專利名稱：片狀組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用羊膜的片狀組合物及其制作方法。本發(fā)明的片狀組合物可以用作例如用于制作人工組織(角膜上皮片等)的培養(yǎng)基質(zhì)、目M^ 面或皮膚等再建用的移植材料、或者抗粘連劑。
背景技術(shù)：
羊膜具有活體適合性高、富有柔軟性等作為移植材料而優(yōu)選的特 性，正在謀求在以角膜上皮的再建為代表的各種組織再建中的利用(例如參照專利文獻(xiàn)1~4)。羊膜的利用方法大致可劃分為兩種。即，謀求 羊膜直接應(yīng)用于患處的組織再建的方法和羊膜作為細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)而 使用的方法。對于這些中的任一種利用方法而言，羊膜的柔軟性都是重 要的特性。因?yàn)榫哂懈呷彳浶?，羊膜可無間隙地被覆患處，并且也可以 與患處良好的粘附并成活，發(fā)揮出良好的治療效果。另一方面，作為細(xì) 胞培養(yǎng)用基質(zhì)使用羊膜時，由于具有高柔軟性因此可以在羊膜上進(jìn)行良 好的細(xì)胞增殖以及正常的組織化(分化)。專利文獻(xiàn)1:特開平5-56987號>^才艮 專利文獻(xiàn)2:國際^>開第03/043542 Al號文本 專利文獻(xiàn)3:國際公開第03/092762 Al號文本 專利文獻(xiàn)4:國際公開第2004/078225 Al號文本發(fā)明內(nèi)容羊膜是哺乳動物中覆蓋子宮和胎盤最表層的膜，由分娩時獲取。因 此，并非能夠經(jīng)常得到新鮮狀態(tài)的羊膜，如果考慮到今后的臨床應(yīng)用， 期待著提供可以長時間保存并且操作性也優(yōu)異的羊膜。因此，將釆取的 羊膜制成干燥狀態(tài)，使保存性以及操作性提高。通過實(shí)施干燥處理羊膜 的保存性等雖然顯著提高了，但是發(fā)生結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變性等，結(jié)果是當(dāng) 回到濕潤狀態(tài)時柔軟性大大地降低。如果柔軟性降低，還發(fā)生不能無間 隙地被覆患處的情況，對患處的粘附性、成活性也降低。另一方面，經(jīng)干燥處理的羊膜，在其上的細(xì)胞增殖率降低、多層化也受阻、不發(fā)生正 常的組織化(分化)。認(rèn)為這是由于伴隨著柔軟性的降低，羊膜表面的 平坦性大幅降低而引起的。本發(fā)明是鑒于以上課題而完成的，其主要目的在于提供含有保存性 以及操作性優(yōu)異，并且使用時具有高柔軟性的羊膜的片狀組合物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人等試著通過對羊膜實(shí)施修飾，來提高 柔軟性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了用作為二糖之一的海藻糖處理后的羊膜，即使隨后 實(shí)施干燥處理，在回到濕潤狀態(tài)時柔軟性也恢復(fù)、其柔軟性是與未處理 的羊膜(未加工羊膜)同等的水平?？傊鞔_了海藻糖處理對提高羊 膜的柔軟性是有效的。并且，看到了通過經(jīng)由海藻糖處理，羊膜的透明度也提高了這個驚 人的現(xiàn)象。由上述事實(shí)表明，在對透明性的要求盡可能高的用途(例如 角膜再建)中使用時，將羊膜進(jìn)行海藻糖處理是極其有效的。另一方面，通過海藻糖處理能夠獲得羊膜的拉伸強(qiáng)度也提高、比未 加工羊膜還強(qiáng)韌的羊膜。由上述事實(shí)弄清了海藻糖處理對于羊膜操作性 的提高、移植后的形態(tài)保持也是有效的。此外，在驗(yàn)證海藻糖處理后的羊膜的活體適合性時，看到與未加工 羊膜同樣的高活體適合性。由此，確認(rèn)了海藻糖處理對于活體適合性沒 有影響。得到以上見解后，檢查海藻糖對羊膜在作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)時的功能 所帶來的影響。具體而言，在海藻糖處理后的羊膜上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞， 檢查細(xì)胞增殖率、多層化的程度。其結(jié)果是看到了良好的細(xì)胞增殖，并且發(fā)生了 5~7層的多層化。這比未實(shí)施海藻糖處理的羊膜上的多層化 (1~2層)的程度大幅提高。如此，表明羊膜在作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)使用 時，海藻糖處理也是有效的。接著，將在羊膜上形成有細(xì)胞層的片移植到動物眼表面，驗(yàn)證其再 建效果。其結(jié)果是，顯示出良好的粘附性和成活性，能夠無缺損地再建 眼表面，并維持高透明性。本發(fā)明主要基于以上見解，提供以下的片狀組合物。[I] 一種片狀組合物，具備附加了海藻糖的羊膜而成。[2根據(jù)[l]所述的片狀組合物，是凍結(jié)狀態(tài)或者干燥狀態(tài)。[3]根據(jù)[2]所述的片狀組合物，是凍干狀態(tài)。[4]根據(jù)[1]~ [3]中任一項所述的片狀組合物，所述羊膜是去除了上 皮細(xì)胞層的羊膜。[5]根據(jù)[1]~ [4]中任一項所述的片狀組合物，檢測出所述羊膜的作 為基底膜成分的膠原iv、膠原vn、層粘連蛋白5與未處理的羊膜為同等 強(qiáng)度。[6]根據(jù)[1]~ [5]中任一項所述的片狀組合物，所述羊膜是人羊膜。[7]根據(jù)[1]~ [6]中任一項所述的片狀組合物，在所述羊膜上形成含 有活體來源的細(xì)胞的細(xì)胞層。[8]根據(jù)[7]所述的片狀組合物，在所述細(xì)胞層中所述活體來源的細(xì) 胞是多層化的。[9]根據(jù)[7]所述的片狀組合物，所述活體來源的細(xì)胞是來源于角膜 上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛嚢上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、 視網(wǎng)膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者腸管粘膜上皮的細(xì)胞。[10]根據(jù)[7]所述的片狀組合物，所述細(xì)胞層是由多層化為約5~7 層的細(xì)胞構(gòu)建的，并且具備與角膜上皮類似的性質(zhì)。[II] 根據(jù)[1]~ [6]中任一項所述的片狀組合物，作為抗粘連用材料、 或者作為由于手術(shù)侵害導(dǎo)致的臟器或器官的表面組織損害的再建用材 料而使用。[12]根據(jù)[1]~ [ll]中任一項所述的片狀組合物，在所述羊膜的絨毛 膜側(cè)的表面附著粘附成分。[13]根據(jù)[12]所述的片狀組合物，所述粘附成分為纖維蛋白原及凝血酶。[14]根據(jù)[12]所述的片狀組合物，所述粘附成分為纖維蛋白原、凝 血酶以及抑肽酶。[15]根據(jù)[1]~[14]中任一項所述的片狀組合物，用活體吸收性材料 被覆所述羊膜的絨毛膜側(cè)的表面。作為其他方面本發(fā)明提供以下的移植方法。[16] —種移植方法，使用[1] [15]中任一項的片狀組合物作為移植 材料。作為其他方面，本發(fā)明還提供以下的制作方法。[17] —種片狀組合物的制作方法，包括以下步驟(a) 制備羊膜的步驟；(b) 向所述羊膜附加海藻糖的步驟。[18]根據(jù)[17]所述的制作方法，還包括以下步驟(c) 在步驟b之后進(jìn)行凍結(jié)處理或干燥處理的步驟。[19]根據(jù)[18]所述的制作方法，還包括以下步驟(d) 在步驟c之后進(jìn)行滅菌處理的步驟。[20]根據(jù)[17]~[19]中任一項所述的制作方法，所述步驟a包括以 下步驟(al)從羊膜去除上皮的步驟。[21]根據(jù)[20]所述的制作方法，所述步驟al包括以下步驟(1) 準(zhǔn)備由活體分離的羊膜的步驟；(2) 對所述羊膜實(shí)施凍融處理的步驟；(3) 對凍融處理后的羊膜實(shí)施胰蛋白酶處理的步驟；(4) 清洗胰蛋白酶處理后的羊膜的步驟。[22]根據(jù)[21]所述的制作方法，其特征在于，在所述凍融處理中， 凍結(jié)溫度為約-20。C 約-80。C,融解溫度為約4。C 約50。C。[23]根據(jù)[21]或[22]所述的制作方法，其特征在于，所述凍融處理 反復(fù)實(shí)施2次以上。[24]根據(jù)[20]~[23]中任一項所述的制作方法，其特征在于，使用 胰蛋白酶濃度為約0.01% (w/v) ~約0.05% (w/v)的胰蛋白酶溶液實(shí) 施所述胰蛋白酶處理。[25]根據(jù)[24]所述的制作方法，其特征在于，所述胰蛋白酶溶液含 有約0.1mM 約0.6 mM的從EDTA、 NTA、 DTPA、 HEDTA、 GLDA以及它們的任意組合中選擇的螯合劑。[26]根據(jù)[20]~[25]中任一項所述的制作方法，其特征在于，在胰 蛋白酶溶液僅接觸羊膜上皮側(cè)的條件下，實(shí)施所述胰蛋白酶處理。[27]根據(jù)[20]~[26]中任一項所述的制作方法，在步驟b之后實(shí)施 以下的步驟(A)在所述羊膜上形成含有活體來源的細(xì)胞的細(xì)胞層。


圖l是匯總了作為組織再建用材料的片狀組合物的用途(主要應(yīng)用 部位、應(yīng)用方法的例子，優(yōu)選的羊膜形態(tài)、主要目的)的表。圖2是說明羊膜的固定法的圖。(a)是以一對框夾持羊膜；(b)是 以框和平板狀部件夾持羊膜。圖3是顯示海藻糖處理 凍干羊膜的物性評價試驗(yàn)(厚度)結(jié)果的圖。圖4是顯示海藻糖處理 凍干羊膜的物性評價試驗(yàn)(透明度)結(jié)果 的圖。圖5是顯示海藻糖處理凍干羊膜的物性評價試驗(yàn)(拉伸強(qiáng)度)結(jié) 果的圖。圖6是顯示海藻糖處理 凍干羊膜的物性評價試驗(yàn)(柔軟性)結(jié)果 的圖。圖7是顯示海藻糖處理'凍干羊膜的活體適合性評價試驗(yàn)結(jié)果的圖。 將海藻糖處理.凍干羊膜移植到家兔的角膜實(shí)質(zhì)層間，觀察眼表面的狀態(tài)。左邊是剛移植完的眼表面狀態(tài)，右邊是移植后一個月的眼表面狀態(tài)。圖8是顯示海藻糖處理'凍干羊膜的活體適合性評價試驗(yàn)結(jié)果的圖。 將海藻糖處理.凍干羊膜移植到家兔的角膜實(shí)質(zhì)層間，在移植后l個月 時將包含移植部的角膜的一部分摘出進(jìn)行HE染色。圖9是顯示在海藻糖處理.凍干羊膜上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞時的器具 等狀態(tài)的剖面模式圖。培養(yǎng)嵌套12靜置于培一 11內(nèi)，在培》11 底面形成3T3細(xì)胞層15。此外，顯示了如下狀態(tài)在培養(yǎng)嵌套12的底面 上靜置羊膜13，在其上培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞14。符號16為培養(yǎng)基。圖10是顯示在海藻糖處理 凍干羊膜上形成細(xì)胞層的圖(HE染 色圖像)。將使用了未進(jìn)行海藻糖處理而進(jìn)行凍干所得到的羊膜(未處 理凍干羊膜)時所形成的細(xì)胞層狀態(tài)作為比較對照。圖11是在海藻糖處理.凍干羊膜上形成細(xì)胞層的片(培養(yǎng)角膜上 皮片)的HE染色圖像和免疫染色圖像。在免疫染色圖像中，各抗體的 信號為綠色。細(xì)胞核以紅色表示。角膜型角蛋白3表達(dá)(+ )、皮膚角化 型角蛋白10 (-)、結(jié)膜型角蛋白13 (-)。圖12是顯示使用海藻糖處理 凍干羊膜制作的培養(yǎng)角膜上皮片的 再建效果的圖。在培養(yǎng)角膜上皮片移植后第二天以及第十四天的眼表面 的狀態(tài)(上面)以及熒光素染色圖像(下面)。圖13是移植后第二周的培養(yǎng)角膜上皮片的HE染色圖像(左上邊) 和關(guān)于各種角蛋白的免疫染色圖像(右上邊、下邊)。記號**表示海藻 糖處理.凍干羊膜(TH-AM)。圖14是使用了對基底膜特異性成分的抗體以及對致密層特異性成 分的抗體將海藻糖處理.凍干羊膜進(jìn)行免疫染色后的結(jié)果。顯示將海藻 糖處理 凍干羊膜的免疫染色圖像(C)與未加工羊膜(A)的免疫染 色圖像以及未經(jīng)海藻糖處理但進(jìn)行凍干的羊膜的免疫染色圖像(B)進(jìn) 行比較。1:膠原I的染色圖像；2:膠原m的染色圖像；3:膠原IV的 染色圖像；4:膠原V的染色圖像；5:膠原VII的染色圖像；6:層粘連 蛋白5的染色圖像；7:纖連蛋白的染色圖像。圖15是顯示羊膜上皮的去除順序的流程圖。圖16是顯示胰蛋白酶處理的方法的圖。(a)是將框固定的羊膜的上皮側(cè)朝下浸漬于胰蛋白酶溶液中。(b)是向框內(nèi)加入胰蛋白酶溶液， 從而使胰蛋白酶作用于羊膜的上皮側(cè)。圖17是經(jīng)胰蛋白酶處理的羊膜、未加工羊膜(有上皮)、用手處理 的羊膜的HE染色圖像。圖18是經(jīng)胰蛋白酶處理的羊膜的免疫染色圖像。圖19同樣是經(jīng)胰蛋白酶處理的羊膜的免疫染色圖像。圖20是未加工羊膜(有上皮)的免疫染色圖像。圖21是用手處理的羊膜的免疫染色圖像。圖22是匯總HE染色實(shí)驗(yàn)以及免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表。標(biāo)號說明1、 2、 3框 4板狀部件 5胰蛋白酶溶液 10羊膜11培養(yǎng)皿(culture dish ) 12培養(yǎng)嵌套(培養(yǎng)插入容器) 13羊膜14角膜上皮細(xì)胞 15 3T3細(xì)胞層 16培養(yǎng)基具體實(shí)施方式
本發(fā)明的第l方面涉及片狀組合物。在本發(fā)明的片狀組合物中使用 羊膜作為其主要構(gòu)成成分。由于羊膜所具有的高透明性及強(qiáng)韌性，所以 可以構(gòu)成透明性及強(qiáng)度優(yōu)異的片狀組合物。此外，由于羊膜的高活體親 和性及低免疫原性，所以可以構(gòu)成活體親和性更加優(yōu)異且免疫原性低的 片狀組合物。通過使用羊膜，可以進(jìn)一步期待抗炎癥作用、抑制瘢痕形 成、阻礙血管新生的作用。在本發(fā)明的片狀組合物含有細(xì)胞層的情況下，在良好地形成該細(xì)胞層方面，也優(yōu)選使用羊膜。即，如后所述，具備細(xì) 胞層的片狀組合物是通過以羊膜為基質(zhì)(支持體)并在其上播種、培養(yǎng) 規(guī)定的細(xì)胞而形成，結(jié)果由于羊膜具有使細(xì)胞在其上良好地粘附及增殖 的特性，所以使用羊膜則細(xì)胞可以良好地粘附及增殖而形成細(xì)胞層。(羊膜的來源)"羊膜"是哺乳動物中覆蓋子宮和胎盤最表層的膜，在膠原豐富的 軟組織上形成基底膜、上皮層而構(gòu)成?？梢允褂萌恕⒑镒?、黑猩猩、豬、 馬、牛等的羊膜。其中，優(yōu)選使用人羊膜。這是因?yàn)樵诎庖咴浴?病毒感染的安全性方面有利。(海藻糖的附加)本發(fā)明的片狀組合物使用附加了海藻糖的羊膜。本發(fā)明人等的研究 結(jié)果表明，通過附加海藻糖，可以提高羊膜的柔軟性、特別是可大幅改 善處于凍干狀態(tài)時的柔軟性。并且，如后述實(shí)施例所示，表明了附加海 藻糖的羊膜作為細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)發(fā)揮了良好的功能?；谶@些見解，構(gòu) 成的本發(fā)明的片狀組合物具有高度柔軟性、另 一方面在作為細(xì)胞培養(yǎng)用 基質(zhì)使用時可進(jìn)行良好的細(xì)胞增殖和多層化。這里，如果羊膜內(nèi)部的基質(zhì)蛋白變?nèi)酰瑒t羊膜的強(qiáng)度降低，并且容 易受到損害。并且，不能將水分牢固地保持在內(nèi)部，會變脆弱而失去彈 性。海藻糖作用于基質(zhì)蛋白內(nèi)結(jié)合松散的部位從而強(qiáng)化了蛋白質(zhì)間的結(jié) 合，由此使羊膜內(nèi)部的保持水分的功能正?；?，預(yù)想維持了羊膜本來的 濕潤、聚集、彈性。認(rèn)為通過預(yù)先附加海藻糖，可有效防止伴隨著凍干 處理的羊膜內(nèi)部的基質(zhì)蛋白變?nèi)彳?，特別是在水中的膨潤變?nèi)醯那闆r。海藻糖(物質(zhì)名，通稱)是以a-D-吡喃葡糖基(1, 1) -a-D-吡喃 葡萄糖苷來表示的化合物。對羊膜附加海藻糖，可以通過例如用海藻糖溶液處理羊膜來進(jìn)行。 另外，后面詳細(xì)描述了海藻糖的附加方法。另夕卜，本發(fā)明的一種實(shí)施方式實(shí)質(zhì)上是僅由附加了海藻糖的羊膜構(gòu) 成的。(羊膜的狀態(tài))本發(fā)明的一種實(shí)施方式是使用去除了上皮細(xì)胞層的羊膜。去除了上皮細(xì)胞層的羊膜完全沒有因上皮細(xì)胞所引起的免疫排斥等問題，安全性 變得極高。并且，細(xì)胞在去除了上皮的羊膜上更加良好地粘附以及增殖， 因此也可獲得能夠在更短時間構(gòu)建高品質(zhì)的細(xì)胞片這種制作方面的優(yōu) 點(diǎn)。通過檢查本發(fā)明的片狀組合物中不含羊膜上皮層的細(xì)胞，能夠確認(rèn) 是去除了上皮層的羊膜。另一方面，也可以使用殘存有上皮層的羊膜來構(gòu)建本發(fā)明的片狀組 合物。通過預(yù)先使羊膜的上皮層殘存，可在制作階段進(jìn)行Y射線處理等 充分的滅菌處理，可實(shí)現(xiàn)安全性的提高。(再構(gòu)建后的羊膜的使用)使用再構(gòu)建后的羊膜也能構(gòu)成本發(fā)明的片狀組合物。具體而言，例 如可以使用經(jīng)勻漿器、超聲波、酶處理而暫時分解，并再次構(gòu)建成膜狀 的形狀的羊膜。處理方法優(yōu)選使用勻漿器。這是由于能期待基底膜的微 小結(jié)構(gòu)體較高度地保持。勻漿器處理的條件(轉(zhuǎn)數(shù))為例如3000rpm~50000rpm，優(yōu)選為10000rpm~40000rpm，更優(yōu)選為約 30000rpm。(厚度)通過使用羊膜，本發(fā)明的片狀組合物可構(gòu)成非常薄的片狀。本發(fā)明 的片狀組合物可調(diào)制成例如10nm~500nm的厚度。如此的非常薄的片 狀會增加通用性。也可以使用去除了絨毛膜側(cè)的致密層的一部分(例如 l(Him~30nm左右)的羊膜來構(gòu)建本發(fā)明的片狀組合物，還可以通過涂 敷活體吸收性原材料而制成例如100nm~500pm左右的厚度。(粘附成分的使用)本發(fā)明的一種實(shí)施方式是將纖維蛋白原以及凝血酶(以下，也將它 們統(tǒng)稱為"粘附成分")附著于羊膜的表面。由此，在移植本發(fā)明的片 狀組合物時，首先，通過凝血酶特異性地水解纖維蛋白原而生成纖維蛋 白，接著，纖維蛋白聚合而形成穩(wěn)定的纖維蛋白塊，從而發(fā)揮粘附作用。 如果這樣提高了粘附性，在將片狀組合物應(yīng)用于患處時，無需縫合也能 獲得足夠的粘附力，由此可實(shí)現(xiàn)手術(shù)方式的簡便化。另外，在本說明書 中，將具有上皮且附著有粘附成分的羊膜還稱作"粘附成分附著■有 上皮羊膜"，將無上皮但附有粘附成分的羊膜還稱作"粘附成分附著-無上皮羊膜"。纖維蛋白原及凝血酶根據(jù)本發(fā)明的片狀組合物的用途，附著在羊膜 的單面或兩面。單面附著時，無論羊膜上有無上皮，羊膜的絨毛膜側(cè)表 面(即，與上皮側(cè)相反側(cè)的表面)成為附著面。因此，使用如此構(gòu)成的 片狀組合物時，使存在羊膜上皮的側(cè)朝上，移植到應(yīng)用部位。另外，以 抗粘連為目的的片狀組合物時，制成粘附成分附著于羊膜的單面。以活 體粘附劑為目的移植到活體內(nèi)時，優(yōu)選在羊膜的兩面附著粘附成分。如后所述，該方式的片狀組合物考慮到使用目的等，制備成適當(dāng)?shù)?狀態(tài)(例如干燥狀態(tài)或濕潤狀態(tài))，并經(jīng)過在羊膜表面附著纖維蛋白原 及凝血酶的工序來制備。因此，根據(jù)其制作過程中及/或其最終狀態(tài)如 何，可預(yù)想直到被使用為止的期間由一部分纖維蛋白原生成纖維蛋白。 因此，本發(fā)明的片狀組合物還包括附著有因這樣的原因生成的纖維蛋白 或纖維蛋白塊的物質(zhì)。纖維蛋白原及凝血酶的來源沒有特別限定。例如，可以把人、猴子、 黑猩猩、牛、馬、羊、豬等的血液作為材料來制備纖維蛋白原及凝血酶。此外，作為纖維蛋白原及凝血酶，可以使用利用培養(yǎng)細(xì)胞(例如CHO 細(xì)胞或COS細(xì)胞)而得到的重組體(recombinant),優(yōu)選使用人來源 (特別是人來源的重組體)的纖維蛋白原及凝血酶。這是因?yàn)樵诎?疫原性的安全性方面有利。此外，如果考慮可以使用穩(wěn)定品質(zhì)的物質(zhì)及 感染的問題，則特別優(yōu)選使用重組體。特別優(yōu)選使用來源于接受本發(fā)明的片狀組合物移植的患者 (recipient)的血液的纖維蛋白原及凝血酶。這是因?yàn)椴挥脫?dān)心會發(fā)生 起因于這些粘附成分的免疫排斥反應(yīng)。另外，纖維蛋白原及凝血酶的來源可以不必相同。如果列舉一例， 可以將人血液來源的纖維蛋白原和牛血液來源的凝血酶組合使用。纖維蛋白原及凝血酶的附著量沒有特別限定。例如，纖維蛋白原的 附著量可以設(shè)定在每lcm2羊膜0.1mg~50mg的范圍。同樣地，凝血 酶的附著量可以設(shè)定在每lcm2羊膜0.5 u mg ~ 10mg的范圍。設(shè)定纖維蛋白原及凝血酶的附著量時首要考慮粘附力。即，為了獲 得所希望的粘附力，必須設(shè)定這些成分的附著量。另一方面，纖維蛋白 原或凝血酶的附著量過多時，雖然根據(jù)所使用的纖維蛋白原的來源來決定，但是容易發(fā)生免疫反應(yīng)或血管新生這一點(diǎn)成為問題。在此，例如在片狀組合物被應(yīng)用于眼表面的再建等的情況下，在移 植后這些成分導(dǎo)致的血管新生成為問題時，為了盡可能抑制血管新生的 發(fā)生，優(yōu)選減少這些成分的附著量。通過將這些成分的附著量設(shè)定在可 能范圍內(nèi)的低值，可抑制移植后的血管新生，期待高的治療效果。本發(fā)明人等的研究結(jié)果表明當(dāng)將纖維蛋白原與羊膜組合使用的情況下，當(dāng) 纖維蛋白原的附著量為每lcm2羊膜約0.5mg以上時，可獲得對眼表面 的良好粘附力。即使凝血酶的附著量為每lcm2羊膜約liig時，也可獲 得對眼表面的良好粘附力?；谶@些見解，纖維蛋白原附著量優(yōu)選的范 圍為每1 112羊膜0.5~20mg，進(jìn)一步優(yōu)選的范圍為每lcn^羊膜 0.5mg~ 10mg，更進(jìn)一步優(yōu)選的范圍為每lcm2羊膜0.5mg~ 6mg (具 體地說，例如約0.5mg、約lmg、約2mg)。同樣地，凝血酶附著量優(yōu) 選的范圍為每lcn^羊膜lug lmg，進(jìn)一步優(yōu)選的范圍為每lcn^羊 膜5 ii g~ 200 ii g，更進(jìn)一步優(yōu)選的范圍為每lcm2羊膜10 ii g~ 100 u g (具體地說，例如約10ug、約20ug、約30ug)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，除了纖維蛋白原及凝血酶以外，還有 抑肽酶附著在羊膜表面。抑肽酶阻礙如下過程通過凝血酶的作用而形 成的纖維蛋白塊被纖維蛋白溶酶溶解。因此，通過并用抑肽酶可抑制纖 維蛋白塊的分解，可維持甚至強(qiáng)化粘附力。抑肽酶的來源沒有特別限定。例如，可以使用牛、馬、羊、豬、猴 子、黑猩猩等的胰臟來源的抑肽酶。此外，還可以使用利用培養(yǎng)細(xì)胞(例 如CHO細(xì)胞或COS細(xì)胞)而得到的重組體(recombinant)的抑肽酶。 如果考慮可以使用穩(wěn)定品質(zhì)的物質(zhì)及感染問題，則優(yōu)選使用重組體。使用抑肽酶時，其附著量沒有特別限定。例如，可以將抑肽酶的附 著量設(shè)定在每lcm2羊膜0.1 KIU~ 200 KIU的范圍。根據(jù)上述的纖維 蛋白原附著量的研究，使抑肽酶的附著量變化來研究對于粘附力的影 響，結(jié)果表明，在與羊膜組合使用時即使將抑肽酶量設(shè)定在1 KIU~2 KIU的范圍，也可以得到對眼表面的充分粘附力。基于該見解，抑肽酶 附著量優(yōu)選的范圍為每lcn^羊膜1 KIU~ 100 KIU，進(jìn)一步優(yōu)選的范 圍為每lcn^羊膜1 KIU~20 KIU，更進(jìn)一步優(yōu)選的范圍為每lcn^羊 膜1 KIU ~ 10 KIU (具體地說，例如約1 KIU、約2 KIU、約3 KIU )。 抑肽酶的量過多時，自然會引起制造成本的上升，起因于抑肽酶自身的免疫原性等的副作用的可能性增大。另一方面，抑肽酶的量過少時，可 能不能充分發(fā)揮抑制纖維蛋白塊分解的抑肽酶的作用。另外，在各種用途中纖維蛋白塊被用作粘附劑，在那樣的用途中一 般并用抑肽酶。本發(fā)明人等的研究結(jié)果表明，與羊膜進(jìn)行組合時，即使不使用抑肽酶也可得到對于活體的充分粘附力?？梢圆皇褂靡蛛拿?，意 味著不僅簡化構(gòu)成而在制作上及成本方面上有利，而且沒有必要考慮起因于抑肽酶自身的免疫原性等的副作用。(利用活體吸收性材料的強(qiáng)化)以活體吸收性材料被覆羊膜的絨毛膜側(cè)，由此能夠提高本發(fā)明的片 狀組合物的強(qiáng)度。作為以該目的使用的活體吸收性材料，優(yōu)選采用在較 早期被羊膜分解 吸收的材料。例如可適當(dāng)使用例如聚乳酸羥基乙酸(polyglactin) 910、明膠、膠原、聚乳酸等作為此處的活體吸收性材 料。用于強(qiáng)化的活體吸收性材料的形態(tài)沒有特別限定。例如以成形為網(wǎng) 眼狀或者片狀的活體吸收性材料被覆羊膜絨毛膜側(cè)從而強(qiáng)化羊膜。羊膜 的狀態(tài)在進(jìn)行強(qiáng)化的過程中可以是濕潤狀態(tài)、干燥狀態(tài)任一種。但是， 產(chǎn)品的最終形態(tài)優(yōu)選羊膜為干燥狀態(tài)。這是因?yàn)槿绻歉稍餇顟B(tài)則操作 性以及保存性優(yōu)異。需要說明的是，本說明書中的實(shí)施了強(qiáng)化的羊膜也 稱作"雜化羊膜"。(細(xì)胞層)本發(fā)明的片狀組合物的一種實(shí)施方式為在羊膜上具有細(xì)胞層。在該 實(shí)施方式中，并用粘附成分時，在未形成細(xì)胞層的側(cè)的羊膜表面附著有 粘附成分(纖維蛋白原等)。在該實(shí)施方式中，使用去除了上皮的羊膜。從而，在上皮存在的一 側(cè)形成細(xì)胞層。此處的細(xì)胞層由活體來源的細(xì)胞構(gòu)成。構(gòu)成細(xì)胞層的細(xì) 胞的來源沒有特別限定。例如，由角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛 嚢上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、視網(wǎng)膜色素上皮、呼吸道粘膜 上皮或者腸道粘膜上皮來源的細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞層。可以由相互不同的二種 以上的細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞層。這樣，通過含有來源不同的二種以上的細(xì)胞來 構(gòu)成，本說明書中也稱之為"雜化"。經(jīng)雜化的細(xì)胞層中的細(xì)胞的含有 形態(tài)(雜化狀態(tài))沒有特別限定，例如，各細(xì)胞可以分散，任意細(xì)胞(或 者多種類的細(xì)胞)可以具有一定的聚集而存在。此外，各細(xì)胞的含有率在細(xì)胞層整體中可以不是均勻的。細(xì)胞層可以是單層，也可以是多層(多 層化的狀態(tài))。具有經(jīng)雜化的細(xì)胞層時，構(gòu)成細(xì)胞層的細(xì)胞種類，以構(gòu)建用作角膜 上皮的再建的本發(fā)明的片狀組合物的情況為例，詳述如下。經(jīng)雜化的細(xì)胞層含有二種以上的細(xì)胞。因此，為了方便說明，把細(xì) 胞層所含有的細(xì)胞種類之一當(dāng)作第1細(xì)胞，把與其種類不同的細(xì)胞種類當(dāng)作第2細(xì)胞。首先，使用自體細(xì)胞作為第l細(xì)胞。本說明書中的"自 體"是指應(yīng)用本發(fā)明的片狀組合物的對象，即接受移植的人(recipient), 另一方面，這樣的"自體，，以外的人稱為"他人"。只要在與后述的第2 細(xì)胞雜化時能夠形成角膜上皮樣的粘膜上皮層，則第l細(xì)胞的種類沒有 特別限定。作為第l細(xì)胞的例子，可列舉來源于口腔粘膜上皮、結(jié)膜上 皮、鼻腔粘膜上皮等粘膜上皮的細(xì)胞，或者來源于能夠構(gòu)建這樣的粘膜 上皮的未分化細(xì)胞(即粘膜上皮的干細(xì)胞)的細(xì)胞。在此"來源于或者 來源的，，是指為了特別指定起始材料而使用的。因此，例如，如果說來 源于口腔粘膜上皮的(或者口腔粘膜上皮來源的)細(xì)胞，則是指以口腔 粘膜上皮細(xì)胞為起始材料而獲得的細(xì)胞。此外，本發(fā)明中的"能夠構(gòu)建 粘膜上皮的未分化細(xì)胞"是指具有向構(gòu)成該粘膜上皮的細(xì)胞分化的能力 的細(xì)胞。例如，如果說能夠構(gòu)建口腔粘膜上皮的未分化細(xì)胞，則是指能 夠向口腔粘膜上皮細(xì)胞分化的細(xì)胞。作為未分化細(xì)胞的具體例，可舉出 口腔粘膜上皮或結(jié)膜上皮等、構(gòu)成特定組織的細(xì)胞的前體或者干細(xì)胞、 或者分化度低的上皮系干細(xì)胞等。經(jīng)雜化的細(xì)胞層可以含有不同的二種以上的第1細(xì)胞。例如，可以 在含有來源于口腔粘膜上皮的細(xì)胞和來源于結(jié)膜上皮的細(xì)胞的狀態(tài)下 構(gòu)建細(xì)胞層。本發(fā)明中的"口腔粘膜上皮"包括口腔內(nèi)緣粘膜上皮部、口唇部、 口上顎部、頰部等。其是來源于口腔粘膜上皮的細(xì)胞，可以以表達(dá)口腔 粘膜上皮特異性的角蛋白4、或角蛋白13為指標(biāo)來確認(rèn)?；蛘撸€可 以以表達(dá)角蛋白3為指標(biāo)。已知這種角蛋白3是角膜特異性的角蛋白之 一，但在口腔粘膜上皮中也確認(rèn)其有表達(dá)。另外，從表達(dá)這種作為角膜 特異性角蛋白的角蛋白3的角度講，可優(yōu)選使用口腔粘膜上皮細(xì)胞作為 制作角膜上皮移植用的組合物的材料。另一方面，通過研究口腔粘膜上皮細(xì)胞特異性的基因的表達(dá)，可以 確認(rèn)其為口腔粘膜上皮來源。另外，來源于口腔粘膜上皮以外的組織的細(xì)胞，也同樣地可以通過 檢查該組織中特異性的標(biāo)記或者基因的表達(dá)來確認(rèn)其來源。作為第2細(xì)胞的具體例，可列舉來源于角膜上皮、結(jié)膜上皮、或者 羊膜上皮的細(xì)胞。其中，優(yōu)選第2細(xì)胞為來源于角膜上皮或者結(jié)膜上皮 的細(xì)胞。這是因?yàn)?，對于由來源于眼表面組織的細(xì)胞而構(gòu)建的細(xì)胞層來 說，可具有與角膜上皮更接近的特性。特別優(yōu)選第2細(xì)胞為來源于角膜 上皮的細(xì)胞。這是因?yàn)椋沙蔀榕c角膜上皮更近似特性的細(xì)胞層。第2細(xì)胞可以是自體細(xì)胞或者他人細(xì)胞的任何一種。如果是由自體 細(xì)胞構(gòu)建而得的細(xì)胞層，則會形成沒有或很少免疫排斥問題的細(xì)胞層。 如果是由他人細(xì)胞構(gòu)建而得的細(xì)胞層，由于作為原材料的細(xì)胞容易獲 得，所以形成在其制作方面有利的細(xì)胞層。本發(fā)明的細(xì)胞層可以含有不 同的二種以上的第2細(xì)胞。例如，可以在含有來源于角膜上皮的細(xì)胞和 來源于結(jié)膜上皮的細(xì)胞的狀態(tài)下構(gòu)建細(xì)胞層。本發(fā)明的片狀組合物中的細(xì)胞層含有來源于角膜上皮的細(xì)胞，可以 以例如角膜上皮特異性的角蛋白3或者角蛋白12的表達(dá)為指標(biāo)來確認(rèn)。 此外，還可以以表達(dá)角蛋白4為指標(biāo)。另外，來源于角膜上皮以外的組織的細(xì)胞也同樣地可以通過檢查該 組織中特異性的標(biāo)記或者基因的表達(dá)來確認(rèn)其來源。本發(fā)明的片狀組合物由于使用羊膜作為支持體，所以可以構(gòu)建成非 常薄的狀態(tài)?？梢詫⒈景l(fā)明的片狀組合物制備成如下厚度在不含細(xì)胞 層時制備成例如10 u m ~ 100 ii m的厚度，在含有細(xì)胞層時制備成例如 20um 200um的厚度。這樣，非常薄也是本發(fā)明的一大特征。由于 具有該特征，可以在各種用途中應(yīng)用。特別是，可以利用高透明性在眼 表面的再建等中應(yīng)用。(片狀組合物的狀態(tài))本發(fā)明的片狀組合物的狀態(tài)沒有特別限定，可以以濕潤狀態(tài)(例如 被浸于溶液中的狀態(tài))、凍結(jié)狀態(tài)或者干燥狀態(tài)(包括半干燥狀態(tài))提 供。如果是凍結(jié)狀態(tài)在使用前無需在冷凍或者冷藏環(huán)境下進(jìn)行管理，其操作(保存、運(yùn)輸?shù)? 變得容易。但是，即使是干燥狀態(tài)，也可以根據(jù)需要進(jìn)行冷凍或者冷藏 保存。特別地，如制成凍干狀態(tài)則在操作方面優(yōu)異，而且應(yīng)用時良好地粘 附于患處(在患處表面浸潤而發(fā)揮粘附力)，因此在應(yīng)用后基本上不需 要縫合(但是，為了更加牢固地粘附在患處，也可以進(jìn)行縫合處理)。 不需要縫合的話，就大大減輕了患者以及醫(yī)生的負(fù)擔(dān)。優(yōu)選使用具有上皮層的凍結(jié)狀態(tài)、具有上皮層的干燥狀態(tài)(凍干狀 態(tài))、沒有上皮層的濕潤狀態(tài)、沒有上皮層的凍結(jié)狀態(tài)或者沒有上皮層 的干燥狀態(tài)(凍干狀態(tài))的羊膜來構(gòu)建本發(fā)明的片狀組合物。另外，本說明書中，具有上皮層的凍結(jié)狀態(tài)的羊膜也稱作"凍結(jié)保 存 有上皮羊膜"，具有上皮層的凍干狀態(tài)的羊膜也稱作"凍干 有上 皮羊膜"，沒有上皮層的凍結(jié)狀態(tài)的羊膜稱作"凍結(jié)保存'無上皮羊膜"， 沒有上皮層的凍干狀態(tài)的羊膜也稱作"凍干■無上皮羊膜"。干燥狀態(tài)的片狀組合物容易操作，具體來講，在常溫(例如約10。C~ 約35'C)等也能保存。即，在使用前無需在冷凍或者冷藏環(huán)境下進(jìn)行 管理，其操作(保存、運(yùn)輸?shù)?變得容易。另一方面，由于處在干燥狀態(tài)，在不影響其使用的情況下可以進(jìn)行 有效的滅菌處理。并且，由于是干燥狀態(tài)經(jīng)時劣化極小，經(jīng)長時間仍可 維持其高品質(zhì)狀態(tài)。為了發(fā)揮本發(fā)明的片狀組合物所期待的功能(例如作為用于形成細(xì) 胞層的基質(zhì)的功能、作為組織再建材料的功能等)，認(rèn)為保持基底膜的 結(jié)構(gòu)是重要的。此處本發(fā)明優(yōu)選的一種實(shí)施方式，其特征在于，使用殘 存有基底膜成分(膠原IV (al、 a2和a5)、膠原VH、層粘連蛋白5)的 羊膜。是否殘存有基底膜成分，可以通過實(shí)施以該成分為檢測對象的免 疫染色來鑒定。本發(fā)明的一種實(shí)施方式，是將這些成分中的至少一種、 優(yōu)選多種、更優(yōu)選全部進(jìn)行檢測。并且，優(yōu)選檢測的這些成分的強(qiáng)度與 以未處理的羊膜(即，從活體分離后未進(jìn)行凍結(jié)等處理的羊膜)為對象 檢測時的強(qiáng)度沒有顯著不同(優(yōu)選幾乎是相等的強(qiáng)度)。另一方面，優(yōu)選使用還殘存有致密層成分(膠原I、 m、 V、纖連 蛋白)的羊膜。致密層成分的殘存狀態(tài)與上述基底膜成分的情況同樣地可通過免疫染色進(jìn)行鑒定。通過對羊膜附加海藻糖，即使是實(shí)施凍干處理也可以高度地維持基 底膜以及致密層的結(jié)構(gòu)。(提供形態(tài))例如，可以以收納于玻璃或塑料等容器的狀態(tài)、或者使用透明膜或 者遮光片等進(jìn)行包裝后的狀態(tài)來提供本發(fā)明的片狀組合物。優(yōu)選以基本上不與氧接觸的狀態(tài)包裝本發(fā)明的片狀組合物來提供。 在該形態(tài)下，沒有因氧而引起的品質(zhì)劣化，經(jīng)長時間仍能維持高品質(zhì)。 作為"基本上不與氧接觸的狀態(tài)"，可列舉以容器內(nèi)處于真空狀態(tài)或者 將氮填充到容器內(nèi)(氮置換)的狀態(tài)、或者用膜、片材等密封包裝的狀 態(tài)。另外，本發(fā)明的片狀組合物通常是事先進(jìn)行滅菌處理。(用途)本發(fā)明的片狀組合物可以作為組織再建用移植材料、抗粘連劑等使 用。本發(fā)明的片狀組合物的應(yīng)用領(lǐng)域可列舉眼科領(lǐng)域、消化器外科領(lǐng)域、 婦科領(lǐng)域、皮膚科領(lǐng)域。將本發(fā)明的片狀組合物的應(yīng)用例(應(yīng)用部位、應(yīng)用方法等)分為本發(fā)明的片狀組合物不具備細(xì)胞層的情況(A)和具備細(xì)胞層的情況(B) 進(jìn)行記載。A.不具備細(xì)胞層的片狀組合物的應(yīng)用例不具備細(xì)胞層的片狀組合物可應(yīng)用于鞏膜、角膜的再建(對于翼狀 胬肉或者角膜上皮缺損等的治療)、皮膚(表皮)潰瘍、燙傷時的被覆 等。并且，也可用作組織再建用材料。此處的"組織再建用材料，，是指 活體組織的再建(再生)所使用的材料。不具備細(xì)胞層的片狀組合物， 優(yōu)選用在以再建因手術(shù)侵害引起的臟器或者器官的表面組織損害為目 的的治療中。本發(fā)明的片狀組合物特別適合作為用于再建在通常的治愈 過程中產(chǎn)生粘連的表面組織的材料。此處的術(shù)語"組織再建"典型地意 味著將表面組織損傷處恢復(fù)成正常狀態(tài)，由于防止了該臟器或者器官等 的表面組織的再粘連，也作為包括使該臟器等恢復(fù)成正常狀態(tài)(例如防 止輸卵管的粘連剝離后的再粘連，使其恢復(fù)正常狀態(tài))的情況的術(shù)語使 用。作為本發(fā)明的再建對象的組織的適合例有腹部、胸部或者骨盆內(nèi)的 臟器或者器官(胃、大腸、小腸、盲腸、十二指腸、心臟、肺、輸卵管、直腸、肝臟、卵巢、子宮等)的表面組織；或者腹腔、胸腔、骨盆腔、 口腔、鼻腔、耳或者咽喉的表面組織；或者眼組織。因此，本發(fā)明的片 狀組合物可應(yīng)用于消化器外科、婦產(chǎn)科、胸外科、口腔外科、耳鼻喉外 科以及眼外科領(lǐng)域。本發(fā)明的片狀組合物特別適合于作為用于再建腹 部、胸部或者骨盆內(nèi)的臟器或者器官的表面組織，或者腹腔、胸腔或者 表面組織的材料。但是，即使是上述這些領(lǐng)域之外，本發(fā)明也可廣泛應(yīng) 用于伴有外科手術(shù)的領(lǐng)域。以下，對本發(fā)明的片狀組合物的應(yīng)用部位、應(yīng)用方法等進(jìn)行了詳細(xì)的記載。在作為組織再建用材料使用時，本發(fā)明的片狀組合物的用途以應(yīng)用 方法和應(yīng)用目的為基準(zhǔn)，可大致可劃為以下三類。(1)被覆組織再建用材料(應(yīng)用方法) 組織再建(應(yīng)用目的)型將組織再建用材料貼于臟器表面、腹膜表面等，目的在于再建受損 的組織表面的用法(使用方法)。該用途的具體例為下述的1-1、 1-4， l國5， 1-6。(2) 被覆組織再建用材料(應(yīng)用方法)'抗粘連(應(yīng)用目的)型將羊膜貼于臟器表面、腹膜表面等，目的在于抑制與周邊組織形成 粘連的用法(使用方法)。該用途的具體例為下述的2-1、 3-1， 3-2， 3-3。(3) 留置組織再建用材料(應(yīng)用方法)'抗粘連(應(yīng)用目的)型通過將羊膜留置于形成高度粘連的部位，抑制粘連形成的用法(使 用方法)。該用途的具體例，為下述的l-2、 1-3、 2-2。以往的抗粘連劑 大多采用該使用形態(tài)。例如作為抗粘連劑現(xiàn)在正使用的生物膜與下述的 l-2是同樣的使用形態(tài)。但是，在下述的1-3， 2-2的使用形態(tài)下生物膜 卻不能使用。以下顯示了作為組織再建用材料的片狀組合物的用途的具體例(參 照圖1)。l.在消化器外科領(lǐng)域的應(yīng)用l-l受損臟器的再建、抗粘連用途的應(yīng)用法在進(jìn)行各種外科手術(shù)時在操作過程中會對臟器產(chǎn)生微小損傷。損傷區(qū)域失去漿膜結(jié)構(gòu)，如在術(shù)后早期不能再建該結(jié)構(gòu)的話，就成為臟器間 形成粘連的原因，也存在損傷基本功能的情況，這是不利的。有效利用 羊膜的組織再建能力、抗粘連能力，可以解決上述問題。具體地講，用 組織再建用材料覆蓋損傷臟器表面來實(shí)現(xiàn)組織再建以及抗粘連。對于這 種目的，可優(yōu)選使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜、凍結(jié)保存'無上皮羊膜、 凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著.無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建用材 料。為了筒便操作，優(yōu)選以干燥狀態(tài)的羊膜(例如凍干 有上皮羊膜、 凍干.無上皮羊膜)構(gòu)建的組織再建用材料，在心臟等需要載體柔軟性 的領(lǐng)域中也可以選擇以凍結(jié)保存狀態(tài)的羊膜(例如凍結(jié)保存'有上皮羊 膜、凍結(jié)保存*無上皮羊膜)構(gòu)建的組織再建用材料。應(yīng)用方法，是在 外科手術(shù)結(jié)束的階段，以羊膜基底膜面向腹腔側(cè)的狀態(tài)用組織再建用材 料直接被覆臟器的損傷區(qū)域。之后，根據(jù)需要進(jìn)行固定。固定可以使用醫(yī)用縫合線(vicryl)等縫合線。在使用以干燥狀態(tài)的羊膜構(gòu)建的組織 再建用材料時，可期待高粘接力，因此可以省略縫合等固定處理。在使 用用粘附成分構(gòu)建的組織再建用材料時，也同樣可期待高粘接力。這樣， 優(yōu)選無需另行進(jìn)行縫合等固定處理，來實(shí)現(xiàn)組織再建用材料固定于應(yīng)用 部位。這是由于進(jìn)行縫合等時，操作變得繁瑣并且有可能會促進(jìn)發(fā)生炎 癥而形成粘連。特別地，如果使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜構(gòu)建的組織 再建用材料，則可發(fā)揮對應(yīng)用部位的高粘接力，并且不會發(fā)生由粘附成 分引起的異物反應(yīng)的問題，可以說特別優(yōu)選。通過以上操作，可期待在術(shù)后早期漿膜結(jié)構(gòu)的再建，并且可實(shí)現(xiàn)損 傷臟器的再建 抗粘連。l-2.受損臟器-創(chuàng)面間的抗粘連用途的應(yīng)用法在進(jìn)行各種外科手術(shù)后，有時會在腹腔內(nèi)臟器和創(chuàng)面間形成粘連。 如果腹腔內(nèi)臟器與創(chuàng)面發(fā)生粘連，則臟器被物理性固定了成為臟器的運(yùn) 動性減弱，內(nèi)腔梗阻、麻痹性腸梗阻的原因。有效利用羊膜的抗粘連能 力，可以解決上述問題。對于這種目的，可使用以凍結(jié)保存'有上皮羊 膜、凍結(jié)保存'無上皮羊膜、凍干'有上皮羊膜進(jìn)行強(qiáng)化的雜化羊膜等 構(gòu)建的組織再建用材料。為了獲得不褶皺的足夠的強(qiáng)度，優(yōu)選使用用干 燥狀態(tài)的羊膜構(gòu)建的組織再建用材料，更優(yōu)選使用以干燥狀態(tài)的羊膜且 進(jìn)行強(qiáng)化的雜化羊膜構(gòu)建的組織再建用材料。應(yīng)用方法例如下面內(nèi)容。 在外科手術(shù)結(jié)束的階段，將組織再建用材料插入創(chuàng)面下，直接留置。此時，以羊膜的基底膜側(cè)成為腹腔側(cè)、絨毛膜側(cè)成為腹壁側(cè)的方式應(yīng)用組 織再建用材料。應(yīng)用后，可利用縫合等進(jìn)行固定，優(yōu)選不固定僅留置的 方式。通過以上操作，可以實(shí)現(xiàn)術(shù)后臟器和創(chuàng)面間的抗粘連。l-3.骨盆底抗粘連的應(yīng)用在骨盆內(nèi)，存在直腸、子宮等臟器表面的一部分沒有被腹膜覆蓋的 腹腔外臟器。在對這種腹腔外臟器進(jìn)行手術(shù)時，產(chǎn)生在骨盆內(nèi)沒有腹膜 存在的區(qū)域，小腸落入骨盆底，形成骨盆壁和小腸的粘連。 一旦形成粘 連的話，大多難以剝離。因此預(yù)防措施是重要的。使用羊膜的漿膜再建 能力可以預(yù)防骨盆底的粘連。對于這種目的，可優(yōu)選使用以凍結(jié)保存'有 上皮羊膜、凍結(jié)保存'無上皮羊膜、凍干.有上皮羊膜進(jìn)行強(qiáng)化的雜化 羊膜等構(gòu)建的組織再建用材料。組織再建用材料所要求的性質(zhì)與1-2. 相同。應(yīng)用方法例如下面內(nèi)容。在外科手術(shù)結(jié)束的階段，將組織再建用 材料插入骨盆底，輕輕地壓于腹膜而被覆腹膜。此時，以羊膜的基底膜 側(cè)成為腹腔側(cè)、絨毛膜側(cè)成為腹膜側(cè)的方式應(yīng)用組織再建用材料。應(yīng)用 后，可利用縫合等進(jìn)行固定，優(yōu)選不固定僅被覆的方式。通過以上操作，可以實(shí)現(xiàn)術(shù)后骨盆底的抗粘連。l-4.壁側(cè)腹膜的再建用途的應(yīng)用法由于進(jìn)行數(shù)次手術(shù)的情況或腹壁瘢痕疝等腹膜疾病引起壁側(cè)腹膜的 缺損?？墒褂醚蚰ぷ鳛槿睋p腹壁的填補(bǔ)用載體。對于這種目的，可優(yōu)選 使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜、凍結(jié)保存■無上皮羊膜、凍干 有上皮 羊膜、粘附成分附著'無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建用材料。腹膜的缺 損大、重度的情況下，從強(qiáng)度角度出發(fā)優(yōu)選使用以凍結(jié)保存'有上皮羊 膜構(gòu)建的組織再建用材料。應(yīng)用在外科手術(shù)結(jié)束階段進(jìn)行。首先將組織 再建用材料置于腹壁缺損區(qū)域進(jìn)行覆蓋。以羊膜的基底膜側(cè)面向腹腔側(cè) 的狀態(tài)用組織再建用材料被覆腹壁缺損區(qū)域。之后，還可以使用縫合線 等將組織再建用材料固定。使用以附有粘附成分的羊膜構(gòu)建的組織再建 用材料時，通過粘附成分完成固定即可。通過以上操作可以期待腹壁的 再建。1-5.抑制腹膜播種性轉(zhuǎn)移的應(yīng)用腹膜播種是指胃癌、大腸癌、卵巢癌發(fā)展、癌細(xì)胞從組織游離通過胸水、腹水轉(zhuǎn)移至體腔而引起的病例。伴隨著腹膜播種的癌癥的預(yù)后極 差，抑制轉(zhuǎn)移的方法是所人們期望的，但目前還未知有效的方法。有效 利用羊膜的性質(zhì)，存在能夠抑制轉(zhuǎn)移的可能性。作為癌細(xì)胞以高頻率發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位已知有大網(wǎng)膜、橫膈膜、腸間膜等。將這些乳斑(milky spots)預(yù)先以組織再建用材料被覆形成屏障，由此可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的抑制。 對于這種目的，可使用以凍結(jié)保存 有上皮羊膜、凍結(jié)保存 無上皮羊 膜、凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著 無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建 用材料，從操作筒便出發(fā)，優(yōu)選使用以凍干.有上皮羊膜構(gòu)建的組織再 建用材料。作為應(yīng)用方法，例如以包覆組織的狀態(tài)用組織再建用材料被 覆應(yīng)用部分。并且，還可以通過在一部分以補(bǔ)丁的形式進(jìn)行縫合或者通 過附著于羊膜的粘附成分將組織再建用材料固定在應(yīng)用部位。組織再建 用材料的應(yīng)用時期可以是癌癥進(jìn)展發(fā)生轉(zhuǎn)移后，也可以在未開始播種的 階段(預(yù)備性的使用)。l-6.防止復(fù)發(fā)粘連的應(yīng)用在進(jìn)行剖腹手術(shù)后，發(fā)生腸間或者腸和腹壁的粘連折曲，引發(fā)通路 障礙、陷入功能衰竭的地步，而引起腸梗阻。即使實(shí)施粘連解除術(shù)，由 于在粘連組織特別是出現(xiàn)高度炎癥而瘢痕化的組織中發(fā)生漿膜缺損而 經(jīng)常在術(shù)后導(dǎo)致再粘連。使用羊膜可實(shí)現(xiàn)防止術(shù)后粘連復(fù)發(fā)以及修復(fù)、 強(qiáng)化漿膜缺損部。對于這種目的，可使用以凍結(jié)保存'有上皮羊膜、凍 結(jié)保存 無上皮羊膜、凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著 無上皮羊膜 等構(gòu)建的組織再建用材料。從操作簡便出發(fā)，優(yōu)選使用以凍干.有上皮 羊膜構(gòu)建的組織再建用材料。作為應(yīng)用方法例如，剖腹后在將粘連進(jìn)行 物理性剝離的階段，用組織再建用材料以筒狀包裹腸。此時，適合以羊 膜的基底膜側(cè)面向腹腔側(cè)的狀態(tài)使用組織再建用材料。之后，通常進(jìn)行 固定，可以用醫(yī)用縫合線等縫合線將臟器與羊膜進(jìn)行縫合，還可以縫合 羊膜之間(羊膜成為管狀)或者不縫合而進(jìn)行留置。使用以附有粘附成 分的羊膜構(gòu)建的組織再建用材料時通過該粘附成分完成固定即可。優(yōu)選 無需另行進(jìn)行縫合等固定處理，來實(shí)現(xiàn)將組織再建用材料固定于應(yīng)用部 位。進(jìn)行縫合等操作時操作變得繁瑣，并且有可能會促進(jìn)引發(fā)炎癥而形 成粘連。特別是如果使用以干燥狀態(tài)的羊膜構(gòu)建的組織再建用材料，可 以對應(yīng)用部位發(fā)揮高粘接力，并且沒有因粘附成分所引發(fā)的異物反應(yīng)問 題，可以說特別優(yōu)選。通過以上操作，可以預(yù)防粘連的復(fù)發(fā)，并可期待在術(shù)后早期漿膜結(jié) 構(gòu)的再建。2. 婦產(chǎn)科領(lǐng)域的應(yīng)用 2-l.輸卵管阻塞的應(yīng)用如果輸卵管與腹膜等發(fā)生粘連，則輸卵管閉塞卵子不能通過，導(dǎo)致 不孕。使用羊膜可以防止輸卵管的粘連。對于這種目的，組織再建用材 料的應(yīng)用方法例如下面內(nèi)容。將已粘連的部分剝離，進(jìn)行通常的輸卵管 傘端成形術(shù)。在術(shù)后閉合腹部前以組織再建用材料被覆輸卵管區(qū)域。對 于這種目的，可使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜、凍結(jié)保存.無上皮羊膜、 凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著.無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建用材 料，從操作簡便出發(fā)，優(yōu)選使用以凍干 有上皮羊膜構(gòu)建的組織再建用 材料。作為應(yīng)用方法，例如以包覆組織的狀態(tài)用組織再建用材料被覆應(yīng) 用部分。并且，還可以通過在一部分以補(bǔ)丁的形式進(jìn)行縫合或者通過附 著于羊膜的粘附成分將組織再建用材料固定在應(yīng)用部位。2- 2.防止骨盆底粘連的應(yīng)用骨盆內(nèi)的子宮是腹腔外臟器，臟器表面的約50%沒有被腹膜覆蓋。 為此，如果進(jìn)行子宮摘除手術(shù)則產(chǎn)生腹膜缺損部位，結(jié)果導(dǎo)致骨盆底和 小腸的粘連形成。使用羊膜可防止骨盆底的粘連。對于這種目的所使用 的組織再建用材料的形態(tài)、應(yīng)用方法與1-3.相同。3. 眼科領(lǐng)域中的應(yīng)用3- 1.青光眼手術(shù)的應(yīng)用青光眼是視神經(jīng)受損、視野變窄而視力下降的疾病。青光眼的治療 是通過切除小梁形成新的房水排出系統(tǒng)來進(jìn)行手術(shù)的，術(shù)后鞏膜和結(jié)膜 發(fā)生粘連，有時治療效果并不理想。針對這種問題，認(rèn)為羊膜的使用是 有效的。具體來講，進(jìn)行一般的小梁切除后，將組織再建用材料插入結(jié) 膜下。對于這種目的，可使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜、凍結(jié)保存-無 上皮羊膜、凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著 無上皮羊膜等構(gòu)建的羊 膜，從操作筒便出發(fā)，優(yōu)選使用以凍干，有上皮羊膜構(gòu)建的組織再建用 材料。應(yīng)用后，還可以將組織再建用材料經(jīng)縫合等固定在應(yīng)用部位。3-2.瞼球粘連的應(yīng)用瞼球粘連是指從眼瞼結(jié)膜到眼球發(fā)生瘢痕化，眼瞼與眼球發(fā)生粘連 的疾病。發(fā)生瞼球粘連時，眼表面大范圍受損的情況居多，將粘連的組 織剝離后多復(fù)發(fā)。認(rèn)為利用羊膜可以抑制瞼球粘連。作為具體的應(yīng)用方 法，例如將眼瞼與眼球間的粘連剝離后，將瘢痕化的結(jié)膜組織剝離，使 鞏膜露出，以組織再建用材料被覆。對于這種目的，可使用以凍結(jié)保 存■有上皮羊膜、凍結(jié)保存，無上皮羊膜、凍干■有上皮羊膜、粘附成 分附著.無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建用材料，從操作簡便等理由出發(fā)， 優(yōu)選使用以粘附成分附著'無上皮羊膜構(gòu)建的組織再建用材料。使用該 組織再建用材料時，主要可利用粘附成分實(shí)現(xiàn)固定于應(yīng)用部位。以組織 再建用材料被覆的部位可以是瞼側(cè)也可以是鞏膜。3-3.復(fù)發(fā)翼狀胬肉的應(yīng)用翼狀胬肉是指結(jié)膜組織發(fā)生異常增生，增生組織粘連于角膜引起散 光、視力下降的疾病。認(rèn)為羊膜對于該疾病是有效的。作為具體的應(yīng)用 方法，例如將翼狀胬肉組織剝離使鞏膜露出后，以組織再建用材料被覆。 對于這種目的，可使用以凍結(jié)保存.有上皮羊膜、凍結(jié)保存'無上皮羊 膜、凍干.有上皮羊膜、粘附成分附著■無上皮羊膜等構(gòu)建的組織再建 用材料，從操作簡便等理由出發(fā)，優(yōu)選使用以粘附成分附著'無上皮羊 膜構(gòu)建的組織再建用材料。使用該組織再建用材料時，主要可利用粘附 成分實(shí)現(xiàn)固定于應(yīng)用部位。B.具有細(xì)胞層的片狀組合物的應(yīng)用例具有細(xì)胞層的片狀組合物可以應(yīng)用于角膜或視網(wǎng)膜的再建(對于史 蒂芬強(qiáng)森綜合癥、熱化學(xué)外傷、眼類天皰瘡、視網(wǎng)膜脫落、老年性黃斑 變性癥、青光眼、視網(wǎng)膜色素變性癥等的治療)、表皮-糖尿病性潰瘍 (表皮)、表皮水皰癥、或者燹傷的治療等。(片狀組合物的制作方法)本發(fā)明的其他方面涉及片狀組合物的制作方法。本發(fā)明的制作方法 包括下面的步驟。即，(a)制備羊膜的步驟和(b)對上述羊膜附加海藻糖 的步驟。l.羊膜的制備步驟(a)"羊膜"是哺乳動物中覆蓋子宮和胎盤的最表層的膜，在膠原豐富 的軟組織上形成基底膜、上皮層而構(gòu)成。作為羊膜，優(yōu)選使用人羊膜。人羊膜可以從例如分娩時產(chǎn)后得到的人胎膜、胎盤等中獲取。具體地說， 通過將分娩后立即得到的含有人胎膜、胎盤及胯帶的一體物進(jìn)行處理、精制，可以制備人羊膜。處理、精制方法可以采用特開平5-56987號 中記載的方法等公知的方法。即，可以從分娩時得到的胎膜剝離羊膜， 通過超聲波清洗等物理處理及酶處理等將殘存組織去除，經(jīng)過適當(dāng)?shù)那?洗工序來制備人羊膜。這樣制備得到的人羊膜可以事先凍結(jié)保存到使用時為止。人羊膜的 凍結(jié)可以在例如-80。C、將DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)和甘油以體積比等量混合而得的溶液中進(jìn)行。通過凍結(jié)保存 可提高操作性是勿庸置疑的，還有望降低抗原性。還可以直接利用羊膜，優(yōu)選利用通過進(jìn)行刮除處理等從羊膜上去除 了上皮的羊膜。由于去除上皮，所以抗原性降低。例如，將如上那樣凍 結(jié)保存的人羊膜解凍之后，用EDTA或蛋白分解酶處理，緩解細(xì)胞間 的粘附，接著用細(xì)胞刮器等刮除上皮，從而可以制備去除了上皮的人羊 膜。優(yōu)選以包括以下步驟的方法去除羊膜的上皮。(1) 準(zhǔn)備由活體分離的羊膜的步驟。(2) 對上述羊膜實(shí)施凍融處理的步驟。(3) 對凍融處理后的羊膜實(shí)施胰蛋白酶處理的步驟。(4) 清洗胰蛋白酶處理后的羊膜的步驟。根據(jù)該上皮去除法，可以與以往的用手的上皮去除法同等程度地在 抑制基底膜損傷的同時完全去除上皮。即，根據(jù)該上皮去除法，可獲得 上皮被完全去除，并且具有良好地保持了本來結(jié)構(gòu)的基底膜的羊膜。該 羊膜例如作為細(xì)胞培養(yǎng)用的基質(zhì)(基材)發(fā)揮良好功能。另一方面，以 下的上皮去除法與以往的用手方法相比，操作非常簡便，操作時間也縮 短了。并且，同時還可以容易地處理多數(shù)羊膜。進(jìn)而，不特殊要求熟練 的技術(shù)，因而也容易進(jìn)行自動化。以下，詳細(xì)說明上皮去除法的各步驟。(羊膜的準(zhǔn)備步驟l)在步驟(1)中準(zhǔn)備羊膜。這里的羊膜優(yōu)選人羊膜。人羊膜可以從 例如分娩時產(chǎn)后得到的人胎膜、胎盤等中獲取。具體地說，可以通過將 分娩后立即得到的含有人胎膜、胎盤及胯帶的一體物進(jìn)行處理、精制，來制備人羊膜。這樣的人羊膜制備方法可以采用特開平5-56987號中 記載的方法等公知的方法。典型地按著以下順序?qū)嵤┰摬襟E。(l腦l)羊膜的采取分娩時采取胎盤組織的一部分，接著用手將羊膜組織從胎盤組織剝離。 還可以在該階段暫時凍結(jié)。(l-2)血球成分等的去除將羊膜上附著的血球成分用生理鹽水等清洗.去除。并且，用手將絨毛 膜剝離、去除。如此，優(yōu)選在這個階段制成去除了血球成分和絨毛膜的 羊膜，在后述的凍融處理(步驟2)后，還可以進(jìn)行血球成分的去除和 /或絨毛膜的剝離。這樣制備得到的人羊膜可以凍結(jié)保存直到下面的處理為止。人羊膜 的凍結(jié)可以在例如-80。C、將DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)和甘油以體積比等量混合而得的溶液中進(jìn)行。通過凍結(jié)保存 可提高操作性是勿庸置疑的，還有望降低抗原性。(框固定)將按著以上順序制備的羊膜固定于框后，優(yōu)選進(jìn)行以下處理。通過 以框固定羊膜，操作變得容易。羊膜的固定方法的具體例如圖2所示。可使用與圖2a的例同樣形 狀的兩個框(l、 2)。羊膜IO被這兩個框夾住其邊緣部而被固定。另外， 以羊膜展開的狀態(tài)固定。圖2b的例中，使用框3和板狀部件4固定羊 膜10。首先，將羊膜10以展開的狀態(tài)置于板狀部件4上。此時羊膜 IO的上皮側(cè)朝上。接著，在羊膜10的上面放置框3，以板狀部件4和 框3夾持羊膜10的邊部。其結(jié)果是僅有羊膜10的上皮側(cè)露出。因此， 在實(shí)施后述的胰蛋白酶處理時，可以使胰蛋白酶溶液僅與羊膜的上皮側(cè) 接觸(例如，向框3的內(nèi)側(cè)添加胰蛋白酶溶液)。由此，可以在不影響 上皮以外的部分(羊膜致密層以及基底膜)的情況下進(jìn)行胰蛋白酶處理。 即，使胰蛋白酶作用于羊膜上皮，同時保護(hù)羊膜致密層等使其免受胰蛋 白酶的作用。(凍融處理步驟2)在該步驟中，使羊膜暫時凍結(jié)，之后使其融解。通過該凍融處理， 在后面的胰蛋白酶處理時，羊膜上皮層容易剝離。考慮這是由于羊膜上 皮層與基底膜之間的粘附狀態(tài)(粘接狀態(tài))松散引起的。凍結(jié)溫度可采用約-20 °C ~約-80 。C 。從可以獲得足夠的凍結(jié)狀態(tài)、 可以利用通用的冷凍裝置等角度進(jìn)行考慮，優(yōu)選在約-80 "C下使其凍結(jié)。 另一方面，融解溫度可以釆用約4'C 約50°C。優(yōu)選將融解溫度設(shè)為約37t:。優(yōu)選反復(fù)實(shí)施凍融處理。通過反復(fù)實(shí)施，在之后的胰蛋白酶處理中， 增強(qiáng)了容易剝離上皮的這種凍融處理的效果。但是，反復(fù)進(jìn)行必要以上 的處理時，預(yù)想到還會對上皮以外的部分產(chǎn)生壞影響。因此，優(yōu)選例如反復(fù)實(shí)施2~4次凍融處理。本發(fā)明人等經(jīng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過實(shí)施2 次凍結(jié)溫度-80t)、融解溫度37t:的凍融處理，可獲得足夠必要的效果。 基于上述見解，優(yōu)選在凍結(jié)溫度-80t:、融解溫度37"C的條件下實(shí)施2次凍融處理。反復(fù)實(shí)施凍融處理時的各次的條件(凍結(jié)溫度、融解溫度)可以全 部相同，也可以一部分不同，或者也可以互不相同。但是從操作性的角 度出發(fā)，優(yōu)選各次的條件相同。(胰蛋白酶處理步驟3)在該步驟中，將凍融處理后的羊膜用胰蛋白酶處理。胰蛋白酶處理 是通過使羊膜與胰蛋白酶溶液接觸而實(shí)施的。作為胰蛋白酶溶液，可使 用例如胰蛋白酶濃度為約0.01% (w/v) ~約0.05% (w/v)的胰蛋白酶 溶液。優(yōu)選使用胰蛋白酶濃度為約0.02% (w/v)的胰蛋白酶溶液。如 果胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶濃度過低，則不能發(fā)揮充分的胰蛋白酶作 用。另一方面，如果胰蛋白酶溶液的胰蛋白酶濃度過高，則能夠使胰蛋 白酶良好地作用于羊膜上皮相反地，胰蛋白酶也對羊膜致密層以及基底 膜發(fā)生作用，該部分被損傷。胰蛋白酶大多是市場上出售的牛來源、豬來源、人來源等的胰蛋白 酶。例如可以優(yōu)選使用Trypsin-EDTA (Invitrogen公司)、trypsinl: 250 ( Sigma公司)。預(yù)先向胰蛋白酶溶液中添加普通的螯合劑，螯合劑不是必須的。作為螯合劑可使用EDTA、 NTA、 DTPA、 HEDTA、 GLDA等?？梢詫?這些任意組合使用。添加螯合劑使其濃度為例如約0.1mM 約0.6 mM。優(yōu)選在僅使羊膜上皮側(cè)與胰蛋白酶溶液接觸的條件下實(shí)施胰蛋白 酶處理。這是為了保護(hù)羊膜上皮以外的部分使其免受胰蛋白酶的作用。 例如，通過僅使羊膜上皮側(cè)浸漬于胰蛋白酶溶液，在羊膜上皮側(cè)添加涂 布胰蛋白酶溶液，封閉羊膜絨毛膜側(cè)以使其不與溶液接觸而進(jìn)行加工之 后，全部浸漬于胰蛋白酶溶液等，由此可以僅使羊膜上皮側(cè)與胰蛋白酶 溶液接觸。如上所述，如果使用預(yù)先固定于圖2b所示的框的羊膜(框 固定羊膜)，則成為僅露出羊膜的上皮側(cè)的狀態(tài)，所以例如即使通過將 框固定羊膜浸漬于胰蛋白酶溶液，也可以僅使羊膜上皮側(cè)與胰蛋白酶溶 液接觸。在該方法中，還具有以框固定的羊膜進(jìn)行浸漬這種簡便操作就 能夠?qū)嵤┮鹊鞍酌柑幚淼倪@個優(yōu)點(diǎn)。另夕卜，在使用如此固定于框的羊膜 時，不僅可以連同框一起浸漬于胰蛋白酶溶液的方法，還可以通過僅使 羊膜的上皮側(cè)部分浸漬于胰蛋白酶溶液(例如將羊膜的上皮側(cè)朝下浸漬 于胰蛋白酶溶液)、向框內(nèi)添加胰蛋白酶溶液或者將胰蛋白酶溶液涂布 于羊膜上皮側(cè)，從而僅使羊膜的上皮側(cè)與胰蛋白酶溶液接觸。胰蛋白酶處理時間(胰蛋白酶溶液的接觸時間)例如為約5分鐘~ 約60分鐘。優(yōu)選約10分鐘~約20分鐘，更優(yōu)選約15分鐘。如果處理 時間過短，則不能使胰蛋白酶充分地作用，結(jié)果是羊膜上皮的除去不充 分。另一方面，如果處理時間過長，則有時胰蛋白酶也對羊膜的基底膜、 致密層產(chǎn)生作用，可能使該部分損傷。胰蛋白酶處理的溫度條件為例如約25。。~約421C,以使得胰蛋白 酶良好地發(fā)揮作用。與胰蛋白酶溶液接觸期間優(yōu)選維持羊膜在靜置的狀態(tài)。因?yàn)榭紤]這 樣使胰蛋白酶溶液更難于浸透到基底膜、致密層。也可以分多次實(shí)施胰蛋白酶處理。(清洗步驟4)用以上的方法與胰蛋白酶溶液接觸后，清洗羊膜。通過該清洗，去 除附著的胰蛋白酶溶液，同時去除羊膜上皮(上皮細(xì)胞)。例如，通過 置于具有適當(dāng)流動性的液體中(例如流水中)、以浸于適當(dāng)?shù)囊后w中的 狀態(tài)使其振蕩(例如上下振蕩)、或者以浸于適當(dāng)?shù)囊后w中的狀態(tài)施加超聲波等，由此清洗胰蛋白酶處理后的羊膜。作為清洗中所使用的液體，可示例生理鹽水、磷酸系緩沖液、精制水、DMEM。清洗后的羊膜也可以預(yù)先冷藏或者冷凍保存直到使用時。例如可以 在浸漬于含有甘油的保存液(例如含有50%甘油的DMEM( Dulbecco，s Modified Eagle's Medium: GIBCOBRL公司))的狀態(tài)進(jìn)行保存。2. 海藻糖的附加:步驟(b)對羊膜附加海藻糖，可通過例如將羊膜浸漬于海藻糖溶液來進(jìn)行。 例如將羊膜浸漬于將海藻糖溶解于蒸餾水、磷酸緩沖的生理鹽水(PBS (-))使其濃度為5% (w/v) ~20% (w/v)所得到的溶液中。浸漬時的 溫度在例如4°C~37"C的范圍內(nèi)。浸漬時間在例如1小時~1天的范圍內(nèi)。 另外，海藻糖可利用例如林式會社林原商事提供的"Toreha"(注冊商 標(biāo))或Hplus VLifescience公司提供的"Torehainochi，，等。作為向羊膜附加海藻糖的方法，可釆用將海藻糖溶液涂布于羊膜表 面的方法、將海藻糖溶液噴到羊膜表面的方法、將海藻糖直接添加在羊 膜表面的方法等。另外，在從羊膜除去上皮的步驟(例如上述步驟2~4)之前，可實(shí) 施附加海藻糖的步驟。3. 凍結(jié)處理或者干燥處理步驟(c)本發(fā)明的一種實(shí)施方式是將附加了海藻糖后的羊膜凍結(jié)或者干燥。 通過該處理提高保存性、操作也變得容易。特別是通過干燥處理，可制 成在保存性方面以及操作方面極其優(yōu)異的片狀組合物。并且，由于伴隨 著干燥的表面形態(tài)的變化，可期待羊膜對活體組織的親和性(粘附性) 提高。羊膜的干燥優(yōu)選以凍干處理實(shí)施。這是由于可抑制羊膜的柔軟性 的降低。并且，凍干處理從保持羊膜的基底膜成分的結(jié)構(gòu)的角度也優(yōu)選。 在凍干處理中， 一般通過在沸點(diǎn)約-2(TC (107Pa、 0.8托) 約-50'C (4Pa、 0.03托)這樣的低氣壓環(huán)境(真空)下，從凍結(jié)固化狀態(tài)的試 樣(例如在約-40X:下凍結(jié)后的試樣)升華來除去水分。通過凍干處理， 可以從內(nèi)部均勻地脫水并且實(shí)現(xiàn)高干燥度，因此可以將本來的功能以及 形態(tài)以高度地保持的狀態(tài)使其干燥。并且凍干處理具有如下特征l.處 理中的劣化少；2.能夠容易地?zé)o菌化；3.得到復(fù)元性優(yōu)異的干燥體；4. 得到保存性優(yōu)異的干燥體等。凍干處理可通過具有真空室、冷卻-加熱裝置、排氣裝置(冷凝管以 及真空泵)的凍干機(jī)進(jìn)行。多數(shù)的凍干裝置為市場上出售的，可以使用 從其中進(jìn)行任意選擇的裝置實(shí)施干燥處理。另外，處理條件可基于所使 用的裝置中附有的使用說明書進(jìn)行設(shè)定。此時，可以考慮進(jìn)行干燥處理的試樣的大小、干燥度等。干燥度可以設(shè)定成例如水活性(AW)小于 0.5。通過切斷凍干后的羊膜，或者剪斷羊膜，可得到期望大小以及形狀 的干燥羊膜。也可以將得到的干燥羊膜固定于支持體或框。本發(fā)明的一種實(shí)施方式，是將經(jīng)干燥處理得到的干燥羊膜以基本上 不與氧接觸的狀態(tài)收納于適當(dāng)?shù)娜萜髦?。以基本上隔絕于氧的狀態(tài)包 裝，由此制成保存性極其優(yōu)異的不含上皮的干燥羊膜。例如，將干燥處理后的羊膜收納于適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)后，通過吸除容器 內(nèi)的空氣形成真空狀態(tài)或者對容器內(nèi)進(jìn)行氮置換等，羊膜可以以基本上 隔絕于氧的狀態(tài)進(jìn)行包裝?；蛘?，也可以通過將脫氧劑一同封入容器內(nèi)， 來除去殘存的氧。另外，還可以將上述方法任意組合使用。作為容器可 以使用例如包含可塑性合成樹脂的袋狀或者管狀的容器(將兩張片材重 疊將周邊部密封后的容器)或者由玻璃等無機(jī)材料形成的瓶狀容器等。在實(shí)施凍結(jié)處理或者干燥處理之前或者之后，還可以實(shí)施以活體吸 收性材料被覆羊膜的絨毛膜側(cè)的步驟。通過該處理可提高羊膜的強(qiáng)度。 作為活體吸收性材料可例示聚乳酸羥基乙酸910 (polyglactin)、明膠、 膠原、聚乳酸等。4.滅菌處理步驟步驟(d)通過實(shí)施滅菌處理可以將混入菌的風(fēng)險最小化?？梢酝ㄟ^EOG(環(huán) 氧乙烷氣體)、UV(紫外線)、Y射線處理等進(jìn)行羊膜的滅菌。其中，優(yōu) 選釆用Y射線滅菌。這是由于羊膜的物性降低少。在Y射線滅菌中，輻射 劑量為例如2kGy 50kGy，優(yōu)選為10kGy~30kGy，更優(yōu)選為15kGy~25 kGy。優(yōu)選在將實(shí)施了一系列處理后的羊膜收納于容器中的狀態(tài)或者以 膜或者片等包裝的狀態(tài)下實(shí)施滅菌處理。因此，優(yōu)選在滅菌處理前實(shí)施 將羊膜在容器等中收納等的步驟。另外，優(yōu)選以基本上不與氧接觸的狀 態(tài)將羊膜進(jìn)行收納或者包裝。這是由于可以抑制品質(zhì)的劣化、能夠長期保存。5.粘附成分的附著步驟(e)本發(fā)明的一種實(shí)施方式是將纖維蛋白原以及凝血酶附著于羊膜的 表面。這些成分的附著可以在例如上述干燥處理后實(shí)施。通過使用干燥 狀態(tài)的羊膜，可以使纖維蛋白原等粘附成分更好地附著。纖維蛋白原及凝血酶向羊膜表面的附著可分別單獨(dú)進(jìn)行或者同時 進(jìn)行。附著方法沒有特別限定。作為附著方法的例子，可以舉出將附著 成分的溶解液涂布、滴加、或者噴霧到羊膜表面的方法，或者將羊膜浸 漬在附著成分的溶解液中的方法。此外，將纖維蛋白原自身(或者凝血 酶自身)、或者將纖維蛋白原(或者凝血酶)溶解到適當(dāng)?shù)娜軇┲兄?而析出的成分添加(涂抹)到羊膜表面，從而可以使纖維蛋白原(或者 凝血酶)附著在羊膜表面。優(yōu)選制備這2種成分的混合液，使用該混合液來涂布、滴加等，由 此使纖維蛋白原及凝血酶同時附著在羊膜表面。以下，說明這樣的將2 種成分同時附著的方法的具體例。首先，制備纖維蛋白原溶解液。具體地說，將纖維蛋白原溶解在乙 醇(例如94%乙醇)等的溶劑(溶媒)中，使之達(dá)到所希望的濃度。除 了乙醇之外，還可以使用無水乙醇、異丙醇、甲醇等醇類或丙酮等作為 溶劑。另一方面，以同樣的順序另外制備凝血酶溶解液。作為此時的溶 劑，可以使用例如乙醇(例如99.5%乙醇)、無水乙醇、異丙醇、甲醇 等醇類或丙酮等。接著，混合以以上的順序準(zhǔn)備好的纖維蛋白原溶解液及凝血酶溶解 液。使用如此得到的混合液，如上所述，實(shí)施向羊膜上的涂布、滴加等。 如上這樣將纖維蛋白原溶解液和凝血酶溶解液混合，使用混合液實(shí)施附 著操作，此時，優(yōu)選注意不讓混合液中的水分量增多。如果混合液中的 水分量增多，則在附著操作前會發(fā)生纖維蛋白原、凝血酶間的反應(yīng)，給 附著操作帶來障礙。此外，為了移植后獲得良好的粘附力，優(yōu)選在事前 不發(fā)生作用的狀態(tài)下將纖維蛋白原和凝血酶附著在羊膜上。如果考慮以 上方面，則優(yōu)選釆用水溶性且水分量少的揮發(fā)性溶劑分別作為纖維蛋白 原的溶劑及凝血酶的溶劑。纖維蛋白原溶解液及凝血酶溶解液、或者纖維蛋白原和凝血酶的混合液的涂布、滴加等，典型地說，是對羊膜表面的全部區(qū)域均勻地實(shí)施， 但例如也可以僅在一部分區(qū)域?qū)嵤?例如，以點(diǎn)滴的方式間隔"^殳置并在 多個區(qū)域?qū)嵤?，或僅在周邊部實(shí)施)，或以不同的附著量來實(shí)施。在上述方法中，可以同時進(jìn)行纖維蛋白原以及凝血酶的附著，也可 以在不同的步驟中將各自的成分附著。即，還可以將纖維蛋白原的附著和凝血酶的附著作為2階段的步驟實(shí)施。但是，從可簡化操作方面、以 及能夠使纖維蛋白原以及凝血酶以更加均勻的分散狀態(tài)附著的方面，優(yōu) 選使用纖維蛋白原和凝血酶的混合液以 一步進(jìn)行附著操作。另外，纖維蛋白原及凝血酶可以依照常規(guī)方法由血液來制備。還可 以使用重組體的纖維蛋白原等，此時可以由適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液或 者細(xì)胞破碎液通過常規(guī)方法來制備。此外，還可以使用市場上出售的纖 維蛋白原等。例如，人來源的纖維蛋白原可以從Baxter公司購入。同 樣地，人來源的凝血酶可以從Baxter 乂>司購入。除了纖維蛋白原及凝血酶以外，還可以使抑肽酶附著在羊膜表面。 即，在該實(shí)施方式中，進(jìn)一步實(shí)施使抑肽酶附著的步驟(步驟b-l)。抑 肽酶的附著可以通過與纖維蛋白原同樣的方法及順序來實(shí)施。即，通過 采用抑肽酶溶解液的涂布、滴加、噴霧、浸漬等，可以在羊膜表面附著 抑肽酶。抑肽酶溶解液可以通過將抑肽酶溶解在氯化鈉溶液(例如 0.85%溶液)、氯化鉀溶液、氯化鈞溶液、氯化鎂溶液等中來制備。應(yīng)說明的是，抑肽酶可以依照常規(guī)方法由牛的胰臟來制備。還可以 4吏用重組體的抑肽酶，此時可以由適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液或者細(xì)胞破 碎液通過常規(guī)方法來制備。此外，還可以使用市場上出售的抑肽酶。例 如，牛來源的抑肽酶可以從Bayer藥品公司購入。使抑肽酶附著的步驟還可以單獨(dú)實(shí)施，優(yōu)選與使纖維蛋白原及凝血 酶附著的步驟同時實(shí)施。這是因?yàn)檎掣匠煞值母街僮髯鳛檎w被簡化 了。此外，還因?yàn)槟軌驅(qū)⒗w維蛋白原、凝血酶及抑肽酶以更均勻分散的 狀態(tài)附著在羊膜表面。例如，制備纖維蛋白原、凝血酶、及抑肽酶的混 合液，將其涂布等，從而可以實(shí)施這3種成分向羊膜的同時附著。這3 種成分的混合順序沒有特別限定。纖維蛋白原等的附著可以對羊膜的單面或者兩面實(shí)施。在前者的情 況下，原則上無論羊膜中有無上皮，在與上皮側(cè)(上皮存在的一側(cè))呈相反側(cè)的表面(即絨毛膜側(cè))進(jìn)行纖維蛋白原等的附著。附著纖維蛋白原及凝血酶(根據(jù)情況還有抑肽酶)之后，根據(jù)需要 實(shí)施干燥處理。如此，形成保存穩(wěn)定性優(yōu)異的片狀組合物。此外，成為 在處理(輸送、移植操作等)方面也優(yōu)選的形態(tài)。作為干燥處理，可以釆用風(fēng)干、真空干燥、減壓干燥、凍干等一般 的干燥處理方法。(含有細(xì)胞層的片狀組合物的制備方法)在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在羊膜上形成使用活體來源的細(xì)胞的 細(xì)胞層。形成細(xì)胞層的步驟可以按著下面的順序?qū)嵤?。首先，?zhǔn)備適當(dāng) 的活體來源的細(xì)胞(制備活體來源的細(xì)胞的步驟)。作為活體來源的細(xì) 胞，使用適合于最終得到的片狀組合物的用途的細(xì)胞。例如，制作皮膚 表皮組織的再生用片時，優(yōu)選使用皮膚表皮細(xì)胞(包括其干細(xì)胞、前體 細(xì)胞)或毛嚢上皮細(xì)胞(包括其干細(xì)胞、前體細(xì)胞)等。同樣地，以角 膜上皮組織的再生為目的時，優(yōu)選使用角膜上皮細(xì)胞(包括其干細(xì)胞、前體細(xì)胞)；以粘膜上皮組織的再生為目的時，優(yōu)選使用粘膜上皮細(xì)胞 (包括其干細(xì)胞、前體細(xì)胞)。作為粘膜上皮細(xì)胞的例子，可以舉出口 腔粘膜上皮細(xì)胞、腸道粘膜上皮細(xì)胞、呼吸道粘膜上皮細(xì)胞等。對于活體來源的細(xì)胞的制備方法，以皮膚表皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、 口腔粘膜上皮細(xì)胞、腸道粘膜上皮細(xì)胞及呼吸道粘膜上皮細(xì)胞為例進(jìn)行 說明。(皮膚表皮細(xì)胞)首先，采取皮膚時，預(yù)先用聚乙烯吡咯酮碘等消毒藥預(yù)防性地消毒 釆取部位，進(jìn)行抗真菌劑的外用涂布之后，依照皮膚活檢采取小皮膚片。 培養(yǎng)表皮角化細(xì)胞時，用剪子從皮膚片中盡可能地剔除脂肪組織和真 皮，用杜氏磷酸緩沖液(PBS)清洗數(shù)次。在70%乙醇中浸泡1分鐘來 進(jìn)行滅菌。切成長方條狀，浸于分散酶液中，在4t:下靜置一晚。接著 將表皮從真皮上剝離。把剝離得到的表皮清洗后，切碎表皮片，調(diào)配表 皮角化細(xì)胞懸浮液。把細(xì)胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中，播種于膠原被覆培 養(yǎng)皿上，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，(角膜上皮細(xì)胞)角膜上皮細(xì)胞可從角膜緣部組織中獲得。例如，從角膜緣部組織剝離 去除內(nèi)皮細(xì)胞，切除結(jié)膜，制作單一細(xì)胞懸浮液。然后把它保存于氮罐中，接著迅速在37X:下融解來調(diào)配角膜上皮細(xì)胞懸浮液。根據(jù)需要，進(jìn)行傳代 培養(yǎng)。對傳代培養(yǎng)而言，例如，可使用無血清培養(yǎng)基EpilifeTM(CASCADE 公司)、MCDB153培養(yǎng)基(日水制藥林式會社)或改變這些培養(yǎng)基的M 酸組成等而制成的培養(yǎng)基等。(口腔粘膜上皮細(xì)胞)作為口腔粘膜上皮細(xì)胞，可以使用存在于齒根部的細(xì)胞(口腔內(nèi)緣 粘膜上皮細(xì)胞)、口唇部細(xì)胞、口上顎部細(xì)胞、頰部細(xì)胞等。其中，口 腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞因其增殖能力高且抗原性低，而特別優(yōu)選使用它。 口腔粘膜上皮細(xì)胞可以用手術(shù)刀等切除目標(biāo)細(xì)胞存在的部位，或通過進(jìn) 行刮除來釆取。對于口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞，可以通過將拔牙時附著的 口腔粘膜上皮從牙釉質(zhì)牙骨質(zhì)移行部分離出來，由此進(jìn)行釆取。在此， 為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進(jìn)行用分散酶或胰蛋白酶等酶的處理或 過濾器處理。(腸道粘膜上皮細(xì)胞)腸道粘膜上皮細(xì)胞是在大腸內(nèi)窺鏡下從腸道上皮活檢組織中釆取，或 者用剖腹手術(shù)時常規(guī)的手法采取。還可以用激光捕捉顯微解剖(lazer capture microdissection )方法從組織中切除上皮細(xì)胞。本發(fā)明技術(shù)也適用 于食道、胃、十二指腸、小腸、大腸的人的所有消化道上皮細(xì)胞而制作的 片狀組合物。由于潰瘍、炎癥等，人的消化道上皮受到損傷時，骨髓來源 細(xì)胞發(fā)揮應(yīng)對緊急事態(tài)的急救作用，而修復(fù)上皮。消化道上皮細(xì)胞的一部 分也可以由骨髓制作。從這個意義上本發(fā)明的意義可以與使用角膜上皮細(xì) 胞視為同等。通常1000個中只有少數(shù)幾個可以由骨髓生成的上皮細(xì)胞，在 胃潰瘍、大腸炎等引起的消化道內(nèi)面的潰瘍(傷口 )治愈的過程中增加50 倍到100倍，已確認(rèn)大約10個中有1個消化道上皮細(xì)胞為骨髓來源。這里 制作的消化道粘膜上皮細(xì)胞來源片狀組合物，認(rèn)為對于認(rèn)定為難癥的重癥 腸道感染癥、潰瘍性大腸炎、克隆病、貝切特病等腸道病的難治潰瘍、炎 癥而言，在促進(jìn)腸道上皮的再生方面也是頗有意義的。也期待著對腸道變態(tài)反應(yīng)的可用性。(呼吸道粘膜上皮細(xì)胞)呼吸道粘膜上皮細(xì)胞容易從呼吸道粘膜的活檢組織中得到，與上述的 組織相同，為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進(jìn)行用分散酶或胰蛋白酶等酶 處理或過濾器處理。呼吸道粘膜上皮細(xì)胞通過P防御素的生物合成、^^放等，對各種感染癥的病情JC^重要的作用。而且，呼吸道粘膜上皮對哮喘、變態(tài)反應(yīng)疾病中所起的作用也高。對受到組織損傷的呼吸道粘膜提供 本發(fā)明的由呼吸道粘膜上皮細(xì)胞制作的片狀組合物，不僅是緊急時進(jìn)行應(yīng) 對，還可用于人工呼吸道的提供。尤其羊膜上制作的片所具有的免疫抑制 作用是有益的?？谇徽衬ど掀ぜ?xì)胞、腸道粘膜上皮細(xì)胞等，特別是在釆取組織之后， 為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)，優(yōu)選進(jìn)行用M酶或胰蛋白酶等酶的處理或過 濾器處理?；铙w來源的細(xì)胞優(yōu)選由接受片狀組合物移植的受者(recipient)制備。 即、優(yōu)選活體來源的細(xì)胞的供體和活體移植片的受者是相同的人。通過使 用這樣的自體細(xì)胞，可解決免疫排斥的問題。制備好的活體來源的細(xì)胞被播種到羊膜上(將活體來源的細(xì)胞播種 到羊膜上的步驟)，供給其后的培養(yǎng)(培養(yǎng)經(jīng)播種的活體來源的細(xì)胞并 使其增殖的步驟)。在該實(shí)施方式中，特別優(yōu)選使用去除了上皮的羊膜。通過去除上皮， 可以期待抗原性的降低，此外，通過事先去除不需要的細(xì)胞，可以良好 地形成目的細(xì)胞層。使用去除了上皮的羊膜時，優(yōu)選在去除上皮而表露 出的面?zhèn)?即基底膜側(cè))播種活體來源的細(xì)胞。這是因?yàn)樵谠撁鎮(zhèn)群?豐富的IV型膠原，認(rèn)為播種的活體來源的細(xì)胞的增殖、多層化會良好 地進(jìn)行。在此，也可以通過使用二種以上的細(xì)胞，形成經(jīng)雜化的細(xì)胞層。對 于這種情況的細(xì)胞層的具體形成方法，以制作角膜上皮再建用的片狀組 合物為例，詳述如下。首先，作為細(xì)胞層形成中使用的細(xì)胞種之一 (第1細(xì)胞)，優(yōu)選使 用口腔粘膜上皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞、鼻腔粘膜上皮細(xì)胞、或其他粘膜 上皮細(xì)胞、或者能夠構(gòu)建這些中的任意一種粘膜上皮的未分化細(xì)胞。另一方面，作為與第1細(xì)胞一起用于細(xì)胞層形成的細(xì)胞種(第2細(xì)胞)，優(yōu) 選使用角膜上皮細(xì)胞、結(jié)膜上皮細(xì)胞、或羊膜上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞從其 存在的活體組織中采取。具體地說，例如，用手術(shù)刀等采取目的細(xì)胞存 在的組織的一部分之后，經(jīng)過結(jié)締組織的去除、細(xì)胞的分離等處理，制 備成細(xì)胞懸浮液(懸濁液)的形態(tài)。另外，作為第l細(xì)胞可以使用不同 的二種以上的細(xì)胞。對于第2細(xì)胞也同樣地可以使用不同的二種以上的 細(xì)胞。在優(yōu)選作為第1細(xì)胞釆取源的口腔粘膜上皮中提示有干細(xì)胞的存在， 可認(rèn)為容易實(shí)施向形成上皮樣細(xì)胞層的細(xì)胞分化誘導(dǎo)。另外，利用口腔粘 膜上皮細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)容易釆取，可大量釆取細(xì)胞，進(jìn)而在處置雙眼 性患者的情況下也可以用自體的細(xì)胞制備移植材料等。尤其是，對于不能 采取角膜上皮細(xì)胞的患者，可以應(yīng)用自體細(xì)胞來源的移植材料，其優(yōu)點(diǎn)是， 可以大幅度地解除臨床上極其重要的排斥反應(yīng)問題。作為口腔粘膜上皮細(xì)胞可以采用存在于齒根部的細(xì)胞(口腔內(nèi)緣粘膜 上皮細(xì)胞)、口唇部細(xì)胞、口上顎部細(xì)胞、頰部細(xì)胞等。其中，口腔內(nèi)緣 粘膜上皮細(xì)胞由于其增殖性能高，而且抗原性低，故特別優(yōu)選采用它?？?腔粘膜上皮細(xì)胞可以從目標(biāo)細(xì)胞所在部位用手術(shù)刀等切除，或進(jìn)行刮除來 采取。對于口腔內(nèi)緣粘膜上皮細(xì)胞，可以通過將拔牙時附著的口腔粘膜上 皮從牙釉質(zhì)牙骨質(zhì)移行部分離來采取。另外，為了去除結(jié)締組織等雜質(zhì)， 優(yōu)選實(shí)施用分軟酶或胰蛋白酶等酶處理或過濾器處理。也可以釆用從準(zhǔn)備移植本發(fā)明制作的片狀組合物的患者以外的口腔所 采取的口腔粘膜上皮細(xì)胞，但若考慮免疫排斥反應(yīng)，優(yōu)選從患者自身的口 腔采取口腔粘膜上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于口腔粘膜增殖能力高，通常，術(shù)后數(shù)日內(nèi)服抗生素，通過漱口藥 水(Isodine)消毒等來治愈創(chuàng)傷，因而認(rèn)為通過采取粘膜引起的患者自身 的侵害是輕度的。另一方面，作為第2細(xì)胞，可以優(yōu)選用他人(alio)的角膜上皮細(xì)胞。這樣的角膜上皮細(xì)胞，例如可以從眼庫(Northwestlions eye bank等)中 獲得沒有感染癥的供者的目 。作為第2細(xì)胞可以使用的細(xì)胞不限于角膜 上皮細(xì)胞，也可以使用結(jié)膜上皮細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞等。但是，若采用作 為在活體中構(gòu)成角膜上皮的細(xì)胞的角膜上皮細(xì)胞、或在其附近存在的結(jié)膜 上皮細(xì)胞，則認(rèn)為可構(gòu)建更好地再現(xiàn)角膜上皮特性的片狀組合物。本發(fā)明 人等的研究結(jié)果確認(rèn)，使用角膜上皮細(xì)胞作為第2細(xì)胞時，可以構(gòu)建類似 于角膜上皮的細(xì)胞層。這一事實(shí)支持上述的預(yù)想，并且印證了特別優(yōu)選角 膜上皮細(xì)胞作為第2細(xì)胞。另一方面，使用羊膜上皮細(xì)胞作為第2細(xì)胞時， 也被確認(rèn)可形成良好地再現(xiàn)角膜所要求的特性的細(xì)胞層。這一事實(shí)表明， 還可以優(yōu)選使用羊膜上皮細(xì)胞作為第2細(xì)胞?？梢岳米泽w的細(xì)胞作為第2細(xì)胞，但是如果釆用他人的細(xì)胞則可以 更容易獲得細(xì)胞。例如，即使為雙眼性患者制作治療用片狀組合物時，也 可以獲得作為第2細(xì)胞的角膜上皮細(xì)胞。將分別調(diào)制好的第1細(xì)胞和第2細(xì)胞(以下，把這些統(tǒng)稱為"第1細(xì) 胞等")播種在羊膜上，進(jìn)行培養(yǎng)。通常，將調(diào)制成細(xì)胞懸浮液形態(tài)的第1 細(xì)胞和第2細(xì)胞分別往羊膜上滴加，實(shí)施培養(yǎng)。典型地i兌，第1細(xì)胞的播種和第2細(xì)胞的播種同時(這里的"同時" 當(dāng)然包括文字所表示的同時，也包括一方播種后沒有實(shí)質(zhì)性的時間間隔地 播種另一方的情況)實(shí)施，例如，在播種第1細(xì)胞后經(jīng)過數(shù)分~數(shù)小時的 時間，播種第2細(xì)胞等，也可以在不同的時機(jī)播種兩者。這樣通過錯開播 種時機(jī)，可以構(gòu)建例如富有來源于第1細(xì)胞的細(xì)胞的區(qū)域局部存在的細(xì)胞 層等，可以構(gòu)建非均質(zhì)的細(xì)胞層。播種的第1細(xì)胞等的比率沒有特別限定，典型地說，播種大體等數(shù)的 第1細(xì)胞和第2細(xì)胞。應(yīng)說明的是，在釆用口腔粘膜上皮細(xì)胞作為第1細(xì) 胞，采用角膜上皮細(xì)胞作為第2細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，比較第1細(xì)胞數(shù)與第2細(xì) 胞數(shù)的比為3:7的情況、5:5的情況以及7:3的情況，結(jié)果表明在細(xì)胞增殖 及多層化方面，它們之間沒有明顯的差異(未出示數(shù)據(jù))。通過在羊膜上培養(yǎng)第1細(xì)胞及第2細(xì)胞，這些細(xì)胞增殖而形成細(xì)胞 層(認(rèn)為該過程中至少一部分細(xì)胞分化)。形成細(xì)胞層之后，實(shí)施使該 細(xì)胞層的表層接觸空氣的步驟。另外，在本說明書中也將該步驟稱為空氣上舉(Air-lifting )。該步驟是為了使形成細(xì)胞層的細(xì)胞分化以及誘導(dǎo)屏 障功能而實(shí)施的。該步驟可以如下進(jìn)行通過用滴液管、移液管等暫時去除一部分培養(yǎng) 液而使培養(yǎng)液表面降低，由此使細(xì)胞層的最表層暫時露出于培養(yǎng)液外。或 者，也可以通過將細(xì)胞層連同羊膜一^往上提升，將最表層暫時從培養(yǎng)液 表面露出。進(jìn)而，可以用管等把空氣送入培養(yǎng)液中，使細(xì)胞層的最上層與 空氣接觸。從操作容易性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選通過降低培養(yǎng)液表面而使細(xì)胞 層的最表層露出的方法進(jìn)行。進(jìn)行該步驟的時間，即是多層化細(xì)胞層的最表層與空氣接觸的時間， 根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)、培養(yǎng)條件等而變化，例如3天~2周左右，優(yōu)選為l周 以內(nèi)，更優(yōu)選為3日以內(nèi)。根據(jù)以上的本發(fā)明的方法，在羊膜上形成第1細(xì)胞等多層化的角膜上 皮樣的細(xì)胞層。這樣得到的片狀組合物，可以與作為第1細(xì)胞等的培養(yǎng)基 質(zhì)而采用的羊膜一起用作對于角膜損傷、缺損等的患者的移植材料(代替 角膜上皮)。在這種情況下，以羊膜成為眼球側(cè)的方式移植到角膜上皮缺 損部位。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在支持細(xì)胞的存在下進(jìn)行活體來源的 細(xì)胞的培養(yǎng)。所謂支持細(xì)胞也稱飼養(yǎng)(feeder)細(xì)胞，在培養(yǎng)液中供給成 長因子等等。由于在與支持細(xì)胞的共存下進(jìn)行培養(yǎng)，提高細(xì)胞的增殖效率。 支持細(xì)胞可以使用例如3T3細(xì)胞(瑞士小鼠3T3細(xì)胞、小鼠NIH3T3細(xì)胞、 3T3J2細(xì)胞等)等。其中，從增殖效率和操作容易等觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用 小鼠NIH3T3細(xì)胞作為支持細(xì)胞。優(yōu)選預(yù)先用絲裂酶素C等對支持細(xì)胞實(shí)施非活性化。這是為了防止 隨著支持細(xì)胞自身增殖而阻礙活體來源的細(xì)胞的增殖，來提高活體來源 的細(xì)胞的增殖效率。這種非活性化也可以通過放射線處理等來實(shí)施。支持細(xì)胞的細(xì)胞密度可以是，例如約1乂102個/ 112以上，優(yōu)選約lx 102個/cm2 ~約1 x io7個/cm2,更優(yōu)選約1 x 103個/cm2 ~約1 x 105個/cm2。 用與第l細(xì)胞等的對比來說，例如，可以在使用的支持細(xì)胞數(shù)相對于活體 來源的細(xì)胞的總數(shù)為1/1()S倍 lxl(^倍、優(yōu)選1/102 ~ 1倍的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。若支持細(xì)胞數(shù)少，則活體來源的細(xì)胞的增殖率降低，在過少的情況 下，得不到活體來源的細(xì)胞良好的增殖及多層化。另一方面，在支持細(xì)胞 數(shù)過多的情況下，活體來源的細(xì)胞的增殖率反而下降，因而不優(yōu)選。在支持細(xì)胞共存下進(jìn)行活體來源的細(xì)胞的培養(yǎng)時，優(yōu)選在支持細(xì)胞與 羊膜之間設(shè)置支持細(xì)胞不能通過的孔徑尺寸的隔離膜。通過利用該隔離 膜，在培養(yǎng)時可防止支持細(xì)胞侵入到羊膜側(cè)(即活體細(xì)胞側(cè))。其結(jié)果是 不用擔(dān)心最終獲得的片狀組合物內(nèi)混有支持細(xì)胞。這就意味著可以制作沒 有因支持細(xì)胞所致的免疫排斥問題的片狀組合物，在臨床上有極其重要的 意義。作為隔離膜，可以適當(dāng)選擇使用具有支持細(xì)胞不能通過的孔徑尺寸的公知的隔離膜。例如，可以使用聚碳酸酯制的、孔徑尺寸約0.化m 3.0nm的膜。隔離膜的材質(zhì)沒有特別限定，除了聚碳酸酯以外，也可以 是聚酯等。這樣的隔離膜在市場上出售，能容易地得到。作為使用隔離膜時的培養(yǎng)方法的例子可舉出以下的方法。首先，通過 在培^jol等容器(第l容器)中播種培養(yǎng)非活性化的支持細(xì)胞，從而在容器表面形成支持細(xì)胞層。其次，把用隔離膜形成底面的第2容器設(shè)置于第 1容器內(nèi)。這時，調(diào)整第2容器的位置，使得第2容器的底面處于培養(yǎng)液 中。繼而，在第2容器的底面、即隔離膜上載置或附著羊膜。然后，在羊 膜上播種活體來源的細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。在第2容器的底面預(yù)先載置或附著羊膜(例如，在第2容器的底面 載置去除了上皮的羊膜，在該狀態(tài)下暫時進(jìn)行干燥處理)，將該第2容器 設(shè)置于播種了支持細(xì)胞的第1容器內(nèi)，然后可以在羊膜上播種活體來源的 細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)活體來源的細(xì)胞時使用的培養(yǎng)液，只要能使該細(xì)胞增殖、多層 化就沒有特別限定。例如，可以使用如下的培養(yǎng)基以規(guī)定比例混合在 上皮細(xì)胞的成長中通常使用的DMEM (Dulbecco，s modified Eagle's medium)和Ham，s F12培養(yǎng)基(Ham's F12 medium )，添加FBS、成長 因子、抗生素等而得到的培養(yǎng)基。具體例可舉出，添加有FBS(10"/。)、 胰島素(5mg/ml )、霍亂毒素(0.1nM)、上皮細(xì)胞生長因子(EGF )(10ng/ml) 以及青霉素-鏈霉素(50IU/ml)的、DMEM和Ham's F12培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基(混合體積比l:l)。此外，還可以使用進(jìn)一步添加有三碘曱狀 腺原氨酸(例如2nM )、谷氨酰胺(例如4mM )、轉(zhuǎn)鐵蛋白(例如5 mg/ml )、 腺噪呤(例如0.18mM )和/或氫化可的矛> (例如0.4mg/ml )的 DMEM/Ham,s F12混合培養(yǎng)基。還可以在異種動物細(xì)胞不存在的條件下進(jìn)行活體來源的細(xì)胞的培 養(yǎng)。本發(fā)明中的"異種動物細(xì)胞不存在的條件下"是指，作為培養(yǎng)活體 來源的細(xì)胞時的條件，不使用對該活體來源的細(xì)胞而言為異種的動物細(xì) 胞。具體地說，是指使用人細(xì)胞(例如人皮膚表皮細(xì)胞或人角膜上皮細(xì) 胞)作為活體來源的細(xì)胞時，小鼠或大鼠等人以外的動物種的細(xì)胞在培 養(yǎng)液中不存在(不共存)的條件。通過在這樣的條件下實(shí)施培養(yǎng)，不用 擔(dān)心在最終得到的移植材料(即片狀組合物)中混入異種來源的成分(包 括異種細(xì)胞自身)。培養(yǎng)活體來源的細(xì)胞時使用的培養(yǎng)基，只要能使該細(xì)胞增殖就沒有 特別限定。例如，可以使用如下培養(yǎng)基MCDB153培養(yǎng)基(日水制藥 林式會社)、或EpiLife (Cascade公司)、改變這些培養(yǎng)基的氨基酸 組成等而制成的培養(yǎng)基、以規(guī)定比例混合上皮細(xì)胞的成長中通常使用的 DMEM ( Dulbecco,s modified Eagle's medium)和Ham's F12培養(yǎng)基 (Ham's F12 medium)而得的培養(yǎng)基等。特別優(yōu)選在本發(fā)明中使用無 血清且不含異種動物來源的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。另一方面，可以使用添加 有成長因子或抗生素等的培養(yǎng)基。但是，優(yōu)選使用不含血清的培養(yǎng)基。 即，優(yōu)選釆用無血清培養(yǎng)法作為本發(fā)明中的培養(yǎng)方法。這是因?yàn)榭梢员?免因混入血清來源的成分而導(dǎo)致的免疫排斥等問題。還可以在含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此時，優(yōu)選使用同種來源的血清(培養(yǎng)人的活體來源 的細(xì)胞時為人來源的血清)、或者使用自體血清。當(dāng)然，只要可能，優(yōu) 選使用不會擔(dān)心引起免疫排斥反應(yīng)的自體血清。為了良好地增殖活體來源的細(xì)胞，在培養(yǎng)步驟過程中也可以變更培 養(yǎng)條件。培養(yǎng)步驟的結(jié)果是活體來源的細(xì)胞在羊膜上增殖。在有必要將這樣 得到的細(xì)胞層的表層角化時(例如使用皮膚表皮細(xì)胞制作皮膚表皮片 時、使用角膜上皮細(xì)胞制作角膜上皮片時)，可以實(shí)施上述的空氣上舉 (Air-lifting )。將活體來源的細(xì)胞播種到羊膜上,使得例如細(xì)胞密度達(dá)到約lxl03 個/cm2以上、優(yōu)選約lxl()3個/cm2 約lxl()7個/cm2、進(jìn)一步優(yōu)選約lx104 個/ 112~約lxl()6個/cm2。在優(yōu)選的一種實(shí)施方式中，在預(yù)先制備好的含有人成纖維細(xì)胞的 膠原基質(zhì)上載置羊膜，其后，在羊膜上播種活體來源的細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。 即，在該實(shí)施方式中，實(shí)施如下步驟在膠原凝膠內(nèi)培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞 的步驟(步驟B)、及在上述膠原凝膠上載置羊膜之后，將上述活體來 源的細(xì)胞播種或栽置在該羊膜上的步驟(步驟C)。按這樣的順序制成 的片狀組合物含有在載置于含人成纖維細(xì)胞的膠原凝膠上的羊膜上增 殖的活體來源的細(xì)胞。該實(shí)施方式的片狀組合物在去除膠原基質(zhì)之后可 以用作移植材料。此外，也可以與膠原基質(zhì)一起用作移植材料。"膠原皿"是作為人成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基質(zhì)而發(fā)揮作用。作為膠原 ^^f材料的膠原種類沒有特殊限定，可以使用I型膠原、III型膠原、IV 型膠原等。也可以使用多種^^、混合存在的膠原。這些膠原可以通過酸溶 解法、堿溶解法、酶溶解法等從豬、牛、羊等動物的皮膚、軟骨等結(jié)締組 織中提取、精制。在此，為了降低抗原性，優(yōu)選使用通過用胃蛋白酶或胰 蛋白酶等分解酶處理來去除端肽的、所謂的組織修復(fù)膠原 (atherocollagen )。作為膠原凝膠的材料，可以使用羊膜來源的、特別是 人羊膜來源的膠原。在此，所謂的羊膜來源是指廣義的以羊膜為初始原材 料而得到的物質(zhì)。膠原凝膠所含有的人成纖維細(xì)胞的來源沒有特別限定，只要產(chǎn)生膠 原則哪一種組織來源都可以，例如可以使用由皮膚組織、口腔粘膜組織等 制備得到的人成纖維細(xì)胞。顯示膠原基質(zhì)的制作方法的具體例子。首先，按以下的順序制^^人 成纖維細(xì)胞。釆取皮膚，接著從皮膚剝離真皮。把真皮切碎，使其附著于 I型^^、 _試亞。靜置培養(yǎng)，將從真皮片游離的人成纖維細(xì)胞進(jìn)行傳代 培養(yǎng)。使細(xì)胞從試亞底面剝離，調(diào)配細(xì)胞懸浮液，播種于細(xì)胞培養(yǎng)用試皿。 適當(dāng)?shù)貎龃?例如在液氮中M)細(xì)胞。另一方面，用I型膠原調(diào)制中和膠原液(參照后述的實(shí)施例)。把它 添加到培養(yǎng)容器(例如培養(yǎng)嵌套)中，在室溫中靜置10分鐘左右，使其凝膠化。接著，用上述方法將預(yù)先培養(yǎng)好的對數(shù)增殖期的人成纖維細(xì)胞混合 于該凝膠中，再次使其皿化。然后，靜置培養(yǎng)。通過以上順序得到含有 人成纖維細(xì)胞的膠原基質(zhì)。通過該創(chuàng)意努力，形成了有必要的強(qiáng)度、且能 夠載置羊膜層、活體來源的細(xì)胞的^f、基質(zhì)，成為本發(fā)明的基礎(chǔ)。在膠原 基質(zhì)上載置(附著)另行準(zhǔn)備的羊膜。其后，按上述順序?qū)嵤┘?xì)胞的播種、 培養(yǎng)。另外，伴隨著使粘附成分(纖維蛋白原等)附著于羊膜表面的操 作，在粘附成分的附著操作之前形成細(xì)胞層。即，在該實(shí)施方式中，在 羊膜上形成細(xì)胞層之后，使纖維蛋白原等粘附成分附著于羊膜表面(未 形成細(xì)胞層一側(cè)的表面)。實(shí)施例1l.海藻糖處理 凍干羊膜的制備l-l.羊膜的釆取對于沒有全身合并癥的準(zhǔn)備剖腹產(chǎn)的孕婦事先會同婦產(chǎn)科醫(yī)生進(jìn)4iS人 真的說明、取得同意后，在手術(shù)室剖腹產(chǎn)時采取羊膜。操作要注意清潔， 按手術(shù)操作洗手后穿上手術(shù)袍。M前準(zhǔn)備清潔的釆取羊膜用搪瓷盤和清 洗用生理鹽水。M后將胎盤組織移到搪瓷盤上，用手把羊膜組織從胎盤 剝離。羊膜與胎盤的粘連牢固的部分用剪刀切除。1-2.羊膜的處理羊膜處理的過程按(1)清洗、(2)修整、(3)保存的順序?qū)嵤?在全部過程中，優(yōu)選在清潔的通風(fēng)櫥內(nèi)操作，全部使用經(jīng)滅菌的容器和 器具，培養(yǎng)皿等使用經(jīng)滅菌的一次性(可任意處理的)培養(yǎng)皿。用生理鹽水邊清洗邊去除附著于所釆取的羊膜上的血液成分，再用足夠量的生 理鹽水(添加0.005%氧氟沙星)清洗。接著，用添加有青霉素-鏈霉 素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS)總計清洗3次。接著，把羊膜移到培 養(yǎng)皿內(nèi)，用剪刀進(jìn)行約4x3cm左右大小的分割。分割后以形狀、厚度 等為基準(zhǔn)，選擇狀態(tài)良好的羊膜。1-3.羊膜的保存在2cc的滅菌低溫管中各注入lcc的保存液，把每一片經(jīng)采取、清 洗后選出的羊膜裝入，加上標(biāo)記后，保存于-80"C的低溫冰箱中。保存 液使用含有50%滅菌過的甘油的DMEM(Dulbecco，S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL公司)。保存的羊膜使用期限是3個月，若過期就 進(jìn)行焚燒處理。另外，未進(jìn)行這樣的保存處理也可以實(shí)施以下的上皮處 理。l-4.羊膜上皮的處理將在-80"C下保存的羊膜在室溫下解凍之后，用添加有青霉素-鏈 霉素(50IU)的磷酸緩沖液(PBS )清洗2次。將清洗后的羊膜浸于0.02 % EDTA溶液(Nacalai tesque公司)(100mm培養(yǎng)皿)中、在37。C的C02 培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)1小時。反應(yīng)后用足量的PBS清洗羊膜2次，在實(shí)體顯 微鏡下，用細(xì)胞刮器(Nunc公司USA)用手刮除(去除)上皮。另外， 以光學(xué)以及電子顯微鏡操作(掃描型電子顯微鏡)確認(rèn)用這種處理方法 是否完全去除刮除了 一層羊膜上皮。l-5.海藻糖處理.凍干羊膜的制備將去除了上皮的羊膜在10% (w/v)海藻糖溶液中在37X:浸漬2小 時。海藻糖溶液是將海藻糖(Torehainochi, H plus V Lifescience公 司、林原制)以蒸餾水稀釋而制備的。溶液的pH保持在7 10的范圍。 將羊膜用一組滅菌后的塑料框夾持，之后以夾具固定。和框一起移入-80 1C的低溫水箱內(nèi)，待確認(rèn)羊膜凍結(jié)后，使用真空凍干機(jī)(Yamato、 NEOCOOL)進(jìn)行凍干處理(-110"C、約1小時)。根據(jù)使用說明書， 以能獲得充分干燥體來進(jìn)行條件設(shè)定。從框中將凍干處理后的羊膜取 下，移入外側(cè)為聚酰胺尼龍、內(nèi)側(cè)為聚乙烯所制成的雙層結(jié)構(gòu)的袋內(nèi)， 使用家用真空包裝器(FLAME NUOVA、 MAGIC VAC )進(jìn)行真空包裝。 對如此獲得的真空袋狀態(tài)的羊膜進(jìn)行Y射線照射(約25kGy)來滅菌。 將滅菌處理后的羊膜直接以真空袋狀態(tài)常溫保存至即將使用時。另外， 從保存開始經(jīng)12個月，也能維持剛凍干后的狀態(tài)。下面的實(shí)驗(yàn)使用常 溫保存一個月后的干燥羊膜。2.海藻糖處理.凍干羊膜的物性評價以上述順序制備的海藻糖處理.凍干羊膜(也稱作海藻糖處理FD-AM)在室溫下浸漬于PBS至充分復(fù)元后，進(jìn)行其物性評價。試驗(yàn) 項目、試驗(yàn)方法如下。另外，將分別制備的五片海藻糖處理 凍干羊膜 供給各試驗(yàn)，將得到的測定值的平均值用于評價。此外，準(zhǔn)備未實(shí)施上 皮處理、海藻糖處理以及凍干處理的羊膜(未加工羊膜)以及除了未實(shí) 施海藻糖處理以外以同樣順序制備的凍干羊膜，作為物性評價的基準(zhǔn) (比較對照)。(1) 厚度用Keyence公司制的雙掃描高精度激光測定器(LT-卯10M)進(jìn)行 厚度的測定。(2) 透明度使用日本電色社制造的濁度計(NDH2000)測定濁度，用于透明 度的評價。濁度以下式計算。霧度(濁度)=漫透射率(DF) /全光線透 射率(TT )(3) 拉伸強(qiáng)度拉伸強(qiáng)度的測定使用A&D公司制造的拉伸強(qiáng)度計(Tensilon RTC-1210A)。(4 )柔軟性為了測定柔軟性，使用Karlzeiss制、顯微外科手術(shù)用顯微鏡以 肉目艮檢測褶皺的存在。用3人分別測定在眼球整個面的范圍內(nèi)褶皺的個 數(shù)，由其平均值評價柔軟性。試驗(yàn)結(jié)果如圖3~圖6所示。首先，如圖3所示可知海藻糖處理-凍 干羊膜比凍干羊膜厚。認(rèn)為是由于經(jīng)海藻糖處理后水分保持能力提高的 緣故。另外，反映出去除上皮層的情況，即海藻糖處理.凍干羊膜比未 加工羊膜(AM)還薄^艮多。其次，如圖4所示海藻糖處理.凍干羊膜比凍干羊膜的透明度高。 如此，表明了海藻糖處理導(dǎo)致透明性提高這個令人驚訝的事實(shí)。與海藻糖處理.凍干羊膜相比，未加工羊膜的透明度差是由于上皮層的存在引起的o另一方面，如圖5所示，海藻糖處理 凍干羊膜比凍干羊膜的拉伸 強(qiáng)度高。令人驚訝的是，即使與具備上皮的羊膜(未加工羊膜)相比， 也是海藻糖處理 凍干羊膜的強(qiáng)度高。如此，就表明了海藻糖處理對于 提高羊膜的強(qiáng)度是非常有效的。并且，如圖6所示，海藻糖處理 凍干羊膜的柔軟性與凍干羊膜大 為差異，和未加工羊膜是同等的。如此，海藻糖處理因提高羊膜的柔軟 性而非常有效。3. 海藻糖處理■凍干羊膜的活體適合性評價對于移植于活體的材料的活體適合性要求高。因此，海藻糖處 理 凍干羊膜的活體適合性按著以下順序評價。用手術(shù)刀由6周齡日本家兔的眼表面切入角膜實(shí)質(zhì)層。繼而，將 修整為適當(dāng)大小的海藻糖處理'凍干羊膜插入到實(shí)質(zhì)層的切口內(nèi)。在以 上移植術(shù)后，經(jīng)時觀察眼表面的狀態(tài)。剛移植完和移植后一個月眼表面 的狀態(tài)示于圖7。在移植后一個月時，沒有看到從周圍新生血管，也沒 有炎癥反應(yīng)。并且，眼表面的透明性也比剛移植完顯著提高了。從該結(jié) 果判斷，海藻糖處理'凍干羊膜的活體適合性與未處理的羊膜是同等的。為了對活體適合性作更詳細(xì)調(diào)查，在移植后一個月時，將包含移 植部的角膜的一部分摘出進(jìn)行HE染色。HE染色圖像示于圖8。移植 片(即，海藻糖處理 凍干羊膜)用箭頭指示。由圖8所示，上皮的分 化異常、角膜內(nèi)血管新生、上皮浮腫、以及細(xì)胞浸潤都沒有看到。由該 結(jié)果確認(rèn)了海藻糖處理 凍干羊膜的抗原性極低、活體適合性優(yōu)異。4. 使用海藻糖處理 凍干羊膜制備培養(yǎng)角膜上皮片 4-l.回收角膜上皮細(xì)胞從6周齡的日本白色家兔釆取的角膜浸漬于含有10%牛胎兒血清 (FBS)的DMEM中，切除結(jié)膜、角膜內(nèi)皮等不需要的組織。之后，將 組織用磷酸緩沖液(PBS)清洗，在37t:下浸漬于含有1.2U/ml分散酶的(Nacalaitesque公司)的磷酸緩沖液(PBS)中1小時。取出處理后 的組織，在室溫下浸漬于0.02。/。EDTA中2分鐘，接著在室溫下浸漬于 磷酸緩沖液中2分鐘，使分散酶活性停止。在含有10 %胎牛血清(FBS ) 的DMEM中刮除角膜上皮細(xì)胞，之后經(jīng)離心處理來濃縮、回收角膜上 皮細(xì)胞。4-2.制備共培養(yǎng)細(xì)胞作為共培養(yǎng)細(xì)胞(支持細(xì)胞)，使用NIH-3T3細(xì)胞(以下簡稱"3T3 細(xì)胞")。將事先培養(yǎng)的長滿75F燒瓶(BD Falcon公司)的3T3細(xì)胞在 0.05。/。絲裂酶素C溶液中浸漬2小時，抑制3T3的增殖活性。接著，用 磷酸緩沖液(PBS)清洗數(shù)次去除絲裂酶素C。用0.05%胰蛋白酶-EDTA 溶液處理細(xì)胞后，移液操作制作細(xì)胞懸濁液(3T3細(xì)胞懸濁液)。4-3.細(xì)胞層的形成將在l.中得到的海藻糖處理'凍干羊膜在室溫下浸漬于PBS中直至 充分復(fù)元。將如此制備的人羊膜作為基質(zhì)，將角膜上皮細(xì)胞和3T3細(xì)胞 按以下的順序進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)器具使用6孔的培養(yǎng)皿(culture dish) (Corning公司，NY)和培養(yǎng)嵌套(培養(yǎng)插入容器)(聚碳酸酯制、平均 孑Uf圣尺寸3.0nm、 Corning公司，NY )。首先，在培一上以約1 x 104個/ 112的細(xì)胞密度播種313細(xì)胞懸浮液， 在37C、 5。/。C02的條件下培養(yǎng)。此外，在培養(yǎng)嵌套上將基底膜側(cè)(存在 上皮的一側(cè))朝上貼附羊膜，在室溫下干燥10分鐘。其后，在貼附羊膜的 培養(yǎng)嵌套上以約1 x 105個/ 112的細(xì)胞密度播種角膜上皮細(xì)胞懸浮液。以上操作后，如圖9所示，在培養(yǎng)i內(nèi)設(shè)置培養(yǎng)嵌套，在同一個培 養(yǎng)基中培養(yǎng)3T3細(xì)胞以及角膜上皮細(xì)胞。另外，圖9是表示培養(yǎng)中的狀態(tài) 的剖面模式圖。培養(yǎng)嵌套12靜置于培養(yǎng)亞11內(nèi)，在培養(yǎng)亞11底面形成 3T3細(xì)胞層15。此外，還顯示了如下狀態(tài)在培養(yǎng)嵌套12的底面上靜置 羊膜13，在其上培養(yǎng)有角膜上皮細(xì)胞14。符號16為培養(yǎng)基。使用如下培養(yǎng)基在DMEM/Ham，s F12混合培養(yǎng)基(混合體積比 1:1)中添加10%FBS、胰島素(5mg/ml)、霍亂毒素(O.lnM)、青霉 素-鏈霉素(50IU/ml)、人重組上皮細(xì)胞生長因子(EGF) (10ng/ml)。在上述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了 3周(Submerge),之后，為了分化誘 導(dǎo)粘膜上皮，利用所謂的空氣上舉(Air-lifting)法培養(yǎng)一周。所謂空 氣上舉法是將培養(yǎng)基的液面達(dá)到細(xì)胞層面為止，把該細(xì)胞層的表面暴露 在空氣中的方法，所述細(xì)胞層面是在羊膜上形成的角膜上皮細(xì)胞來源的 細(xì)胞層面。Submerge中隔天更換培養(yǎng)基，空氣上舉后每天更換培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)。其結(jié)果是在羊膜上形成細(xì)胞層。5.培養(yǎng)角膜上皮片的組織學(xué)特征的驗(yàn)證空氣上舉后在培養(yǎng)2天時，形成了近似于角膜上皮的細(xì)胞層(圖 IO右欄)?？芍?xì)胞層與正常角膜上皮同樣細(xì)胞多層化為5 7層。在該 細(xì)胞層的羊膜側(cè)存在類圓柱形的類似基底細(xì)胞的細(xì)胞群。并且，最表層 的細(xì)胞呈扁平形但具有核，與皮膚不同其表面沒有角化。如此確認(rèn)羊膜 上形成了類似角膜上皮的細(xì)胞層(角膜上皮樣層)。另外，以未進(jìn)行海 藻糖處理而凍干的羊膜(凍干羊膜)作為基質(zhì)，同樣地進(jìn)行角膜上皮細(xì) 胞培養(yǎng)時，雖然形成了細(xì)胞層，但是只看到l-2層的多層化(圖10左 欄)。由上述事實(shí)可以說，實(shí)施了海藻糖處理的凍干羊膜發(fā)揮了促進(jìn)角 膜正常分化的功能。其次，為了進(jìn)一步研究細(xì)胞層的組織學(xué)特性進(jìn)行免疫染色。首先， 將得到的細(xì)胞層與羊膜一起切成適當(dāng)?shù)拇笮。瑑鼋Y(jié)包埋于OCT化合物 中。之后，用冷凍切片機(jī)進(jìn)行薄切，制作載物切片。在進(jìn)行免疫染色時， 對作為代表性的細(xì)胞骨架蛋白的角蛋白相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行研究。即，檢查角 膜特異性角蛋白3、表皮特異性角蛋白10以及結(jié)膜特異性角蛋白13的 表達(dá)。方法如下以磷酸緩沖液(PBS)清洗載物切片后，用1%胎牛 血清(FBS)進(jìn)行封閉，抑制非特異性抗體反應(yīng)。然后，在室溫下使對 于各角蛋白的抗體(一次抗體)反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，以含有triton-X 的PBS在15分鐘、3次的條件下進(jìn)行洗滌，接著在室溫下使熒光標(biāo)記 抗體(2次抗體)反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，用磷酸緩沖液(PBS)在15分 鐘、3次的條件下進(jìn)行洗滌，封入后用共聚焦顯微鏡觀察組織。對細(xì)胞層的各種角蛋白的抗體反應(yīng)如下。首先都未看到對表皮特 異性角蛋白10以及結(jié)膜特異性角蛋白13的染色性(圖11下邊)。另一 方面，在大范圍內(nèi)看到對角膜特異性角蛋白3的染色性(圖ll右上邊)。 對角蛋白3的染色性在細(xì)胞層的上部強(qiáng)。從以上結(jié)果可確認(rèn)形成了近似于正常角膜上皮的上皮細(xì)胞層。6.使用培養(yǎng)角膜上皮片的移植實(shí)驗(yàn)使用4.制作的、在羊膜上形成有角膜上皮樣細(xì)胞層的片(培養(yǎng)角 膜上皮片)進(jìn)行以下的移植實(shí)驗(yàn)。首先，對家兔進(jìn)行角膜上皮細(xì)胞的釆取，使用月型刀從距離緣部 4mm的外側(cè)將角膜和結(jié)膜上皮以lOOjim的厚度全部去除。通過該操作， 由于含有角膜上皮干細(xì)胞的上皮細(xì)胞消失，所以可認(rèn)為再現(xiàn)了人為的眼 表面干細(xì)胞缺乏癥。接著，將培養(yǎng)角膜上皮片移植到緣部偏內(nèi)側(cè)的區(qū)域。移植時使用 10-0尼龍線縫合周圍組織。移植后，在移植片上縫上治療用軟性隱形眼 鏡。術(shù)后，涂上抗生素和類固醇眼用軟骨2次/日。在移植后的時間點(diǎn)， 顯示出與移植前的培養(yǎng)角膜上皮片同樣的透明度。在移植后2天以及14天觀察實(shí)施移植術(shù)的眼表面。并且，實(shí)施熒 光素染色試驗(yàn)。另外，熒光素染色試驗(yàn)如下進(jìn)行使熒光素試紙含抗生 素的眼藥等水分，并直接涂于眼表面，使之眨眼2、 3次后，觀察眼表 面的熒光素染色性。如果角膜上皮殘存，則由于其緊密的細(xì)胞間粘附結(jié) 構(gòu)而熒光色素不浸潤，未見到由熒光素引起的染色。在移植后2天，眼表面維持透明性(圖12左上邊)。另外，通過熒 光素染色，確認(rèn)了培養(yǎng)角膜片無缺損地殘存在眼表面(圖12左下邊)。 另一方面，移植的培養(yǎng)角膜上皮片未顯示熒光素染色性，由此確認(rèn)了培 養(yǎng)角膜上皮片具備角膜上皮同樣的屏障功能。另外，在移植的培養(yǎng)角膜 上皮片周圍的周邊范圍看到了熒光素染色性，確認(rèn)了存在于移植部的組 織沒有污染周圍殘存的結(jié)膜上皮。另外，對于一般的角膜上皮而言，細(xì)胞之間以緊密粘附結(jié)構(gòu)結(jié)合， 因此熒光色素不會浸潤其表面。即，在熒光素染色試驗(yàn)中不顯示染色性。 另一方面，當(dāng)細(xì)胞間的粘附松弛，細(xì)胞自身剝離屏障功能受損時，發(fā)生 熒光色素浸潤而將組織染色。因此，通過檢查由熒光素染色引起的染色 性，可以確認(rèn)移植的培養(yǎng)角膜上皮片是否具有與角膜上皮同樣的屏障功 能。另一方面，即使是在移植后14天培養(yǎng)角膜上皮片仍殘存于眼表 面，并且與移植后2天的狀態(tài)比較向周圍擴(kuò)展，被覆了眼表面整體(圖 12右上邊)。并且，眼表面未顯示熒光素染色性，確認(rèn)了培養(yǎng)角膜上皮 片維持了屏障功能(圖12右下邊)。就透明性而言，與移植后2天的時 間點(diǎn)比較無變化，依然維持高透明性(圖12右上邊)。由以上結(jié)果證實(shí)了將海藻糖處理■凍干羊膜作為基質(zhì)得到的培 養(yǎng)角膜上皮片具備對眼表面良好的成活性，其經(jīng)長期仍能維持。并且， 還確認(rèn)了在移植后向周圍擴(kuò)展，同時在長時間發(fā)揮作為角膜上皮所必需 的屏障功能，并且維持高透明性。即，確認(rèn)了用上述方法得到的培養(yǎng) 角膜上皮片作為角膜上皮的替代發(fā)揮著良好功能，并且可適合用作在角 膜損傷、缺損等情況下再建眼表面的移植材料。7. 移植后的培養(yǎng)角膜上皮片的組織學(xué)特性評價然后，將移植后2周的培養(yǎng)角膜上皮片摘出，研究其組織學(xué)特性。 在圖13的左上邊顯示了培養(yǎng)角膜上皮片的HE染色圖像?？梢源_認(rèn)在 海藻糖處理 凍干羊膜(TH-AM、記號**)上，與正常角膜上皮同樣， 細(xì)胞是規(guī)則整齊排列而構(gòu)成的細(xì)胞層。該細(xì)胞層越往上層扁平形狀的細(xì) 胞越多，維持了極其近似于角膜上皮的結(jié)構(gòu)。在圖13的右上邊以及下邊，顯示了對各種角蛋白染色試驗(yàn)的結(jié)果。 大體上，顯示與移植前的培養(yǎng)角膜上皮片同樣的染色性。即，都沒有見 到對表皮特異性角蛋白10以及結(jié)膜特異性角蛋白13的染色性(圖13 下邊)；在細(xì)胞層整體看到了對角膜特異性角蛋白3的染色性(圖13右 上邊)。如上述確認(rèn)了即使在移植培養(yǎng)角膜上皮片后，也維持了角膜特 異性的角蛋白。其結(jié)果是，從組織學(xué)的觀點(diǎn)強(qiáng)有力地支持了培養(yǎng)角膜上 皮片在長時間發(fā)揮著與角膜上皮同樣的功能。8. 對基底膜成分以及致密層成分的免疫染色為了使羊膜良好地作為細(xì)胞培養(yǎng)用的基質(zhì)而發(fā)揮作用，認(rèn)為優(yōu)選 基底膜和致密層保持其本來的結(jié)構(gòu)?；啄ず椭旅軐邮欠癖３制浔緛淼?結(jié)構(gòu)，可以通過分別對其有無特征成分(是否殘存)進(jìn)行檢查而評價。 因此，以下面所示的免疫染色法來檢查海藻糖處理.凍干羊膜中是否殘存基底膜成分和致密層成分。另外，以未進(jìn)行上皮處理、海藻糖處理以 及凍干處理的羊膜(未加工羊膜)以及除了未進(jìn)行海藻糖處理以外與海 藻糖處理'凍干羊膜同樣的方法制備的羊膜(凍干羊膜)作為比較對象。首先，將各羊膜分別切成1.5xi.5cm的大小，用OCT化合物進(jìn)行包 埋，在-80X:凍結(jié)制成凍結(jié)標(biāo)本。將該標(biāo)本直接以凍結(jié)狀態(tài)使用冷凍切 片機(jī)(CM1900 Leica公司制)以厚度8薩在垂直方向?qū)χ蚰っ媲邢拢?固定于載玻片上制作凍結(jié)切片。使用該切片以下面的順序進(jìn)行免疫染 色。1.丙酮固定5分鐘、2.PBS清洗30分鐘、3.利用PBS/3 4BSA進(jìn) 行封閉15分鐘、4.一次抗體1小時、5.PBS清洗30分鐘、6、利用 PBS/3WBSA進(jìn)行封閉15分鐘、7. 二次抗體1小時、8. PBS清洗30分 鐘、9.封入。在熒光顯微鏡(Leica DMIRB)下觀察封入后的樣品。另外，所使用的抗體如下，應(yīng)用量遵從各制造商的操作指南。膠原I ( collagen I ) :LSL LB-1190;膠原m ( collagenm )丄SL LB1300;膠原IV( collagenIV ):LSL LB-1407;膠原V( collagen V ):LSL LB1581;膠原vn ( collagenVn ) :Chemicon MAB1345;層粘連蛋白 5(Laminin-5) :Chemicon MAB19562;纖連蛋白(fibronectin)丄SL LB國1021。在羊膜基底膜層有膠原iv、 vn、層粘連蛋白5表達(dá)，在致密層有 膠原i、 m、 v、纖連蛋白表達(dá)。為此，通過進(jìn)行各抗體的免疫染色能 夠觀察羊膜基底膜以及致密層的殘存。并且，在本實(shí)驗(yàn)中還進(jìn)行PI染 色，因此也可同時辨別羊膜上皮細(xì)胞的有無。免疫染色的結(jié)果如圖14所示。A列為未加工羊膜的染色圖像、B列為凍干羊膜的染色圖像、c列為海藻糖處理 凍干羊膜的染色圖像。各列中從上開始按順序?yàn)?l)膠原I的染色圖像；(2)膠原m的染色 圖像；(3)膠原IV的染色圖像；(4)膠原V的染色圖像；(5)膠原Vn的 染色圖像；(6)層粘連蛋白5的染色圖像；(7)纖連蛋白的染色圖像。由染色結(jié)果表明以下事項。首先，相比于凍干羊膜，海藻糖處理.凍干羊膜的基底膜成分(膠原iv、膠原vn、層粘連蛋白5)的信號強(qiáng)，即 基底膜成分所涉及的染色性近似于未加工羊膜的染色性。這個事實(shí)暗示 著海藻糖處理 凍干羊膜高度保持了基底膜本來的結(jié)構(gòu)。在一部分的染色結(jié)果(膠原iv、纖連蛋白)中，凍干羊膜在整體確 認(rèn)了染色性，而海藻糖處理 凍干羊膜與未加工羊膜同樣，染色的部位 和未染色的部位的邊界比較明確。這個事實(shí)暗示著海藻糖處理.凍干羊 膜高度保持了基底膜和致密層各自的本來結(jié)構(gòu)。由致密層所涉及的染色結(jié)果可知，海藻糖處理 凍干羊膜的致密層比凍干羊膜的致密層厚。由上述事實(shí)可知通過實(shí)施海藻糖處理在回到 至濕潤狀態(tài)時，致密層良好地膨潤，恢復(fù)至接近于未加工羊膜的厚度。如上述表明了海藻糖處理 凍干羊膜的基底膜和致密層的結(jié)構(gòu)近似 于未加工羊膜的基底膜和致密層結(jié)構(gòu)。即，確認(rèn)了通過實(shí)施海藻糖處理， 能防止在凍干時基底膜和致密層結(jié)構(gòu)的損傷，并且可獲得具備近似于未 加工羊膜的結(jié)構(gòu)的基底膜和致密層的羊膜。9.上皮去除法的研究以圖15所示的順序處理羊膜，制備上皮去除后的羊膜(不含上皮 羊膜)。以下，詳細(xì)說明各步驟的操作方法(處理方法)、操作條件(處 理條件)等。9-l.羊膜的采取對于沒有全身合并癥的準(zhǔn)備剖腹產(chǎn)的孕婦事先會同婦產(chǎn)科醫(yī)生進(jìn)行 認(rèn)真的說明、取得同意后，在手術(shù)室剖腹產(chǎn)時采取羊膜。操作要注意清潔， 按手術(shù)操作洗手后穿上手術(shù)袍。分娩前準(zhǔn)備清潔的采取羊膜用搪瓷盤和清 洗用生理鹽水。M后將胎盤組織移到搪瓷盤上，用手把羊膜組織從胎盤 剝離。羊膜與胎盤的粘連牢固的部分用剪刀切除。9-2.血液成分的去除、絨毛膜的剝離首先，用生理鹽水邊清洗邊去除附著于所采取的羊膜上的血液成 分，再用足量的生理鹽水(添加0.005%氧氟沙星)清洗。接著，用手去掉粘附于羊膜的絨毛膜。9-3.羊膜的固定以圖2b所示的方法固定羊膜。首先，上皮側(cè)朝上將羊膜放在已滅 菌的氟樹脂片上。之后，以不變得褶皺、松弛的狀態(tài)拉伸羊膜，將已滅 菌的氟樹脂片框放在羊膜上。用夾具等固定氟樹脂片和氟樹脂片框。由 此，羊膜就成為被氟樹脂片和氟樹脂片框夾持的狀態(tài)(框固定)。將向 外側(cè)伸出的多余部分的羊膜切下來。在實(shí)體顯微鏡下觀察，確認(rèn)上皮側(cè) 是朝上的。9國4.凍融處理將框固定的羊膜移入-80C的低溫水箱內(nèi)，放置約30分鐘(凍結(jié))。 從低溫水箱中取出后，移入37。C的培養(yǎng)箱內(nèi)，放置約30分鐘(融解)。 再進(jìn)行一次以上操作。9-5.胰蛋白酶處理凍融處理后，將羊膜的上皮側(cè)浸漬于胰蛋白酶溶液(0.02%胰蛋白 酶、含0.2mMEDTA的磷酸緩沖液)，放置約15分鐘(37。C )。浸漬方 法釆用圖16a所示的方法。即，在保持被框固定的羊膜10在氟樹脂片4 朝下面的狀態(tài)下，將胰蛋白酶溶液5加到氟樹脂片框3內(nèi)。由此，僅是 羊膜IO的上皮部分浸漬于胰蛋白酶溶液5中。另外，如圖16b所示， 將框固定的羊膜IO，以其上皮側(cè)朝下的狀態(tài)放入容器6內(nèi)，由此也可以 實(shí)施向胰蛋白酶溶液5的浸漬。在該例中，設(shè)置于容器6內(nèi)側(cè)的突起7 卡住氟樹脂片框3，由此實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶溶液5的液面5a和羊膜10處 于所期望的位置關(guān)系。9-6.清洗將胰蛋白酶處理后的羊膜從氟樹脂片和氟樹脂片框取下移入PBS 中，使其振蕩來進(jìn)行清洗(140rpm 15分鐘2次)。通過該操作，去除 胰蛋白酶溶液以及羊膜上皮細(xì)胞。9國7.凍干將清洗后的羊膜用一組滅菌后的塑料框夾持，之后以夾具固定。和框一起移入-80C的低溫水箱內(nèi)，待確認(rèn)羊膜凍結(jié)后，使用真空凍干機(jī) (Yamato、 NEOCOOL)進(jìn)行凍干處理(-110"C、約1小時)。根據(jù)使 用說明書，以能獲得充分干燥體來進(jìn)行條件設(shè)定。由塑料框?qū)龈商幚?后的羊膜取下，移入外側(cè)為聚酰胺尼龍、內(nèi)側(cè)為聚乙烯所制成的雙層結(jié) 構(gòu)的袋內(nèi)，使用家用真空包裝器(FLAEMNUOVA、 MAGIC VAC )進(jìn) 行真空包裝。對如此獲得的真空袋狀態(tài)的羊膜進(jìn)行Y射線照射(約 25kGy)進(jìn)行滅菌。將滅菌處理后的羊膜直接以真空袋狀態(tài)常溫保存至 即將使用時。9-8.利用凍融處理以及胰蛋白酶處理的上皮去除法的評價用以下手法評價上述的羊膜上皮去除法。評價實(shí)驗(yàn)中使用胰蛋白 酶處理后，清洗得到的不含上皮的羊膜(胰蛋白酶處理羊膜)。(1) HE染色按著下面的順序?qū)⒉缓掀さ难蚰?胰蛋白酶處理羊膜)進(jìn)行HE 染色。另外，將未去除上皮的羊膜(未加工羊膜)和用手去除上皮的羊 膜(用手處理的羊膜)作為比較對象。首先，將不含上皮的羊膜(胰蛋白酶處理羊膜)、未加工羊膜、用 手去除上皮的羊膜(用手處理的羊膜)分別切成1.5xi.5cm的大小，用 OCT化合物進(jìn)行包埋，在-801C凍結(jié)制成凍結(jié)標(biāo)本。將該標(biāo)本直接以凍結(jié) 狀態(tài)使用冷凍切片機(jī)(CM1900 Leica公司制)在垂直方向?qū)χ蚰っ?以厚度8nm切下，固定于載玻片上制作凍結(jié)切片。HE染色的順序以及條件如下。1. 10%福爾馬林5分鐘、2.流水清 洗15分鐘、3.蘇木精溶液10秒、4.流水清洗15分鐘、5.曙紅溶液 10秒、6.流水清洗15分鐘、7. 70%乙醇10秒、8. 90%乙醇10秒、 9. 95°乂乙醇IO秒、10. 100%乙醇IO秒、11. 100%二甲苯10秒、12.畫 二甲苯30分鐘、13.封入。在光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX50)下觀察封入后的樣品。使用羊膜以蘇木精進(jìn)行染色時，羊膜上皮細(xì)胞和致密層有核細(xì)胞被染色。另一方面，以曙紅進(jìn)行染色時，致密層被染色。因此，根據(jù)HE 染色可辨別上皮細(xì)胞有無剝離、致密層有無損傷。，HE染色結(jié)果示于圖17。在未加工羊膜中能確認(rèn)細(xì)胞層(上皮)。皮)。由該結(jié)果可確認(rèn)根據(jù)上述方法可以將上皮完全地、并且均勻地去 除。并且，未看到有致密層的損傷。(2)對基底膜成分和致密層成分的免疫染色為了良好地發(fā)揮出作為細(xì)胞培養(yǎng)用基質(zhì)的作用，認(rèn)為除了完全去 除上皮層以外，還優(yōu)選使基底膜和致密層保持其本來的結(jié)構(gòu)。可以通過 分別對其特征性成分有無(是否殘存)的檢查來評價基底膜和致密層是 否維持了結(jié)構(gòu)。因此，對于胰蛋白酶處理羊膜而言，以下面顯示的免疫 染色法來檢查是否殘存基底膜成分和致密層成分。另外，和HE染色的 情況相同地，將未去除上皮的羊膜(未加工羊膜)和用手去除上皮的羊 膜(用手處理的羊膜)作為比較對象。羊膜凍結(jié)切片的制作方法和HE染色的情況相同。使用該切片按著 以下的順序進(jìn)行免疫染色。1.丙酮固定5分鐘、2.PBS清洗30分鐘、3.利用PBS/3MBSA進(jìn) 行封閉15分鐘、4.一次抗體1小時、5.PBS清洗30分鐘、6、利用 PBS/39iBSA進(jìn)行封閉15分鐘、7. 二次抗體1小時、8. PBS清洗30分 鐘、9.封入。在熒光顯微鏡(Leica DMIRB)下觀察封入后的樣品。另外，所使用的抗體如下，應(yīng)用量遵從各制造商的操作指南。膠原I ( collagen I ) :LSL LB-1190;膠原m ( collagenm ) :LSL LB1300;膠原IV( collagenIV )丄SL LB-1407;膠原V( collagenV ):LSL LB1581;膠原Vn ( collagenVn ) :Chemicon MAB1345;層粘連蛋白 5(Laminin-5) :Chemicon MAB19562;纖連蛋白(fibronectin) :LSL LB-1021。在羊膜基底膜層有膠原iv、 vn、層粘連蛋白5表達(dá)，在致密層有膠原i、 m、 v、纖連蛋白表達(dá)。為此，通過進(jìn)行各抗體的免疫染色能 夠觀察羊膜基底膜以及致密層的殘存。并且，在本實(shí)驗(yàn)中還進(jìn)行Pi染 色，因此也可同時辨別羊膜上皮細(xì)胞的有無。免疫染色的結(jié)果如圖18~圖21所示。圖18和19為胰蛋白酶處理 的羊膜的免疫染色圖像、圖20為未加工羊膜(有上皮)的免疫染色圖 像、圖21為用手處理的羊膜的免疫染色圖像。將免疫染色的結(jié)果匯總 后的表示于圖22中。從這些結(jié)果可知，在胰蛋白酶處理的羊膜中，還 殘存著與用手處理的羊膜同等程度的基底膜成分、致密層成分。即，依照上述處理方法，能夠殘存與以往用手處理方法同等的基底膜成分和致 密層成分。9-9.總結(jié)由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可確認(rèn)用組合了凍融處理和胰蛋白酶處理的方 法處理羊膜，可以使羊膜的基底膜和致密層基本上沒有損傷(即以良好 地保持本來結(jié)構(gòu)的狀態(tài))地、完全地去除上皮。產(chǎn)業(yè)上的可應(yīng)用性本發(fā)明的片狀組合物作為組織再建用移植材料、抗粘連劑等用于 廣泛的領(lǐng)域。作為本發(fā)明的片狀組合物的適用領(lǐng)域，可示例眼科領(lǐng)域、 消化器外科領(lǐng)域、婦科領(lǐng)域、皮膚科領(lǐng)域。本發(fā)明不限于上述發(fā)明的實(shí)施方式及實(shí)施例的說明。在不超出所 要求保護(hù)范圍的記載、且是本領(lǐng)域技^A員能容易想到的范圍內(nèi)，各種變形 方式都包括在發(fā)明中。本說明書中寫明的論文、公開專利公才ML專利公報等的內(nèi)容，通過援引其 全郎內(nèi)容而引用。
權(quán)利要求
1、一種片狀組合物，具備附加了海藻糖的羊膜而成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的片狀組合物，是凍結(jié)狀態(tài)或者干燥狀態(tài)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的片狀組合物，是凍干狀態(tài)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的片狀組合物，所述羊膜是去 除了上皮細(xì)胞層的羊膜。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的片狀組合物，檢測出所述羊膜的作為基底膜成分的膠原iv、膠原vn、層粘連蛋白5與未處理的羊膜為同等強(qiáng)度。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的片狀組合物，所述羊膜是人 羊膜。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一項所述的片狀組合物，在所述羊膜上 形成含有活體來源的細(xì)胞的細(xì)胞層。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的片狀組合物，在所述細(xì)胞層中所述活體 來源的細(xì)胞是多層化的。
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的片狀組合物，所述活體來源的細(xì)胞是來 源于角膜上皮、結(jié)膜上皮、皮膚表皮、毛嚢上皮、口腔粘膜上皮、虹 膜色素上皮、視網(wǎng)膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者腸管粘膜上皮的 細(xì)胞。
10、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的片狀組合物，所述細(xì)胞層是由多層化為 約5~7層的細(xì)胞構(gòu)建的，并且具備與角膜上皮類似的性質(zhì)。
11、 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項所述的片狀組合物，作為抗粘連 用材料、或者作為由于手術(shù)侵害導(dǎo)致的臟器或器官的表面組織損害的 再建用材料而使用。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1~11中任一項所述的片狀組合物，在所述羊膜 的絨毛膜側(cè)的表面附著有粘附成分。
13、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的片狀組合物，所述粘附成分為纖維蛋 白原及凝血酶。
14、 根據(jù)權(quán)利要求12所述的片狀組合物，所述粘附成分為纖維蛋 白原、凝血酶以及抑肽酶。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1~14中任一項所述的片狀組合物，用活體吸收 性材料被覆所述羊膜的絨毛膜側(cè)的表面。
16、 一種移植方法，使用權(quán)利要求1~15中任一項的片狀組合物作 為移植材料。
17、 一種片狀組合物的制作方法，包括以下步驟(a) 制備羊膜的步驟；(b) 向所述羊膜附加海藻糖的步驟。
18、 根據(jù)權(quán)利要求17所述的制作方法，還包括以下步驟(c) 在步驟b之后進(jìn)行凍結(jié)處理或干燥處理的步驟。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的制作方法，還包括以下步驟(d) 在步驟c之后進(jìn)行滅菌處理的步驟。
20、 根據(jù)權(quán)利要求17~19中任一項所述的制作方法，所述步驟a 包括以下步驟(al)從羊膜去除上皮的步驟。
21、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制作方法，所述步驟al包括以下步(1) 準(zhǔn)備由活體分離的羊膜的步驟；(2) 對所述羊膜實(shí)施凍融處理的步驟；(3) 對凍融處理后的羊膜實(shí)施胰蛋白酶處理的步驟；(4) 清洗胰蛋白酶處理后的羊膜的步驟。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的制作方法，其特征在于，在所述凍融 處理中，凍結(jié)溫度為約-20。C 約-80。C,融解溫度為約4。C 約50。C。
23、 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的制作方法，其特征在于，所述 凍融處理反復(fù)實(shí)施2次以上。
24、 根據(jù)權(quán)利要求20~23中任一項所述的制作方法，其特征在于， 使用胰蛋白酶濃度為約0.01% (w/v) ~約0.05% (w/v)的胰蛋白酶 溶液實(shí)施所述胰蛋白酶處理。
25、 根據(jù)權(quán)利要求24所述的制作方法，其特征在于，所述胰蛋白 酶溶液含有約0.1mM 約0.6 mM的從EDTA、NTA、DTPA、HEDTA、 GLDA以及它們的任意組合中選擇的螯合劑。
26、 根據(jù)權(quán)利要求20~25中任一項所述的制作方法，其特征在于， 在胰蛋白酶溶液僅接觸羊膜上皮側(cè)的條件下，實(shí)施所述胰蛋白酶處理。
27、 根據(jù)權(quán)利要求20~26中任一項所述的制作方法，在步驟b之 后實(shí)施以下的步驟(A)在所述羊膜上形成含有活體來源的細(xì)胞的細(xì)胞層。
全文摘要
本發(fā)明提供一種片狀組合物，該片狀組合物含有保存性以及操作性優(yōu)良并且使用時具有高度柔軟性的羊膜。使用附加了海藻糖的羊膜。通過附加海藻糖可提高羊膜的柔軟性，并且可防止伴隨著凍干處理的基底膜以及致密層的損傷。
文檔編號A61L27/00GK101242862SQ20068003058
公開日2008年8月13日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日
發(fā)明者中村隆宏, 木下茂, 栗原英司, 橫井則彥 申請人:阿如布勒斯特有限公司;木下茂