本發(fā)明屬于生物技術(shù)及制藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種特異性修飾的干擾素α綴合物、其制備方法、包含其的藥物組合物及其在制備預(yù)防和/或治療肝炎或腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干擾素(interferon，IFN)是真核細(xì)胞針對(duì)病毒感染和其它抗原刺激而產(chǎn)生的一類具有廣譜抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。IFN已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，如乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性感染，多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、等炎癥反應(yīng)異常性疾病，骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌等腫瘤疾病。根據(jù)IFN的來(lái)源及其對(duì)酸的耐受程度，可將其分為I型、II型和III型。其中，I型IFN包括α、β、ω、κ、ε、δ6種類型，IFNα的臨床應(yīng)用最廣，由白細(xì)胞分泌產(chǎn)生。IFNα存在許多結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)亞型，由165-166氨基酸殘基組成，如αl、α2、α3等，在同一亞型內(nèi)又因氨基酸的差異而細(xì)分，如α1有2種：α-1a、α-1b；α2有3種：α-2a、α-2b、α-2c。目前，臨床應(yīng)用以IFNαlb、IFNα2a、IFNα-2b為主。其中，IFNα-1b由166個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約19.4kDa，IFNα-2a由165個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約19.2kDa。但I(xiàn)FN作為蛋白質(zhì)藥物，存在以下缺點(diǎn)：1)會(huì)被消化系統(tǒng)破壞，不能夠口服；2)藥物分子量較小，易被腎小球?yàn)V過(guò)和體內(nèi)不穩(wěn)定，易被蛋白質(zhì)酶解，體內(nèi)半衰期較短；3)需要長(zhǎng)時(shí)間、頻繁、連續(xù)注射給藥，患者依從性差；4)藥物免疫原性較高；5)有時(shí)溶解度低，易沉淀析出。

與生物相容的、高分子量的聚合物綴合是用于增加治療肽或蛋白的半衰期和用于改進(jìn)其持久性效果的最常用技術(shù)之一。迄今為止最成功的手段是通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)聚乙二醇(PEG)屏蔽蛋白質(zhì)的表面，這種方法稱為聚乙二醇化(pegylation)。蛋白質(zhì)的PEG修飾技術(shù)，始于20世紀(jì)70年代。藥物經(jīng)PEG修飾后，往往會(huì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)更長(zhǎng)的半衰期；2)較低的最大血藥濃度；3)血藥濃度波動(dòng)較?。?)較少的酶降解作用；5)較少的免疫原性及抗原性；6)較小的毒性；7)更好的溶解性；8)用藥頻率減少；9)提高病人的依從性，提高生活質(zhì)量，降低治療費(fèi)用。

用于蛋白綴合的另一選擇(作為PEG的替代方案)是利用其它線性的或支鏈的生物相容性聚合物，例如聚氧丙烯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、聚多糖等等。

PEG化修飾在IFN的長(zhǎng)效劑型開發(fā)中得到了成功應(yīng)用，如Roche的PEGASYS(派羅欣)和Schering的PEG-INTRON(佩樂(lè)能)。PEGASYS是被分子量為40kDa的分支型PEG隨機(jī)修飾的IFNα-2a，其循環(huán)周期為96小時(shí)，能保持IFNα-2a抗病毒活性的7％；PEG-INTRON是被分子量為12kDa的線性PEG隨機(jī)修飾的IFN-α2b，其循環(huán)周期為45小時(shí)，可保持IFNα-2b抗病毒活性的28％。

以上PEG化修飾的成功運(yùn)用均是采用化學(xué)法PEG化IFNα。目前，化學(xué)法修飾技術(shù)中PEG分子主要結(jié)合到IFNα的以下功能集團(tuán)：1)N-末端或絲氨酸或賴氨酸的NH₂基團(tuán)；2)半胱氨酸的巰基；3)組氨酸的咪唑基團(tuán)等。

中國(guó)專利CN1167777A要求保護(hù)PEG-IFNα結(jié)合物，IFNα通過(guò)酯鍵或酰胺鍵與PEG部分連結(jié)，因此，PEG部分可通過(guò)IFNα上的賴氨酸殘基或N-末端的NH₂基團(tuán)或絲氨酸殘基的羥基與IFNα結(jié)合，PEG化修飾位點(diǎn)種類和數(shù)目很多，且可以附著一個(gè)或更多PEG部分，從而形成未PEG化、單PEG化和多PEG化的IFN的混合物，通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法能從混合物中分離出單PEG化IFNα。但是，由于IFNα-2a分子顯示多個(gè)PEG化位點(diǎn)，因此它是位置異構(gòu)體的混合物。因此該P(yáng)EG化修飾為非特異性位點(diǎn)修飾，修飾位點(diǎn)種類和數(shù)量多且形成的修飾衍生物不穩(wěn)定，造成修飾產(chǎn)物組成不均一、質(zhì)量控制較難。

中國(guó)專利CN1711109A公開了PEG化的IFNα-2a的位置異構(gòu)體：PEG-Lys(31)、PEG-Lys(49)、PEG-Lys(70)、PEG-Lys(83)、PEG-Lys(112)、PEG-Lys(121)、PEG-PEG-Lys(131)、PEG-Lys(134)和PEG-Lys(164)及其分離上述位置異構(gòu)體的方法，要獲得單位點(diǎn)PEG化修飾的IFNα-2a，需要首先化學(xué)法修飾IFN，得到一系列的未PEG化、單PEG化和多PEG化的IFN的混合物，再通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法能從混合物中分離出單PEG化IFNα，然后通過(guò)中國(guó)專利CN1711109A公開的分離方法進(jìn)行分離，步驟繁瑣，操作復(fù)雜。且在化學(xué)修飾過(guò)程中會(huì)用到氰基硼氫化鈉等有毒化合物，給操作人員帶來(lái)健康安全隱患。

除了化學(xué)PEG化之外，結(jié)合甲氧基-PEG(mPEG)鏈和蛋白的酶促程序已經(jīng)被描述。例如，這些基于利用原核和真核起源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶類(TGase)以催化將用伯氨基官能化的mPEG轉(zhuǎn)移至感興趣的多肽鏈中天然存在的或通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變反應(yīng)插入的谷氨酰胺(Gln)殘基的酰基(H.Sato,Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of Proteins,Adv.Drug Deliv.Rev.,54,487-504,2002)。

中國(guó)專利申請(qǐng)CN1165539A公開了使用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTGase)將聚合物鏈連接至在其氨基酸序列中具有至少一個(gè)Gln殘基的肽和蛋白，盡管該專利申請(qǐng)給出了在一些模型蛋白上的單取代的實(shí)例，但不清楚的是取代是否也是位點(diǎn)特異性，這意指它們產(chǎn)生單分子形式或位置異構(gòu)體的混合物，在位置異構(gòu)體的混合物中，盡管被單取代，聚合物鏈與不同的Gln結(jié)合。

本發(fā)明按照CN1165539A公開的技術(shù)方案制備了PEG化的IFNα，并對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行PEG修飾位點(diǎn)鑒定，結(jié)果顯示，該產(chǎn)物為非單一位點(diǎn)修飾，而是一種位置異構(gòu)體的混合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性的單一氨基酸位點(diǎn)修飾的IFNα綴合物、其制備方法、包含其的藥物組合物及其在制備預(yù)防和/或治療肝炎或腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

為此，本發(fā)明提供一種人IFNα綴合物，其特征在于，人IFNα經(jīng)由MTGase的催化作用，在特定位點(diǎn)的Gln側(cè)鏈處經(jīng)過(guò)酰胺鍵合酶促地綴合至親水性非免疫原性聚合物上，獲得純化的人IFNα綴合物。

具體地，本發(fā)明提供一種特異性的、單一氨基酸位點(diǎn)修飾的人IFNα綴合物，其特征在于，人IFNα1或IFNα2分別通過(guò)多肽鏈上的Gln102或Gln101共價(jià)結(jié)合到親水性非免疫原性聚合物上，或天然的人IFNα1或IFNα2的類似物或衍生物通過(guò)多肽鏈上相應(yīng)位置的Gln共價(jià)結(jié)合到親水性非免疫原性聚合物上。

更優(yōu)選地，上述的人IFNα1或IFNα2分別具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的天然的IFNα-1b、IFNα-2a。

其中，所述的親水性非免疫原性聚合物至少用一個(gè)氨基官能化，其選自由聚乙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基淀粉、右旋糖酐、聚多糖組成的組。

優(yōu)選地，所述的親水性非免疫原性聚合物為聚乙二醇，分子量范圍為20-40kDa，優(yōu)選40kDa。

更優(yōu)選地，上述的聚乙二醇是伯氨基官能化的甲氧基-PEG。

所述的聚乙二醇可為直鏈或支鏈的聚乙二醇。

更進(jìn)一步地，所述的聚乙二醇具有下式的結(jié)構(gòu)式：

其中，m和n表征聚合度，為大于0的整數(shù)，m優(yōu)選2-500，n優(yōu)選2-400，上述的聚乙二醇的分子量為20-40kDa，優(yōu)選40kDa。

另外，本發(fā)明還提供了包含上述的一個(gè)或多個(gè)特異性的單一氨基酸位點(diǎn)修飾的人IFNα綴合物的藥物組合物。

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中酶法PEG化修飾人IFNα后，獲得的為非單一氨基酸位點(diǎn)修飾的IFN綴合物，因此，本發(fā)明人在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)MTGase催化人IFNα的PEG反應(yīng)的條件，如反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間以及PEG的分子量大小進(jìn)行了一系列的摸索和實(shí)驗(yàn)。過(guò)酸、過(guò)堿或溫度過(guò)高，會(huì)使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，使酶活性降低甚至失活，從而影響人IFNα的PEG化結(jié)果。較低溫度下，酶的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但酶的活性較低，同樣會(huì)影響人IFNα的PEG化結(jié)果，因此，需要摸索確定合適的反應(yīng)溫度和反應(yīng)的pH。即使在適宜的條件下酶的催化效率也不是一成不變，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶會(huì)發(fā)生鈍化現(xiàn)象，即催化能力下降。因此，需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)摸索合適的溫度、pH及反應(yīng)時(shí)間。PEG分子量大小同樣也會(huì)影響人IFNα的PEG化結(jié)果：分子量過(guò)大或過(guò)小都會(huì)導(dǎo)致非單一位點(diǎn)修飾產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，對(duì)于PEG的分子量大小需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)以確定可產(chǎn)生單一氨基酸位點(diǎn)PEG修飾的人IFNα。本發(fā)明在進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)條件為：4-37℃反應(yīng)3-6小時(shí)，pH范圍為6-10，PEG分子量范圍為20kDa-40kDa時(shí)，均可得到單一谷氨酰胺位點(diǎn)修飾的IFNα綴合物。尤其是，當(dāng)反應(yīng)條件為：25℃反應(yīng)5小時(shí)，pH 8.8，PEG為支鏈且分子量大小為40kDa時(shí)，單一谷氨酰胺位點(diǎn)修飾的IFNα綴合物的收率更高。

因此，本發(fā)明還提供了一種制備上述特異性的單一氨基酸位點(diǎn)修飾的人IFNα綴合物的方法：在MTGase的存在下，將IFNα與非免疫原性聚合物混勻，反應(yīng)條件為：在4-37℃反應(yīng)3-6小時(shí)，pH范圍為6-10；優(yōu)選的反應(yīng)條件是在4-37℃反應(yīng)3-6小時(shí)，pH范圍為8.5-10；更優(yōu)選的反應(yīng)條件是25℃反應(yīng)5小時(shí)，pH為8.8。

此外，本發(fā)明還提供了上述特異性的單一氨基酸位點(diǎn)修飾的人IFNα綴合物在預(yù)防和/或治療肝炎或腫瘤的藥物中的用途。

本發(fā)明的IFNα1、IFNα2可以為從天然來(lái)源提取的或通過(guò)重組生物技術(shù)獲得的IFNα。重組人IFNα1、IFNα2可以是人工合成的，也可以是原核系統(tǒng)如大腸桿菌(E.coli)表達(dá)的，也可以是真核酵母系統(tǒng)如畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)的，也可以是其它昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)或哺乳細(xì)胞系統(tǒng)如CHO表達(dá)的。優(yōu)選的，IFNα1、IFNα2為通過(guò)重組生物技術(shù)獲得的分別具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的人IFNα。

制備人IFNα的方法為本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有技術(shù)，如Poonam Srivastava,Palash Bhattacharaya,Gaurav Pandey,K.J.Mukherjee Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli.Protein Expression and Purification 41(2005)313–322，中國(guó)專利CN1814617A等。

本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)層析法對(duì)人IFNα綴合物進(jìn)行純化分離；優(yōu)選的，采用離子交換、凝膠過(guò)濾層析；更優(yōu)選的采用陽(yáng)離子交換層析，包括SP Sepharose FF，SP Sepharose HP，SOURCE15S等介質(zhì)。

收獲得到的特異性單一氨基酸位點(diǎn)修飾的重組人IFNα綴合物可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)進(jìn)行性質(zhì)分析，如采用質(zhì)譜分析產(chǎn)物的分子量，聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜等分析產(chǎn)物的純度，胞病變抑制法分析產(chǎn)物體外生物學(xué)活性，液相質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析產(chǎn)物的修飾位點(diǎn)。

本發(fā)明的MTGase可以為天然來(lái)源提取的或通過(guò)重組生物技術(shù)獲得的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，可以是原核系統(tǒng)如大腸桿菌、鏈霉菌表達(dá)的，也可以是真核酵母系統(tǒng)如畢赤酵母表達(dá)的。

制備MTGase的方法及其活性檢測(cè)方法為本領(lǐng)域已公開的技術(shù)，如M.-L.HO,S.-Z.LEU,J.-F.HSIEH,AND S.-T.JIANG.Technical Approach to Simplify the Purification Method and Characterization of Microbial Transglutaminase Produced from Streptoverticillium ladakanum.JOURNAL OF FOOD SCIENCE.Vol.65,No.1,2000等。

天然的人IFNα1或IFNα2的類似物是指與天然的IFNα1或IFNα2具有至少90％的同源性，經(jīng)過(guò)1-15個(gè)氨基酸的替代、缺失或增加等變異后仍具有與天然IFNα1或IFNα2相同的功能的蛋白質(zhì)。

天然的人IFNα1或IFNα2的衍生物是指天然的IFNα1或IFNα2序列中至少一個(gè)氨基酸與其他分子連接，同時(shí)保持了與天然IFNα1或IFNα2相同的功能。

本發(fā)明所提供化合物為特異性單一氨基酸位點(diǎn)修飾的IFNα綴合物，克服了目前修飾產(chǎn)物多為混合物的缺點(diǎn)：如修飾沒(méi)有選擇性，為非特異性位點(diǎn)修飾，修飾位點(diǎn)種類和數(shù)量多且形成的修飾衍生物不穩(wěn)定，造成修飾產(chǎn)物組成不均一、質(zhì)量控制較難等。

本發(fā)明所提供的IFNα綴合物的制備方法為經(jīng)由MTGase的催化作用，在特定位點(diǎn)的Gln側(cè)鏈處經(jīng)過(guò)酰胺鍵合酶促地綴合至親水性非免疫原性聚合物上，獲得純化的IFNα綴合物。生產(chǎn)過(guò)程中，操作簡(jiǎn)便、成本低廉，而傳統(tǒng)的化學(xué)法控制過(guò)程復(fù)雜，并且在修飾過(guò)程中會(huì)用到氰基硼氫化鈉等有毒化合物，給操作人員帶來(lái)健康安全隱患。

本發(fā)明所提供IFNα綴合物中修飾位點(diǎn)遠(yuǎn)離活性區(qū)，體外生物學(xué)活性高于派羅欣2-3倍；產(chǎn)品體內(nèi)性質(zhì)更加穩(wěn)定。

附圖說(shuō)明

附圖1：40kDa PEG-IFNα-2a SOURCE 15S純化圖譜。

附圖2：IFNα-2a及PEG-IFNα-2a純化樣品SDS-PAGE電泳結(jié)果。

附圖3：40kDa PEG-IFNα-1b SOURCE 15S純化圖譜。

附圖4：PEG₃₃₅₀-IFNα-2a純化圖譜。

附圖5：40kDa PEG-IFNα-2a純化樣MALDI-TOF MS法分子量測(cè)定結(jié)果。

附圖6：40kDa PEG-IFNα-2a純化樣品RP-HPLC結(jié)果。

附圖7：40kDa PEG-IFNα-2a修飾位點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

附圖8：細(xì)胞病變抑制法分析產(chǎn)物體外生物學(xué)活性結(jié)果圖。

附圖9：細(xì)胞病變抑制法抑制50％細(xì)胞病變時(shí)各組分的體外生物學(xué)活性圖。

附圖10：PEG-IFNα-2a用于荷瘤裸鼠治療的腎癌腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋和說(shuō)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1 分子量為40kDa的支鏈PEG-IFNα-2a的制備

將IFNα-2a蛋白用25mM Tris-HCl pH8.8的緩沖液透析平衡，IFNα-2a濃度調(diào)整至2mg/ml，按IFNα-2a與PEG的分子摩爾比為l:5的比例，加入PEG粉末(40kDa支鏈mPEG-NH₂，由北京鍵凱科技有限公司提供)，輕輕攪拌使粉末溶解，加入 0.6IU/ml MTGase，25℃反應(yīng)5h獲得偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物，加入終濃度為20mM的醋酸銨終止反應(yīng)，對(duì)上述偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析：將上述偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加入5倍體積的緩沖液A(25mM NaAC，pH5.0)稀釋，之后上樣于經(jīng)緩沖液A平衡的陽(yáng)離子交換層析柱(SOURCE 15S，GE HealthcarLife Sciences)上，洗脫采用從緩沖液A到緩沖液B(25mM NaAC，0.5M NaCl，pH5.0)的線性洗脫(3-18％)，收集唯一洗脫峰(如附圖1所示)。

實(shí)施例2 分子量為20kDa直鏈PEG-IFNα-2a的制備

實(shí)施例1中的PEG粉末更換為分子量為20kDa的直鏈mPEG-NH₂，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例3 分子量為40kDa支鏈PEG-IFNα-2a在pH 6.0緩沖液中的制備

實(shí)施例1中的25mM Tris-HCl緩沖液的pH由8.8變?yōu)?.0，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例4 分子量為40kDa支鏈PEG-IFNα-2a在pH 8.5緩沖液中的制備

實(shí)施例1中的25mM Tris-HCl緩沖液的pH由8.8變?yōu)?.5，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例5 分子量為40kDa支鏈PEG-IFNα-2a在pH 10.0緩沖液中的制備

實(shí)施例1中的25mM Tris-HCl緩沖液的pH由8.8變?yōu)?0.0，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例6 分子量為40kDa支鏈PEG–IFNα-2a在溫度為4℃下的制備

實(shí)施例1中的偶聯(lián)反應(yīng)溫度變?yōu)?℃，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例7 分子量為40kDa支鏈PEG–IFNα-2a在溫度為37℃下的制備

實(shí)施例1中的偶聯(lián)反應(yīng)溫度變?yōu)?7℃，其他制備步驟同實(shí)施例1。

實(shí)施例8 分子量為40kDa支鏈PEG-IFNα-1b的制備

實(shí)施例1中的IFNα-2a更換為IFNα-1b，其他制備步驟同實(shí)施例1(如附圖3所示)。

實(shí)施例9 中國(guó)專利CN1165539A實(shí)施例10PEG-IFNα-2a的制備

將IFNα-2a蛋白用200mM Tris-HCl pH7.5的緩沖液透析平衡，IFNα-2a濃度調(diào)整至2mg/ml，按IFNα-2a與PEG的分子摩爾比為l:5的比例，加入PEG粉末(分子量3350，由Sigma公司提供)，輕輕攪拌使粉末溶解，加入220U/ml MTGase，37℃反應(yīng)2h獲得偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物，加入終濃度為20mM的醋酸銨終止反應(yīng)，對(duì)上述偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析：將上述偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加入5倍體積的緩沖液A(25mM NaAC，pH5.0)稀釋，之后上樣于經(jīng)緩沖液A平衡的陽(yáng)離子交換層析柱(SOURCE 15S，GE Healthcare Life Sciences)上，洗脫采用從緩沖液A到緩沖液B(25mM NaAC，0.5M NaCl，pH5.0)的線性洗脫(3-18％)，分別收集各洗脫峰峰尖(如附圖4所示)，收獲純化的PEG₃₃₅₀-IFNα-2a。

實(shí)施例10 PEG-IFNα-2a的性質(zhì)分析

對(duì)實(shí)施例1-9樣品分別進(jìn)行性質(zhì)分析。

(1)MALDI-TOF MS法檢測(cè)分子量

采用MALDI-TOF MS(5800MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX)法測(cè)定上述實(shí)施例PEG化修飾產(chǎn)物的分子量。試劑盒使用ProteoMass Peptide&Protein MALDI-MS Calibration Kit(MSCAL 1，Sigma)，原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導(dǎo)出。

實(shí)施例1-8中，在不同條件下40kDa PEG修飾得到的PEG-IFNα-2a的MS分子量一致，大小約59.4kDa(如附圖5所示)；20kDa PEG修飾的PEG-IFNα-2a的MS分子量大小約41.3kDa。

(2)蛋白質(zhì)純度檢測(cè)

PEG-IFNα-2a的修飾位點(diǎn)異構(gòu)體的純度檢測(cè)采用RP-HPLC法。HPLC分析柱采用C18(4.6mm×250mm，waters)，樣品上樣體積20μl(約10μg蛋白)，流動(dòng)相：A液：0.2％三氟乙酸水溶液，B液：95％乙腈的A液，梯度：0％-100％B(80min)，流速：0.9mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。

實(shí)施例1-8中，在不同條件下PEG修飾所得的PEG-IFNα-2a的純度檢測(cè)結(jié)果均為單一主峰，純度大于99％(如附圖6所示)。

(3)PEG化修飾位點(diǎn)的鑒定

將PEG-IFNα-2a、PEG-IFNα-1b和未修飾的IFNα-2a、IFNα-1b，經(jīng)Trypsin與Glu C酶降解后，進(jìn)行質(zhì)譜分析，收集譜圖，與數(shù)據(jù)庫(kù)中由野生型IFNα-2a經(jīng)胰蛋白酶降解產(chǎn)生的所有多肽片段的理論值比較。

將實(shí)施例1-7得到的PEG-IFNα-2a產(chǎn)物進(jìn)行PEG化修飾位點(diǎn)鑒定，結(jié)果如圖7所示。以上PEG-IFNα-2a的酶解產(chǎn)物在45.6min-47min均出現(xiàn)一色譜峰，該峰未在IFN酶解產(chǎn)物分離圖中發(fā)現(xiàn)，故該峰為PEG化肽段。將PEG-IFNα-2a酶解產(chǎn)物在相同的條件下進(jìn)行分離，收集45.6min-47min色譜峰，離心干燥后用于后續(xù)N端測(cè)序。N端序列分析結(jié)果為A_VI_GVGVTETPLMK。該肽段第二位氨基酸理論序列為半胱氨酸，在N端測(cè)序時(shí)不穩(wěn)定，不能測(cè)定；而第5位氨基酸為Gln，在本次試驗(yàn)中不能測(cè)出。綜合質(zhì)譜分析結(jié)果，在未修飾的IFNα-2a樣品中，含有Gln的多肽片段均被捕捉到，而在PEG-IFNα-2a樣品中，只捕捉到了除Gln101外的其它含有Gln的多肽片段，表明由于Gln101位有PEG的修飾，分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所能捕捉到的范圍，因此可以證實(shí)PEG修飾位點(diǎn)應(yīng)為該肽段第五位氨基酸Gln，即IFNα-2a的第101位氨基酸Gln。

將實(shí)施例8獲得的PEG-IFNα-1b洗脫峰收集后與未經(jīng)修飾的IFNα-1b經(jīng)Trypsin與Glu C酶降解后，做質(zhì)譜分析，進(jìn)行PEG化修飾位點(diǎn)的鑒定。結(jié)果顯示兩個(gè)峰的N端序列分析結(jié)果分別為_DLP_THSLDNR和A_VM_EER；第二個(gè)肽段分析方法同實(shí)施例1-6分析，該肽段第二位氨基酸理論序列為半胱氨酸，在N端測(cè)序時(shí)不穩(wěn)定，不能測(cè)定；而第5位氨基酸為Gln，在本次試驗(yàn)中不能測(cè)出。綜合質(zhì)譜分析結(jié)果，在未修飾的IFNα-1b樣品中，含有Gln的多肽片段均被捕捉到，而在PEG-IFNα-1b樣品中，只捕捉到了除Gln102外的其它含有Gln的多肽片段，表明由于Gln102位有PEG的修飾，分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀所能捕捉到的范圍，因此可以證實(shí)PEG修飾位點(diǎn)應(yīng)為該肽段第五位氨基酸Gln(即IFNα-1b的第102位氨基酸Gln)。

同理將實(shí)施例9獲得的兩個(gè)PEG-IFNα-2a洗脫峰分別收集后經(jīng)Trypsin與Glu C酶降解后，做質(zhì)譜分析，進(jìn)行PEG化修飾位點(diǎn)的鑒定。結(jié)果顯示兩個(gè)峰的N端序列分析結(jié)果分別為_DLP_THSLGSR和A_VI_GVGVTETPLMK；第二個(gè)肽段分析同實(shí)施例1-7分析，即IFNα-2a的第101位氨基酸Gln被PEG化修飾；而對(duì)第一個(gè)肽段進(jìn)行分析，結(jié)果顯示IFNα-2a的第5位氨基酸Gln被PEG化。因此，使用專利CN1165539A實(shí)施例10所述方法獲得的修飾產(chǎn)物為非單一Gln位點(diǎn)修飾的IFN。

(4)PEG-IFNα-2a的體外活性測(cè)定

采用細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)PEG-IFNα-2a的體外生物學(xué)活性。按照歐洲藥典(Europe Pharmacopoeia Volume III)中所述方法，測(cè)定IFN的體外抗病毒活性。這種試驗(yàn)是基于IFN與A-549細(xì)胞共孵育之后，使得A-549細(xì)胞建立了抗病毒狀態(tài)， 從而使腦心肌炎病毒(EMCV)攻擊不再致A-549細(xì)胞病變，IFN的濃度通過(guò)半數(shù)細(xì)胞得到保護(hù)時(shí)的稀釋倍數(shù)來(lái)定量，每個(gè)樣品均同步檢測(cè)3個(gè)平行樣。

實(shí)施例1所得的PEG-IFNα-2a產(chǎn)物的體外生物學(xué)活性檢測(cè)結(jié)果如附圖8-9所示，結(jié)果顯示，PEG-IFNα-2a能保持IFNα-2a抗病毒活性的20％左右，比PEGASY(批號(hào)：131326/SH0202，7％)高2-3倍。

(5)PEG-IFNα-2a大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究

實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠，隨機(jī)分組，每組6只，雌雄各半，分籠喂養(yǎng)，以700μg/kg體重的劑量分別給予單次皮下注射IFNα-2a、PEG-IFNα-2a和PEGASYS，給藥后尾靜脈取血，取血時(shí)間分別為：IFNα-2a—注射后0min、5min、10min、0.5h、1h、2h、3h、4h、12h、24h；PEG-IFNα-2a和PEGASYS—注射后0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h；血樣經(jīng)5,000rpm，10min離心后取血漿部分，置-70℃保存?zhèn)溆?。用?shí)施例8(4)方法檢測(cè)血清中干擾素活性。

將實(shí)施例1所得的PEG-IFNα-2a、IFNα-2a和PEGASYS分別按上述步驟進(jìn)行大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究，結(jié)果如表1所示。

表1 IFNα-2a和PEG-IFNα-2a的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

可見(jiàn)，IFNα-2a經(jīng)PEG化后，末端半衰期顯著延長(zhǎng)。與PEGASYS相比，實(shí)施例1的PEG-IFNα-2a產(chǎn)物的在大鼠體內(nèi)的吸收速度和程度都有明顯提高，半衰期更長(zhǎng)，同時(shí)清除速率比PEGASYS低，因此，實(shí)施例1的PEG-IFNα-2a產(chǎn)物比PEGASYS有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性。

(6)PEG-IFNα-2a對(duì)人皮下腎癌異種移植腫瘤模型的藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究

收集A498細(xì)胞，每只NOD-SCID小鼠腋部皮下注入細(xì)胞懸液，2.7×10⁶個(gè)/只，建立荷瘤小鼠模型。待腫瘤長(zhǎng)到200-300mm³時(shí)，將小鼠根據(jù)腫瘤體積及動(dòng)物體重均衡分成5個(gè)組：空白對(duì)照組，PEG-IFNα-2a組(1.5、15μg/只，實(shí)施例1，1周給藥1次)，PEGASYS組(1.5、15μg/只，1周給藥1次)，IFNα-2a組(15μg/只，1周給藥3次)，每組5只動(dòng)物，均為皮下給藥，每周量瘤3次，第26天剖瘤稱重。

給藥后動(dòng)物正常飼養(yǎng)，使用測(cè)量瘤徑的方法，動(dòng)態(tài)觀察受試藥的抗腫瘤作用， 試驗(yàn)結(jié)束后(第28天)將動(dòng)物處死，剝瘤，計(jì)算抑瘤率。

腫瘤體積(tumor volume，TV)的計(jì)算公式為：TV＝1/2×a×b²。其中a和b分別表示腫瘤長(zhǎng)和寬，根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算出腫瘤體積。

根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)腫瘤體積抑制率(％)。

相對(duì)腫瘤體積抑制率＝(1－TRTV/CRTV)×100％。其中，TRTV：治療組RTV，CRTV：陰性對(duì)照組RTV，相對(duì)腫瘤體積(RTV)＝V_t/V₀。V₀為分籠給藥時(shí)(即d₀)測(cè)量所得腫瘤體積，V_t為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，Repeated Measure過(guò)程分析隨時(shí)間變化多次測(cè)量間腫瘤體積變化，Multivariate過(guò)程比較各次測(cè)量時(shí)組間腫瘤體積差異，

動(dòng)物腫瘤體積變化如附圖10所示。結(jié)果顯示：與空白組相比，各治療組從第10天起均可顯著抑制A498腫瘤生長(zhǎng)，從第12天起各劑量組均可極顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。PEGASYS 15μg和PEG-IFNα-2a 15μg組均能引起所有小鼠腫瘤完全消退，PEGASYS 1.5μg、PEG-IFNα-2a 1.5μg和IFNα-2a 15μg能引起部分小鼠腫瘤縮小，部分腫瘤完全消退?？梢?jiàn)，與未PEG化IFNα-2a作用相比，同劑量的PEG-IFNα-2a(15μg)抗腫瘤效果更為顯著，能引起所有小鼠腫瘤完全消退；15μg的IFNα-2a的抗腫瘤效果與1.5μg的PEG-IFNα-2a和PEGASYS相當(dāng)。

上文對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作了詳細(xì)的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，盡管參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。