本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種人神經(jīng)生長因子類似物及其制備方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor，NGF)是最早發(fā)現(xiàn)和最典型的神經(jīng)營養(yǎng)因子，同時也是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一。它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。目前NGF已被開發(fā)成治療外周神經(jīng)損傷的藥物應(yīng)用于臨床，并廣泛應(yīng)用于神經(jīng)損傷、偏癱、卒中、顱腦損傷、小兒腦癱等神經(jīng)性疾病領(lǐng)域。但目前，商品化的NGF為鼠源性神經(jīng)生長因子(mNGF)，潛在免疫原性風(fēng)險。天然的人神經(jīng)生長因子(hNGF)分布于人體的腦、神經(jīng)節(jié)、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織，原料來源有限，且其中hNGF含量低，分離純化極其困難，無法直接提取獲得。

hNGF基因位于1號染色體短臂上，完整的hNGF外顯子編碼241個氨基酸組成的hNGF前體，通常稱為preproNGF，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中preproNGF的信號肽(pre部分)被切割下來，生成hNGF原體，即proNGF(由223個氨基酸組成)，然后被轉(zhuǎn)運至高爾基體內(nèi)，再經(jīng)蛋白酶酶切去除前導(dǎo)肽(pro部分)，生成hNGF成熟肽(由120個氨基酸組成)，被轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，發(fā)揮生理功能。

在各大表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因其表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢成為制備重組人神經(jīng)生長因子的首選。但目前存在的主要問題是：hNGF難于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)重組人神經(jīng)生長因子的穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種人神經(jīng)生長因子類似物，具有與天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，其避免了現(xiàn)有的鼠源性神經(jīng)生長因子mNGF免疫原性風(fēng)險問題。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種人神經(jīng)生長因子類似物的制備方法，解決了重組人神經(jīng)生長因子難于在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、可溶及高活性表達(dá)的技術(shù)難題。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案：

一種人神經(jīng)生長因子類似物(GhNGF)，所述的人神經(jīng)生長因子類似物含人神經(jīng)生長因子正常氨基酸序列及其N末端增加一個甘氨酸殘基。

如上所述的人神經(jīng)生長因子類似物，優(yōu)選地，所述人神經(jīng)生長因子正常氨基酸序列為天然人神經(jīng)生長因子氨基酸序列，或者具有與天然人神經(jīng)生長因子氨基酸序列95％以上同源性且具有神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性的氨基酸序列。

如上所述的人神經(jīng)生長因子類似物，優(yōu)選地，所述人神經(jīng)生長因子類似物含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

如上所述的人神經(jīng)生長因子類似物，優(yōu)選地，用于編碼所述SEQ ID NO.1的氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中第331～693位所示或其互補序列。

一種人神經(jīng)生長因子類似物的制備方法，優(yōu)選地，將改造的人神經(jīng)生長因子原體(proNGF)cDNA插入原核表達(dá)載體，構(gòu)建成重組表達(dá)載體，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備；其中，所述改造的人神經(jīng)生長因子原體(proNGF)cDNA編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.3中第8～231位所示序列，或者與其氨基酸序列同源性大于90％的序列。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述原核表達(dá)載體為融合蛋白表達(dá)載體，為pMAL載體、pGEX載體或pET載體。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述pMAL載體為pMAL-p5x、pMAL-p5E、pMAL-p5G，所述pET載體為pET39b或pET32a。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述的融合蛋白表達(dá)載體經(jīng)過了改造，其消除了載體自身的凝血酶酶切識別位點。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述改造的人神經(jīng)生長因子原體(proNGF)cDNA含如SEQ ID NO.2中第22～693位所示序列或其互補序列。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)制備的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后，采用凝血酶酶切，再次純化獲得人神經(jīng)生長因子類似物純品。

本發(fā)明提供的人神經(jīng)生長因子類似物，具有與天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，是利用基因工程重組蛋白技術(shù)制備的重組人神經(jīng)生長因子(hNGF)。其取代了組織提取的鼠源性神經(jīng)生長因子(mNGF)，有效避免了mNGF存在免疫原性風(fēng)險的問題，也解決了天然的人神經(jīng)生長因子不能直接獲得的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供一種人神經(jīng)生長因子類似物的制備方法，在人神經(jīng)生長因子正常氨基酸序列的N末端多增加1個甘氨酸殘基(G)，使其在大腸桿菌中的穩(wěn)定性和表達(dá)量得到明顯提高，同時在選用融合蛋白表達(dá)體系時更有利于操作控制，從而實現(xiàn)重組人神經(jīng)生長因子在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)。

附圖說明

圖1為MBP-GhNGF融合表達(dá)的SDS-PAGE圖。

圖2為MBP-GhNGF融合表達(dá)Western Blot鑒定圖。

圖3為Trx-GhNGF融合表達(dá)的SDS-PAGE圖。

圖4為不同IPTG濃度于28℃誘導(dǎo)對MBP-GhNGF融合表達(dá)影響的SDS-PAGE圖。

圖5為不同IPTG濃度于25℃誘導(dǎo)對MBP-GhNGF融合表達(dá)影響的SDS-PAGE圖。

具體實施方式

發(fā)明人通過對NGF分子結(jié)構(gòu)的深入研究，提出了一種人神經(jīng)生長因子類似物。該類似物是指在人神經(jīng)生長因子正常氨基酸序列的N末端增加了一個甘氨酸殘基(G)，記作GhNGF，其中，人神經(jīng)生長因子正常氨基酸序列為天然人神經(jīng)生長因子氨基酸序列，或者具有與天然人神經(jīng)生長因子氨基酸序列95％以上同源性且具有神經(jīng)生長因子生物學(xué)活性的氨基酸序列。通過優(yōu)化表達(dá)，使其在大腸桿菌中的穩(wěn)定性和表達(dá)量得到明顯提高，同時在選用融合蛋白表達(dá)體系時更有利于操作控制。

本發(fā)明在制備人神經(jīng)生長因子類似物的過程中，對人神經(jīng)生長因子原體(proNGF)進行改造，使其編碼的proNGF第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造為甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一個甘氨酸(Gly¹⁰⁴)；改造后編碼的氨基酸序列Gly¹⁰²-Arg¹⁰³-↓Gly¹⁰⁴(↓為酶切位點)可被凝血酶識別，并在Arg¹⁰³羧基端切開，產(chǎn)生N末端多一個甘氨酸的hNGF成熟肽，即本發(fā)明所制備的人神經(jīng)生長因子類似物(GhNGF)。經(jīng)免疫印跡(Western Blot)鑒定和生物活性檢測證明，GhNGF具有與天然hNGF一致的免疫活性和生物活性，而且，GhNGF能夠?qū)崿F(xiàn)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)。因GhNGF為具有新結(jié)構(gòu)的生物分子，其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)，使其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為可能，有利于新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用。

下面通過具體實施例來說明本發(fā)明，應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進一步的說明。

在本說明書中，除非特別指明，否則所用技術(shù)術(shù)語為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員常用術(shù)語；本說明書中未注明具體條件的實驗方法是按常規(guī)實驗方法；本說明書中所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑及培養(yǎng)基的成分和配制方法可參見常規(guī)實驗手冊中的操作。

實施例1：GhNGF基因的獲得

本發(fā)明的人神經(jīng)生長因子類似物，是在天然人神經(jīng)生長因子氨基酸序列及其N末端增加了一個甘氨酸殘基，具體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1：

GSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA。

為了實現(xiàn)重組人神經(jīng)生長因子在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)，發(fā)明人參照大腸桿菌偏愛密碼子表，同時對proNGF前導(dǎo)肽編碼序列進行改造，將proNGF第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造為甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一個甘氨酸(Gly¹⁰⁴)，另外還結(jié)合密碼子簡并性、GC含量、轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性等因素，設(shè)計適用于重組蛋白表達(dá)的序列，具體如SEQ ID NO.2所示的proNGF cDNA序列，其中，5’端含有AvaⅠ限制性酶切位點(CTCGGG)，3’端含有HindⅢ限制性酶切位點(AAGCTT)和終止密碼子TAA，其中SEQ ID NO.2中第331～693位所示或其互補序列編碼的氨基酸序列對應(yīng)為SEQ ID NO.1所示序列。

SEQ ID NO.2：(proNGF cDNA設(shè)計序列)

5’-CTCGGGGATGACGATGACAAAGAACCGCACTCCGAATCAAACGTTCCGGCTGGCCATACGATTCCGCAGGCGCACTGGACCAAACTGCAACATTCGCTGGATACCGCCCTGCGTCGCGCTCGTAGCGCACCGGCAGCAGCAATTGCTGCGCGCGTGGCCGGTCAGACGCGTAATATCACCGTTGATCCGCGCCTGTTTAAAAAACGTCGCCTGCGTTCCCCGCGCGTCCTGTTCTCAACGCAGCCGCCGCGTGAAGCAGCAGACACCCAAGATCTGGACTTTGAAGTGGGCGGTGCTGCGCCGTTCAACCGTACCCATCGCTCTGGCCGTGGTAGCTCTAGTCATCCGATTTTTCACCGTGGCGAATTCAGTGTTTGCGATAGCGTGAGCGTTTGGGTCGGTGATAAAACCACGGCCACGGACATTAAAGGCAAAGAAGTGATGGTTCTGGGTGAAGTTAACATCAACAACAGCGTCTTCAAACAGTATTTCTTTGAAACCAAATGCCGCGATCCGAACCCGGTTGACTCTGGCTGTCGTGGTATCGATTCTAAACACTGGAATAGTTACTGTACCACGACCCATACGTTTGTCAAAGCTCTGACCATGGATGGCAAACAAGCCGCATGGCGCTTCATTCGTATCGACACCGCATGCGTCTGTGTGCTGAGCCGCAAAGCCGTGCGTCGCGCATAAAAGCTT-3’。

通過化學(xué)合成的方式合成了該序列。上述proNGF cDNA序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中GRG為凝血酶酶切識別位點。

SEQ ID NO.3：

LGDDDDKEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSGRGSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRA。

本發(fā)明所改造的proNGF cDNA，是根據(jù)氨基酸的密碼子簡并性和大腸桿菌密碼子偏愛性，再綜合考慮cDNA序列及其轉(zhuǎn)錄的mRNA序列結(jié)構(gòu)、GC含量、穩(wěn)定性等因素，優(yōu)化、改造堿基序列，使其編碼的proNGF在大腸桿菌中的穩(wěn)定性和表達(dá)量得到提高，編碼的proNGF氨基酸序列等同于天然人proNGF氨基酸序列的第102位氨基酸(Lys¹⁰²)改造為甘氨酸(Gly¹⁰²)，并在第103位氨基酸(Arg¹⁰³)后插入一個甘氨酸(Gly¹⁰⁴)后的序列。編碼的proNGF氨基酸序列如SEQ ID NO.3中第8～231位所示序列，或者與該氨基酸序列同源性大于90％的序列。

上述設(shè)計的proNGF cDNA如SEQ ID NO.2所示的第22～693位序列結(jié)合不同的融合蛋白表達(dá)載體，均能實現(xiàn)本發(fā)明的目的蛋白——人神經(jīng)生長因子類似物的表達(dá)。選用不同的融合蛋白表達(dá)載體需要設(shè)計不同PCR擴增引物，引入相應(yīng)的酶切位點。其中用于pET39b和pET32a表達(dá)載體的PCR擴增引物序列如下：

SEQ ID NO.4：(正向引物，5’端引入KpnⅠ限制性酶切位點GGTACC)

5'-CGG GGTACC GATGACGATGACAAAGAACCGC-3'

SEQ ID NO.5：(反向引物，引入HindⅢ限制性酶切位點AAGCTT和終止密碼子TAA。)

5'-CCC AAGCTTTTATGCGCGACGCACG-3'。

實施例2：GhNGF重組表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌的獲得

融合蛋白表達(dá)是在目的蛋白的N端或C端添加特殊蛋白序列，以提高目的蛋白的可溶性，促進其正確折疊，實現(xiàn)其快速親和純化，或者實現(xiàn)其細(xì)胞表達(dá)定位。該特殊蛋白序列被稱作為融合蛋白標(biāo)簽(tag)，常用的融合蛋白標(biāo)簽有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、二硫鍵形成蛋白(Dsb)、硫氧還蛋白(Trx)以及His-tag、S-tag等。采用該方式表達(dá)的載體就稱作融合蛋白表達(dá)載體，比如pMAL載體采用MBP作為融合蛋白標(biāo)簽，pGEX載體采用GST作為融合蛋白標(biāo)簽。

本發(fā)明采用原核表達(dá)載體，可實現(xiàn)本發(fā)明的目的，優(yōu)選為融合蛋白表達(dá)載體；具體可用pMAL載體、pGEX載體或pET載體；更為優(yōu)選地，為pMAL-p5x、pMAL-p5E、pMAL-p5G或pET39b或pET32a；最為優(yōu)選地，為pET39b或pET32a。列舉如下來說明：

2.1以pMAL-p5x為融合蛋白表達(dá)載體，構(gòu)建GhNGF重組表達(dá)載體及融合表達(dá)工程菌。

將人工合成的proNGF cDNA序列(SEQ ID NO.2)，用AvaⅠ和HindⅢ雙酶切后通過T4DNA連接酶連接到同樣經(jīng)雙酶切的pMAL-p5x表達(dá)載體上，構(gòu)建pMAL-p5x-GhNGF重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株Top10，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)篩選重組子，經(jīng)PCR與酶切鑒定正確后，測序驗證其序列正確性。

提取鑒定正確的重組子為pMAL-p5x-GhNGF重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)表達(dá)菌株BL21(DE3)中，在含有50μg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)篩選重組子，獲得的重組子即為MBP融合表達(dá)的GhNGF工程菌，命名為MBL-GhNGF。將其保存于15％甘油中，凍存于－80℃冰箱。其中，MBL-GhNGF工程菌表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白應(yīng)含有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽、hNGF原體的pro部分以及GhNGF序列，理論分子量約為70kDa。

取甘油管凍存的MBL-GhNGF工程菌，按0.2％接種于含有新鮮LB抗性培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)的試管中，振蕩培養(yǎng)過夜，活化菌株；再轉(zhuǎn)接至100mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)約3h，測其OD600值在0.6～0.8時，加入0.5mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，于37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收集菌體；稱量菌體濕重，按菌體和破菌液(25mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH10.0)重量比為1∶15的比例加入破菌液，超聲破菌后，將破菌上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖1所示，其中M為蛋白Marker；1為0.5mM IPTG、37℃誘導(dǎo)4h的破菌上清；2為0.5mM IPTG、37℃誘導(dǎo)4h的破菌沉淀。結(jié)果說明破菌上清中有分子量約70kDa的融合蛋白表達(dá)。

將上述表達(dá)的分子量約70kDa的融合蛋白分別用proNGF單抗(Abcam公司產(chǎn)品，貨號：ab68151，下同。)和NGF單抗(Abcam公司產(chǎn)品，貨號：ab52918，下同。)進行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中圖2A為采用proNGF單抗雜交鑒定；圖2B為采用NGF單抗雜交鑒定；1為未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21(DE3)空載菌；2為未誘導(dǎo)MBL-GhNGF工程菌菌體全蛋白；3為0.2mM IPTG、28℃誘導(dǎo)4h的破菌沉淀；4為0.2mM IPTG、28℃誘導(dǎo)4h的破菌上清。結(jié)果表明破菌上清中的70kDa的融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

2.2以pET39b為融合蛋白表達(dá)載體，構(gòu)建GhNGF重組表達(dá)載體及融合表達(dá)工程菌。

以2.1構(gòu)建的重組載體pMAL-p5x-GhNGF為模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列為引物，擴增proNGF cDNA序列，使其序列5’端帶有KpnⅠ限制性酶切位點，3’端序列不變，仍含有HindⅢ限制性酶切位點和終止密碼子TAA。

具體地，PCR反應(yīng)體系為50μl，其中pMAL-p5x-GhNGF的模板1μl，運用實施例1中的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的正、反向引物(10μM)各1μl，dNTPs 3μl，5×Buffer 10μl，Taq DNA聚合酶1μl，ddH₂O33μl。擴增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后一個循環(huán)后72℃延伸10min。用1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產(chǎn)物，回收后的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過T4DNA連接酶連接到同樣經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的pET39b表達(dá)載體上，構(gòu)建pET39b-GhNGF重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α，在含有50μg/ml卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)篩選重組子，經(jīng)PCR與酶切鑒定正確后，測序驗證其序列正確性。提取鑒定正確的重組載體pET39b-GhNGF的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)表達(dá)菌株BL21(DE3)，在含有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)篩選重組子，獲得的重組子即為DsbA融合表達(dá)的GhNGF工程菌，命名為D39BL-GhNGF。其中，D39BL-GhNGF工程菌表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白應(yīng)含有二硫鍵形成蛋白(DsbA)標(biāo)簽、hNGF原體的pro部分以及GhNGF序列，理論分子量約為53kDa。

取甘油管凍存的D39BL-GhNGF工程菌，按0.2％接種于含有新鮮LB抗性培養(yǎng)基(含50μg/ml Kan)的試管中，振蕩培養(yǎng)過夜，活化菌株；再轉(zhuǎn)接至100mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)約3h，測其OD600值在0.6～0.8時，加入0.2mM IPTG，于25℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收集菌體；稱量菌體濕重，按菌體和破菌液(20mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0)重量比為1∶15的比例加入破菌液，超聲破菌后，將破菌上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測和Western Blot鑒定。結(jié)果說明破菌上清中有分子量約53kDa的融合蛋白表達(dá)；且該融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

2.3以pET32a為融合蛋白表達(dá)載體，構(gòu)建GhNGF重組表達(dá)載體及融合表達(dá)工程菌。

為提高表達(dá)的融合蛋白DsbA-proNGF被凝血酶酶切的效率，可通過PCR定點突變的方法消除載體本身自帶的凝血酶酶切識別位點(LVPRGS)的編碼序列，如將該氨基酸序列從LVPRGS突變?yōu)長VPKGS。

2.3.1改造pET32a，消除其自帶的凝血酶酶切識別位點(LVPRGS)的編碼序列。

合成以下引物(SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7)，以定點突變凝血酶酶切識別位點(LVPRGS)的編碼序列，將其中R(精氨酸)的編碼序列突變?yōu)镵(賴氨酸)的編碼序列。

SEQ ID NO.6：(正義鏈引物，其中AAA為賴氨酸編碼序列)

5’-AAAAGGTTCTGGTATGAAAGAAACCGCTGC-3’

SEQ ID NO.7：(反義鏈引物，其中TTT為賴氨酸編碼序列)

5’-TCATACCAGAACCTTTTGGCACCAGACCAG-3’

以pET32a載體為模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列為引物進行擴增。PCR體系為30μl，其中pET32a載體的模板質(zhì)粒1μl，上述引物(10μM)各0.8μl，dNTPs(10μM)0.6μl，5×Buffer 6μl，Phusion高保真DNA聚合酶0.3μl，補加ddH₂O至30μl。擴增反應(yīng)條件為98℃1min；98℃5s，61℃30s，72℃3min，32個循環(huán)；72℃10min。用1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)DpnⅠ酶切消化模板質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株Top10，挑選克隆菌落，測序驗證其序列正確性。測序正確的克隆菌所含質(zhì)粒即為改造的pET32a載體，記作pET32a-deT。

2.3.2構(gòu)建pET32a-deT-GhNGF重組表達(dá)載體及工程菌

取2.2中采用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5為引物擴增的產(chǎn)物，用KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后，通過T4DNA連接酶連接到同樣經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的pET32a-deT表達(dá)載體上，構(gòu)建pET32a-deT-GhNGF重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株Top10，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)篩選重組子，重組子經(jīng)PCR與酶切鑒定正確后，測序驗證其序列正確性。

提取鑒定正確的重組載體pET32a-deT-GhNGF的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)表達(dá)菌株Origami B(DE3)，在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)篩選重組子，獲得的重組子即為TrxA融合表達(dá)的GhNGF工程菌，命名為T32deTOB-GhNGF。將其保存于15％甘油中，凍存于－80℃冰箱。其中，T32deTOB-GhNGF工程菌表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白應(yīng)含有硫氧還蛋白(TrxA)標(biāo)簽、hNGF原體的pro部分以及GhNGF序列，理論分子量約為42kDa。

取活化后的T32deTOB-GhNGF工程菌，按體積比1∶100的比例接種至100ml LB培養(yǎng)基中，在OD600達(dá)到0.6時，加入終濃度為0.5mM的IPTG，25℃誘導(dǎo)表達(dá)4h；對照不加IPTG，同樣條件培養(yǎng)。離心收集菌體，加入15ml的PBS，超聲破菌，條件為超聲2s、間歇3s，80％功率；破菌后于4℃12000rpm離心15min，分出破菌上清和沉淀，沉淀用同等體積的PBS重懸。分別取20μl的菌液、破菌上清及沉淀重懸液，均加入5μl 5×上樣Buffer，混勻，于100℃沸水浴變性5min，各取10μl，行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖3所示，其中1為未誘導(dǎo)全菌蛋白；2為未誘導(dǎo)破菌沉淀；3為未誘導(dǎo)破菌上清；4為誘導(dǎo)表達(dá)的全菌蛋白；5為誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀；6為誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清。結(jié)果表明破菌上清中有分子量大小約42kDa的目標(biāo)蛋白。

將上述表達(dá)的分子量約42kDa的融合蛋白分別用proNGF單抗和NGF單抗進行Western Blot鑒定，結(jié)果表明42kDa的融合蛋白具有proNGF和NGF免疫活性。

實施例3：GhNGF的表達(dá)及純化

3.1MBP融合表達(dá)GhNGF及純化

3.1.1MBP融合表達(dá)GhNGF的條件優(yōu)化

將實施例2.1中活化的MBL-GhNGF工程菌，接種于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時，分別于誘導(dǎo)溫度28℃，IPTG濃度為0mM、0.05mM、0.2mM誘導(dǎo)4h；誘導(dǎo)溫度25℃，IPTG濃度為0mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM誘導(dǎo)4h，離心收集菌體，超聲破菌后，將破菌上清和沉淀進行SDS-PAGE檢測。實驗結(jié)果如圖4、圖5所示，其中，圖4中1為蛋白Marker；2為未誘導(dǎo)全菌蛋白；3為0.05mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；4為0.05mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀；5為0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；6為0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀；圖5中，1為蛋白Marker；2為未誘導(dǎo)全菌蛋白；3為0.05mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；4為0.05mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀；5為0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；6為0.1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀。7為0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；8為0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀；9為0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌上清；10為0.5mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的破菌沉淀。

結(jié)果表明，在誘導(dǎo)溫度為25℃，IPTG濃度0.2mM誘導(dǎo)4h時，可溶性蛋白表達(dá)量相對較多。

3.1.2MBP融合表達(dá)GhNGF的純化

重組GhNGF蛋白的表達(dá)是采用實施例2.1構(gòu)建的MBL-GhNGF工程菌來完成。發(fā)酵后發(fā)酵液離心收集菌體，壓力勻漿破菌，收集上清上Dextrin Sepharose HP層析柱，用含麥芽糖的緩沖液(200mM麥芽糖-20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0)洗下融合蛋白，加入凝血酶25℃酶切2小時，然后通過Dextrin Sepharose HP層析柱除去雜蛋白(未酶切的全長融合蛋白和融合蛋白標(biāo)簽-hNGF前導(dǎo)肽(MBP-pro peptide))，切下的GhNGF經(jīng)SP Sepharose FF層析獲得純度大于95％的GhNGF。

3.2DsbA融合表達(dá)GhNGF及純化

重組GhNGF蛋白的表達(dá)是采用實施例2.2構(gòu)建的D39BL-GhNGF工程菌來完成。發(fā)酵后發(fā)酵液離心收集菌體，壓力勻漿破菌，收集上清上Ni-Sepharose 6FF層析柱，用50mM-200mM咪唑(Imidazole)梯度洗脫收集融合蛋白，經(jīng)凝血酶25℃酶切2小時，然后通過Ni-Sepharose 6FF層析柱除去雜蛋白(未酶切的全長融合蛋白和融合蛋白標(biāo)簽-hNGF前導(dǎo)肽(Dsb-pro peptide))，切下的GhNGF經(jīng)SP Sepharose FF層析獲得純度大于95％的GhNGF。

3.3TrxA融合表達(dá)GhNGF及純化

重組GhNGF蛋白的表達(dá)是采用實施例2.3構(gòu)建的T32deTOB-GhNGF工程菌來完成。發(fā)酵后發(fā)酵液離心收集菌體，壓力勻漿破菌，收集上清，同3.2方法純化，獲得純度大于95％的GhNGF。

上述三種方法獲得純化后的GhNGF分別用proNGF單抗和NGF單抗進行Western Blot再次鑒定，上述純化后的GhNGF均具有proNGF和NGF免疫活性。

實施例4：GhNGF的鑒定

4.1N末端氨基酸序列檢測

實施例3中三種表達(dá)體系表達(dá)制備的GhNGF，N末端15個氨基酸的測序結(jié)果均為：GSSSHPIFHRGEFSV，與設(shè)計值一致。

4.2生物活性檢測

以中國藥品生物制品檢定研究院分發(fā)的鼠神經(jīng)生長因子參考品為參照，采用《中國藥典》2015年版三部通則3530“TF-1細(xì)胞/MTS比色法”進行檢測，實施例3中三種表達(dá)體系表達(dá)制備的GhNGF的比活性分別為6.37×10⁵U/mg、5.71×10⁵U/mg和7.12×10⁵U/mg。

以上實施例表明，GhNGF能夠?qū)崿F(xiàn)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中穩(wěn)定、可溶及高活性的表達(dá)，從而有利于其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)制備，以及新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用。

應(yīng)當(dāng)指出，以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對于本技術(shù)中的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)特征的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些潤飾和改進也應(yīng)屬于本發(fā)明的專利保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海特生物制藥股份有限公司

<120> 一種人神經(jīng)生長因子類似物及其制備方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys

1 5 10 15

Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile

20 25 30

Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser

35 40 45

Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro

50 55 60

Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr

65 70 75 80

Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys

85 90 95

Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val

100 105 110

Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala

115 120

<210> 2

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcggggatg acgatgacaa agaaccgcac tccgaatcaa acgttccggc tggccatacg 60

attccgcagg cgcactggac caaactgcaa cattcgctgg ataccgccct gcgtcgcgct 120

cgtagcgcac cggcagcagc aattgctgcg cgcgtggccg gtcagacgcg taatatcacc 180

gttgatccgc gcctgtttaa aaaacgtcgc ctgcgttccc cgcgcgtcct gttctcaacg 240

cagccgccgc gtgaagcagc agacacccaa gatctggact ttgaagtggg cggtgctgcg 300

ccgttcaacc gtacccatcg ctctggccgt ggtagctcta gtcatccgat ttttcaccgt 360

ggcgaattca gtgtttgcga tagcgtgagc gtttgggtcg gtgataaaac cacggccacg 420

gacattaaag gcaaagaagt gatggttctg ggtgaagtta acatcaacaa cagcgtcttc 480

aaacagtatt tctttgaaac caaatgccgc gatccgaacc cggttgactc tggctgtcgt 540

ggtatcgatt ctaaacactg gaatagttac tgtaccacga cccatacgtt tgtcaaagct 600

ctgaccatgg atggcaaaca agccgcatgg cgcttcattc gtatcgacac cgcatgcgtc 660

tgtgtgctga gccgcaaagc cgtgcgtcgc gcataaaagc tt 702

<210> 3

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<212> PRT

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Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile

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Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg

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Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr

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Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val

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Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Gly Arg Gly Ser

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Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser

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Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly

130 135 140

Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe

145 150 155 160

Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp

165 170 175

Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr

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Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala

195 200 205

Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser

210 215 220

Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala

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<212> DNA

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cccaagcttt tatgcgcgac gcacg 25

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tcataccaga accttttggc accagaccag 30