專利名稱：：重組干擾素α2(IFNα2)突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及與野生型IFNa2相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性的重組干擾素a2(IFNa2)突變體及其活性片段、類似物、衍生物以及變體，還涉及其藥物組合物，所述藥物組合物可用于治療或預(yù)防與IFNa2表達增加有關(guān)的癌癥、自身免疫性疾病、感染性疾病和病癥。
背景技術(shù)：
：IFN(千擾素)于1957年由Isaacs和Lindenmann發(fā)現(xiàn)，并因其干擾病毒增殖的能力而命名。IFN還可抵抗細(xì)菌和寄生蟲感染，抑制細(xì)胞分裂，抑制自發(fā)性細(xì)胞凋亡，以及促進或阻止細(xì)胞分化?；谄涫荏w特異性，公認(rèn)有兩種類型IFN:I型和II型。I型IFN是單體蛋白質(zhì)家族，包括為白細(xì)胞產(chǎn)物的IFNa和IFNco,成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IFNp,以及僅在有^帝類動物種類中描述的IFNt。唯一已知的II型IFN是專門由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的二聚體IFNy。IFNa家族包括13個完全無內(nèi)含子的翻譯的基因(除了假基因以外)。各成員包括具有165或166個氨基酸殘基的成熟蛋白質(zhì)，其中具有兩個保守的二硫鍵Cysl-Cys98和Cys29-Cys138。在各種IFNa亞類中表現(xiàn)了高水平的序列同源性(80%),且在這些亞類和IFN|3之間存在約35%的同源性。盡管不同亞類具有高同源性，但它們的抗增殖、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)方面的生物活性顯著不同。幾種I型IFN的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到解答，包括小鼠IFN卩(1IFA、1RMI)、人類IFN卩(1AU1)、人類IFNa2(lRH2、HTF)以及羊IFNt(1B5L)。結(jié)構(gòu)上，IFN是a螺旋細(xì)胞因子家族的成員。所有I型IFN通過由IFNAR1和IFNAR2組成的普通受體復(fù)合物進行信號傳導(dǎo)。I型干擾素受體的主要配體結(jié)合成分是IFNAR2，它對于IFNa2具有~10nM的結(jié)合親和力。IFNAR2的細(xì)胞外部分的結(jié)構(gòu)包括兩個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，IFNa2的結(jié)合位點位于N末端結(jié)構(gòu)域和連接環(huán)。成熟的IFNAR1是530個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有21個殘基組成的^爭膜片段，和100個殘基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。IFNAR1的細(xì)胞外部分的結(jié)構(gòu)尚未知，j旦從序列上來看，可以推測它由四個免疫J求蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成。IFNa2與IFNAR1的結(jié)合是弱的，于人工膜上纟全測的親和力為1.5-5pM。牛IFNAR1(BoIFNARl)和人類IFNAR1(HuIFNARl)具有68%的同一性。HuIFNARl的亞結(jié)構(gòu)域2和3顯示在與IFNa2的結(jié)合中起關(guān)鍵作用。通過使用同源性BoIFNARl置換這些亞結(jié)構(gòu)域，親和力顯著增加。可溶性BoIFNARl可以以10nM的親和力結(jié)合人類IFN,這比HuIFNARl的親和力大500倍。表達IFNAR2的小鼠細(xì)胞以8nM的親和力結(jié)合IFNa2,而僅表達IFNAR1的細(xì)胞表現(xiàn)無配體結(jié)合。當(dāng)IFNAR1和IFNAR2共表達時，觀察到對于IFNa2的親和力增加10倍。使用于人工膜上的體外研究，顯示IFNAR1請導(dǎo)的三元復(fù)合物結(jié)合親和力增加的程度與該受體的相對表面濃度有關(guān)。IFN上IFNIFNAR1的結(jié)合位點的位置定位于位于B、C和D螺旋以及DE環(huán)上的IFNP，而IFNa2的Ala掃描誘變^是示IFNAR1的結(jié)合位點限制于B和C螺旋。許多研究已經(jīng)表明三元復(fù)合物的形成以順序方式發(fā)生，從IFN結(jié)合IFNAR2形成中間復(fù)合物開始，然后是IFNAR1的募集。FNAR1-IFNP-IFNAR2復(fù)合物顯示具有1:1:1的化學(xué)計量。IFNAR1受體是IFN受體復(fù)合物的基本成分，IFNAR1無效突變或針對該受體的中和Ab的添加導(dǎo)致對IFNa和IFN(3的抗病毒和抗增殖應(yīng)答完全喪失。IFNAR1和IFNAR2的結(jié)合刺激組成型相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)激酶Jakl和Tyk2的激活，導(dǎo)致酪氨酸磷酸化級聯(lián)，該級聯(lián)引起磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)形成二聚體，并運輸至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中，它們結(jié)合特異性DNA序列并刺激成百上千的應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。關(guān)于IFN如何非常相似地誘導(dǎo)相同細(xì)胞類型的不同活性的問題仍未解決。還表明不同IFNa亞類的生物活性與它們各自的結(jié)合親和力和所Y吏用的細(xì)胞類型有關(guān)。脊推動物I型IFN由獨享受體識別，所述受體由兩個5爭膜蛋白(IFNAR1和IFNAR2)組成，通過它們結(jié)合的Jak激酶表現(xiàn)其活性，將Stat轉(zhuǎn)錄因子作為其主要靶(Brierley，M.M.和Fish,E.N.2002.JInterferonCytokineRes.結(jié)構(gòu)域)的IgG樣折疊被識別，它們分別被認(rèn)為是結(jié)合蛋白和附屬的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子一即異聚受體的a和卩鏈。在該定義中隱含兩條鏈的配體解離常數(shù)的差異。盡管如此，二者均促成高親和力結(jié)合位點的建立。"普通"p鏈和不同識別鏈的組合是差異應(yīng)答不同配體的異聚受體的特征。與不同a鏈相互作用的能力為差異受體表達建立了潛在的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系(Kotenko，S.V.和Langer，J.A.2004.IntImmimopharmacol4,593-608)。當(dāng)如IFNAR1,它們具有與不同信號傳導(dǎo)途徑的元件相互作用的能力時，它們可以建立用于差異基因表達的聯(lián)系(Platanias，L.C.和Fish,E.N.1999.ExperimentalHematology27,1583-1592)。人類12號染色體的IFN具有不同的非等位基因a蛋白，一個(3,—個ffl。如從具有顯著序列同源性、共享的3D核心結(jié)構(gòu)和共享的受體的家族所預(yù)期的，I型IFN的活性重疊。盡管如此，可以識別它們并甚至通過其氨基酸差異而分類，已經(jīng)注意到活性相對差異的許多情況。出現(xiàn)的畫面是功能性差異僅在特定的生理學(xué)情況中出現(xiàn)。除了它們在賦予幾乎任何細(xì)胞的抗病毒保護中的局部作用以外，它們還與第二道抗病毒防線的發(fā)展有關(guān)。注意到IFN之間的可能差異也許是它們緊密結(jié)合IFNAR1的潛能(Roisman等，2005.JMoIBiol.353,271-281)。多年來,I型IFN的差異活性已經(jīng)是深入研究的主題。特別注意到IFN(3與IFNa相比具有其他的活性。這兩種IFN之間差異的詳細(xì)分析表明在IFN應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄激活中IFN(3通常具有較高的活性，并且在IFN水平降低時具有活性。結(jié)合研究表明針對附屬亞單位IFNAR1的親和力是IFNa2和IFN卩之間的關(guān)鍵差異(Jaitin，2006.MolCellBiol.26，1888-1897)。已知IFNa2具有抗癌作用。然而，這種治療并非總是有效，并且有時導(dǎo)致與劑量和療程相關(guān)的無法忍受的副作用。WO97/12630公開了使用替莫唑胺聯(lián)合IFNa2治療癌癥患者。WO01/54678公開了使用替莫唑胺和聚乙二醇化的IFN治療癌癥患者。在美國，丙型肝炎病毒(HCV)感染是最常見的慢性血源性感染。盡管新感染的數(shù)量已經(jīng)下降，但慢性感染的負(fù)擔(dān)顯著，美國疾病控制中心(theCenterforDiseaseControl)估計在美國具有三百九十萬(1.8%)受感染的人。慢性肝臟疾病是美國成人死亡的第十位主要原因，每年導(dǎo)致約25,000人死亡，或占所有死亡人數(shù)的約1%。研究表明40。/。的慢性肝臟疾病是HCV相關(guān)的，每年導(dǎo)致約8，000-10，000人死亡。HCV相關(guān)的末期肝臟疾病是成人肝臟移植最常見的適應(yīng)癥。在過去十年，慢性丙型肝炎的抗病毒治療進展迅速，在療效方面可見到顯著改進。盡管如此，即使使用聚乙二醇化的IFN-a加上病毒唑聯(lián)合治療，還是有40%至50%的患者治療失敗，即為非應(yīng)答者或復(fù)發(fā)者。目前這些患者沒有有效的治療替代方法。特別地，肝組織活檢具有晚期肝纖維化或肝硬化的患者處于發(fā)展晚期肝臟疾病的并發(fā)癥(包括腹水、黃癥、靜脈曲張破裂出血、腦病以及進行性肝衰竭)的顯著風(fēng)險和顯著增加的肝細(xì)胞癌的風(fēng)險中。多發(fā)性硬化癥(MS)是慢性神經(jīng)性自身免疫性脫髓鞘疾病。MS可引起視力模糊、單側(cè)視力喪失(視神經(jīng)炎)、平衡喪失、協(xié)調(diào)性差、言語不清、震顫、麻木、極度疲勞、智力功能改變(如記憶和注意力)、肌肉無力、感覺異常，以及失明。許多受治療者具有慢性進行性殘疾，但長期的臨床穩(wěn)定性可能中斷惡化期。神經(jīng)病變可以是永久性或逐漸消失。MS的病理特征是針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的異常免疫反應(yīng)。特別地，T淋巴細(xì)胞被激活而針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘，引起脫髓鞘。在脫髓鞘過程中，髓磷脂^皮石皮壞，并被已知為斑塊(plaque)的變硬的"硬化"組織的疤痕取代。這些損害在遍及腦、視神經(jīng)以及脊髓的分散部位出現(xiàn)。在美國被批準(zhǔn)用于治療MS的這兩種類型的IFN-p為IFN-Pla和IFN-Plb。I型糖尿病，也稱為自身免疫性糖尿病或胰島素依賴性糖尿病(IDDM),是一種自身免疫性疾病，其特征是胰腺細(xì)胞被自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞選擇性破壞(Bach，1994,Endocr.Rev.15:516-542)。IDDM的病理非常復(fù)雜，其涉及遺傳易感宿主中表觀遺傳事件(可能病毒感染)、胰島細(xì)胞以及免疫系統(tǒng)之間的的相互作用。許多細(xì)胞因子，包括IFN-a和IFN-y,與人類和該疾病動物模型的IDDM的發(fā)病機理有關(guān)(Campbell等，1991,J.Clin.Invest.87:739-742)。似乎在對潛在的致糖尿病刺激例如病毒的應(yīng)答中胰島細(xì)胞的IFN-a局部表達可觸發(fā)胰島炎過程。W09304699公開了一種治療胰島素依賴性糖尿病的方法，其包括進行IFN-a拮抗劑的給藥。基于系統(tǒng)性紅斑狼掩(SLE)患者的IFNa表達水平增加，IFNa與SLE的發(fā)病才幾理有關(guān)(Ytterberg和Schnitzer,1982,ArthritisRheum.25:401-406)。WO02066649公開了用于治療胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的抗IFNa特異性抗體。美國專利申請公布No.20040230040公開了IFNa2的半胱氨酸突變體。美國專利申請公布No.200400024747>開了在基于人類Daudi細(xì)胞系的測定中具有抗增殖活性的IFNa同系物。美國專利No.4,588,585公開了突變的IFN卩l(xiāng)b，其中經(jīng)由在密碼子17的第一個堿基中T轉(zhuǎn)換成A,Cysl7凈皮改變成Serl7,這防止了不正確的二硫鍵形成。WO2005016371公開了一種包括具有更大特異性活性的改進的重組人類IFN(3lb突變體的藥物組合物。對于與IFNa2的表達增加有關(guān)的癌癥、感染性疾病、多發(fā)性硬化癥以及自身免疫性疾病可使用的治療是昂貴的，僅在一定比例的患者中有效，且常見有副作用。對于安全、可靠、有效以及費用合理的合適的治療方法仍存在未滿足的醫(yī)學(xué)需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了具有重要治療用途的新型IFNa2突變體。本發(fā)明的變體作為激動劑或拮抗劑與野生型IFNa2相比具有提高的特異性。本發(fā)明首次公開了下述發(fā)現(xiàn)重組IFNa2突變體才莫擬IFN卩(SEQIDNO:3)的結(jié)合性質(zhì)并顯示差異IFN卩活性的重要特征。這包括增加的體外和體內(nèi)抗增殖活性，和IFNAR2受體的特異性下調(diào)。根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其活性片段、類似物、衍生物以及變體，其中所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氨基酸取代、C末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基S吏取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有^_高的特異性激動活性或拮抗活性。根據(jù)某些實施方案，所述多肽包括選自H57A(SEQIDNO:24)、E58A(SEQIDNO:25)、Q61A(SEQIDNO:26)、H57Y(SEQIDNO:27)、E58N(SEQIDNO:28)、Q61S(SEQIDNO:29)及其組合的至少一個突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了一種三突變體H57A，E58A,Q61A(SEQIDNO:5)，其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種四突變體N65A,L80A,Y85A,Y89A(SEQIDNO:6)，其與野生型IFNa2相比具有拮抗活性。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了一種IFN(x2蛋白質(zhì)，其包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQIDNO:7),其與野生型IFNa2相比具有4是高的特異性活性。本發(fā)明IFNa2突變體的特異性突變各自位于所述蛋白質(zhì)的不同位置，并因此可結(jié)合產(chǎn)生另外或增加的作用。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了一種IFNa2變體，其包括三突變體H57A，E58A,Q61A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:8),所述IFNa2變體具有非常高的特異性活性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種IFNa2變體，其包括四突變體N65A,L80A,Y85A，Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:9)，所述IFNa2變體對于IFNAR2具有增加的結(jié)合親和力但具有非常低的生物活性。現(xiàn)在公開該IFNa2變體作為IFN拮抗劑起作用，其通過IFN的受體阻斷它們的天然活性。才艮據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了一種三突變體H57M，E58D,Q61L(SEQIDNO:10)，其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了一種三突變體H57Y,E58N，Q61S(SEQIDNO:11),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了一種IFNa2變體，其包括三突變體H57M,E58D，Q61L和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:12),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明提供了一種IFNa2變體，其包括三突變體H57Y,E58N，Q61S和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:13),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明提供了具有增加的特異性活性的聚乙二醇化的IFNa2突變體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明多肽的DNA分子。根據(jù)一個實施方案，所述DNA分子包括選自SEQIDNO:15-23、SEQIDNO:30-35的序列。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明DNA分子的載體，其中所述載體能夠在原核宿主細(xì)胞或真核宿主細(xì)胞中表達突變體IFNa2多肽。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了一種包括本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括作為活性成分的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其活性片段、類似物、衍生物以及變體且包括藥學(xué)上可接受的載體，其中所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氨基酸取代、C末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基酸取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。根據(jù)某些實施方案，所述藥物組合物包括具有SEQIDNO:5-13和SEQIDNO:24-29任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片^殳、類似物、衍生物以及變體。根據(jù)一個實施方案，所述藥物組合物包括具有SEQIDNO:5、7、8、10、11、12以及13任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片^^殳、類似物、衍生物以及變體，其中所述多肽具有提高的特異性激動活性。根據(jù)另一個實施方案，所述藥物組合物包括具有SEQIDNO:6和9任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片段、類似物、衍生物以及變體，其中所述多肽具有提高的特異性拮抗活性。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防與IFN的調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括給藥于具有其需要的受治療者治療有效量的本發(fā)明藥物組合物，其中所述疾病或病癥選自癌癥、自身免疫性疾病和感染性疾病。根據(jù)一個實施方案，所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥(MS)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述MS選自復(fù)發(fā)-緩解型MS、繼發(fā)-進展型MS、原發(fā)-進展型MS以及進展-復(fù)發(fā)型MS。才艮據(jù)某些實施方案，具有SEQIDNO:5、7、8、10、11、12以及13任一者的IFNa2突變體可用于治療或預(yù)防MS。根據(jù)一個實施方案，所述癌癥選自毛細(xì)胞性白血病、卡波濟氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤和黑素瘤。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了一種抑制癌細(xì)胞生長的方法，所述方法包括將癌細(xì)胞暴露于具有SEQIDNO:5、7、8、10、11、12以及13任一者的IFNa2突變體及其片段、類似物以及衍生物。根據(jù)一個實施方案，所述感染性疾病是肝炎病毒感染。根據(jù)某些實施方案，所述肝炎選自曱型肝炎、乙型肝炎以及丙型肝炎。根據(jù)另一個實施方案，所述具有SEQIDNO:5、7、8、10、11、12以13任一者的IFNa2突變體可用于治療或預(yù)防感染性肝炎病毒感染。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明公開了與IFNa2表達增加有關(guān)的疾病的治療或預(yù)防的方法，所述疾病包括但不限于胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE),所述方法包括給藥于具有其需要的受治療者具有SEQIDNO:6和9的IFNa2突變體及其片段、類似物以及衍生物。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的IFNa2突變體用于制備治療或預(yù)防與IFN的調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病或病癥的藥劑的用途。結(jié)合下文的附圖、說明書以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的這些和其他實施方案將變得顯而易見。附圖簡述圖1A-1C顯示了通過IFNa2的親和捕獲和結(jié)合I型IFN受體-細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(IFNARl-EC)的固定作用。圖1A顯示了捕獲的IFNAR1與固定的mAbDB2的結(jié)合曲線，之后是與mAbAA3交聯(lián)的結(jié)合曲線。圖1B顯示了穩(wěn)定態(tài)親和力分析。IFNa2E58A(濃灰色)和E96A(淡黑色)以0.25和4之間的不同濃度(見圖中的數(shù)字)與固定于表面的IFNAR1的結(jié)合。圖1C顯示了實時追蹤的IFNa2、IFN(3以及三突變體H57A,E58A，Q61A(SEQIDNO:5)從表面固定的IFNAR1-EC的解離反應(yīng)。解離速率直接與結(jié)合親和力有關(guān)，數(shù)據(jù)總結(jié)于表1和3中。圖2顯示了IFNAR1和IFNAR2與IFNa2結(jié)合的分析。將I型IFN相對于IFNa2進行比對。加下劃線的殘基為至Ala的突變體不改變與任何受體的結(jié)合的那些。上方的"+"和"-"標(biāo)記表示當(dāng)突變時突變是否引起IFN(x2的結(jié)合親和力增加或減少(見表1)。上方的數(shù)字表示改變是否由于與IFNARl(l)或IFNAR2(2)結(jié)合的原因。IFNa8上的C末端殘基用大寫表示來標(biāo)記SEQID7中所做的改變。被框的殘基為與SEQID5-13有關(guān)的那些。圖3A-3B顯示了IFNa2上結(jié)合IFNAR1的功能表位。圖3A顯示了我們所分析的所有突變體蛋白質(zhì)與IFNAR1和IFNAR2的結(jié)合親和力改變的圖表。圖3B顯示了先前確定的IFNa2和IFNAR2的復(fù)合物模型的表面示意圖。給出突變時改變與IFNAR1的結(jié)合的殘基的編號。突變時增加結(jié)合親和力>2倍的殘基標(biāo)有下劃線(57、58、61)。該圖包括PyMol。圖4A-4C顯示了IFN對WISH細(xì)胞的抗病毒和抗增殖反應(yīng)的濃度依賴性。圖4A顯示了當(dāng)進行系列稀釋的IFN(250nM-0.48pM的IFNa2和125nM-0.24pM的IFN卩)給藥時抗增殖反應(yīng)的一組原始數(shù)據(jù)。圖4B和4C顯示了三個非依賴性抗增殖(4B)和抗病毒(4C)實驗且還包括三突變體H57A,E58A,Q61A(SEQIDNO:5)的光密度讀數(shù)。數(shù)據(jù)為6個重復(fù)顯示，包括標(biāo)準(zhǔn)差。曲線符合劑量反應(yīng)方程，并表現(xiàn)了組合數(shù)據(jù)的最佳適合。圖5A-5B顯示了IFN突變體的生物活性。圖5A顯示了21IFNa2單突變體，三突變體H57A，E58A,Q61A(SEQIDNO:5),四突變體N65A,L80A,Y85A,Y89A(SEQIDNO:6)、(SEQIDNO:7),三突變體H57Y，E58N,Q61S(SEQIDNO:ll)以及IFN卩的與相對抗增殖活性進行比較而標(biāo)繪的相對抗病毒活性(與野生型相比)。圖5B顯示了與其對于IFNAR1-EC的相對結(jié)合親和力比較而標(biāo)繪的相同蛋白質(zhì)的相對抗病毒和抗增殖活性。所有數(shù)據(jù)均來自表1-4。直線表示生物活性和親和力之間的理論關(guān)系。線上方的點為生物活性變化(抗病毒或抗增殖)比它們的親和力變化弱的突變體，線下方的點相反。圖6A-6C顯示了通過斑點寡核苷酸微陣列實驗監(jiān)測的IFN對基因表達的作用。對于不同的16小時長的IFN處理進行試驗0.3nM(l，000單位)野生型IFNa2;3nM(10,000單位)野生型IFNa2;0.3nMHEQ(SEQIDNO:5)以及0.15nMIFN卩(l，OOO單位)。各條件通過在染色交換微陣列復(fù)制中對于IFN處理與未處理進行比較來表示。另外，包括未處理與另一個樣品的未處理比較的微陣列實驗的四個復(fù)制物表示無IFN處理作為對照。圖6A顯示了根據(jù)倍數(shù)改變以升序標(biāo)繪的395個基因的相對表達水平(與未處理相比)。圖6B顯示了相對于添加0.15nMIFN卩時的表達水平標(biāo)繪的表達水平。僅有的例外是未處理對照(黑點)的表達水平，其相對于第二組對照標(biāo)繪，以評價隨機的波動水平。圖6C顯示了四個處理的IFN誘導(dǎo)的基因的聚類分析。IFN卩和HEQ(SEQIDNO:5)的基因表達模式聚集在一起，它們之間具有非常短的距離。使用3nM野生型IFNa2聚類處理的細(xì)胞的表達次之，而0.3nM野生型IFNa2的基因表達更遠(yuǎn)。本發(fā)明詳細(xì)說明本發(fā)明提供了與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的激動活性或拮抗活性的IFNa2突變體及其活性片段、類似物、衍生物以及變體。本發(fā)明的突變體提供了提高的治療效用，其包括選自提高的特異性或選沖奪性，提高的作用持續(xù)時間、提高的穩(wěn)定性以及更小的副作用的至少一種優(yōu)點。本發(fā)明還提供了包括IFNa2突變體的藥物組合物，其可用于治療或預(yù)防與IFNa2表達增加有關(guān)的癌癥、多發(fā)性硬化癥、感染性疾病和病癥，例如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。定義術(shù)語"IFN(干擾素)"是指分泌性蛋白質(zhì)家族，它們是具有抗病毒、抗原蟲、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。最初通過其來源將IFN分為白細(xì)胞IFNal(SEQIDNO:1)、IFNa2(SEQIDNO:2)、成纖維細(xì)胞IFN卩(SEQIDNO:3)以及免疫細(xì)胞IFNy(SEQIDNO:4)。特別受關(guān)注的是IFNa、IFN卩以及IFNy。IFNa是白細(xì)胞產(chǎn)生的IFN的主要類型。當(dāng)提到本發(fā)明的改進的IFNa2多肽時，術(shù)語"類似物"、"片段"、"衍生物"以及"變體"意思是保留與改進的IFNa2多肽基本相似的功能性活性或基本相同的生物學(xué)功能或活性的所述改進的IFNa2多肽的類似物、片段、衍生物以及變體。"類似物"包括這樣一種改進的IFNa2多肽，即其中至少一個氨基酸被另一個氨基酸取代，產(chǎn)生與本文所列的多肽相比具有增加的活性、穩(wěn)定性或較長的半衰期的本發(fā)明多肽的活性類似物。"片段"是本發(fā)明的改進的iFNa2多肽的一部分，它保留與改進的IFNa2多肽基本相似的功能性活性或基本相同的生物學(xué)功能或活性，如本申請下文所描述的本文公開的體外測定中所顯示的。"衍生物"包括對于本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的所有修飾，其基本保留本文所述的功能，且包括其他結(jié)構(gòu)和伴隨功能，如具有較長半衰期的聚乙二醇化多肽。"變體"包括具有氨基酸序列的多肽，其包括本發(fā)明突變體IFNa2多肽的組合，所述多肽保留與原始突變體IFNa2多肽相比基本相似的功能性活性或增加的功能性活性。"基本相似的功能性活性"和"基本相同的生物學(xué)功能或活性"分別是指當(dāng)通過相同操作或測定來確定各多肽的生物活性時，其生物活性度在與之相比的多肽所表現(xiàn)的生物活性的約50%至100%之內(nèi)或更多、更優(yōu)選在80%至100%之內(nèi)或更多以及更優(yōu)選在約90%至100%之內(nèi)或更多。兩種多肽之間的"相似性"通過將一種多肽的氨基S吏序列與另一種多肽的序列進行比較而確定。如果具有同一性或是保守性氨基酸取代，其中一種多肽的氨基酸與另一種多肽的相應(yīng)氨基酸相似。保守性取代包括下列參考文獻中描述的那些Dayhoff，M.O.,編輯，TheAtlasofProteinSequenceandStructure5，NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.(1978),和Argos,P.(1989)EMBOJ.8:779-785。例如，屬于下述組之一的氨基酸表示保守性改變或取代Ala:-Pro,Gly，Gin,Asn,Ser,Thr:-Cys，Ser,Tyr,Thr;-Val,Ho,Lgu,Mot,Ala,Phe;-Lys,Arg,His;國Phe,Tyr,Tip,His;以及-Asp,Glu。本文使用的關(guān)于本發(fā)明的IFNa2突變體的"特異性活性"是指IFNa2的生物活性或功能。IFNa2的生物活性或功能為本領(lǐng)域公知，包括但不限于任何方法測定和纟全測。本文所使用的"提高的特異性活性"是指本發(fā)明的IFNa2組合物的特異性活性或拮抗活性大于對照的野生型IFNa2組合物的特異性活性或拮抗活性。如本文所述或本領(lǐng)域已知，本發(fā)明的IFNa2組合物的特異性活性可以使用測定和/或檢測IFNa2特異性活性的方法與對照的野生型IFNa2組合物的特異性活性比較而進行分析。"IFNa2組合物"是指IFNa2多肽及其片段、類似物、衍生物或變體，或包括IFNa2多肽及其片段、類似物、衍生物或變體的組合物(如藥物組合物)。術(shù)語"重組蛋白質(zhì)或多肽"是指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽，即從編碼所需蛋白質(zhì)或多肽的外源性重組DNA表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的原于大多數(shù)細(xì)菌培養(yǎng)物中表達的蛋白質(zhì)或多肽通常無聚糖。酵母中表達的蛋白質(zhì)或多肽具有與哺乳動物細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)或多肽不同的糖基化形式。本文所使用的"表達載體"是指當(dāng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞中時，能夠復(fù)制和表達感興趣的基因的核酸分子。所述表達載體包括一種或多種表型選擇性標(biāo)記和復(fù)制起點，以確保載體的維持并且如需要提供在宿主中的擴增。選擇性標(biāo)記包括例如賦予抗生素抗性標(biāo)記的序列(例如青霉素、四環(huán)素和卡那霉素抗性序列)，其可用于通過選擇獲得成功的轉(zhuǎn)化體，或提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)素。合適的表達載體可以是衍生自例如pBR322的質(zhì)?；蚋鞣NpUC質(zhì)粒，它們可商購獲得。其他表達載體可衍生自噬菌體、噬菌?；蛘沉１磉_載體，所有均描述于Sambrook等，(MolecularCloning:ALaboratoryManual.第3版，2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress)的1.12-1.20部分。分離的質(zhì)粒和DNA片段被切割、修剪以及以特定順序連接在一起而產(chǎn)生所需的載體，如本領(lǐng)域公知(參見，例^口Sambrook等，i口上)。術(shù)語"天然的"、"天然存在的"或"野生型"(wt)蛋白質(zhì)或多肽是指從天然存在的來源中獲得的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語"天然的IFN"或"野生型IFN"包括天然或野生型IFN,并包括IFN的翻譯后修飾，包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化、?；约扒懈?。術(shù)語"重組表達載體或質(zhì)粒"是可復(fù)制的DNA載體或質(zhì)粒構(gòu)建體，用于擴增或表達編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽的DNA。表達載體或質(zhì)粒含有DNA調(diào)控序列和編碼序列。DNA調(diào)控序列包括啟動子序列、核糖體結(jié)合位點、多聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄終止序列、上游調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及增強子。本文所定義的重組表達系統(tǒng)經(jīng)調(diào)節(jié)元件謙導(dǎo)時表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語"轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，，是指已經(jīng)被外源性DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。外源性DNA可以被或不被整合(即共價結(jié)合)至構(gòu)成宿主細(xì)胞基因組的染色體DNA。例如，在原核細(xì)胞和酵母中外源性DNA可保留在游離型元件上，例如質(zhì)粒，或穩(wěn)定整合至染色體DNA中。關(guān)于真核細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是外源性DNA已整合至染色體中的細(xì)胞。該穩(wěn)定性通過真核細(xì)胞系或克隆經(jīng)復(fù)制產(chǎn)生含有外源性DNA的子代細(xì)胞群的能力來表現(xiàn)。本文所使用的術(shù)語"引物"是指這樣一種寡核苷酸，即無論是純化的限制性酶切消化而天然存在還是合成產(chǎn)生的，當(dāng)置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下能夠作為合成的起點起作用，所述條件即在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶的存在下和合適的溫度和pH。所述引物可為單鏈或雙鏈并且必須足夠長以在所述誘導(dǎo)劑的存在下引導(dǎo)所需延伸產(chǎn)物的合成。"治療有效量"是指本發(fā)明的改進的IFNa2多肽當(dāng)給藥于具有其需要的受治療者時足夠治療疾病或病癥的量。例如，用于與IFNa2表達增加有關(guān)的復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化癥(MS)、癌癥、感染性疾病或病癥，例如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。術(shù)語"受治療者"是指人類受治療者和非人類受治療者。術(shù)語"癌癥"意于包括所有類型的癌性生長或致癌過程、轉(zhuǎn)移組織或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或器官，不考慮組織病理類型或侵襲階段。癌癥的實例包括但不限于實體瘤和白血病，包括APUD瘤(apudoma)、迷芽瘤、鰓原瘤、惡性類癌綜合征、類癌心臟癥、癌(例如沃克癌、基底細(xì)力包癌、基底鱗狀癌、布-皮癌、導(dǎo)管癌、艾氏癌、非小細(xì)胞肺癌、燕麥細(xì)胞癌、乳頭狀癌、細(xì)支氣管癌、支氣管原癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌以及移行細(xì)胞癌)、組織細(xì)胞疾病、白血病(如B細(xì)胞性白血病、混合細(xì)胞性白血病、無標(biāo)記血細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞性白血病、慢性T細(xì)胞白血病、人T細(xì)胞白血病病毒-II(HTLV-II)相關(guān)性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肥大細(xì)胞性白血病以及骨髓性白血病)、組織細(xì)胞增多病、何杰金氏病、免疫增生性小腸疾病(immunoproliferativesmall)、非何杰金氏'淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、黑素瘤、成軟骨細(xì)胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細(xì)胞瘤、組織細(xì)胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、間皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、顱咽管瘤、無性細(xì)胞瘤、錯構(gòu)瘤、間葉瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細(xì)胞瘤、牙骨質(zhì)瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋養(yǎng)層細(xì)胞瘤、腺癌、腺瘤、膽管瘤、膽脂瘤、圓柱瘤、嚢腺癌、嚢腺瘤、粒層細(xì)胞瘤、兩性胚細(xì)胞瘤、肝癌、汗腺瘤、胰島細(xì)胞瘤、睪丸間質(zhì)細(xì)胞瘤、絨毛狀瘤、睪丸支持細(xì)胞瘤、泡膜細(xì)胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌細(xì)胞瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、神經(jīng)鞘瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)上皮瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、非嗜鉻性副神經(jīng)節(jié)瘤、血管角質(zhì)瘤、嗜酸細(xì)胞增多性血管淋巴樣增生、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管^L瘤、淋巴管肉瘤、；^果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、嚢性肉瘤、葉狀瘤(phyllodes)、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、月旨肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤(如伊文氏肉瘤、實驗性肉瘤、卡波濟氏肉瘤以及巨細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)纖維瘤病、宮頸非典型增生，以及細(xì)胞變得永久性或被轉(zhuǎn)化的其他病癥。本文所使用的"治療MS"涵蓋受治療者的疾病狀態(tài)的治療，所述疾病狀態(tài)的特征為與MS相關(guān)的癥狀，例如無力、麻木、震顫、視力喪失、疼痛、麻痹、平衡喪失、膀胱和腸機能障礙以及認(rèn)知改變(原發(fā)性癥狀)、反復(fù)尿路感染、廢用性虛弱、姿勢調(diào)整和軀干控制欠佳、肌肉失衡、骨密度降低、呼吸淺無力以及褥瘉(繼發(fā)性癥狀)；以及抑郁(三級癥狀(tertiarysymptom)),并包括(i)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(ii)緩解疾病，即引起疾病復(fù)原。術(shù)語"肝炎病毒感染"是指甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒的一種或多種的感染，其中血源性肝炎病毒感染尤其令人關(guān)注。如本文所使用，本文中可與"肝纖維變性"互換使用的術(shù)語"肝纖維化"是指在慢性肝炎感染過程中出現(xiàn)的肝臟中應(yīng)痕組織的生長。本文所使用的術(shù)語"聚乙二醇化的IFNa2突變體"是指聚乙二醇修飾的IFNa2突變體的偶聯(lián)物。優(yōu)選的聚乙二醇-IFNa2突變體的偶聯(lián)物為可逆性偶聯(lián)物，其在生理條件下被緩慢轉(zhuǎn)化為藥物，例如根據(jù)WO2004089280所述的方法所制備的。其他IFNa2突變體偶聯(lián)物可通過將IFNa2突變體與水溶性聚合物偶聯(lián)而制備。此類聚合物的非限制性實例包括其他聚烯基氧化物均聚物，例如聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和嵌段共聚物。作為基于聚烯基氧化物聚合物的替代物，也可以使用有效非抗原性物質(zhì)例如葡聚糖、聚乙烯吡咯酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于^_水化合物的聚合物等。這些IFNa聚合物偶聯(lián)物描述于美國專利No.4,766,106和美國專利No.4,917,888。如本文所使用，"微陣列"是指附著于載體的多個分離的核酸分子或寡核苷SW笨針，其中每個核酸分子或寡核苷酸探針在唯一的預(yù)選區(qū)附著于載體。術(shù)語"核酸"可與術(shù)語"多核香酸"互換使用。術(shù)語"多核苷酸"是指核苷酸^i。優(yōu)選地，所述鏈具有約20至10,000個核香酸，更優(yōu)選約150至3,500個核苷酸。術(shù)語"探針"是指能夠與基因轉(zhuǎn)錄物或其互補序列雜交而形成多核苷酸探針/基因轉(zhuǎn)錄物復(fù)合物的多核苦酸序列。術(shù)語"基因"包括可被轉(zhuǎn)錄為RNA的區(qū)域，這是因為本發(fā)明考慮了RNA或其等同物(例如cDNA和cRNA)的檢測。本發(fā)明的基因包括但不限于特定生物過程特有或有關(guān)的和/或提示生物過程的基因，所述生物過程例如細(xì)胞凋亡、分化、應(yīng)激反應(yīng)、老化、增殖等；細(xì)胞機制基因，如細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、毒性化合物的代謝等；疾病相關(guān)基因，例如癌癥、多發(fā)性硬化癥、感染等有關(guān)的基因。例如，所述基因可為癌基因，其在細(xì)胞中的表達誘導(dǎo)該細(xì)胞從正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肺瘤細(xì)胞?；虻钠渌麑嵗ǖ幌抻诩?xì)胞因子基因、朊病毒基因、編碼誘導(dǎo)血管發(fā)生的分子的基因、編碼粘附分子的基因、編碼細(xì)胞表面受體的基因、編碼與轉(zhuǎn)移和/或侵襲過程有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因、胰蛋白酶基因，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的分子的基因。根據(jù)本發(fā)明，基因轉(zhuǎn)錄物的水平可通過使用半定量法如微陣列雜交或更多定量的方法例如定量qPCR檢測基因轉(zhuǎn)錄物如RNA的水平來確定。如本文所使用，術(shù)語"調(diào)節(jié)表達和/或活性"通常是指作用以控制或調(diào)節(jié)細(xì)胞成分的量或活性(功能性)的任何過程。靜態(tài)調(diào)節(jié)以某種給定水平維持表達和/或活性。上調(diào)是指表達和/或活性的相對增加。因此，下調(diào)是指表達和/或活性的相對減少。下調(diào)與給定的細(xì)胞成分的活性的抑制同義。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的特征將三個單突變(H57A,E58A,Q61A)(SEQIDNO:5)引入IFNa2，這與野生型蛋白質(zhì)(SEQID:NO2)相比，特異性增加了其針對IFNAR1受體的結(jié)合親和力約30倍。本文所使用的稱為HEQ的突變體IFNa2蛋白質(zhì)的親和力與對于IFN卩所檢測的相似(表3),大大超過任何其他IFN亞類。對于HEQ的生物活性的評價表明其獲得IFN卩(SEQIDNO:3)的非常相似的特征。因此，與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比，HEQ僅促進其抗病毒效能增加2倍，但促進其抗增殖效能增加24倍(表4)。將另外兩組突變引入IFNa2中與HEQ:H57M，E58D,Q61L(本文稱為MDL,SEQIDNO:10)和H57Y,E58N,Q61S(本文稱為YNS,SEQIDNO:ll)相同的位置。兩者的抗病毒活性均在野生型的3倍之內(nèi)(表4)。然而，它們的抗增殖活性高于IFN(3的HEQ的抗增殖活性。對于MDL，其活性與野生型相比高40倍，對于YNS,其活性在WISH細(xì)胞中高160倍，在MDA231細(xì)胞中高70倍，這比對于IFN(3(SEQIDNO:3)所檢測的高3-7倍。通過寡核苷酸微陣列實驗檢測HEQ(SEQIDNO:5)的基因轉(zhuǎn)錄模式。HEQ基因活性比相同蛋白濃度的IFNa2高得多，與記錄的IFN卩(SEQIDNO:3)的基因活性相似。在疾病治療中，YNS或HEQ與野生型IFNa2或IFNP相比，可潛在地為更有效的藥物。YNS和HEQ優(yōu)于野生型IFNa2的優(yōu)點在于其較大的抗增殖特異性，這有助于減輕副作用和治療癌癥或多發(fā)性硬化癥。YNS的優(yōu)點是其與IFN(3相比較高的抗增殖作用，特別是在人類乳腺癌細(xì)胞MDA231中所檢測的。本發(fā)明還提供了本文所使用的稱為NLYY的四突變體N65A，L80A,Y85A,Y89A(SEQIDNO:6)，其與野生型蛋白質(zhì)相比抗增殖活性減小1000倍，抗病毒活性減小100倍，-f旦仍舊以野生型親和力結(jié)合IFNAR2(表2)。本發(fā)明提供了IFNa2蛋白，其包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQIDNO:7),如本文使用的稱為a8尾。將a8尾突變體改造成具有IFNa8的尾以使IFNa2和其受體IFNAR2之間的靜電結(jié)合能最佳。結(jié)合檢測顯示a8尾突變體與野生型相比結(jié)合親和力高18倍(表2)。a8尾突變體的抗病毒活性與野生型相比高3倍，抗增殖活性與野生型相比高10倍(表2)。本發(fā)明的三種IFNa2突變體的特異性突變分別位于蛋白質(zhì)的不同位置，并因此可組合產(chǎn)生另外或增加的作用。本發(fā)明提供了變體，其包括三突變體HEQ(SEQIDNO:5)、MDL(SEQIDNO:IO)或YNS(SEQIDNO:1l)和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQIDNO:7)的組合。這些變體(SEQIDNO:8、12以及13)可證明在治療癌癥中較有效，特別是因為它們的抗增殖活性增加。另外，它們的較高的結(jié)合能力可克服癌細(xì)胞中受體下調(diào)的問題。由于HEQ由三個至Ala的單點突變組成，并且a8尾突變體包括天然IFNa8的C末端取代IFNa2的C末端，特異性免疫原性應(yīng)答的可能性小。本發(fā)明還提供了一種對IFNAR2的結(jié)合親和力增加但生物活性非常低的變體，其包括四突變體N65A,L80A,Y85A,Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:9)。該IFNa2變體是IFN拮抗劑，其通過IFN的受體阻斷它們的天然活性。本發(fā)明的改進的IFNa2組合物包括IFNa2突變體多肽或其片段、類似物、衍生物以及變體，它們比對照的野生型IFNa2組合物的特異性活性大至少2倍，優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，甚至更優(yōu)選1000倍。在某些實施方案中，本發(fā)明的IFNa2組合物對于野生型IFNa2具有拮抗活性。本發(fā)明的拮抗劑IFNa拮抗劑被定義為能夠在體內(nèi)干擾IFNa生物活性的任何物質(zhì)。不一定所述拮抗劑完全中和IFNa活性，而僅中和至足以在體內(nèi)發(fā)揮IDDM或SLE治療活性的程度。已知IFNa具有多種生物活性。本文所使用的拮抗劑可減輕、抑制或中和這些活性中的一種或多種。通常所述拮抗劑干擾IFNa的抗病毒、抗增殖或免疫調(diào)節(jié)活性中的至少一種(且優(yōu)選所有)。所述拮抗劑一般選自下列幾類IFNa受體的可溶形式，阻斷IFNa與其受體結(jié)合或合適相互作用的抗IFNa受體抗體，能夠結(jié)合并中和IFNa自身的抗體，與IFNa竟?fàn)幨荏w結(jié)合位點但它們自身不表現(xiàn)明顯的IFNa活性的非IFN多肽。本發(fā)明的拮抗劑為拮抗IFNa和IFN卩活性的IFNa的突變體。IFNa2誘變在特定位置改變氨基酸的作用可通過引入氨基酸耳又代和使用本文所述的測定檢測改變的IFNa2多肽的生物活性來進行試驗?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變技術(shù)，包括但不限于化學(xué)誘變，使用例如QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)進行體外定點誘變等。例如丙氨酸掃描誘變的技術(shù)特別適于這種方法。核酸本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的核酸分子?？墒褂弥亟MDNA技術(shù)(如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增、克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生核酸分子。核酉銀列包括天然核酸序列及其同系物，包括但不限于天然等位基因變體和修飾的核酸序列，其中核苷酸以如下方式被插入、刪除、取代和/或轉(zhuǎn)化即所述修飾不顯著干擾核酸分子編碼本發(fā)明重組IFNa2多肽的能力。多核苷酸或寡核香酸序列可從蛋白質(zhì)的遺傳密碼推導(dǎo)，然而，必須考慮密碼子的簡并性，本發(fā)明的核酸序列還包括因遺傳密碼而具有簡并性的序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定所述序列。本文所使用的術(shù)語"核酸"和"多核苦酸"是指寡核苦酸、多核苷酸或核苷酸及其片段或部分，以及基因組或合成來源的DNA或RNA,它們可以是單鏈或雙鏈，并代表有義鏈或反義鏈。該術(shù)語還應(yīng)理解為包括如由核苦酸類似物制備和適用于所述實施方案的RNA或DNA的等同物、類似物。術(shù)語"寡核苷酸"是指具有至少約6個核苷酸至約60個核苦酸、優(yōu)選約15至30個核苷酸以及更優(yōu)選約20至25個核苷酸的核S臾序列，其可用于PCR擴增或雜交測定，或微陣列。如本文所使用，"寡核苦酸"大體上等同于本領(lǐng)域通常定義的術(shù)語"擴增引物"、"引物"、"寡聚物"以及"探針"。如本文所使用，高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指能耐受達約5%至約25%、優(yōu)選達約5%至約15%序列差異的那些條件。非限制地，高嚴(yán)謹(jǐn)條件(低于所計算的雜交物的Tm-10°C)的實例在低于所計算的雜交物的Tm的合適的Ti(溫育溫度)下使用0.1XSSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)和0.5%SDS的洗液。條件的最終嚴(yán)謹(jǐn)性主要取決于洗滌條件，特別是如果所使用的雜交條件為允許隨同穩(wěn)定雜交物一起形成較不穩(wěn)定的雜交物的那些條件。然后較高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈鞐l件去除較不穩(wěn)定的雜交物?？膳c上述高嚴(yán)謹(jǐn)至中度嚴(yán)謹(jǐn)洗滌條件一起使用的普通雜交條件為在合適的Ti于6XSSC(或6XSSPE)、5XDenhardt試劑、0.5%SDS、100pg/ml變性的鮭精DNA片段的溶液中雜交。(通常參見Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress(1989)對于合適的高嚴(yán)謹(jǐn)條件的描述)。嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交實驗和洗滌中使用的溫度、雜交溶液和洗液中單價陽離子的摩爾濃度以及雜交液中曱酰胺的百分?jǐn)?shù)的函數(shù)。通常，與探針雜交的敏感度受探針的量和特異性活性、靶核酸的量、標(biāo)記的可檢測性、雜交速率以及雜交的持續(xù)時間影響。對于DNA:DNA雜交物，雜交速率在低于Tm約20。C-25°C的Ti為最大，對于DNA:RNA雜交物，雜交速率在低于Tm約10。C-15。C的Ti為最大。約1.5MNa+的離子強度也使其最大化。所述速率與雙鏈體長度成正比，與錯配度成反比。然而，雜交的特異性是所需雜交物和"本底"雜交物之間穩(wěn)定性差異的函數(shù)。雜交穩(wěn)定性是雙鏈體長度、堿基組合物、離子強度、錯配以及去穩(wěn)定劑(如果有的話)的函數(shù)。DNA:DN雜交物的理想雜交的Tm可使用Meinkoth等(AnalBiochem.1984;138(2):267-84)的方程式來估計。改進的IFNa2多肽的表達與純化有幾種在細(xì)菌尤其是大腸桿菌(E.coli)中表達和純化重組人類IFNa2的方法，來獲得具有提高的激動活性或拮抗活性的IFNa2多肽。已知的方法可用于在細(xì)菌中表達克隆基因。為在原核系統(tǒng)中獲得克隆的真核基因的高水平表達，優(yōu)選構(gòu)建含有指導(dǎo)mRN轉(zhuǎn)錄的強啟動子的表達載體。適于該目的的調(diào)控區(qū)的實例為大腸桿菌卩葡萄糖苷酶基因的啟動子和操縱子區(qū)、大腸桿菌色氨酸生物合成途徑，或噬菌體A的左側(cè)啟動子。大腸桿菌中所轉(zhuǎn)化的DNA質(zhì)粒中包括選擇性標(biāo)記也是有用的。所述標(biāo)記的實例包括負(fù)責(zé)抗青霉素、四環(huán)素或氯霉素的基因。在原核細(xì)胞表達系統(tǒng)大腸桿菌中不發(fā)生翻譯后修飾，例如糖基化。另外，具有復(fù)合二硫鍵連接模式的蛋白質(zhì)當(dāng)在大腸桿菌中表達時可被折疊。對于原核系統(tǒng)，所表達的蛋白質(zhì)以不溶解形式存在于細(xì)胞質(zhì)，存在于所謂的包涵體中，在細(xì)胞裂解后可見于可溶部分，或通過添加合適的分泌信號序列^C定向至周質(zhì)中。如果所表達的蛋白質(zhì)在不溶解的包涵體中，通常需要包涵體的增溶和隨后重折疊。許多原核表達載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并可商購獲得，例如pKK223-3(PharmaciaFineChemicals,Uppsala,Sweden),pKK233-2(Clontech,PaloAlto,CA,USA),以及pGEMl(PromegaBiotech,Madison,WI,USA)。重組微生物表達系統(tǒng)中通常使用的啟動子包括p-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang,A.C.等，1978,Nature275:617-624)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和Tac啟動子(Sambrook,J.F.等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.1989)。其他有用的細(xì)菌表達系統(tǒng)應(yīng)用X-噬菌體pL啟動子和dts857溫度誘導(dǎo)的阻抑物(Bernard等，1979,Gene5:59-76)。目前，使用下列方案將編碼IFNa2的基因克隆至基于pT7T3-18U質(zhì)粒的雙順反子的表達載體，其中我們添加起始密碼子上游的第二順反子。第二順反子是lpp5、基因的最開始9個氨基酸，包括其側(cè)鄰Xbal和Ndel限制性酶切位點的SD位點。插入第二順反子的原因是提高異源蛋白表達產(chǎn)量。另外，為了提高表達水平，將最開始的23個氨基酸的密碼子改變成TGTGATCTGCCGCAGACTCACTCTCTGGGTTCTCGTCGT白在BL21細(xì)胞中表達，于豐富培養(yǎng)基中過夜。IFNa2存在于包涵體中，所述包涵體溶于含有5mMDTT的8M尿素中。IFNa2通過20倍稀釋過夜而重折疊。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進行蛋白質(zhì)純化。蛋白質(zhì)的通常產(chǎn)量為10mg/L細(xì)胞培養(yǎng)物。在SDS-PAGE上IFNa2跑出18kDa的單條帶。改進的IFNa2多肽的類似物及其片段、衍生物以及變體本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的類似物及其片段、衍生物或變體可為(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基取代的那些；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基的那些；或(m)其中改進的IFNa2多肽與另一種化合物融合的那些，所述另一種化合物例如增加改進的IFNa2多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸與成熟的改進的IFNa2多肽融合的那些，所述另外的氨基酸例如前導(dǎo)序列或分泌序列，或用于純化成熟的改進的IFNa2多肽的序列；或(v)其中改進的IFNa2多肽與較大的多肽融合用于增加作用持續(xù)時間的那些，所述較大的多肽即人類白蛋白、抗體或Fc。從本文的教導(dǎo)內(nèi)容來看，認(rèn)為所述類似物及其片段、衍生物以及變體在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。"保守性氨基酸取代"是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的那些。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(如天門冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(如甘氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、具有卩支鏈側(cè)鏈的氨基酸(如蘇氨酸纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸組氨酸)。對于保守性氨基酸殘基或存在于保守性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基不進行非保守性取代。片段或生物活性部分包括適于用作藥劑、研究試劑等的多肽片段。片段包括含有足夠相似于或衍生自本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的氨基酸序列并表現(xiàn)所述多肽的至少一種活性但包括比本文所公布的全長多肽較少的氨基酸的肽。通常，生物活性部分包括具有所述多肽至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。所述生物活性部分可合成和通過重組技術(shù)制備并可通過本文所公開和/或本領(lǐng)域公知的方法用于評價本發(fā)明的多肽的一種或多種功能性活性。本發(fā)明的優(yōu)選衍生物包括與另一種化合物融合的改進的IFNa2多肽，所述另一種化合物例如增加所述多肽的半衰期和/或降低所述多肽潛在免疫原性的化合物(例如聚乙二醇，"PEG")。PEG可用于賦予水溶性、大小、減慢腎臟清除率以及降低對融合蛋白的免疫原性。參見，例如美國專利No.6,214，966。在聚乙二醇化的情況下，所述改進的IFNa2多肽與PEG的融合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實現(xiàn)。例如，可通過首先將半胱氨酸突變引入改進的IFNa2多肽然后使用PEG-馬來酰亞胺進行位點特異性衍生來實現(xiàn)。半胱氨酸殘基可添加至改進的IFNa2多肽的C末端。參見，例如Tsutsumi,Y.等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:8548-8553。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的變體包括具有足夠與原始的改進的IFNa2多肽的氨基S臾序列相似的氨基S臾序列的多肽或其組合。所述變體包括由于誘變導(dǎo)致氨基S銀列不同的改進的IFNa2多肽。可通過篩選突變體的組合文庫鑒定具有提高的活性的變體，例如本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的平截或點突變體。在一個實施方案中，變體的多樣性文庫通過核酸水平的組合誘變產(chǎn)生并通過多樣性基因文庫編碼。變體的多樣性文庫通過例如酶催化將合成的寡核苷酸與基因序列連接而產(chǎn)生，使得一組簡并的潛在變體氨基酸序列可作為單個多肽表達，或者作為一組其中含有所述組序列的較大的改進的IFNa2多肽表達(例如用于噬菌體展示)。有多種方法可用于自簡并的寡核苷酸序列產(chǎn)生潛在的變體的文庫。可于自動DNA合成儀中進行簡并性基因序列的化學(xué)合成，并且然后將合成基因連接至合適的表達載體。簡并組基因的用途使得以一種混合物形式提供編碼所需組潛在變體序列的所有序列。合成簡并性寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知(參見，例如，Itakura,K.等，1984,Annu.Rev.Biochem.53:323-356)。用于篩選通過點突變或平截制備的組合文庫的基因產(chǎn)物和篩選cDNA快速篩選由改進的IFNa2多肽的組合誘變產(chǎn)生的基因文庫的特異性活性。適于篩選大基因文庫的高通量分析的最廣泛使用的技術(shù)通常包括將基因文庫克隆至可復(fù)制的表達載體、使用產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，以及在下述的條件下表達組合基因，所述條件即其中所需活性促進編碼其產(chǎn)物可被檢測的基因的載體的分離的條件。一種增強文庫中功能性突變頻率的4支術(shù)-回歸總體i秀變(Recursiveensemblemutagenesis,REM),可耳關(guān)合篩選測定用于鑒定所需變體。本發(fā)明的藥物組合物本發(fā)明還提供了可給藥于患者以實現(xiàn)治療作用的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可通過將具有所需純度的藥學(xué)有效量的改進的IFNa2多肽與藥學(xué)上可接受的載體組合而制備用于給藥。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽和藥物組合物可用于胃腸外(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下)、表面、口服、可吸入或局部給藥。本發(fā)明的改進的多肽可以以藥物組合物形式用于任何合適的給藥方法，包括但不限于靜脈、皮下、肌內(nèi)或鞘內(nèi)給藥。因此，上述多肽優(yōu)選與藥學(xué)上可接受的無菌藥物載體組合，例如5%葡萄糖、乳酸林格氏溶液、生理鹽水、無菌水或任何其他被設(shè)計用于靜脈輸注的商業(yè)上制備的生理緩沖液。應(yīng)理解載體溶液的選擇以及所述組合物的劑量和給藥根據(jù)受治療者和具體的臨床使用情況而不同，并受標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)規(guī)程管理。才艮據(jù)本發(fā)明的方法，這些藥物組合物可以以有效抑制或緩解與MS、癌癥、IDDM或SLE有關(guān)的病理結(jié)果或癥狀的量^^藥。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽可通過靜脈快速濃注、通過持續(xù)靜脈輸注或通過兩種途徑結(jié)合來給藥。可選地，或另外，與合適的賦形劑混合的改進的IFNa2多肽可經(jīng)肌肉內(nèi)部位被攝取至循環(huán)中。明確地，多肽由于對胃酸或腸酶的消化易感而較不適于口服給藥，然而，在某些實施方案中，特定的制劑可用于口服給藥。在制備口服液體劑型(如懸浮液、酏劑以及溶液)的組合物中，可使用通常的藥物基質(zhì)例如水、乙二醇、油、乙醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等。類似地，當(dāng)制備口服固體劑型時(例如粉劑、片劑以及膠嚢)，可應(yīng)用載體諸如淀粉、糖、制粒劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑等。由于片劑和膠嚢容易給藥，它們表現(xiàn)為本發(fā)明藥物組合物的理想口服劑型。多肽較不適于局部給藥，然而對于局部治療可使用特定的制劑。對于局部給藥，本發(fā)明的改進的IFNa2多肽可使用溫和、增加水分的基質(zhì)配制，例如軟膏或乳劑。合適的軟膏基質(zhì)的實例為凡士林油、凡士林油加硅酮、羊毛脂以及油包水乳劑。對于通過吸入給藥，根據(jù)本發(fā)明使用的IFNa2多肽可方便地采用從使用合適的推進劑的加壓包裝或噴霧器的氣霧劑噴霧形式來遞送，所述推進劑例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加壓氣霧劑的情況中，可通過提供遞送測定量的閥來確定劑量單位?？膳渲朴糜谖肫骰虼等肫鞯娜缑髂z的膠囊和藥筒，其含有所述肽和合適的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽以及藥物組合物可特別用于靜脈內(nèi)給藥。用于給藥的組合物通常包括溶于藥學(xué)上可接受的載體、優(yōu)選水載體的改進的IFNa2多肽的溶液。多種水載體可^f吏用，例如緩沖鹽水等。這些溶液為無菌并通常無不合乎需要的物質(zhì)。所述組合物可通過傳統(tǒng)的公知的滅菌技術(shù)進行滅菌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易確定靜脈給藥的常用組合物。給藥量明確地為蛋白質(zhì)特異性并依賴于其效能和藥代動力學(xué)類型。用于制備可胃腸外給藥的組合物的實際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或?qū)λ麄儊碚f是顯而易見的，并較詳細(xì)描述于像Remington'sPharmaceuticalScience,第18版，MackPublishingCompany,Easton,PA，1990的出版物中。在治療性治療中，可進行含有本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的組合物或其雞尾酒形式(即具有其他蛋白質(zhì))的給藥。在治療性應(yīng)用中，將足夠治愈或至少部分阻止疾病的組合物給藥于患有MS、癌癥以及與IFNa2表達增加有關(guān)的疾病的患者。適于實現(xiàn)該目的的量被定義為"治療有效量"。該用途的有效量取決于疾病的嚴(yán)重性和患者健康的一般狀況。所述組合物的單次或多次給藥可根據(jù)患者所需和所能耐受的劑量和頻率而給藥。在任何情況下，所述組合物可提供足夠量的本發(fā)明的改進的IFNa2多肽以有效治療患者。通常，根據(jù)預(yù)期的給藥模式，藥學(xué)上可接受的組合物含有約1%至約99%(按重量)的本發(fā)明的改進的IFNa2多肽，以及99%-1°/。(按重量)的合適的藥物賦形劑或載體。優(yōu)選地，所述組合物具有約5°/。-75%(按重量)的本發(fā)明的改進的IFNa2多肽，其余是合適的藥物賦形劑或載體。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽或其藥學(xué)上可接受的組合物可以以治療有效量給藥，所述治療有效量根據(jù)下列多種因素而不同包括所應(yīng)用的具體的改進的IFNa2多肽的特異性活性；改進的IFNa2多肽的代謝穩(wěn)定性和作用時間；患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食；給藥模式和時間；分泌速率；藥物聯(lián)合；具體疾病狀況的嚴(yán)重性；以及經(jīng)受治療的宿主。通常，本發(fā)明的改進的IFNa2多肽每天的治療有效劑量為每次給予約O.l嗎至約1000jxg/kg體重，優(yōu)選，每次給予約0.5嗎至約100嗎/kg體重。例如，才艮據(jù)治療方案，對于70kg人的給藥，本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的劑量范圍為每次給予約10嗎至約100嗎。例如，如果本發(fā)明的改進的IFNa2多肽或含有所述多肽的制劑每天1至幾次給藥，那么較制劑每周、每月或更不頻繁給藥需要較低的劑量。預(yù)期以合適的劑量進行本發(fā)明的改進的IFNa2多肽的給藥。通常將劑量調(diào)整成處于或低于最大耐受劑量(MTD)。提示IFN毒性的體征記錄為血液學(xué)毒性，貧血、血小板減少、白細(xì)胞減少；胃腸毒性，腹瀉、消化不良、吞咽困難、N/V、腹痛；肝臟毒性，膽紅素、堿性磷酸酶以及LFT增加；腎臟和膀胱毒性，顯微鏡性血尿、膿尿、氮質(zhì)血癥、蛋白尿(proteinuria),急性腎功能衰竭、腎病綜合征、糖尿、蛋白尿(albuminuria);肺臟毒性，端坐呼吸、呼吸困難、支氣管痙攣、咳嗽、肺水腫、ARDS;心臟毒性，暈厥、MI、SVT、心動過緩、心動過速、眩暈、血壓過低、血壓過高。神經(jīng)毒性為思維混亂、震顫、麻木、感覺異常、肌收縮無力、嗜睡、幻覺、腦病、癲癇發(fā)作、昏迷、精神運動性阻滯、記憶障礙、口干燥、出汗、人格障礙、精神激動、神經(jīng)病理、抑郁、焦慮、失語、具有視力喪失的視網(wǎng)膜梗塞、目痛、偏盲、味覺改變、頭痛、暈厥、失眠。記錄了皮滲、蕁麻滲、表皮壞死、斑丘疹的皮膚毒性。代謝毒性表現(xiàn)為高血糖。另外，對于血凝固檢測到PT/PTT增加。另外，咽炎、脫發(fā)、疲勞、倦怠、食欲減退、體重減輕、發(fā)燒、寒戰(zhàn)、肌痛、關(guān)節(jié)痛、發(fā)紺為對IFN的潛在毒性反應(yīng)。治療適應(yīng)癥多發(fā)性硬化癥(TMS)兩種形式的IFN,IFNpia和IFN(31b，；故批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)-纟爰解型MS。IFN-P也用于治療生殖器疣。本發(fā)明的改進的IFNa2多肽可用于上述疾病、病癥或疾患，并且還可用于治療其他類型的MS,包括繼發(fā)-進展型MS、原發(fā)-進展型MS以及進展-復(fù)發(fā)型MS。對于"可用于"是指所述改進的IFNa2多肽對于治療疾病可用于治療疾病，例如預(yù)防疾病，或預(yù)防疾病進展至較嚴(yán)重的狀況，或緩解或減輕疾病癥狀或結(jié)果，例如MS。癌癥盡管在癌癥治療中的許多進展、可大大減小癌癥風(fēng)險的公知的生活方式改變以及某些癌癥提供的預(yù)警體征，但許多患者仍然發(fā)展癌癥，對于癌癥無提供治愈或顯著緩解的任何合理希望的常規(guī)治療可以使用。已知，IFNa2具有抗癌作用?；加型砥诎┌Y的患者可表現(xiàn)一種或多種下列的體征或癥狀存在癌性腫瘤、疲勞、疼痛、腫瘤負(fù)荷的體力狀態(tài)減少以及公知的與各具體癌癥相關(guān)的癥狀。為了實踐本發(fā)明，以足夠消除或至少緩解一種或多種體征或癥狀的量將IFNa2突變體給藥于表現(xiàn)一種或多種上述體征或癥狀的患者。肝炎病毒(HCV)感染目前治療HCV感染的療法具有某些缺點。涉及經(jīng)長期治療期每天(QD)、每隔一天(QOD)或每隔兩天(TIW)注射IFN-a的給藥方案具有一種或多種下列缺點(1)給藥方案令患者感到不適，且在某些情況下，導(dǎo)致患者順應(yīng)性減?。?2)給藥方案常與副作用有關(guān)，引起患者其他不適，且在某些情況下，導(dǎo)致患者順應(yīng)性減??；(3)給藥方案導(dǎo)致血清IFNa濃度的"峰(Cmax)"和"谷(Cmin)"，在"谷"期間，病毒可復(fù)制和/或感染其他細(xì)胞，和/或突變；(4)在許多情況下，在早期病毒反應(yīng)過程中病毒滴度的對數(shù)減少不足以影響最終導(dǎo)致病毒清除的持續(xù)的病毒反應(yīng)。本發(fā)明可對治療肝炎病毒感染的治療潛在性的進展具有顯著影響。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)IDDM的病因是討論得非常多的問題。似乎是多因素，包括遺傳傾向和環(huán)境影響。已經(jīng)鑒定了IDDM和由位于第6號染色體短臂的主要組織相容性復(fù)合物區(qū)編碼的特異性HLA之間的緊密聯(lián)系。主要的高危等位基因為DR3和DR4。被認(rèn)為重要的環(huán)境影響包括病毒，并且?guī)讞l證據(jù)支持該觀點。某些致糖尿病的或相關(guān)的病毒(腮腺炎病毒、麻滲病毒、風(fēng)滲腦心肌炎M病毒、柯薩奇病毒B以及rheovirus)在流行病學(xué)上與IDDM的發(fā)展有關(guān)并當(dāng)接種至嚙齒類動物時可引起糖尿病。致糖尿病病毒可直接感染培養(yǎng)的B細(xì)胞。另外，已從死于嚴(yán)重酮癥酸中毒的患有新發(fā)病的IDDM的男孩的胰腺分離了柯薩奇病毒B4,并且該病毒產(chǎn)生實驗動物的糖尿病以及受感染動物的B細(xì)胞的病毒抗原。IDDM患者的B細(xì)l包分泌aIFN,因此，本發(fā)明的拮抗劑IFNa2多肽可對IDDM的治療潛在性的進展具有顯著影響。紅斑狼齊(LE)LE是自身免疫性疾病，引起對不同機體組織和部分的炎癥和破壞，包括關(guān)節(jié)、腎臟、心臟、肺臟、腦、血管以及皮膚。LE的最常見的癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛或腫脹(關(guān)節(jié)炎)、發(fā)燒、疲勞延長或極度疲勞、皮滲和腎臟問題。盡管LE的病因尚未知，但認(rèn)為LE是由遺傳、環(huán)境以及可能的激素因素組合而引起。LE的特征為疾病或發(fā)作期以及好轉(zhuǎn)或緩解期。因此，LE的有效治療的目標(biāo)是預(yù)防發(fā)作、使器官破壞和并發(fā)癥最小化，以及維持正常的機體功能。LE的常用處方藥包括非類固醇類的抗炎癥藥物(NSAID)、樸熱息痛、皮質(zhì)類固醇類、抗瘧藥以及免疫調(diào)節(jié)藥。由于目前可用的藥劑的有限成功以及它們的潛在嚴(yán)重副作用，提供對于LE的可選有效治療是重要的。本發(fā)明的組合物可有效最小化和/或消除LE患者的各種癥狀?，F(xiàn)在已經(jīng)大體描述了本發(fā)明，通過參考下列實施例將更容易理解本發(fā)明，所述實施例通過舉例說明的方式而提供，且非意于限制本發(fā)明。實施例方法(i)定點誘變.如先前所述(Piehler,J.和Schreiber，G1999,J.MoLBiol294，223-237),通過使用高保真聚合酶pwo(BoehringerMannheim)和pfu(Stratagene)使用含有突變密碼子的18-21核苷酸引物進行表達質(zhì)粒pT72Ca2的PCR擴增。在磷酸化和連接之后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1細(xì)胞中。通過DNA測序鑒定含有突變的整個表達基因的序列。(ii)蛋白表達和純化.如先前所述(Piehler，J.和Schreiber，G.1999，J.Mol.Biol289,57-67)，在大腸桿菌中表達IFNa2和IFNAR2-EC并通過離子交換和尺寸排除色語法純化。從280nm的吸光度檢測蛋白濃度，對于IFNa2，s280=18070Cm.'M"，對于IFNAR2-EC,s28o=26500Cm"M-1。如先前所述(Arduini，R.M.等，1999，ProteinScience8,1867-1877)在Sf9昆蟲細(xì)胞中表達IFNAR1-EC并純化。通過SDS-PAGE在非還原條件下分析蛋白純度。如先前所述(Piehler，J.和Schreiber,G.1999，J.Mol.Biol.289，57-67),通過IFNAR2-EC的分析凝膠過濾測定所有突變體的活性IFNa2蛋白的濃度。對于配體結(jié)合研究，使用馬來酰亞胺化學(xué)作用來位點特異性標(biāo)記IFNa2和IFNP。通過在HBS中溫育2倍摩爾多的OregonGreen488(OG488)馬來酰亞胺(MolecularProbes),直接在其自由半胱氨酸殘基C17標(biāo)記IFNP。在摻入其他半胱氨酸殘基(突變S136C)之后4吏用OG488標(biāo)記IFNa2,所述其他半胱氨酸殘基顯示不影響與IFNAR1-EC或IFNAR2-EC的相互作用(Gavutis等，2005,BiophysicalJournal88(6):4289-4302).(iii)IFNa2-YNS突變體的生長和重折疊.在750ml燒并瓦中培養(yǎng)大腸桿菌。將該細(xì)菌離心，使用30ml裂解緩沖液重懸浮，并進行細(xì)菌學(xué)聲處理5次，每次30秒。在16,000rpm離心30分鐘之后，將沉淀物(包涵體)重懸于30mltriton洗液(0.5%triton,50mMTris8以及100mMNaCl)中。在25，000g(于ss34sorval中14，500rpm)離心包涵體,并洗滌4-5次。將純化的包涵體于4。C輕攪拌下溶解于5ml的6M胍中約12小時。在25000g離心20分鐘之后，保留上清液，并去除沉淀物。對于重折疊，使用pH9.3的0.8M精氨酸以l:20稀釋上清液，于渦旋振蕩器上緩慢輕柔攪拌，并在20。C震蕩2小時。在16，000rpm離心20分鐘之后，使用Tris7.4透析，通過離子交換色鐠法純化蛋白，獲得~5mg/L的純蛋白。(iv)結(jié)合親和力的檢測.通過反射計量千擾光譜法(RIfS)在流通條件下檢測重組IFNAR1-EC和IFNa2之間的相互作用(Schmitt,H.M.等，1997,Biosens.和Bioelectron.12，809-816)。該方法在界面上將生物分子相互作用作為在薄二氧化硅層的明顯光學(xué)厚度的變化進行4僉測。將與表面的結(jié)合作為干擾光譜的變化來檢觀'J。表面上lpm的變化對應(yīng)于約lpg/mm2蛋白。應(yīng)用于實時結(jié)合檢測的另一種方法為通過使用ProteON(Biorad)的SPR(表面等離振子共振)。所有檢測均使用HBS(20mMHEPESpH7.5,150nMNaCl以及0.01%TritonX100)作用電泳緩沖液進行。IFNAR1受體亞單位與芯片表面的結(jié)合通過兩種方法進行。在一種方法中，非中和性抗IFNAR1-ECmAbDB2通過氨基酸偶聯(lián)化學(xué)作用經(jīng)其暴露的氨基偶聯(lián)至(氨基官能化葡聚糖AMD500)表面。IFNAR1-EC被親和捕獲至表面，之后與第二mAbAA3交聯(lián)。在另一種方法中，IFNAR1的His標(biāo)記尾直接與芯片的NTA表面連接。用于檢測IFN-IFNAR2-EC相互作用的方法的詳細(xì)描述可見于(Piehler,J.和Schreiber，G.2001,Anal.Biochem.289,173-186)。對于弱結(jié)合，解離常數(shù)KD的確定從針對蛋白濃度標(biāo)繪并根據(jù)質(zhì)量作用定律確定的平衡反應(yīng)獲得。對于較緊密的結(jié)合相互作用，從比值k解g(k。ff)/k結(jié)合(k。n)=10)測定動力學(xué)速率常數(shù)并直接從平衡反應(yīng)計算親和力。(v)抗病毒保護活性測定.將野生型和IFNa2變體的抗病毒活性作為抑制水泡性口膜炎病毒(VSV)對人類WISH細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)的作用進行測定(Evinger,M.等，1981，Arch.Biochem.Biophys.210，319-329)。將IFNci2突變體的相對活性作為與50%保護所需的野生型IFNa2的濃度相比50%細(xì)胞保護所需的濃度來4企測。(vi)抗增殖測定.如先前所述(Piehler，J.等，2000，J.Biol.Chem.275:40425-40433),測定IFNa2對DaudiBurkitt淋巴細(xì)胞的抗增殖活性。使用IFN處理細(xì)胞60小時。然后基于四唑鹽XTT分解為甲月替的色度檢測使用細(xì)胞染色試劑盒(BiologicalIndustriesCo，Israel)測定活細(xì)胞的數(shù)量。通過將不同濃度IFN添加至生長培養(yǎng)基實施對WISH細(xì)胞的抗增殖測定，在通過龍膽紫染色72小時之后檢測細(xì)胞密度。(vii)誤差.于RIfS上才企測的IFNa2-IFNAR2結(jié)合的Ko的誤差(c7)為20%，相對親和力(wt/mut)為30%。對于IFNa2-IFNAR1,Ko的誤差(cj)為35%，相對親和力(wt/mut)為50%。使用2cj(95%置信度)作為基礎(chǔ)置信水平，這表明2倍變化的最小值可看作是顯著的。各生物活性檢測值(不管是抗病毒或抗增殖)的誤差(cr)大小為35%。因此，兩個檢測值之間的2cj置信水平表明小于2倍的差異在實驗誤差范圍內(nèi)。(viii)斑點寡核苦酸微陣列實驗.含有幾乎19,000個不同探針(Compugen人類寡核苷酸組)的聚L賴氨酸包被的玻璃微陣列購自CAG(CenterforAppliedGenomics,NewJersey)。4吏用包4舌青色素(Cy)3或Cy5標(biāo)記的cDNA探尋表示IFN處理與未處理(對照)比較的微陣列。使用不同IFN處理WISH細(xì)胞16小時，并提取它們的認(rèn)A(RNeasyMidikit,Qiagen),使用于核苷酸混合物中aa-dUTP與dTTP以4:1比值混合的氨烷基修飾的dUTP核苦酸將其中100嗎RNA經(jīng)受逆轉(zhuǎn)錄(M-MLVH-點突變體RT酶，Promega)。使用結(jié)合aa-dUTP的NHS激活的Cy3或Cy5熒光探針(Amersham)標(biāo)記產(chǎn)生的cDNA。評價摻入(NanoDrop分光光度計)，并以100|il目標(biāo)體積將標(biāo)記的cDNA與等量的熒光染料(各自100pmol)混合(使用一種顏色處理并使用另一種顏色作為對照)于最終的2XSSC,0.08%SDS和6jil封閉液(Amersham),在95。C退火3分鐘，冷卻并在凸起的蓋玻片(LifterSlip,ErieScientificCompany)和微陣列之間應(yīng)用。于暗處中55。C進行雜交12小時。之后，于55。C在2XSSC,0.5%SDS中洗滌玻片5分鐘，于室溫在0.5XSSC中洗滌5分鐘，最后于室溫在0.05XSSC中洗滌5分鐘。然后，通過在1000rpm旋轉(zhuǎn)3分鐘干燥，并于暗處儲存直至掃描。(ix)微陣列圖像和數(shù)據(jù)分析.使用DNA微陣列掃描儀(Agilent)進行雜交微陣列掃描。使用SpotReader(NilesScientific)軟件進行自動斑點檢測、本底扣除和強度定量。使用GeneSpring(SiliconGenetics)軟件進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、過濾和聚類分析。所述分析基于對各斑點的處理與對照的比值，并包括諸如相對于本底(噪音)的SpotReader輸出標(biāo)志的數(shù)據(jù)過濾(信號性質(zhì)的指示)的操作。通過兩個染料交換微陣列重復(fù)表示各處理(條件)。通過在至少兩個條件中超過1.7閾值的基因整合起始系列的調(diào)節(jié)IFN的基因，其僅耐受一個"缺乏"("A")標(biāo)志，提示在每個基因的所有條件中的"噪音"斑點。在了解于超過一個IFN處理中觀察到真實的上調(diào)或下調(diào)之后選擇該標(biāo)準(zhǔn)，因此，選擇兩個條件作為最小值，低嚴(yán)謹(jǐn)閾值有必要包括以較低水平修飾的ISG。將這些基因的系列輸出成Excel工作表，并含有平均處理與對照的比值、復(fù)制值、t檢驗p值，t檢驗p值是基于復(fù)制物和標(biāo)志密碼子之間的距離對于微陣列技術(shù)誤差的估計值。然后，通過比較各對復(fù)制物之間以及條件之間的距離，并觀察p值和"A"標(biāo)志的存在，肉眼掃描基因的顯著性差異。因為每個條件產(chǎn)生的低量復(fù)制物的較大噪音，統(tǒng)計選擇使得上調(diào)/下調(diào)清楚顯現(xiàn)，該費事的分析是必需的。認(rèn)為超過1.7閾值的平均值不是真正的調(diào)節(jié)，而是技術(shù)噪音，并且因此將該基因從該系列排除，所述平均值具有其復(fù)制物之一在該闊值以下，或相對于平均值具有較大的復(fù)制物之間距離，以及無其他條件具有相似和顯著水平。最后一列包括395個基因，在處理16小時被IFN上調(diào)或下調(diào)。在將該系列輸入回GeneSpring之后對其進行聚類分析。實施例1使用光學(xué)生物傳感器系統(tǒng)對IFNa2-IFNARl-EC相互作用進行表征使用RIfS通過無標(biāo)記固相檢測研究IFNAR1-EC與IFNa2的相互作用。該技術(shù)需要相互作用的化合物之一固定于芯片表面。使用了先前成功應(yīng)用于IFNAR2-EC的方法，其中使用自身經(jīng)由氨基偶聯(lián)固定于表面的mAb固定受體(Piehler,J.和Schreiber，G.2001,Anal.Biochem.289,173-186)。將非中和的抗IFNARl-ECmAbDB2經(jīng)其暴露的氨基偶聯(lián)至氨基官能化的葡聚糖AMD500表面。IFNAR1-EC在與第二mAbAA3交聯(lián)之后被親和捕獲至mAb表面。如下實時RIfS中的過程示于圖1A。通過以0.12to4(_iM范圍的濃度注射IFNa2蛋白來檢測IFNARl-EC與RIfS表面的結(jié)合活性。由于IFNa2與IFNARl-EC的低結(jié)合親和力，不能檢測到結(jié)合和解離的動力學(xué)數(shù)據(jù)。因此，通過根據(jù)質(zhì)量作用定律標(biāo)繪穩(wěn)定態(tài)反應(yīng)與蛋白濃度檢測結(jié)合親和力。這導(dǎo)致野生型IFNa2的親和力常數(shù)為1.5pM(Lamken,P.等，2004，JMolBiol341，303-318)。實施例2制作IFNa2對于IFNAR1的結(jié)合位點的圖譜為了對IFNa2上IFNAR1的結(jié)合位點進行定位，進行了位于B和C螺旋上的大多數(shù)殘基的Ala掃描(圖2和3)。共產(chǎn)生了21個單點突變，通過RIffi或ProteON4企測它們對IFNAR2和IFNAR1的結(jié)合親和力。由于突變位于IFNa2上的IFNAR2結(jié)合位點相對表面，不同突變體蛋白對IFNAR2的結(jié)合親和力與野生型IFNa2對IFNAR2的結(jié)合親和力非常相似(表l)。這是令人確信的，因為它證實了所有突變體蛋白的合適折疊及它們的活性濃度。盡管IFNa2與IFNAR2-EC的結(jié)合提供了明確的動力學(xué)信號，其對IFNAR1-EC的結(jié)合較弱，并不得不通過變化配體的濃度根據(jù)穩(wěn)定態(tài)親和力的折射單位(RU)信號進行分析。在該情況下，所有IFNa2蛋白的正確和精確的濃度的知識是必需的。因此，對于所有突變體蛋白濃度在分析性凝膠過濾柱上通過其結(jié)合IFNAR2-EC的能力進行了證實。所有結(jié)合檢測結(jié)果總結(jié)于表1和3以及圖3A.。三種單突變(H57A、E58A、Q61A)引起結(jié)合的增加，而6種突變(F64A、N65A、T69A、L80A、Y85A、Y89A)引起結(jié)合減少。然而，沒有鑒定到結(jié)合的熱點，因此沒有突變導(dǎo)致親和力超過5倍的變化。為了確證單突變作用，制備了含有單突變L80A,Y85A，Y89A的三突變體(本文稱為LYY)以及四突變N65A，L80A，Y85A，Y89A(SEQIDNO:6)(本文稱為NLYY)。這兩種突變體蛋白的結(jié)合低于檢測的閾值。表1:突變體IFNa2(B和C螺旋以及C-D環(huán))與IFNAR2-EC和IFNAR1-EC的相互作用的熱力學(xué)和動力學(xué)常數(shù)<image>imageseeoriginaldocumentpage39</image>y=Ao+A/(l+(c/c50)s)[方程l]其中y是與細(xì)胞數(shù)量有關(guān)的透射率，Ao是偏移，A是變幅，c是濃度，C50是給出50%活性的濃度，s是斜率。促進50%抗病毒保護的IFNa2和IFN卩的平均濃度分別為0.85和0.43pM(平均經(jīng)6次實驗)。促進50%抗增殖活性的IFNa2和IFNP的平均濃度為1360和29pM(分別平均經(jīng)17和7次實驗)。有趣的是，促進Daudi細(xì)胞中50%抗增殖活性的IFNa2濃度僅0.5pM(表2),這低于對WISH細(xì)胞所檢測的1000倍，證明使用相同細(xì)胞系進行所有實驗的重要性。對于所有IFN突變體蛋白的抗病毒和抗增殖活性相對于野生型IFNa2(野生型/突變體)的抗病毒和抗增殖活性進行了檢測，結(jié)果總結(jié)于表2和4中。如從對于IFNAR1-EC的結(jié)合親和力可見到的，抗病毒和抗增殖活性不顯著改變突變。引起抗病毒活性顯著減小(>2倍)的唯一突變體為E58A。L80A、Y85A以及Y89A引起抗病毒活性顯著減小(但無一超過6倍)。然而，LYY和NLYY突變體組合分別減小抗病毒效能30和100倍。該減小大致符合單突變的累加效應(yīng)(對于LYY,0.5x0.26x0.20=0.029,與三突變體所獲得的結(jié)果相似)。對相同組的突變體的抗增殖活性的作用較顯著，E58A和Q61A均引起活性顯著增加，而N65A、T69A、L80A、Y85A以及Y89A引起活性顯著減小。另外，在使用WISH細(xì)胞的抗增殖測定中檢測的活性減小的程度顯著大于對于抗病毒保護所檢測的。多重的LYY和NLYY突變體分別減小活性190和1100倍。在該情況下，單突變過高估計了對于多重突變體檢測的作用約30倍(對于LYY,0.14x0.035x0.044=0.00022,實驗檢測值0.0057;對于NLYY,0.16x0.14x0.035x0.044=0.000035，實驗檢測值0.00092)。對于所有突變體的抗病毒和抗增殖分析結(jié)果繪于圖5A。方便起見，我們還添加了IFN(3的檢測值。從該曲線圖可看出對特異性IFNa2突變體的抗增殖反應(yīng)較抗病毒反應(yīng)更為敏感。另夕卜，該傾向符合IFN(3的數(shù)據(jù)，IFN(3的抗病毒活性比IFNa2的抗病毒活性高約2倍(與E58A突變體的抗病毒活性相似)，而其抗增殖活性高50倍。將生物活性與所檢測的對于IFNAR1的結(jié)合親和力進行比較，顯示兩種活性均大致與結(jié)合親和力成比例，但不超過整體比例(圖5B)。表2:IFNa2突變體的生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>a斜率來自方程1。實施例4與IFNa2相比HEQ增強三元復(fù)合物的穩(wěn)定性由于發(fā)現(xiàn)Ala的三種突變可增加結(jié)合2至4倍，將這三種IFNa2突變(H57A、E58A、Q61A)組合成單個IFNa2突變體蛋白，如本文所使用，稱為HEQ(SEQIDNO:5)。通過總體內(nèi)反射熒光光譜法(TIRFS)研究IFN與I型干擾素受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(IFNAR1-EC)的結(jié)合以及與包括IFNAR1-EC和IFNAR2-EC的三元復(fù)合物的結(jié)合。IFNAR2-EC和IFNARl-EC通過它們的C末端組氨酸標(biāo)簽連接至固體支持的脂質(zhì)雙層上。通過TIRFS檢測的野生型IFNa2、HEQ以及IFN|3自IFNARl-EC的解離動力學(xué)在圖1C中進行比較。觀察到與IFNa2相比，HEQ的復(fù)合物壽命增加20倍，并觀察到IFN卩的相似解離動力學(xué)(表3)。相比之下，對于所有這三種均獲得了非常相似的解離速率常數(shù)。從這些數(shù)據(jù)，確定了HEQ/IFNAR1-EC復(fù)合物的平衡解離常數(shù)〖0=83nM，YNS/IFNAR1-EC復(fù)合物的KD=33nM,野生型IFNa2/IFNARl-EC復(fù)合物的KD=1.6jiM,IFN卩/IFNARl-EC復(fù)合物的KD=66nM。HEQ與IFNAR2-EC的結(jié)合親和力與對野生型IFNa2(5nM)所檢測的相似，比IFN(3與IFNAR2-EC的結(jié)合親和力弱約10倍(表3)。因此，僅HEQ對于IFNAR1的親和力與IFN卩的相似，但對于IFNAR1的親和力與IFN(3的不相似。IFN通過以1:1:1化學(xué)計量形成三元復(fù)合物(IFNAR1-IFN-IFNAR2)請導(dǎo)生物活性。因為協(xié)同結(jié)合兩個結(jié)合表面的受體亞單位，明顯的配體結(jié)合親和力較僅結(jié)合IFNAR2的結(jié)合力高，并且依賴于相對和絕對的受體表面濃度(Lamken，P.等，2004,JMolBiol341,303-318)。三元復(fù)合物通過增加對于IFNAR1的親和力而穩(wěn)定性增加可通過配體解離動力學(xué)來探尋。因此，IDNO:2)、HEQ(SEQIDNO:5)、YNS(SEQIDNO:11)、a8尾(SEQIDNO:7)以及IFN卩(SEQIDNO:3)的解離。對于IFN|3,使用I47A突變體4t測對于IFNAR2的作用，其以5nM親和力結(jié)合IFN(3,類似于IFNa2與野生型IFNAR2的親和力(表3)。這僅比較了IFNAR1表面濃度對配體解離的作用。而對于IFNa2,解離動力學(xué)顯著依賴于受體表面濃度，觀察到IFN(3和HEQ的上面的解離曲線。這明確證明了與FN(3和HEQ形成的三元復(fù)合物的較高穩(wěn)定性。即使在最高的受體濃度(大于1000受體/細(xì)胞的細(xì)胞受體濃度)，也觀察到野生型IFNa2的解離較最低受體濃度的IFNP和HEQ的解離快。然而，如果受體表面濃度進一步增加，最終野生型IFNa2以與IFN(3或HEQ可比的速率解離。三元復(fù)合物的穩(wěn)定性為表面受體濃度和對各受體的結(jié)合親和力的組合函數(shù)。假定三元復(fù)合物的穩(wěn)定性與生物活性有關(guān)，那么較緊密結(jié)合的IFN的差異活性可天然(像在Daudi細(xì)胞中)或由于轉(zhuǎn)染而隱含在具有高受體數(shù)量的細(xì)胞內(nèi)并不令人驚訝。這還凸顯了通常被忽視的問題，即以非天然水平使用細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的危險性。表3:野生型IFNa2、IFNP以及IFNa2突變體與IFNAR1-EC和IFNAR2-EC的相互作用的速率常數(shù)和親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>1使用OregonGreen488馬來酰亞胺進行位點特異性標(biāo)記的突變體S136C'使用OregonGreen488馬來酰亞胺在自由C17殘基位點進行位點特異性標(biāo)記的:與IFNAR2-ECI47A相互作用實施例5IFNa2突變體HEQ、MDL、a8尾以及YNS的抗病毒和抗增殖活性已經(jīng)注意到與IFNa2相比IFN(3對WISH細(xì)胞的抗病毒效能僅高2倍，而其抗增殖活性高約50倍。圖4B-4C顯示了野生型IFNa2、HEQ(SEQIDNO:5)以及IFN卩的抗病毒和抗增殖活性。在該測定中，HEQ的活性譜與IFNP的活性譜具有可比性。盡管HEQ對IFNAR1的結(jié)合親和力大大增加，但其抗病毒效能比野生型IFNa2的抗病毒效能僅高2倍。其抗增殖活性增加25倍，相比之下，IFN(3的抗增殖活性增加42倍(表4)。相同的傾向?qū)τ贛DL(SEQIDNO:10)和YNS(SEQIDNO:11)也是真實的。而它們的抗病毒活性大致是IFNa2的抗病毒活性，它們的抗病毒活性較高。MDL表現(xiàn)與IFNp相同的活性水平，而YNS表現(xiàn)甚至更高的抗增殖活性水平。抗增殖活性增加與這兩種IFN對IFNAR1的親和力增加是一致的。如先前所注意到的，與IFNa2相比IFN(3似乎能更快速阻止生長。因此，應(yīng)用高濃度IFN之后的細(xì)胞計數(shù)比應(yīng)用IFN卩之后的細(xì)胞計數(shù)小。該現(xiàn)象不能通過使用較高濃度的IFNa2而補償，而是性質(zhì)上的差異(圖4B)。在該方面，HEQ和YNS象野生型IFNa2—樣起作用，但與IFN(3不同。HEQ的滴定曲線斜率(與依賴濃度的起始有關(guān))在野生型IFNa2和IFN卩兩者之間。表4:野生型IFNa2、突變體以及IFNp的相對生物活性<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實施例6使用基因芯片技術(shù)監(jiān)測基因活性基因芯片已經(jīng)成為獲得差異基因活性的完整信息的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。確實，已經(jīng)進行了許多研究來探究IFN誘導(dǎo)時的基因表達模式(deVeer，M.J.等，2001，JLeukocBiol.69，912-920)。通過斑點寡核苷酸微陣列實驗監(jiān)測IFN對基因表達的作用。使用0.3nMIFNa2、3nM(10,000單位)IFNa2;0.3nMHEQ以及0.15nMIFN卩(1,000單位)處理WISH細(xì)胞16小時。選擇WISH細(xì)胞中產(chǎn)生>90%抗增殖反應(yīng)(3nM野生型IFNa2、HEQ以及IFNp)或低于10%抗增殖反應(yīng)(0.3nM野生型IFNa2)的濃度。在各條件下，在染色交換微陣列重復(fù)中進行IFN處理與未處理比較的實驗。另外，包括未處理與與未處理比較的的四重復(fù)的微陣列實驗用作另外的對照。兩種顏色之間的標(biāo)準(zhǔn)化比值作為誘導(dǎo)水平。用于確定IFN的調(diào)節(jié)基因系列的選擇標(biāo)準(zhǔn)描述于方法部分?；蛐酒Y(jié)果可基于每個基因的基礎(chǔ)進行分析，或觀察基因誘導(dǎo)的一般傾向。圖6給出了使用IFN卩(0.15nM)、HEQ以及野生型IFNa2(分別0.3nM和3nM)處理后16小時對于395個調(diào)節(jié)IFN的基因的表達水平變化所記錄的傾向概況。在圖6A中，根據(jù)倍數(shù)變化以升序標(biāo)繪395個基因的相對(與未處理的比較)表達水平。黑色斑點為對照芯片，其含有于兩個顏色通道上僅未處理的樣品的混合物。這提供了預(yù)期的隨機變異的估計值。所記錄的對照芯片的表達水平的最小和最大變化為0.65-1.6倍，最多95%的基因的兩個通道之間的比值僅0.75-1.4倍。基因表達的低水平隨機變異提供了數(shù)據(jù)性質(zhì)的高置信度。通常，IFN卩(0.15nM)和HEQ(0.3nM)的基因表達水平相似(圖6A)，而對于野生型IFNa2(0.3nM)記錄了較低的誘導(dǎo)水平。添加3nM野生型IFNa2時的基因誘導(dǎo)在所記錄的野生型IFNa2(0.3nM)和IFN卩(0.15nM)或HEQ(0.3nM)的水平之間。分析差異表達水平的可選方法是標(biāo)繪不同處理之間基因活性的變化比值(圖6B)。由于IFN(3誘導(dǎo)最大變化，相對于IFN|3誘導(dǎo)計算了所有其他數(shù)值。對照與圖6A中的相同。另夕卜，IFN卩和HEQ似乎誘導(dǎo)了所有基因的相同水平的變化(綠色線在作為對照的黑色線之后)。這意味著當(dāng)使用IFN卩誘導(dǎo)時與HEQ相比單基因作用并非顯著不同。這個驚人的結(jié)果表明這兩種IFN如此相似。發(fā)現(xiàn)IFN(3和野生型IFNa2(0.3nM)之間的最大差異表達。另外，野生型IFNa2(3nM)的結(jié)果在所記錄的野生型IFNa2(0.3nM)和HEQ的結(jié)果之間。對四種處理進行的IFN誘導(dǎo)的基因的聚類分析給出圖6A和6B中圖示的結(jié)果的獨立證實。圖6C顯示了IFN卩和HEQ聚集一起的基因表達才莫式，它們之間具有非常短的距離。使用3nM野生型IFNa2聚類處理的細(xì)胞的表達次之，而0.3nM野生型IFNa2的基因表達更遠(yuǎn)。基因表達模式與觀察到的INFp和IFNa2之間的差異生物活性極其一致，并且還表明HEQ是具有IFN(3的所有特征的IFNa2?；蛐酒峁┝税ɑ蚪M的各基因的表達水平的詳細(xì)信息。分析IFN卩與野生型IFNa2相比的基因表達模式的最令人感興趣的方面之一是研究差異活性，以及差異活性和IFN濃度之間的關(guān)系(Der,S.D.等，1998,ProcNatlAcadSdUSA95，15623-15628)。從395個被誘導(dǎo)的基因中，根據(jù)不同處理之間它們的差異活性水平選擇59個上調(diào)的基因和9個下調(diào)的基因(Jaitin等，2006，MolCellBiol26(5):1888-1897,表3)。IFN卩和HEQ(SEQIDNO:5)對大多數(shù)基因表達的作用比IFNa2以同等抗病毒活性濃度(即分別0.15和0.3nM)誘導(dǎo)的作用強得多，所述基因包括許多未受0.3nM濃度的IFNa2影響的基因。實施例7MDA231肺瘤預(yù)防模型為了建立皮下(s.c.)腫瘤，將MDA231細(xì)胞體外培養(yǎng)至70%匯合，使用胰蛋白酶消化，并以1()S個細(xì)胞/ml的濃度懸浮于PBS,并將107個細(xì)胞皮下注射至^^果鼠的脅腹。然后將小鼠隨機分配成3個處理組，每組6只。處理方案從第1天開始，并持續(xù)至第34天。對小鼠使用PBS皮下注射或使用特定處理l周兩次，共34天。在處理34天后，處死小鼠，切除腫瘤并測定腫瘤大小。結(jié)果總結(jié)于表5中。結(jié)果明確表明與組織培養(yǎng)實驗一致，YNS在體內(nèi)非常有效地抑制了MDA231乳腺癌細(xì)胞的生長。在使用YNS處理34天后，所有^f吏用YNS處理的小鼠的肺塊清除，而5/6的IFNa2處理的小鼠和所有6只PBS處理的小鼠具有不同大小的腫塊。表5:MDA231腫瘤預(yù)防模型的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實施例8:實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，也稱為實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎，是多發(fā)性硬化癥(MS)的動物模型。各種EAE模型為本領(lǐng)域中已知，其依賴于誘導(dǎo)方法、動物品系以及用于誘導(dǎo)該疾病的抗原。EAE是急性或慢性復(fù)發(fā)獲得性炎癥和脫髓鞘自身免疫性疾病。不同形式的EAE與各種形式和時期的MS非常相似。在目前研究中，通過注射髓磷脂堿蛋(MBP)誘導(dǎo)EAE,這是一種已知建立急性期MS模型的方法。在該模型中，通過誘導(dǎo)后約IO天出現(xiàn)臨床癥狀觀察到疾病的發(fā)病。在疾病誘導(dǎo)后約第15天觀察到疾病進展和臨床評分增加，并在疾病誘導(dǎo)后約第23天觀察到自發(fā)恢復(fù)。給雌性Lewis大鼠(平均體重130-180g，Harlan,Israel)的后爪皮下注射于0.1ml完全福氏佐劑(Difco)中乳化的25嗎純化的豚鼠髓磷脂堿蛋白(MBP，Sigma)。根據(jù)12小時光亮/12小時黑暗方案，在22。C的恒溫下維持這些動物，使其隨意攝入食物和水。從誘導(dǎo)后第8天開始，每天隨訪這些動物。結(jié)果記錄為臨床評分O分表示無臨床體征的正常動物，0.5分表示尾巴末梢部分喪失張力，1分表示整個尾巴癱瘓，1.5分表示一條后腿無力，2分表示兩條后腿無力，2.5分表示一條前腿無力，3分表示四條腿均癱瘓，4分表示身體完全癱瘓和瀕死狀態(tài)，5分表示死亡。在疾病發(fā)病后15天，記錄動物的臨床評分，直至誘導(dǎo)后研究的25天結(jié)束，在該期間計算曲線下面積(AUC)。從疾病發(fā)病開始連續(xù)3天，使用HEQ(SEQIDNO:5)、YNS(SEQIDNO:ll)或載體對照處理可臨床評分為0.5和1之間的表現(xiàn)疾病臨床癥狀的動物(在疾病誘導(dǎo)后的第9-11天)。評價幾條給藥途徑，例如以5ml/kg的體積劑量靜脈內(nèi)(于載體中)或通過強飼口服(于載體中)給藥。在研究(約第25天)的最后一天，使用戊巴比妥鈉100mg/kg腹膜內(nèi)注射對動物實施安樂死。結(jié)果表示為平均值士SEM,并通過方差分析(ANOVA)然后通過杜凱氏事后檢驗(Tukey'sposthoctest)分析處理組之間的差異。認(rèn)為p<0.05的值是統(tǒng)計學(xué)上顯著的，在相關(guān)處理組數(shù)字上標(biāo)記星號。使用甲潑尼龍作為陽性對照建立模型的有效性。當(dāng)通過MBP注射誘導(dǎo)疾病那天開始以30mg/kg靜脈內(nèi)進行連續(xù)5天的類固醇給藥時，記錄了AUC減小34%。實施例9系統(tǒng)性紅斑狼瘉(SLE)的動物模型雌性(NZBXNZW)w雜種小鼠(下文稱為"NZB/W"小鼠)自發(fā)發(fā)展狼瘡樣疾病，其特征是存在雙鏈DNA(dsDNA)的血清自身抗體。最終經(jīng)歷完全腎臟衰竭的這些小鼠，常用作旨在更好理解和治療人類狼瘡的實驗?zāi)Ｐ?。NZB/W小鼠的該疾病隨時間進展為腎臟功能障礙，表現(xiàn)為出現(xiàn)蛋白尿。32周齡的雌性NZB/W小鼠用于實驗中以確定NLYY(SEQIDNO:6)是否能延遲狼癡樣疾病的發(fā)展。將這些小鼠分成兩組，每隔1天使用NLYY(10只小鼠的組)或作為對照的大鼠IgG(10只小鼠的組)通過腹膜內(nèi)注射給藥對各組進行處理。處理持續(xù)5周，并且每周評定小鼠蛋白尿的存在。先前對于具體實施方案的說明完全公開了本發(fā)明的一般性質(zhì)，對此其他人在無不適當(dāng)?shù)膶嶒灪筒槐畴x一般概念的情況下可通過應(yīng)用當(dāng)前的信息容易地修改和/或改變所述具體實施方案以用于不同應(yīng)用，且因此，所述改變和修改應(yīng)該并意于包括在所公開的實施方案的等同物的含義和范圍內(nèi)。盡管已經(jīng)結(jié)合其具體實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該清楚許多替代、修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，意于包括落在附屬權(quán)利要求精神和寬范圍內(nèi)的所有所述替代、修改和變化。應(yīng)理解表明本發(fā)明優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明和具體實施例僅通過舉例說明的方式給出，這是因為從所述詳細(xì)說明來看，本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。權(quán)利要求1.一種重組的干擾素α2(IFNα2)多肽及其活性片段、類似物、衍生物以及變體，所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氨基酸取代、C末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基酸取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNα2(SEQIDNO2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括選自H57A(SEQIDNO:24)、E58A(SEQIDNO:25)、Q61A(SEQIDNO:26)、H57Y(SEQIDNO:27)、E58N(SEQIDNO:28)、Q61S(SEQIDNO:29)及其組合的至少一種突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體H57A,E58A,Q61A(SEQIDNO:5),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。4.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括四突變體N65A，L80A,Y85A,Y89A(SEQIDNO:6),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有拮抗活性。5.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代(SEQIDNO:7),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。6.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體H57A,E58A,Q61A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取代的組合(SEQIDNO:8),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。7.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括四突變體N65A,L80A,Y85A,Y89A和C末端ESLRSKE至KRLKSKE的取d義的組合(SEQIDNO:9),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有拮抗活性。8.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體H57M,E58D,Q61L(SEQIDNO:10)，其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。9.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體H57Y,E58N,Q61S(SEQIDNO:11),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。10.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體NO:12)，其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。11.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包括三突變體NO:13),其與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性活性。12.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽被進一步與PEG偶聯(lián)。13.—種編碼多肽的DNA分子，所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氛基酸取代、c末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基酸取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。14.根據(jù)權(quán)利要求13的DNA分子，其中所述DNA分子包括選自SEQIDNO:15-23和SEQIDNO:30-35的序列。15.—種包括根據(jù)權(quán)利要求13-14任一項的DNA分子的載體，所述載體與一個或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可操作地連接。16.—種包括權(quán)利要求15的載體的宿主細(xì)胞。17.—種藥物組合物，其包括作為活性成分的重組的干擾素a2(IFNa2)多肽及其活性片段、類似物、衍生物以及變體，且包括藥學(xué)上可接受的載體，所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氨基酸取代、C末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基酸取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。18.根據(jù)權(quán)利要求17的藥物組合物，其包括具有SEQIDNO:5-13和SEQIDNO:24-29任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片段、類似物、衍生物以及變體。19.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其包括具有SEQIDNO:5、7、8、10、11、12以及13任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片段、類似物、衍生物以及變體，其中所述多肽具有提高的特異性激動活性。20.根據(jù)權(quán)利要求18的藥物組合物，其包括具有SEQIDNO:6和9任一者的重組干擾素a2(IFNa2)多肽及其片l殳、類似物、書f生物以及變體，其中所述多肽具有提高的特異性拮抗活性。21.所述方法包括為需要其的受治療者施用治療有效量的權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述疾病或病癥選自癌癥、自身免疫性疾病和感染性疾病。22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述癌癥選自毛細(xì)胞性白血病、卡波濟氏肉瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性髓細(xì)胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤和黑素瘤。23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述自身免疫性疾病是多發(fā)性硬化癥(MS)。24.才艮據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述MS選自復(fù)發(fā)-緩解型MS、繼發(fā)-進展型MS、原發(fā)-進展型MS以及進展-復(fù)發(fā)型MS。25.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述感染性疾病為肝炎病毒感染。26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中所述肝炎病毒感染選自曱型肝炎、乙型肝炎以及丙型肝炎。27.—種用于治療或預(yù)防與IFNa2表達增加有關(guān)的疾病的方法，其包括為需要其的受治療者施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求20的藥物組合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)。29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述疾病為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。30.—種重組的干擾素a2(IFNa2)多肽及其活性片段、類似物、衍生物以及變體用于制備治療或預(yù)防與IFN的調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病或病癥的藥劑的用途，所述多肽包括選自氨基酸殘基57-89的至少一個氨基酸取代、C末端氨基酸殘基159-165的至少一個氨基酸取代及其組合的突變，其中所述多肽與野生型IFNa2(SEQIDNO:2)相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性。31.根據(jù)權(quán)利要求2-12任一項的干擾素a2(IFNa2)突變體用于制備治療或預(yù)防與IFN的調(diào)節(jié)有關(guān)的疾病或病癥的藥劑的用途。全文摘要本發(fā)明提供了與野生型IFNα2相比具有提高的特異性激動活性或拮抗活性的IFNα2突變體及其活性片段、類似物、衍生物以及變體。本發(fā)明還提供了包括IFNα2突變體的藥物組合物，所述藥物組合物可用于治療或預(yù)防與IFNα2表達增加有關(guān)的癌癥、自身免疫性疾病、感染性疾病或病癥。文檔編號A61K38/21GK101304758SQ200680030639公開日2008年11月12日申請日期2006年6月28日優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日發(fā)明者伊亞爾·卡利,吉迪昂·施雷伯,萊拉·C·羅伊斯曼,迭戈·亞伊丁申請人:維茲曼科學(xué)研究所耶達研究與發(fā)展有限公司