專利名稱：：一種酪蛋白磷酸化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改進蛋白功能性質(zhì)領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種將酪蛋白進行磷酸化的方法。
背景技術(shù)：
：酪蛋白是一類含磷蛋白質(zhì)，磷是生物膜的重要組成成分，是生物體不可缺少的元素之一。酪蛋白分子具有雙親性，柔韌性好，且具有較高的營養(yǎng)價值，常作為食品組分或添加劑應用于食品工業(yè)，還可添加到其他食品中強化蛋白質(zhì)。酪蛋白能夠在水中形成膠體，具有一定的粘度和良好的持水特性在冰淇淋生產(chǎn)中，添加酪蛋白酸鈉做穩(wěn)定劑，具有增強脂肪乳化，保濕和改善粘度等作用。酪蛋白中存在著明顯的疏水區(qū)和親水區(qū)，因此具有較好的乳化性和發(fā)泡性在飲料工業(yè)中，酪蛋白可以作為酸性飲料的穩(wěn)定劑，酒和啤酒的澄清劑，蘋果汁的脫色劑。利用酪蛋白制品的乳化特性，可以用來生產(chǎn)含較高脂類的食品，也可應用于牙膏，護手霜等產(chǎn)品中。另外，在飼料中添加碘化酪蛋白還可提高乳牛的產(chǎn)奶量。但在食物蛋白開發(fā)過程中，由于酪蛋白的一些功能性質(zhì)也使其在食品工業(yè)應用上受到了一定限制。為了擴大其應用范圍，采用適度的磷酸化改性方法可使其原有的功能特性更適于食品加工。而蛋白質(zhì)的磷酸化作用對其消化無顯著影響。目前，在酪蛋白的磷酸化改性方法中大多是采用三氯氧磷作為磷酸化試劑。三氯氧磷是一種非?；顫姷脑噭?，反應放出的熱量和pH的驟降會使蛋白變性，同時，實驗條件很劇烈，不易控制。而且，反應引起蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)后，分子量進一步增大，從而導致溶解度下降。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種以三聚磷酸鈉為磷酸化試劑，反應條件溫和，容易控制，使改性后的酪蛋白的營養(yǎng)價值和各方面性質(zhì)更適合于食品加工的酪蛋白磷酸化的方法。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明酪蛋白磷酸化的方法以分析純干酪素為原料，溶解于磷酸鹽緩沖液中，磁力攪拌至完全溶解后，真空抽濾，得到酪蛋白溶液。將溶液的pH控制在堿性，加入一定濃度的三聚磷酸鈉溶液，再經(jīng)過真空纖維膜透析、冷凍干燥可以得到棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。具體操作步驟如下(1)制備酪蛋白溶液將干酪素溶解于磷酸鹽緩沖液中，在4(TC攪拌至完全溶解，之后進行真空抽濾，去掉干酪素中的固體雜質(zhì)及部分未溶的蛋白質(zhì)和脂類，得到酪蛋白溶液；其中干酪素與磷酸鹽緩沖液的重量/體積比為1:100~150左右。所述磷酸鹽緩沖液由磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置而成，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.2mol/L、pH值為7。(2)磷酸化調(diào)整酪蛋白溶液的pH值為7.G~9.G，之后在上述堿性酪蛋白溶液中加入質(zhì)量體積百分比濃度為3%~5%的三聚磷酸鈉溶液，在30匸5(TC恒溫2-4小時進行磷酸化反應，之后冷卻到室溫。溶液中酪蛋白與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為1:3~5。調(diào)整酪蛋白溶液的pH值時所用溶液最好為稀氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉溶液的濃度為0.01mol/L，由于緩沖液中也是用的鈉鹽，使得引入雜質(zhì)離子少。在磷酸化過程中，三聚磷酸鹽可和蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生化學反應，把反應條件控制在弱堿性，即pH值為7~9時，自由氨基的活性較大，即使在中性到堿性的條件下也可以反應。三聚磷酸鈉和蛋白表面氨基的反應式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(3)純化調(diào)節(jié)磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性，用真空纖維膜進行透析，去除溶液中的小分子量離子，如Na+，磷酸根及磷酸氫根，三聚磷酸根等，收集酪蛋白溶液，再將上述溶液冷凍干燥，得棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。所用調(diào)節(jié)磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性所用的溶液為稀鹽酸溶液，其濃度為0.01mol/L。透析可以選用6000-8000D的真空纖維膜，小于這個分子量的離子會滲透出透析袋，而大于這個分子量的酪蛋白會留在透析袋里邊。在透析過程中，每隔兩小時換一次水，并用質(zhì)量體積比濃度為1°/的氯化鋇溶液檢驗透析溶液中小分子量離子的含量，直到符合要求，一般需要24小時透析結(jié)束。使用氯化鋇進行檢驗時，由于BaCl2和磷酸根的反應生成的磷酸鋇不溶于水，所以反應較為靈敏。冷凍干燥的溫度為-5(TC,壓強為500-600Pa,時間為24小時，使用鋼制托盤進行冷凍干燥。本發(fā)明具有下述技術(shù)效果1.本發(fā)明酪蛋白的磷酸化方法采用三聚磷酸鈉為磷酸化試劑，三聚磷酸鈉是FDA批準使用的，不僅保障了食品安全，改善食品蛋白質(zhì)的功能特性和營養(yǎng)特性，而且不影響食品蛋白的消化率。當酪蛋白與STP(三聚磷酸鈉)在pH-79反應時，三聚磷酸鹽可和蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生化學反應，改性蛋白分子中新增加的磷酸根主要是連接在氮原子上。把反應條件控制在弱堿性，即pH值為7~9時，自由氨基的活性較大，即使在中性到堿性的條件下也可以反應，反應條件溫和，容易控制。而且，不會引起蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)反應。因此，使用三聚磷酸鈉為磷酸化試劑，既營養(yǎng)又安全，而且，實驗工藝筒單，磷酸化效果好。2.通過本發(fā)明的磷酸化方法得到的酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的營養(yǎng)價值。而且，營養(yǎng)價值和各方面性質(zhì)更適合于食品加工。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明詳細說明。實施例1稱取1.OOOg干酪素，將其溶解于100mL用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置的濃度為0.2mol/L、pH為7的磷酸鹽緩沖液中。在溫度40。C時，磁力攪拌約10小時至完全溶解，之后用布氏漏斗進行真空抽濾，少量多次，去掉干酪素中的固體雜質(zhì)及部分未溶的蛋白質(zhì)和脂類，最后得淡黃色酪蛋白溶液。滴加0.01mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)上述酪蛋白溶液的pH值為7.Q備用。量取上述pH值為7.Q的酪蛋白溶液30mL，加入質(zhì)量體積百分比濃度為3。/o的三聚磷酸鈉溶液30mL，磷S吏化反應在電熱恒溫水浴鍋進行，溫度控制在40°C,反應時間為3小時。磷酸化后冷卻至室溫。之后用0.01mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纖維膜透析24小時，收集酪蛋白溶液。透析過程中隔兩小時換一次水。每次透析結(jié)束后用質(zhì)量體積比濃度為1°/。的氯化鋇溶液檢驗收集的酪蛋白溶液，時間差為兩小時左右，直至沒有沉淀出現(xiàn)為止。最后將透析后收集的酪蛋白溶液放入鋼制托盤在溫度-50°C，壓強為500Pa的條件下進行冷凍干燥，約24小時后得棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。實施例2稱取1.OOOg干酪素，將其溶解于150mL用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置的濃度為0.2mol/L、pH為7的磷酸鹽緩沖液中。在溫度4(TC時，磁力攪拌約10小時至完全溶解，之后用布氏漏斗進行真空抽濾，少量多次，去掉干酪素中的固體雜質(zhì)及部分未溶的蛋白質(zhì)和脂類，最后得淡黃色酪蛋白溶液。滴加0.Olmol/L的氬氧化鈉調(diào)節(jié)上述酪蛋白溶液的pH值為8.0備用。量取上述pH值為8.G的酪蛋白溶液30mL,加入質(zhì)量體積百分比濃度為4。/o的三聚磷酸鈉溶液30mL，磷酸化反應在電熱恒溫水浴鍋進行，溫度控制在5(TC，反應時間為2小時。之后用0.01mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纖維膜透析24小時，收集酪蛋白溶液。透析過程中隔兩小時換一次水。每次透析結(jié)束后用質(zhì)量體積比濃度為1%的氯化鋇溶液4企驗收集的酪蛋白溶液，時間差為兩小時左右，直至沒有沉淀出現(xiàn)為止。最后將透析后收集的酪蛋白溶液放入鋼制托盤在溫度-50°C，壓強為600Pa的條件下進行冷凍干燥，約24小時后得棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。實施例3稱取1.OOOg干酪素，將其溶解于120mL用磷酸二氬鈉和磷酸氬二鈉配置的濃度為0.2mol/L、pH為7的磷酸鹽緩沖液中。在溫度40。C時，磁力攪拌約10小時至完全溶解，之后用布氏漏斗進行真空抽濾，少量多次，去掉干酪素中的固體雜質(zhì)及部分未溶的蛋白質(zhì)和脂類，最后得淡黃色酪蛋白溶液。滴加0.01mol/L的氬氧化鈉調(diào)節(jié)上述酪蛋白溶液的pH值為9.0備用。量取上述pH值為9.0的酪蛋白溶液30mL,加入質(zhì)量體積百分比濃度為5。/o的三聚磷酸鈉溶液30mL，磷酸化反應在電熱恒溫水浴鍋進行，溫度控制在30°C，反應時間為4小時。之后用0.01mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)上述磷酸化所得溶液的pH值至中性，用6000-8000D的真空纖維膜透析24小時，收集酪蛋白溶液。透析過程中隔兩小時換一次水。每次透析結(jié)束后用質(zhì)量體積比濃度為ly。的氯化鋇溶液^全驗收集的酪蛋白溶液，時間差為兩小時左右，直至沒有沉淀出現(xiàn)為止。最后將透析后收集的酪蛋白溶液^:入鋼制托盤在溫度-50°C,壓強為550Pa的條件下進行冷凍千燥，約24小時后得棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。未磷酸化酪蛋白功能性質(zhì)如表1所示，磷酸化后酪蛋白功能性質(zhì)如表2所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從上述表中可以看出，在實施例1中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是0.0086g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可達O.0175g(磷/g酪蛋白)，也就是說增量可以達到約0.0089g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的營養(yǎng)價值。乳化性參數(shù)由676.30m2/g提高到1092.55附Vg。在實施例2中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是0.0095g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可達0.0191g(磷/g酪蛋白)，也就是"i兌增量可以達到約0.0096g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的營養(yǎng)價值。乳化性參數(shù)由885.64附2/^提高到960.07m2/g。在實施例3中，未磷酸化的酪蛋白的磷含量是O.0102g(磷/g酪蛋白)，磷酸化后的酪蛋白的含磷量最高可達O.0215g(磷/g酪蛋白)，也就是說增量可以達到約0.0113g(新增磷/g酪蛋白)。酪蛋白中含磷量高，提高了酪蛋白的營養(yǎng)價值。乳化性參數(shù)由1164.52W/g提高到1282.28m2/g。因此，磷酸化作用可以提高蛋白質(zhì)的溶解性和乳化性，磷酸化后的酪蛋白功能性質(zhì)有所改進，更加適于食品生產(chǎn)。盡管參照實施例對所公開的涉及一種酪蛋白磷酸化的方法進行了特別描述，以上描述的實施例是說明性的而不是限制性的，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，所有的變化和修改都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種酪蛋白磷酸化的方法，其特征是包括下述步驟(1)制備酪蛋白溶液將干酪素溶解于磷酸鹽緩沖液中，在40℃攪拌至完全溶解，之后進行真空抽濾，去掉干酪素中的固體雜質(zhì)及未溶的蛋白質(zhì)和脂類，得到酪蛋白溶液；(2)磷酸化調(diào)整酪蛋白溶液的pH值為7.0～9.0，之后在上述堿性酪蛋白溶液中加入質(zhì)量體積百分比濃度為3％～5％的三聚磷酸鈉溶液，在30℃～50℃恒溫2-4小時進行磷酸化反應，之后冷卻到室溫；溶液中酪蛋白與三聚磷酸鈉的質(zhì)量比為1∶3～5；(3)純化調(diào)節(jié)磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性，用真空纖維膜進行透析，收集酪蛋白溶液，再將上述溶液冷凍干燥，得棉花狀的白色的磷酸化酪蛋白。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是所述磷酸鹽緩沖液由磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置而成，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.2mol/L、pH值為7。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是步驟(2)中調(diào)整酪蛋白溶液的pH值為7.Q~9.0時所用溶液為稀氫氧化鈉溶液，步驟(3)所用調(diào)節(jié)磷酸化后的酪蛋白溶液的pH值至中性所用溶液為稀鹽酸溶液。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是酪蛋白溶液進行冷凍干燥的溫度為-50°C，壓強為500-600Pa,時間為24小時，使用鋼制托盤進行冷凍干燥。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是透析過程中選用6000-8000D的真空纖維膜；每隔兩小時換一次水，并用質(zhì)量體積比濃度為1°/的氯化鋇溶液4全驗透析溶液中小分子量離子的含量。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪蛋白磷酸化的方法，其特征是干酪素與磷酸鹽緩沖液的重量/體積比為1:100~150。全文摘要本發(fā)明公開了一種酪蛋白磷酸化的方法，旨在提供一種以三聚磷酸鈉為磷酸化試劑，反應條件溫和，容易控制，使改性后的酪蛋白的營養(yǎng)價值和各方面性質(zhì)更適合于食品加工的酪蛋白磷酸化的方法。將干酪素溶解于磷酸鹽緩沖液中，在40℃攪拌至完全溶解，真空抽濾，得到酪蛋白溶液；調(diào)整酪蛋白溶液的pH值為7.0～9.0，加入3％～5％的三聚磷酸鈉溶液，在30℃～50℃恒溫進行磷酸化反應，之后冷卻到室溫；調(diào)節(jié)磷酸化后酪蛋白溶液的pH值至中性，透析，冷凍干燥，得到磷酸化的酪蛋白。本發(fā)明酪蛋白的磷酸化方法采用三聚磷酸鈉為磷酸化試劑，不僅保障了食品安全，改善食品蛋白質(zhì)的功能特性和營養(yǎng)特性，而且，反應條件溫和，容易控制。文檔編號C07K1/107GK101182347SQ200710150129公開日2008年5月21日申請日期2007年11月9日優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日發(fā)明者任云霞,鵬康,張坤生申請人:天津商業(yè)大學