法主要包括以下步驟：采用BaCl₂-乙醇法對(duì)酪蛋白磷酸肽原料進(jìn)行純化；采用高效液相色譜法對(duì)純化后的酪蛋白磷酸肽原料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；采用固相萃取對(duì)乳制品樣品進(jìn)行純化后，用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，得到檢測(cè)結(jié)果。乙醇沉淀法既可分離磷酸肽，也適用于CPPs原料的含量測(cè)定，但是，此方法靈敏度低且特異性差，不適用于添加CPPs的食品及保健品的測(cè)定。

申請(qǐng)?zhí)枮?01010134407.5的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種檢測(cè)牛乳制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，使用了高壓毛細(xì)管電泳分析儀作為檢測(cè)設(shè)備。上述方法包括制備酪蛋白磷酸肽標(biāo)準(zhǔn)溶液以生成酪蛋白磷酸肽含量與高壓毛細(xì)管電泳分析儀獲得的分析圖譜積分值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線、對(duì)待測(cè)牛乳制品進(jìn)行檢測(cè)、根據(jù)待測(cè)牛乳制品的檢測(cè)結(jié)果利用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)牛乳制品的酪蛋白磷酸肽含量。電泳法，重現(xiàn)性且易受樣品中蛋白質(zhì)和其它非目標(biāo)多肽的干擾，不適合檢測(cè)復(fù)雜食品基質(zhì)中CPPs的含量。

授權(quán)公告號(hào)為CN103760246B的中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)了一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測(cè)方法，步驟包括：將待檢牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脫蛋白后過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱脫鈣，將脫鈣后所得洗脫液過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，除雜和富集，將收集液在溫度60～70℃，轉(zhuǎn)速為50～60rpm下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，過(guò)膜后作為液相檢測(cè)樣品；然后進(jìn)行液相檢測(cè)，按外標(biāo)法以峰面積法計(jì)算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。高效液相色譜法分離效能高但是靈敏度較低。乳制品是富含蛋白質(zhì)和多肽的復(fù)雜基質(zhì)樣品，且酪蛋白磷酸肽是一系列分子量分布不等的多肽混合物，在紫外或熒光檢測(cè)器下難以找到不受干擾的特征峰，無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確有效的定量檢測(cè)分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)奶制品中酪蛋白磷酸肽的標(biāo)簽肽。使用該標(biāo)簽肽以及相應(yīng)的經(jīng)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中的酪蛋白磷酸肽的含量。

一種酪蛋白磷酸肽的標(biāo)簽肽，氨基酸序列為L(zhǎng)SQSKVLPVPQK。

一種酪蛋白磷酸肽的內(nèi)標(biāo)肽，氨基酸序列為L(zhǎng)SQSKVL*PV*PQK，其中L*和V*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸殘基。使用時(shí)，可以通過(guò)向樣品中添加內(nèi)標(biāo)肽，可以達(dá)到對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正的目的。

本發(fā)明又提供了所述的標(biāo)簽肽在奶制品中酪蛋白磷酸肽含量檢測(cè)中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述奶制品為嬰幼兒配方奶粉。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)奶制品中酪蛋白磷酸肽含量的方法，包括以下步驟：

(1)如果待測(cè)樣品為固體，先用水溶解，如果待測(cè)樣品為液體則直接使用，然后加入內(nèi)標(biāo)肽；

(2)使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)；

(3)計(jì)算待測(cè)樣品中，所述的標(biāo)簽肽與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)肽的峰面積比；

(4)將待測(cè)樣品中所述的標(biāo)簽肽的峰面積比數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算出所述標(biāo)簽肽的濃度，然后根據(jù)相應(yīng)的轉(zhuǎn)換公式計(jì)算出待測(cè)樣品中酪蛋白磷酸肽的含量。

待測(cè)樣品通過(guò)高效液相色譜能夠盡量分離純化為一個(gè)單一組分的峰，然后將單一的峰分別通過(guò)質(zhì)譜分析確定成分，再通過(guò)質(zhì)譜的結(jié)果確定高效液相色譜結(jié)果中所述的標(biāo)簽肽以及對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)肽的峰，而峰面積的大小即為各自成分的量。如果不加入內(nèi)標(biāo)肽，則通過(guò)配制已知濃度的標(biāo)簽肽標(biāo)準(zhǔn)樣品，檢測(cè)后獲得相應(yīng)峰面積結(jié)果，通過(guò)濃度與峰面積之間的關(guān)系獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為線性。但是由于樣品在處理過(guò)程中存在樣品損失、高效液相色譜回收率存在損失和波動(dòng)等問(wèn)題存在，使得沒(méi)有添加所述內(nèi)標(biāo)肽時(shí)，所得結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而且檢測(cè)結(jié)果波動(dòng)較大，使得檢測(cè)結(jié)果不夠可靠和準(zhǔn)確。

而通過(guò)加入已知濃度和量的內(nèi)標(biāo)肽，可以通過(guò)計(jì)算標(biāo)簽肽與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)肽的峰面積比，這樣就盡量避免了樣品在處理過(guò)程中存在樣品損失、高效液相色譜回收率存在損失和波動(dòng)等問(wèn)題，因?yàn)閮?nèi)標(biāo)肽也是按相同比例在損失，所以可以通過(guò)內(nèi)標(biāo)肽來(lái)校準(zhǔn)。

優(yōu)選的，所述的內(nèi)標(biāo)肽的氨基酸序列為L(zhǎng)SQSKVL*PV*PQK，其中L*和V*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸殘基。所述內(nèi)標(biāo)肽的使用量可以在較寬范圍內(nèi)選擇，只要結(jié)果能夠檢測(cè)到。但是，最優(yōu)的情況是所添加的內(nèi)標(biāo)特征肽的量與所檢測(cè)樣品中相應(yīng)的特征肽的量接近，這樣可以使校準(zhǔn)結(jié)果最準(zhǔn)確。但同時(shí)也得考慮到成本等問(wèn)題。所以將內(nèi)標(biāo)肽的使用濃度控制在幾十ng/mL為宜，常用可以選擇50ng/mL。

優(yōu)選的，所述待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)前處理，所述前處理方法為：使用pH為4.6的乙酸銨溶液進(jìn)行蛋白沉淀。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線由以下方法獲得：

將所述的標(biāo)簽肽稀釋不同濃度梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品，然后加入內(nèi)標(biāo)肽，再經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)，由標(biāo)簽肽的含量與標(biāo)簽肽、內(nèi)標(biāo)肽檢測(cè)峰面積比值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，樣品檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時(shí)高效液相色譜和質(zhì)譜的檢測(cè)條件相同。

優(yōu)選的，所述高效液相色譜使用BEH300C18色譜柱，柱溫為35℃，流動(dòng)相為0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水溶液，流速為0.3mL/min。

優(yōu)選的，所述質(zhì)譜使用的毛細(xì)管電壓為3.5kV，脫溶劑溫度375℃，脫溶劑氣流量11.5L/min，所述的標(biāo)簽肽的母離子為442.1m/z，子離子372.4m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子568.5m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV；內(nèi)標(biāo)物特征母離子為446.3m/z，子離子372.2m/z，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子574.5m/z，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為10eV。

本發(fā)明通過(guò)選擇酪蛋白磷酸肽中的一種特征肽作為檢測(cè)目標(biāo)來(lái)對(duì)奶制品中酪蛋白磷酸肽進(jìn)行定量檢測(cè)，該特征肽為經(jīng)過(guò)篩選最終確定的，為酪蛋白磷酸肽中最具代表性的一種多肽，在酪蛋白磷酸肽原料中含量相對(duì)穩(wěn)定，再加入經(jīng)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽來(lái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，該方法具有較好的線性、回收率高、準(zhǔn)確性好。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中各肽段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖，其中A為AVPITPT，B為IQKEDVPSERY，C為FYQKFPQY，D為L(zhǎng)NYYQQKP，E為IVPNs(p-s)AEERLHSM，F(xiàn)為VLSRYPSYG，G為L(zhǎng)SQSKVLPVPQK；

圖2為本發(fā)明標(biāo)簽肽與對(duì)應(yīng)的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽在相同條件下的質(zhì)譜掃描圖，其中A為標(biāo)簽肽，B為內(nèi)標(biāo)肽；

圖3為本發(fā)明標(biāo)簽肽與對(duì)應(yīng)的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽在相同條件下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖，其中A為標(biāo)簽肽，B為內(nèi)標(biāo)肽；

圖4為本發(fā)明內(nèi)標(biāo)肽的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖，其中A為標(biāo)簽肽通道，B為內(nèi)標(biāo)肽通道；

圖5為空白試樣在內(nèi)標(biāo)肽離子通道的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖；

圖6為使用不同乙腈濃度作為溶劑溶解本發(fā)明標(biāo)簽肽的效果對(duì)比圖；

圖7為實(shí)施例4中特異性檢測(cè)結(jié)果，其中A～E分別為乳清蛋白、全脂乳粉、大豆蛋白、大米蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品；

圖8為實(shí)施例5中標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

CPPs標(biāo)簽肽的尋找和確定。

由于CPPs是一個(gè)多肽的混合物。先將多個(gè)批次的CPPs原料溶解，稀釋至100μg/mL，進(jìn)行反相色譜分離和質(zhì)譜全掃描。根據(jù)Proteome Discoverer 2.1軟件以及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，盡可能找出所有批次都含有并且相對(duì)較穩(wěn)定的特征肽段(表1)，共找到以下7條肽段(表1)。

表1篩選出的7條酪蛋白磷酸肽特征肽段的基本信息

注：平均親水性0～2，多肽在水中親水性很好；平均親水性＝0，多肽在水中的溶解性一般；平均親水性-2～0，多肽在水中的溶解性較差。

在保證方法的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性的前提下，為便于日后方法推廣，在已查找到的特征肽段中選擇1條既具特異性，又有良好的穩(wěn)定性和較高靈敏度的多肽作為CPPs最終的標(biāo)簽肽。

使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，色譜與質(zhì)譜條件如下：

高效液相色譜分離條件：色譜柱：BEH300C18色譜柱；柱溫為40℃，流動(dòng)相為0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min；

質(zhì)譜條件：CPPs標(biāo)簽肽的母離子為442.1m/z，子離子372.4m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子568.5m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV；內(nèi)標(biāo)物特征母離子為446.3m/z，子離子372.2m/z，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子574.5m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為10eV；毛細(xì)管電壓3.5kV，脫溶劑溫度：375℃，脫溶劑氣流量：11.5L/min。

(1)靈敏度

在連續(xù)3天中，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)樣檢測(cè)分析，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次，找出響應(yīng)值最高的肽段，結(jié)果如圖1所示，對(duì)于CPPs原料肽段1(LSQSKVLPVPQK)具有較高靈敏度，信噪比較大且其色譜保留也相對(duì)較強(qiáng)，有助于與雜質(zhì)的分離。

(2)精密度及回收率

在連續(xù)3天中，使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)樣檢測(cè)分析，每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次，找出穩(wěn)定性高的肽段，結(jié)果如表2所示，肽段LSQSKVLPVPQK的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于3％，且其氨基酸組成個(gè)數(shù)為12個(gè)，對(duì)于序列越長(zhǎng)的，其特異性越強(qiáng)；酪蛋白中β-casein含量較高，來(lái)源于該蛋白的肽段LSQSKVLPVPQK靈敏度較高。

表2各肽段回收率和精密度

綜上，本發(fā)明選擇肽段1(LSQSKVLPVPQK)作為CPPs原料的特征肽段。

實(shí)施例2

同位素內(nèi)標(biāo)的確定。

質(zhì)譜定量檢測(cè)最大的問(wèn)題之一為基質(zhì)干擾，使用內(nèi)標(biāo)以消除基質(zhì)干擾對(duì)結(jié)果帶來(lái)的影響是較為普遍亦是較為理想的手段，尤其同位素內(nèi)標(biāo)為最佳選擇。鑒于本發(fā)明方法檢測(cè)的對(duì)象為多肽，在電噴霧離子(ESI+)模式下產(chǎn)生的為多電荷離子，另外，碳(1.11％¹³C)、氮(0.37％¹⁵N)元素的天然同位素豐度較高，在靈敏的質(zhì)譜檢測(cè)器中響應(yīng)較顯著，如果同位素標(biāo)記個(gè)數(shù)過(guò)少則會(huì)存在干擾，因此選擇兩個(gè)氨基酸L和S進(jìn)行同位素標(biāo)記，同位素標(biāo)記肽段為(LSQSKVL*PV*PQK)。L*和V*為碳、氮全同位素標(biāo)記。

將同一濃度的特異肽與內(nèi)標(biāo)肽混合后進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)肽與特異肽之間不僅具有相同的色譜行為，而且還具有相同的質(zhì)譜行為(圖2、圖3)；

為考察CPPs標(biāo)簽肽(LSQSKVLPVPQK)以及空白試樣是否對(duì)同位素標(biāo)記肽(內(nèi)標(biāo)肽)存在干擾，將同位素肽稀釋后進(jìn)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)只在內(nèi)標(biāo)肽通道出峰，對(duì)CPPs標(biāo)簽肽不存在干擾(圖4)?？瞻讟悠方?jīng)處理后進(jìn)樣分析，空白試樣在內(nèi)標(biāo)肽通道不出峰，對(duì)同位素內(nèi)標(biāo)肽同樣不存在干擾(圖5)。

本實(shí)施例色譜和質(zhì)譜的檢測(cè)條件及參數(shù)同實(shí)施例1中。

實(shí)施例3

(1)樣品前處理方法的優(yōu)化。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)樣品的提取(溶解)，以及純化(沉淀蛋白)兩方面進(jìn)行優(yōu)化。

a、試樣的溶解

由表1可知，LSQSKVLPVPQK多肽親水性一般，因此需要先選擇合適的溶液溶解所選肽段。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較了樣品經(jīng)過(guò)不同濃度的乙腈溶液溶解處理后，CPPs標(biāo)簽肽的峰面積。具體操作如下：

準(zhǔn)確稱取5.0g樣品21份，分別用純水、10％、15％、20％、25％、30％、40％的乙腈溶液溶解樣品，每個(gè)濃度平行3個(gè)樣品。充分溶解后定容至100mL。分別取80μL，用10mmoL乙酸銨溶液(pH＝4.6)定容至1mL，分裝于離心管中，6000r/min(4℃)，離心5min。取上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，以備進(jìn)樣，然后使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，可以看到，所選肽段隨著乙腈比例的增加，溶解能力逐漸降低，因此選擇超純水作為溶劑。

b、蛋白質(zhì)的沉淀

乳制品中通常具有較高的蛋白含量，而其中酪蛋白又占多數(shù)，對(duì)目標(biāo)物的提取和準(zhǔn)確測(cè)定會(huì)產(chǎn)生一定影響，因此，需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚韮?yōu)化以去除大部分的蛋白干擾，蛋白質(zhì)的沉淀可以選用乙腈沉淀蛋白、調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)沉淀蛋白。乙腈沉淀蛋白法，可以將樣品中的所有蛋白沉淀，不具有專一性；又因?yàn)樗x肽段在純乙腈中溶解度很差，所以本實(shí)驗(yàn)不采用此方法。通過(guò)查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，酪蛋白的等電點(diǎn)為pH＝4.6。因此本實(shí)驗(yàn)采用調(diào)節(jié)pH至4.6進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下。從表3結(jié)果來(lái)看，方法一的回收率更佳，且穩(wěn)定性好，而且實(shí)驗(yàn)操作時(shí)更方便，分析效率高。因此選擇方法一作為樣品的前處理方法。

方法一：稱取5.0g奶粉樣品，用超純水溶解，定容至100mL，取80μL，加入50μL同位素內(nèi)標(biāo)肽，用10mmoL的乙酸銨緩沖液定容至1mL。

方法二：稱取5.0g奶粉樣品，用超純水溶解，定容至100mL，取800μL，加入500μL同位素內(nèi)標(biāo)肽，加入5mL純水，用10％甲酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.6，用純水定容至10mL。

分裝于離心管中，6000r/min(4℃)，離心5min。取上清液用0.22μm濾膜過(guò)濾，以備進(jìn)樣，然后使用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示，方法一的回收率較接近100％，且標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)值較小，優(yōu)選方法一作為本發(fā)明樣品前處理的方法。

表3兩種前處理方法的比較

(2)色譜與質(zhì)譜條件

高效液相色譜分離條件：色譜柱：BEH300C18色譜柱；柱溫為40℃，流動(dòng)相為0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min；

質(zhì)譜條件：CPPs標(biāo)簽肽的母離子為442.1m/z，子離子372.4m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子568.5m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV；內(nèi)標(biāo)物特征母離子為446.3m/z，子離子372.2m/z，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為15eV，子離子574.5m/z對(duì)應(yīng)的碰撞能量為10eV；毛細(xì)管電壓3.5kV，脫溶劑溫度：375℃，脫溶劑氣流量：11.5L/min。

(3)結(jié)果計(jì)算

a、由公式1計(jì)算原料中標(biāo)簽肽的含量C_x1

公式1：

其中

C_x1——原料中酪蛋白磷酸肽標(biāo)簽肽的含量，單位為毫克每100克(mg/100g)；

n_a1——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的原料中酪蛋白磷酸肽標(biāo)簽肽的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

v₁——原料的定容體積，單位為毫升(mL)；

m₁——原料的質(zhì)量，單位為克(g)；

F₁——待測(cè)原料溶液的稀釋倍數(shù)；

10^-4——將單位ng/g換算為mg/100g的換算系數(shù)。

b、由公式2計(jì)算待測(cè)樣品中酪蛋白磷酸肽的含量C_x2；

公式2：

其中

C_x2——試樣中酪蛋白磷酸肽的含量，單位為毫克每100克(mg/100g)；

n_a2——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中酪蛋白磷酸肽標(biāo)簽肽的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

v₂——試樣的定容體積，單位為毫升(mL)；

m₂——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；

f——酪蛋白磷酸肽與酪蛋白磷酸肽標(biāo)簽肽之間的關(guān)系，本發(fā)明方法中f＝8.0×10^-3；(經(jīng)檢測(cè)100g酪蛋白磷酸肽原料中平均含本發(fā)明標(biāo)簽肽815.3mg，則f＝8.0×10^-3，815.3mg/100g≈8.0×10^-3)

F₂——待測(cè)試樣溶液的稀釋倍數(shù)；

10^-4——將單位ng/g換算為mg/100g的換算系數(shù)。

實(shí)施例4

特異性實(shí)驗(yàn)：為證明所選擇的肽段LSQSKVLPVPQK是CPPs所特有的，本實(shí)驗(yàn)首先在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)所選的肽段只在動(dòng)物體酪蛋白中存在，特異性強(qiáng)。其次選擇了乳清蛋白、全脂粉、大豆蛋白、大米蛋白等不同類型不同基質(zhì)的蛋白進(jìn)行了特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，既將上述幾種樣品按實(shí)施例3優(yōu)化的前處理方法進(jìn)行處理，按優(yōu)化好的色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，色譜圖如圖7所示，由圖可知，上述蛋白均不在所選肽段離子通道中出峰，更不會(huì)產(chǎn)生干擾，由此說(shuō)明所選肽段為CPPs的特異肽段。

實(shí)施例5

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確吸取CPPs標(biāo)簽肽標(biāo)準(zhǔn)品(1μg/mL)、10μL、25μL、50μL、100μL、200μL，并加50μL內(nèi)標(biāo)肽(1μg/mL)，再分別加入0.1％的甲酸溶液940μL、925μL、900μL、850μL、750μL，渦旋混勻。所得溶液按實(shí)施例2所述方法進(jìn)行檢測(cè)分析，每個(gè)樣品平行檢測(cè)6次，所得結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y＝0.026523x+0.132701，R²＝0.99，其中x為CPPs標(biāo)簽肽的濃度(ng/mL)，y為樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)肽峰面積的比值。

(2)待測(cè)樣品檢測(cè)

稱取原料(共11個(gè)待測(cè)樣品)各約0.1g于試管中，用超純水將試樣充分溶解(必要時(shí)置于渦旋混合器上充分渦旋或者超聲)后定容至100mL。定容后取125μL，加875μL超純水，渦旋混勻。取80μL于2mL試管中，加入50μL內(nèi)標(biāo)(1μg/mL)加入870μL乙酸銨溶液(pH＝4.6)，搖勻后，將溶液倒入離心管中，4℃離心5min，6000r/min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜。所得溶液按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。用內(nèi)標(biāo)法(標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y＝0.026523x+0.132701)根據(jù)樣品峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)計(jì)算11批原料中CPPs標(biāo)簽肽的濃度(x)如表4。根據(jù)實(shí)施例3中給出的公式1計(jì)算各原料CPPs標(biāo)簽肽的含量分別為803.8(C_x1＝80.38×1×10000×10^-4/0.1001＝803.8)、709.8、649.8、826.3、824.9、888.2、731.6、1009.8、807.2、731.4、985.4，單位為mg/100g。

表4CPPs原料檢測(cè)數(shù)據(jù)

實(shí)施例6

配方奶粉的檢測(cè)：

稱取固體試樣約5g(精確至0.01g，內(nèi)含酪蛋白磷酸肽約5mg)于50mL試管中，用超純水將試樣充分溶解(必要時(shí)置于渦旋混合器上充分渦旋或者超聲)后用超純水定容至100mL。定容后取80μL于2mL離心管中，加入50μL內(nèi)標(biāo)物(1μg/mL)，加入870μL乙酸銨溶液(pH＝4.6)，搖勻后，將溶液倒入離心管中，4℃離心5min，6000r/min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜。所得溶液作為進(jìn)樣液進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算得n_a2＝20.73ng/mL，帶入實(shí)施例3中的公式2，C_x2＝20.73×100×12.5×10^-4/(5.0×8×10^-3)＝64.8，樣品中CPPs原料的含量為64.8mg/100g。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州帕匹德科技有限公司

<120> 一種酪蛋白磷酸肽的標(biāo)簽肽及其應(yīng)用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ser Gln Ser Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Leu Ser Arg Tyr Pro Ser Tyr Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Leu Asn Tyr Tyr Gln Gln Lys Pro

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Val Pro Ile Thr Pro Thr

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Phe Tyr Gln Lys Phe Pro Gln Tyr

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Val Pro Asn Ser Ala Glu Glu Arg Leu His Ser Met

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ile Gln Lys Glu Asp Val Pro Ser Glu Arg Tyr

1 5 10