本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及FOXC1基因H446HG突變體及其在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病篩查試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：
急性白血病是危害兒童健康的重大疾病之一，為造血干細(xì)胞在分化過程中于某一階段出現(xiàn)阻滯的一種惡性增殖疾病，其中急性淋巴細(xì)胞性白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)更是兒童最常見的惡性血液病，約占白血病的75％。隨著兒童ALL診斷與治療方案的不斷完善，多種藥物聯(lián)合治療、支持治療及造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用，其5年無病生存率已超過80-90％，成為一種可以治愈的惡性腫瘤。但是，仍然有相當(dāng)部分的ALL病人因治療無效或復(fù)發(fā)而死亡。
化學(xué)因素、放射因素、遺傳因素及免疫因素等在白血病的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，其中免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了非常復(fù)雜的角色，ALL患兒免疫功能紊亂是其發(fā)生難治復(fù)發(fā)和死亡率較高的一個重要原因之一。研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞免疫及其調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)異常是ALL發(fā)病和轉(zhuǎn)歸過程中的一個重要參與因素。炎癥以及腫瘤使得環(huán)境中的抑制型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量(RegμLatory T cells,Treg)大大增加,Treg會分泌大量抑制型細(xì)胞因子(TGF，IL10等)來抑制免疫反應(yīng)。研究顯示，Treg細(xì)胞亞群在多種血液系統(tǒng)惡性疾病包括ALL患兒中的比例較正常人顯著升高，同時，Treg在ALL患兒中的異常分布也被鑒定與患者預(yù)后較差密切相關(guān)。在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中，Treg可以通過分泌CD25抑制IL-2依賴的其他效應(yīng)T細(xì)胞(Effector T cell,Teff)的抗腫瘤效應(yīng)。而在針對白血病的免疫治療中，由特異性白血病細(xì)胞負(fù)載的DC-CIK治療后，ALL患者外周中Treg分布明顯下降。雖然針對Treg在兒童ALL發(fā)生發(fā)展中的免疫抑制效應(yīng)及促瘤作用已逐漸被研究者所闡明，但在兒童ALL的發(fā)生過程中促進(jìn)Treg分化增加的具體調(diào)控機(jī)制仍不明確。
遺傳因素及環(huán)境因素在兒童ALL的發(fā)生中具有重要的聯(lián)系，本課題組也已篩選出一系列在環(huán)境誘導(dǎo)的兒童ALL發(fā)生中具有潛在患病風(fēng)險的特異性突變位點以及單核苷酸多態(tài)性位點，揭示遺傳因素在兒童ALL發(fā)病中的重要作用。而在針對兒童ALL發(fā)病過程中Treg分化增加的機(jī)制研究中，已有研究者發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞分化過程中，基因組特異性基因產(chǎn)生的突變會導(dǎo)致T細(xì)胞異常分化。但目前為止，從遺傳學(xué)角度探索兒童ALL發(fā)病過程中Treg分布異常增加的調(diào)控機(jī)制尚未見報道。因此，深入研究兒童ALL的發(fā)病機(jī)制，可以為發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志及新的靶向治療位點提供堅實的理論基礎(chǔ)，也可以為兒童ALL提供新的診斷和治療依據(jù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
：
解決的技術(shù)問題：本發(fā)明的目的在于針對T細(xì)胞中是否存在相關(guān)突變與兒童ALL發(fā)生相關(guān)的問題，提供一種FOXC1基因H446HG突變體及其應(yīng)用，通過全外顯子測序技術(shù)對比分析ALL患兒T細(xì)胞突變和正常對照T細(xì)胞突變，篩選出ALL特異性的T細(xì)胞突變，為臨床上兒童ALL患者的早期診斷提供新的方法。
技術(shù)方案：FOXC1基因H446HG突變體，所述突變位于第446個氨基酸組氨酸之后插入一個甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
FOXC1基因H446HG突變體，所述突變位于1337位之后插入了核苷酸CGG(c.1337A>ACGG)，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述突變體在制備兒童急性淋巴細(xì)胞白血病篩查試劑盒中的應(yīng)用。
檢測上述FOXC1基因H446HG突變的引物對，如SEQ ID NO.1所示的上游引物：5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’，SEQ ID NO.2所示的下游引物：5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。
檢測上述FOXC1基因H446HG突變的探針，核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
兒童急性淋巴細(xì)胞白血病篩查試劑盒，含有上述探針。
優(yōu)選的，上述試劑盒還含有上述引物對。
優(yōu)選的，上述試劑盒還含有PCR技術(shù)所需的試劑。
本發(fā)明所述的FOXC1基因H446HG突變通過下述步驟獲得：
1)采集標(biāo)本：收集新發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病患兒和特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒的骨髓1-2mL，原代分離培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞；
2)提取T淋巴細(xì)胞基因組DNA，通過全基因組外顯子測序，對比分析急性淋巴細(xì)胞白血病患兒和特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒的T細(xì)胞測序結(jié)果，篩選出兒童急性淋巴細(xì)胞白血病特異性的T細(xì)胞突變；
3)擴(kuò)大樣本量采用Sanger測序法對候選T細(xì)胞突變進(jìn)行驗證，在更大樣本中驗證篩選ALL特異性的T細(xì)胞突變。
FOXC1基因H446HG突變檢測方法
1)提取原代分離T淋巴細(xì)胞基因組DNA；
2)PCR擴(kuò)增；
3)回收并純化所擴(kuò)增的PCR片段；
4)采用Sanger法測定所純化的PCR擴(kuò)增片段序列，得到樣本測序序列；
5)用FOXC1基因標(biāo)準(zhǔn)序列與樣本測序序列比對，分析FOXC1檢測位點突變型類別。
有益效果：本發(fā)明首次從遺傳學(xué)角度篩選與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)生相關(guān)的T細(xì)胞突變，從分子水平為兒童急性淋巴細(xì)胞白血病早期篩查提供了新的方向，提供FOXC1基因H446HG突變在制備兒童急性淋巴細(xì)胞白血病篩查試劑盒中的應(yīng)用，具有重大的實用價值和應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為Sanger法檢測FOXC1野生型及突變型中具體堿基變化示意圖。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。本實施力在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的包含范圍不限于下述的實施例。下面的實施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
實施例1：研究對象的選擇和骨髓樣本收集
所有病例骨髓樣本來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科經(jīng)MICM分型明確診斷的新發(fā)白血病患者，胸骨穿刺采集1-2mL新鮮骨髓。
所有對照骨髓標(biāo)本來自新發(fā)特發(fā)性血小板減少性紫癜(ATP)患者。
樣本的收集和DNA提?。?/p>
1).采集新發(fā)兒童ALL患者骨髓和新發(fā)ITP患者的骨髓(對照)1-2mL，在生物安全柜內(nèi)通過Ficoll法原代分離浸潤性淋巴細(xì)胞。
2).取兩支15mL離心管，首先分別在每只管中加入Ficoll-paque PLUS試劑5mL，然后用滴管把5mL血液沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。
3).Eppendorf centrifuge 5810R離心機(jī)，22℃，500g，離心30min，加速度1，減速度0。
4).離心后管內(nèi)分為四層，上層為血漿，最下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞。第二層為淋巴細(xì)胞分離液，在二、三層界面處有一以單個核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。
5).用1mL移液槍先把上層血清吸掉，然后吸取中間的白色云霧狀狹窄帶所包含的細(xì)胞，至另一只15mL的離心管中。
6).加入5倍以上體積的TexMACS GMP Medium培養(yǎng)液(一般加至10mL左右)，1500rpm×10分鐘，加減速度各為5，洗滌細(xì)胞兩次。
7).倒掉上清液，加入10mL TexMACS GMP Medium和20μL人源性IL-2于10cm培養(yǎng)皿進(jìn)行體外擴(kuò)增。
8).72h后收集細(xì)胞提取DNA，DNA的提取參照QIAGEN DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行。
Agilent全外顯子捕獲測序和數(shù)據(jù)分析
從現(xiàn)有的標(biāo)本中選取3例白血病患者和2例對照DNA進(jìn)行外顯子測序，DNA要求滿足要求如下：DNA總量≥2μg，OD260/280＞1.8，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，基因組DNA電泳條帶清晰，無明顯彌散，無RNA污染。
本發(fā)明采用Illumina HiSeq 2500作為測序平臺：1)對基因組DNA進(jìn)行片段化處理；2)對片段化的雙鏈DNA進(jìn)行末端修復(fù)；3)將“A”堿基加到DNA片段的3’末端；4)連接特定的測序接頭DNA片段的兩端；5)純化連接產(chǎn)物以去除未連接的接頭序列；6)PCR擴(kuò)增有接頭的片段DNA并純化；7)樣本文庫檢測；8)樣本文庫、SureSelect capture library在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交；9)Dynal磁珠捕獲雜交的目的DNA片段并分離純化，除去未結(jié)合的DNA片段并消化RNA；10)PCR擴(kuò)增捕獲的DNA片段并純化PCR產(chǎn)物；11)上機(jī)測序。
測序后數(shù)據(jù)使用Fastqc軟件對下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。使用ngsQCToolkit軟件過濾掉低質(zhì)量reads和有引物污染的reads。使用bwa軟件將各樣品的clean reads回貼到參考基因上，并使用Picard軟件對回貼結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。使用GATK軟件分別檢測各樣本的SNP和Small Indel，得到SNP的堿基突變情況及對應(yīng)染色體的物理位置定位信息，發(fā)生small Indel區(qū)段的大小及在對應(yīng)染色體上的位置。最后將檢測到的SNP和Small InDel與1000Genomes，dbSNP，COSMIC，5000Exomes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行交叉比對獲得最終SNP及InDel。
該步驟在北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成。
突變位點的篩選
基于上述測序篩選結(jié)果，對比分析3例ALL患兒和2例對照組中的SNP及InDel分布，篩選出ALL特異性的突變，同時，通過VENNY法將3組交叉比對后數(shù)據(jù)進(jìn)行合并分析，最終獲得10個InDel滿足在3例ALL患兒中共同存在。將篩選獲得的10個InDel作為候選研究對象。
表1.候選突變信息
擴(kuò)大樣本對測序結(jié)果進(jìn)行驗證
(1)DNA提取
采集25例新發(fā)兒童ALL患者骨髓和10例新發(fā)ITP患者的骨髓(對照)，F(xiàn)icoll法原代分離浸潤性淋巴細(xì)胞并培養(yǎng)72h后，采用CD4特異性磁珠篩選獲得T細(xì)胞并提取其基因組DNA，DNA的提取參照QIAGEN DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行。
(2)PCR擴(kuò)增
DNA樣本取1μL 1％agarose電泳對其樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計，然后根據(jù)估計的濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/μL，對于沒有明顯DNA條帶的樣本則不稀釋。
PCR反應(yīng)體系為1x GC buffer I(TAKARA)，2.5mM Mg2+，0.2mM dNTP，0.2μM的上游引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)0.4μL，0.2μM的下游引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’)0.4μL，HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc.)1U，DNA模板1μL。
擴(kuò)增程序：95℃15分鐘；96℃、10秒，68℃、60秒，擴(kuò)增35個循環(huán)。
(3)回收純化PCR片段
在8μL的PCR產(chǎn)物中加1U SAP和6U Exo I，37℃孵育60min后，再70℃孵育10min。
(4)Sanger法測序
反應(yīng)體系包括3μL BigDye3.1mix，2μL sequencing primer(0.4uM)and 1-2μL
純化了的PCR產(chǎn)物。測序引物：5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。程序：96℃1分鐘；96℃、10秒，50℃、5秒，60℃，4分鐘，28個循環(huán)。
(5)測序文件用Polyphred軟件分析。
在25例ALL患者中，有11例患者在FOXC1基因外顯子I區(qū)存在與篩選結(jié)果一致的InDel，而在對照組中均未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)突變存在。此外，其他候選基因中，其突變分布比例在對照組與ALL組中無明顯差別。
試劑盒的制備
制備兒童ALL的分子診斷試劑盒，其中含有下列可擴(kuò)增出核酸序列的第446位氨基酸突變的引物：正向引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)、反向引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’)，用于檢測所述特異位點的測序用的探針，其序列5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。還可以有相關(guān)PCR技術(shù)常用的試劑，如Taq酶、PCR緩沖液、MgCl2、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合液、染料等試劑，這些試劑也可采用相應(yīng)的市售產(chǎn)品。此試劑盒的價值在于只需要一次抽出少量(2mL)骨髓，即可檢測T細(xì)胞FOXC1基因H446HG突變是否存在，可用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的篩查和早期診斷。
具體試劑盒組成如下：
PCR引物：正向引物(5’-AACCTGCAAGCCATGAGCC-3’)、反向引物(5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’)。
測序探針：5’-ACCGAGTGGAAGTTCTGCTG-3’。
試劑盒中還可以含1x GC buffer I(TAKARA)，2.5mM Mg2+，0.2mM dNTP，HotStar Taq polymerase(Qiagen Inc.)1U，1U SAP和6U Exo I。
試劑盒中的組分除引物外的試劑可以采用現(xiàn)有技術(shù)中用于PCR擴(kuò)增的相應(yīng)試劑。
在該試劑盒的基礎(chǔ)上對回收純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，用Polyphred軟件對測序結(jié)果與正常序列進(jìn)行對比分析。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和潤色，然而均是以檢測本發(fā)明所述的SNP位點相關(guān)，或者是該位點的各種形式的應(yīng)用，這些修改或潤色均屬于本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院
<120> FOXC1基因H446HG突變體及其應(yīng)用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacctgcaag ccatgagcc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
accgagtgga agttctgctg 20
<210> 3
<211> 554
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Gln Ala Arg Tyr Ser Val Ser Ser Pro Asn Ser Leu Gly Val Val
1 5 10 15
Pro Tyr Leu Gly Gly Glu Gln Ser Tyr Tyr Arg Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Gly Tyr Thr Ala Met Pro Ala Pro Met Ser Val Tyr Ser
35 40 45
His Pro Ala His Ala Glu Gln Tyr Pro Gly Gly Met Ala Arg Ala Tyr
50 55 60
Gly Pro Tyr Thr Pro Gln Pro Gln Pro Lys Asp Met Val Lys Pro Pro
65 70 75 80
Tyr Ser Tyr Ile Ala Leu Ile Thr Met Ala Ile Gln Asn Ala Pro Asp
85 90 95
Lys Lys Ile Thr Leu Asn Gly Ile Tyr Gln Phe Ile Met Asp Arg Phe
100 105 110
Pro Phe Tyr Arg Asp Asn Lys Gln Gly Trp Gln Asn Ser Ile Arg His
115 120 125
Asn Leu Ser Leu Asn Glu Cys Phe Val Lys Val Pro Arg Asp Asp Lys
130 135 140
Lys Pro Gly Lys Gly Ser Tyr Trp Thr Leu Asp Pro Asp Ser Tyr Asn
145 150 155 160
Met Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Arg Arg Phe Lys Lys
165 170 175
Lys Asp Ala Val Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Arg Leu His Leu Lys
180 185 190
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Arg Gln Pro Pro Pro Ala Pro Pro Glu Gln
195 200 205
Ala Asp Gly Asn Ala Pro Gly Pro Gln Pro Pro Pro Val Arg Ile Gln
210 215 220
Asp Ile Lys Thr Glu Asn Gly Thr Cys Pro Ser Pro Pro Gln Pro Leu
225 230 235 240
Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Ser Gly Ser Ala Ala Ala Val Pro Lys
245 250 255
Ile Glu Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ser Gly Ser Ser
260 265 270
Pro Pro Gly Ser Leu Pro Ser Ala Arg Pro Leu Ser Leu Asp Gly Ala
275 280 285
Asp Ser Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ser Ala Pro Pro Pro His His
290 295 300
Ser Gln Gly Phe Ser Val Asp Asn Ile Met Thr Ser Leu Arg Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gln Ser Ala Ala Ala Glu Leu Ser Ser Gly Leu Leu Ala Ser Ala
325 330 335
Ala Ala Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ala Pro Pro Leu Ala Leu Gly Ala
340 345 350
Tyr Ser Pro Gly Gln Ser Ser Leu Tyr Ser Ser Pro Cys Ser Gln Thr
355 360 365
Ser Ser Ala Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala
370 375 380
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Thr Tyr His Cys Asn Leu Gln Ala Met
385 390 395 400
Ser Leu Tyr Ala Ala Gly Glu Arg Gly Gly His Leu Gln Gly Ala Pro
405 410 415
Gly Gly Ala Gly Gly Ser Ala Val Asp Asp Pro Leu Pro Asp Tyr Ser
420 425 430
Leu Pro Pro Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ser His Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gln Glu Ala Gly His His Pro
450 455 460
Ala Ala His Gln Gly Arg Leu Thr Ser Trp Tyr Leu Asn Gln Ala Gly
465 470 475 480
Gly Asp Leu Gly His Leu Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
485 490 495
Gly Tyr Pro Gly Gln Gln Gln Asn Phe His Ser Val Arg Glu Met Phe
500 505 510
Glu Ser Gln Arg Ile Gly Leu Asn Asn Ser Pro Val Asn Gly Asn Ser
515 520 525
Ser Cys Gln Met Ala Phe Pro Ser Ser Gln Ser Leu Tyr Arg Thr Ser
530 535 540
Gly Ala Phe Val Tyr Asp Cys Ser Lys Phe
545 550
<210> 4
<211> 3455
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgcaggcgc gctactccgt gtccagcccc aactccctgg gagtggtgcc ctacctcggc 60
ggcgagcaga gctactaccg cgcggcggcc gcggcggccg ggggcggcta caccgccatg 120
ccggccccca tgagcgtgta ctcgcaccct gcgcacgccg agcagtaccc gggcggcatg 180
gcccgcgcct acgggcccta cacgccgcag ccgcagccca aggacatggt gaagccgccc 240
tatagctaca tcgcgctcat caccatggcc atccagaacg ccccggacaa gaagatcacc 300
ctgaacggca tctaccagtt catcatggac cgcttcccct tctaccggga caacaagcag 360
ggctggcaga acagcatccg ccacaacctc tcgctcaacg agtgcttcgt caaggtgccg 420
cgcgacgaca agaagccggg caagggcagc tactggacgc tggacccgga ctcctacaac 480
atgttcgaga acggcagctt cctgcggcgg cggcggcgct tcaagaagaa ggacgcggtg 540
aaggacaagg aggagaagga caggctgcac ctcaaggagc cgcccccgcc cggccgccag 600
cccccgcccg cgccgccgga gcaggccgac ggcaacgcgc ccggtccgca gccgccgccc 660
gtgcgcatcc aggacatcaa gaccgagaac ggtacgtgcc cctcgccgcc ccagcccctg 720
tccccggccg ccgccctggg cagcggcagc gccgccgcgg tgcccaagat cgagagcccc 780
gacagcagca gcagcagcct gtccagcggg agcagccccc cgggcagcct gccgtcggcg 840
cggccgctca gcctggacgg tgcggattcc gcgccgccgc cgcccgcgcc ctccgccccg 900
ccgccgcacc atagccaggg cttcagcgtg gacaacatca tgacgtcgct gcgggggtcg 960
ccgcagagcg cggccgcgga gctcagctcc ggccttctgg cctcggcggc cgcgtcctcg 1020
cgcgcgggga tcgcaccccc gctggcgctc ggcgcctact cgcccggcca gagctccctc 1080
tacagctccc cctgcagcca gacctccagc gcgggcagct cgggcggcgg cggcggcggc 1140
gcgggggccg cggggggcgc gggcggcgcc gggacctacc actgcaacct gcaagccatg 1200
agcctgtacg cggccggcga gcgcgggggc cacttgcagg gcgcgcccgg gggcgcgggc 1260
ggctcggccg tggacgaccc cctgcccgac tactctctgc ctccggtcac cagcagcagc 1320
tcgtcgtccc tgagtcacgg cggcggcggc ggcggcggcg gcgggggagg ccaggaggcc 1380
ggccaccacc ctgcggccca ccaaggccgc ctcacctcgt ggtacctgaa ccaggcgggc 1440
ggagacctgg gccacttggc gagcgcggcg gcggcggcgg cggccgcagg ctacccgggc 1500
cagcagcaga acttccactc ggtgcgggag atgttcgagt cacagaggat cggcttgaac 1560
aactctccag tgaacgggaa tagtagctgt caaatggcct tcccttccag ccagtctctg 1620
taccgcacgt ccggagcttt cgtctacgac tgtagcaagt tttgacacac cctcaaagcc 1680
gaactaaatc gaaccccaaa gcaggaaaag ctaaaggaac ccatcaaggc aaaatcgaaa 1740
ctaaaaaaaa aaaatccaat taaaaaaaac ccctgagaat attcaccaca ccagcgaaca 1800
gaatatccct ccaaaaattc agctcaccag caccagcacg aagaaaactc tattttctta 1860
accgattaat tcagagccac ctccactttg ccttgtctaa ataaacaaac ccgtaaactg 1920
ttttatacag agacagcaaa atcttggttt attaaaggac agtgttactc cagataacac 1980
gtaagtttct tcttgctttt cagagacctg ctttcccctc ctcccgtctc ccctctcttg 2040
ccttcttcct tgcctctcac ctgtaagata ttattttatc ctatgttgaa gggaggggga 2100
aagtccccgt ttatgaaagt cgctttcttt ttattcatgg acttgtttta aaatgtaaat 2160
tgcaacatag taatttattt ttaatttgta gttggatgtc gtggaccaaa cgccagaaag 2220
tgttcccaaa acctgacgtt aaattgcctg aaactttaaa ttgtgctttt tttctcatta 2280
taaaaaggga aactgtatta atcttattct atcctctttt ctttcttttt gttgaacata 2340
ttcattgttt gtttattaat aaattaccat tcagtttgaa tgagacctat atgtctggat 2400
actttaatag agctttaatt attacgaaaa aagatttcag agataaaaca ctagaagtta 2460
cctattctcc acctaaatct ctgaaaaatg gagaaaccct ctgactagtc catgtcaaat 2520
tttactaaaa gtctttttgt ttagatttat tttcctgcag catcttctgc aaaatgtact 2580
atatagtcag cttgctttga ggctagtaaa aagatatttt tctaaacaga ttggagttgg 2640
catataaaca aatacgtttt ctcactaatg acagtccatg attcggaaat tttaagccca 2700
tgaatcagcc gcggtcttac cacggtgatg cctgtgtgcc gagagatggg actgtgcggc 2760
cagatatgca cagataaata tttggcttgt gtattccata taaaattgca gtgcatatta 2820
tacatccctg tgagccagat gctgaataga tattttccta ttatttcagt cctttataaa 2880
aggaaaaata aaccagtttt taaatgtatg tatataattc tcccccattt acaatccttc 2940
atgtattaca tagaaggatt gcttttttaa aaatatactg cgggttggaa agggatattt 3000
aatctttgag aaactatttt agaaaatatg tttgtagaac aattattttt gaaaaagatt 3060
taaagcaata acaagaagga aggcgagagg agcagaacat tttggtctag ggtggtttct 3120
ttttaaacca ttttttcttg ttaatttaca gttaaaccta ggggacaatc cggattggcc 3180
ctcccccttt tgtaaataac ccaggaaatg taataaattc attatcttag ggtgatctgc 3240
cctgccaatc agactttggg gagatggcga tttgattaca gacgttcggg ggggtggggg 3300
gcttgcagtt tgttttggag ataatacagt ttcctgctat ctgccgctcc tatctagagg 3360
caacacttaa gcagtaattg ctgttgcttg ttgtcaaaat ttgatcattg ttaaaggatt 3420
gctgcaaata aatacacttt aatttcagtc aaaaa 3455