專利名稱：作為聚合物綴合前藥中的連接團(tuán)的n,n-二(羥乙基)甘氨酰胺的制作方法
作為聚合物綴合前藥中的連接團(tuán)的N，N-二(羥乙基)甘氨酰胺領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有與生物活性實(shí)體如肽、蛋白、天然產(chǎn)物或合成化學(xué)化 合物的氨基的臨時(shí)鍵合(linkage)的聚合物前藥。背景通常，藥物遞送中的聚合物或者以非共價(jià)方式將藥物通過物理化學(xué)方 法配制于溶劑-聚合物混合物中使用，或者通過將聚合物試劑永久共價(jià)連接 至藥物官能團(tuán)之一而使用。非共價(jià)藥物包封法已用于長效釋放模式的貯庫制劑。通常，將藥物與 聚合物材料混合，以使藥物分布遍及本體聚合物材料中的方式處理。該聚 合物-藥物聚集物可以被成形為以注射用混懸液施用的微粒，或者該聚合物 -藥物聚集物被配制成單次快速濃注施用的凝膠。當(dāng)聚合物膨脹或聚合物降 解允許藥物擴(kuò)散到本體聚合物外部時(shí)發(fā)生藥物釋放。該降解過程可以是自 動(dòng)水解的或者酶催化的?；诳焖贊庾⑹┯盟幬?聚合物凝膠的上市藥物的 實(shí)例是Lupron Depot。基于混懸微粒的上市藥物的實(shí)例是Nutropin Depot。非共價(jià)方法的缺點(diǎn)在于為了防止不受控制的、爆發(fā)型藥物釋放，必 須通過營造立體上高度擁擠的環(huán)境而使藥物包封高度有效。抑制非結(jié)合、 水溶性藥物分子的釋放需要強(qiáng)大的、經(jīng)常通過疏水部分介導(dǎo)的范德華接觸。 許多構(gòu)象敏感藥物如蛋白質(zhì)或肽在包封處理期間和/或在后續(xù)的包封藥物 貯存期間變得功能異常。此外，這類含氨基藥物容易與聚合物降解產(chǎn)生發(fā) 生副反應(yīng)(參見例如D.H. Lee等人，J. Contr. Rel.， 2003， 92， 291-299)。此夕卜， 藥物釋放機(jī)制對生物降解的依賴性會(huì)引起患者間差異。或者，藥物可以通過永久共價(jià)鍵與聚合物綴合。該方法被用于不同種類的分子中，從所謂的小分子到天然產(chǎn)物再到較大的蛋白質(zhì)類。許多小分子藥物如生物堿類和抗腫瘤藥在水性液體中顯示低溶解度。 增溶這些小分子化合物的一種方法是將所述小分子化合物與親水性(水溶 性)聚合物綴合。為此目的，已描述了多種水溶性聚合物，如人血清白蛋白、葡聚糖、凝集素類、聚(乙二醇)(PEG)、聚(苯乙烯-共-馬來酸酐)、聚(N-羥 丙基甲基丙烯酰胺)、聚(二乙烯基醚-共-馬來酸酐)、透明質(zhì)酸(R. Duncan, Nature Rev. Drug Disc, 2003， 2,347-360)。癌癥治療中的主要挑戰(zhàn)是將細(xì)胞毒劑選擇性地靶向腫瘤細(xì)胞。將小分 子抗癌藥聚集到腫瘤組織并降低這些藥物不需要的副作用的有希望的方法 是將細(xì)胞毒素連接至大分子載體。聚合物藥物綴合物對腫瘤的被動(dòng)靶向作 用是基于所謂的增加滲透性和保持效果(EPR)，如Matsumura, Y.和Maeda， H.在Cancer Res.，1986， vol 6， 6387-6392中所述。為此，已有多種聚合物畫 藥物綴合物作為抗癌藥進(jìn)入臨床研究。從1970年代后期以來，已經(jīng)廣泛研究了用聚乙二醇對生物分子進(jìn)行共 價(jià)4務(wù)飾。通過增加溶解度、降低免疫原性以及因降低腎清除率和經(jīng)酶蛋白 質(zhì)水解而增加體內(nèi)循環(huán)半衰期，所謂的PEG化蛋白質(zhì)已顯示出改進(jìn)的治 療效果(參見例如Caliceti P"Veronese F.M.， Adv. Drag Deliv. Rev. 2003， 55, 1261 1277)。然而，當(dāng)聚合物與藥物共價(jià)綴合時(shí)，許多生物分子如INF-a2、沙查那 韋或生長抑素是無活性的或者顯示出降低的生物學(xué)活性(T. Peleg-Shulman 等人，J. Med. Chem" 2004， 47， 4897- 4904)。為了避免由非共價(jià)聚合物混合物或永久共價(jià)連接所致的缺點(diǎn)，優(yōu)選地 可以使用藥物與聚合物載體化學(xué)綴合的前藥方法。在該聚合物前藥中，生 物活性部分(藥物、治療性的生物學(xué)分子等)通常通過臨時(shí)鍵連接到聚合物 載體部分，該臨時(shí)鍵在載體部分與藥物分子的羥基、氨基或羧基之間形成。前藥是本身幾乎無活性的治療劑，但可預(yù)期轉(zhuǎn)化成活性代謝物(參見 B. Testa， J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH， 2003，第4頁)。栽體前藥方法可以以這樣的方式應(yīng)用藥物在體內(nèi)自聚合物釋放以恢復(fù)其生物活性。如果希望藥物緩慢或受控釋放， 則前藥的生物活性與所釋放藥物相比降低是有利的。此時(shí)，可以施用相對 大量的前藥而無伴發(fā)的副作用和劑量過高的風(fēng)險(xiǎn)。隨著時(shí)間延續(xù)發(fā)生藥物 釋放，從而減少了反復(fù)和頻繁施用藥物的需要。前藥活化可如下進(jìn)行酶或非酶裂解載體和藥物分子之間的臨時(shí)鍵， 或者兩者相繼進(jìn)行，即酶步驟繼之以非酶重排，如圖1所示。在無酶體外 環(huán)境如水性緩沖溶液中，臨時(shí)鍵如酯或酰胺可以發(fā)生水解，但是相應(yīng)的水 解速度可以非常緩慢且不是治療可用的。在體內(nèi)環(huán)境中，通常存在酯酶或 酰胺酶，且該酯酶或酰胺酶可引起顯著的、從兩倍直至若干數(shù)量級(jí)的水解 動(dòng)力學(xué)的催化加速作用(參見例如R.B. Greenwald等人，J.Med.Chem. 1999， 42 (18)， 3857-3867)。根據(jù)IUPAC定義(:ft口 http:〃www.chem.qmul.ac.uk/iupac/medchem/(2004年3月8日^方問)所給出)前藥前藥是在表現(xiàn)出其藥理學(xué)作用之前經(jīng)歷生物轉(zhuǎn)化的任意化合物。因此 前藥可以看作是含有特定的、無毒性保護(hù)基的藥物，該保護(hù)基以暫態(tài)方式 使用來改變或消除母體分子中不期望的性質(zhì)。載體連接的前藥(載體前藥)載體連接的前藥含有臨時(shí)鍵合的所給活性物質(zhì)與暫態(tài)載體基團(tuán)，其產(chǎn) 生改進(jìn)的物理化學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)并且在體內(nèi)可以容易地被除去，通常通過 水解裂解。圖示于圖1。級(jí)聯(lián)(cascade)前藥級(jí)聯(lián)前藥是一種載體前藥，其中載體基團(tuán)的裂解僅在暴露活化基團(tuán)之后才變得有效。 聚合物級(jí)聯(lián)前藥聚合物級(jí)聯(lián)前藥是一種含有所給活性物質(zhì)與暫態(tài)聚合物載體基團(tuán)的臨 時(shí)鍵合的載體前藥，其中載體的裂解僅在暴露活化基團(tuán)之后才變得有效。生物前體前藥生物前體前藥是一種前藥，其不是指與載體基團(tuán)的連接，而是由活性 成分本身的分子修飾產(chǎn)生。該修飾產(chǎn)生新化合物，該新化合物能夠通過代 謝或化學(xué)方式轉(zhuǎn)化，所得化合物為活性成分。生物轉(zhuǎn)化生物轉(zhuǎn)化是物質(zhì)經(jīng)活有機(jī)體或酶制劑的化學(xué)轉(zhuǎn)化。其它定義 連接團(tuán)存在于載體前藥中的控制裂解的化學(xué)結(jié)構(gòu)或基團(tuán)，其既不由載體實(shí)體 提供，也不由藥物提供。前藥分為兩類，即生物前體和載體連接的前藥。生物前體不含有載體 基團(tuán)，且通過代謝產(chǎn)生官能團(tuán)而被活化。在載體連接的前藥中，活性物質(zhì) 通過臨時(shí)鍵合與載體部分連接。該載體可以是生物學(xué)惰性的(例如PEG)， 或者可以具有靶向性質(zhì)(例如抗體)。本發(fā)明涉及聚合物載體連接的或大分 子的前藥，其中載體本身是大分子如載體蛋白或多糖或聚乙二醇。載體前藥的裂解產(chǎn)生生物活性增加的分子實(shí)體(藥物)和至少一種副產(chǎn) 物，即載體。裂解之后，該生物活性實(shí)體將顯示出至少一種之前綴合的且 因此被保護(hù)的官能團(tuán)，該基團(tuán)的存在通常有助于藥物的生物活性。為了實(shí)現(xiàn)前藥方案，藥物分子中至少一個(gè)所選官能團(tuán)被用于連接載體 聚合物。優(yōu)選的官能團(tuán)是羥基或氨基。因此，連接化學(xué)和水解條件均取決于所用官能團(tuán)的種類。在簡單的一步裂解機(jī)理中，前藥的臨時(shí)鍵合的通常 特征為內(nèi)在不穩(wěn)定性或酶依賴性。在伴有或不伴有酶催化的水性環(huán)境中， 該鍵合對水解的敏感性控制了聚合物載體與藥物之間的裂解動(dòng)力學(xué)。眾多大分子前藥在文獻(xiàn)中述及，其中所述臨時(shí)鍵合是不穩(wěn)定的酯鍵。在這些情況下，由生物活性實(shí)體提供的官能團(tuán)為羥基或羧酸(例如Y. Luo, MR Ziebell， GD Prestwich，"靶向癌細(xì)胞的透明質(zhì)酸-紫杉醇抗腫瘤生物 綴合物"，Biomacromolecules 2000， 1， 208-218; JCheng等人，"直鏈、 基于p-環(huán)糊精的聚合物和它們的喜樹堿綴合物"，Bioconjugate Chem. 2003, 14， 1007-1017; R. Bhatt等人，"20(S)-喜樹堿的聚(L-谷氨酸)綴合物的合 成和體內(nèi)抗腫瘤活性"，J. Med. Chem. 2003， 46， l卯-193; R.B. Greenwald， A. Pendri， CD. Co隨er， H. Zhao， Y.H. Choe， A. Martinez, K. Sh應(yīng)，S. Guan， J. Med. Chem.， 1999， 42， 3657-3667; B. Testa， J.M: Mayer in Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism, Wiley-VCH， 2003，第8章)。 特別是對于治療性生物大分子以及某些小分子藥物，可能需要將大分 子載體連接到生物活性實(shí)體的氨基(即蛋白質(zhì)的N-末端或賴氨酸氨基基 團(tuán))。如果掩蔽藥物的生物活性需要綴合生物活性實(shí)體的某一氨基，例如位 于活性中心或牽涉于受體結(jié)合的區(qū)域或表位中的氨基，即是這種情況。而 且，在制備前藥期間，氨基可能被處理得更具化學(xué)選擇性并且作為綴合載 體和藥物的更佳手段，原因是與羥基性或酚性基團(tuán)相比，它們具有更大的 親核性。這對于含有大量種類不同反應(yīng)性官能度的蛋白質(zhì)而言特別準(zhǔn)確， 其中非選擇性綴合反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生不需要的產(chǎn)物混合物，該混合物需要大量定 性或者純化，且可降低反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物的療效。與酯鍵相比，酰胺鍵以及脂族氨基甲酸酯類對抗水解通常要穩(wěn)定得多， 而且酰胺鍵的裂解速度對于載體連接的前藥的治療應(yīng)用而言太慢。因此， 為了控制前藥酰胺鍵的裂解能力，加入結(jié)構(gòu)性化學(xué)成分如鄰近基團(tuán)是有益 的。這類既非由載體實(shí)體也非由藥物提供的額外的控制裂解化學(xué)結(jié)構(gòu)被稱 為"連接團(tuán)"。前藥連接團(tuán)對所給臨時(shí)鍵的水解速度具有強(qiáng)烈影響。這些,刮性質(zhì)。含胺生物活性部分經(jīng)靶向釋放特異性酶的前藥活化的若干實(shí)例已被公開。酶依賴性的前提條件在于連接團(tuán)的結(jié)構(gòu)具有被相應(yīng)內(nèi)源性酶識(shí)別為 底物的結(jié)構(gòu)基序(如圖2所示)。在這些情況下，臨時(shí)鍵的裂解以由酶催化 的一步法進(jìn)行。G. Cavallaro等人，Bioconjugate Chem. 2001, 12， 143-151 描述了抗腫瘤藥經(jīng)由蛋白酶纖溶酶(protease plasmin)的酶促釋放。阿糖胞 苷經(jīng)由三肽序列D-Val-Leu-Lys偶聯(lián)至聚合物a，p-聚(N-羥乙基)-DL-天冬 酰胺(PHEA)。阿糖胞苷的酶促釋放是通過蛋白酶纖溶酶而實(shí)現(xiàn)，該蛋白酶 纖溶酶在各種腫瘤團(tuán)塊中的濃度相對較高。前藥裂解的酶催化加速對于器官和細(xì)胞耙向應(yīng)用而言是需要的性質(zhì)。 如果選擇性裂解鍵合的酶特別地存在于所選用于治療的器官和細(xì)胞類型 中，則生物活性實(shí)體的耙向釋^L得以實(shí)現(xiàn)。酶依賴性臨時(shí)鍵合的典型性質(zhì)是其相對于水解的穩(wěn)定性。酶依賴性臨 時(shí)鍵合本身不會(huì)經(jīng)歷將釋放藥物至可誘導(dǎo)通常給藥方案中藥物療效程度的 速率的自動(dòng)水解。僅在酶存在下，酶對酶依賴性臨時(shí)鍵合的攻擊引起酶依 賴性臨時(shí)鍵合裂解的顯著加速，并同時(shí)增加游離藥物的濃度。已經(jīng)描述了由特異性酶如p-內(nèi)酰胺酶(R. Satchi-Fainaro等人， Bioconjugate Chem. 2003， 14， 797-804)和半胱氨酸蛋白酶如組織蛋白酶 B(R. Duncan等人，J. Contr. Release 2001， 74， 135-146)活化的抗腫瘤聚合 物前藥的其它實(shí)例。Wiwattanapatapee等人(2003)描述了用于結(jié)腸遞送5-氨基水楊酸的樹狀聚體前藥。藥物分子通過偶氮鍵與"3代"PAMAM樹 狀聚體綴合。5-氨基水楊酸在結(jié)腸中通過稱為偶氮還原酶的細(xì)菌酶釋放(W. R, Wiwattanapatapee, L Lomlim， K. Saramunee, J. Controlled Release, 2003, 88: 1-9)。大多數(shù)酶促裂解的主要缺點(diǎn)是患者間的差異性。個(gè)體之間的酶水平可 能顯著不同，導(dǎo)致通過酶促裂解的前藥活化的生物差異性。酶水平還可因 施用部位的不同而異。例如已知在皮下注射的情況下，身體的某些區(qū)域比 之于其它區(qū)域產(chǎn)生更可預(yù)期的治療效果。為了降低該不可預(yù)期的效果，非酶促裂解或分子內(nèi)催化特別受到關(guān)注(參見例如B. Testa， J.M: Mayer in Hydrolysis in Drag and Prodrug Metabolism, Wiley- VCH， 2003，第5頁)。此外，對于該膝農(nóng)賴性載體連接的前藥，難以建立藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的 體內(nèi)-體外相關(guān)性。在缺乏可靠的體內(nèi)-體外相關(guān)性的情況下，釋放模式的 優(yōu)化成為一項(xiàng)繁重的任務(wù)。應(yīng)用臨時(shí)鍵合連接到存在于藥物分子中的氨基的其它聚合物前藥基于 級(jí)聯(lián)機(jī)制。通過連接團(tuán)化合物使級(jí)聯(lián)解離成為可能，該連接團(tuán)化合物由掩 蔽基團(tuán)和活化基團(tuán)的結(jié)構(gòu)組合組成。所述掩蔽基團(tuán)借助第 一臨時(shí)鍵合如酯 或氨基甲酸酯與所述活化基團(tuán)連接。所述活化基團(tuán)通過第二臨時(shí)鍵合如氨 基甲酸酯與藥物分子的氨基連接。第二臨時(shí)鍵合(如氨基甲酸酯)的穩(wěn)定性 或?qū)λ獾拿舾行匀Q于是否存在掩蔽基團(tuán)。在掩蔽基團(tuán)存在時(shí)，第二臨 時(shí)鍵合高度穩(wěn)定并且不太可能以治療可用動(dòng)力學(xué)釋放藥物。在掩蔽基團(tuán)不 存在時(shí)，該鍵合變得高度不穩(wěn)定，引起迅速裂解和藥物釋放。第 一臨時(shí)鍵合的裂解在級(jí)聯(lián)機(jī)制中是限速步驟。該第 一步驟可引起活 化基團(tuán)的分子重排如1，6-消除。該重排使得第二臨時(shí)鍵合非常不穩(wěn)定以致 誘導(dǎo)其裂解。理想的是，第一臨時(shí)鍵合的裂解速率與所給治療方案中藥物 分子所需釋放速率相同。此外，期望第二臨時(shí)鍵合的裂解在其不穩(wěn)定性被 第一臨時(shí)鍵合裂解誘導(dǎo)之后基本上即時(shí)發(fā)生(參見圖3)?；?，6-消除的該聚合物前藥的實(shí)例已由R.B. Greenwald等人，J. Med. Chem.， 1999， 42， 3657-3667和PCT專利申請WO畫A畫99/30727， F.M.H. DeGroot等人(W002083180和WO04043493A1)以及D. Shabat等人 (WO04019993Al)描述?；谌龝趸忾]內(nèi)酯化的含氨基聚合物前藥的實(shí)例已由R.B. Greenwald等人,J.Med.Chem. 2000， 43(3)， 457-487; PCT專利申請No. WO-A-02/089789)描述。在該前藥系統(tǒng)中，取代的o-羥基苯基-二甲基丙酸 通過酯、碳酸酯或氨基曱酸酯基團(tuán)作為第一臨時(shí)鍵合與PEG連接，借助 酰胺鍵作為第二臨時(shí)鍵合與藥物分子的氨基連接。在藥物釋放中決定速度 的步驟是第 一鍵合的酶促裂解。該步驟繼之以經(jīng)由內(nèi)酯化的快速酰胺裂解，釋放芳族內(nèi)酯副產(chǎn)物。由Greenwald、 DeGroot和Shabat描述的上述前藥系統(tǒng)的缺點(diǎn)是在 臨時(shí)鍵合裂解之后，釋放高度反應(yīng)性和潛在毒性的芳族小分子副產(chǎn)物如醌 甲基化物或芳族內(nèi)酯。潛在毒性實(shí)體以與藥物1:1的化學(xué)計(jì)算量釋放，并 且可假定高體內(nèi)濃度?；?，6-消除的、具有芳族活化基團(tuán)的一組不同的級(jí)聯(lián)前藥在結(jié)構(gòu)上 分離掩蔽基團(tuán)和載體。這可通過使用聚合物載體和活化基團(tuán)之間的永久鍵 實(shí)現(xiàn)。這一穩(wěn)定的鍵不參與級(jí)聯(lián)裂解機(jī)制。如果載體不作為掩蔽基團(tuán)且活 化基團(tuán)借助穩(wěn)定的鍵與載體偶聯(lián)，則可避免潛在毒性副產(chǎn)物如活化基團(tuán)的 釋放。該活化基團(tuán)和聚合物的穩(wěn)定連接還抑制具有不確定藥理學(xué)的藥物-連接團(tuán)中間體的釋放。Antczak等人(Bioorg Med Chem 9 (2001) 2843-48)描述了 一種試劑， 該試劑形成含胺藥物分子的大分子級(jí)聯(lián)前藥系統(tǒng)的基礎(chǔ)。在該方法中，抗 體作為載體，穩(wěn)定的鍵連接抗體至活化基團(tuán)，其攜帶有可酶促裂解的掩蔽 基團(tuán)。酶促除去酯連接的掩蔽基團(tuán)后，第二臨時(shí)鍵裂解并釋放藥物化合物， 如圖4所示。D. Shabat等人(Chem. Eur. J. 2004， 10， 2626-2634)描述了基于扁桃酸 活化基團(tuán)的聚合物前藥系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，掩蔽基團(tuán)通過氨基甲酸酯鍵連 接至活化基團(tuán)?；罨鶊F(tuán)經(jīng)由酰胺鍵永久連接至聚丙烯酰胺聚合物。經(jīng)催 化性抗體酶促活化掩蔽基團(tuán)后，掩蔽基團(tuán)通過環(huán)化而裂解并釋放藥物。藥 物釋放后活化基團(tuán)仍然連接至聚丙烯酰胺聚合物。M.畫R. Lee等人(Angew. Chem. 2004， 116， 1707-1710)描述了基于扁桃 酸活化基團(tuán)以及可酶促裂解的酯連接的掩蔽基團(tuán)的類似前藥系統(tǒng)。然而在這些連接團(tuán)中，1，6-消除步驟仍產(chǎn)生高度反應(yīng)性的芳族中間體。 即使芳族部分仍然永久地連接到聚合物載體，仍可引起具有潛在毒性和免 疫原作用的副反應(yīng)。由于這些原因，需要提供形成含胺活性劑聚合物前藥的新連接團(tuán)技術(shù)， 該技術(shù)使用脂族前藥連接團(tuán)，其不是酶依賴型的且在裂解期間不產(chǎn)生反應(yīng)性芳族中間體。A.J. Garman等人(A.J. Garman， S.B. Kalindjan, FEBS Lett. 1987， 223 (2)， 361-365 1987)使用PEG5000-馬來酸酐用于可逆地修飾組織型纖溶酶 原激活物和尿激酶中的氨基。通過裂解馬來酰胺酸鍵合、在pH7.4緩沖溶 液中溫育，自PEG-uPA綴合物再生功能酶，這遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)，半衰期 為6.1h。該馬來酰胺酸鍵合的缺點(diǎn)是缺乏較低pH值下綴合物的穩(wěn)定性。 這將馬來酰胺酸鍵合的可用性限制于在堿性(高)pH值下穩(wěn)定的活性劑，因 為活性劑聚合物綴合物的純化必須在堿性(高pH)條件下進(jìn)行，以防止前藥 過早裂解。最近，R.B. Greenwald等人(Greenwald等人，J. Med.Chem. 2004， 47， 726-734以及WO 2004/108070A2)描述了基于N，N-二-(2-羥乙基)甘氨酰胺 (N-二(羥乙基)甘氨酸)連接團(tuán)的PEG級(jí)聯(lián)前藥系統(tǒng)。在Greenwald等人的 論文和專利申請中描述的系統(tǒng)中，兩個(gè)PEG載體分子經(jīng)由臨時(shí)鍵連接至 與藥物分子氨基偶聯(lián)的N-二(羥乙基)甘氨酸分子上。前藥活化的前兩步是 酶促裂解連接PEG載體分子和N-二(羥乙基)甘氨酸活化基團(tuán)的羥基的笫 一臨時(shí)鍵合。描述了導(dǎo)致不同前藥活化動(dòng)力學(xué)的PEG和N-二(羥乙基)甘 氨酸之間不同的鍵合。前藥活化的第二步驟是裂解連接N-二(羥乙基)甘氨 酸活化基團(tuán)至藥物分子氨基的第二臨時(shí)鍵合(圖5)。該系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是 聚合物通過臨時(shí)鍵與N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)連接，以及該第二臨時(shí)N-二(羥乙基)甘氨酸酰胺鍵合的慢水解速率(在礴酸鹽緩沖溶液中t1/2>3h),這 導(dǎo)致N-二(羥乙基)甘氨酸-修飾的前藥中間體釋放，與母體原始藥物分子相 比，該前藥中間體可顯示不同的藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性、毒性和藥效學(xué)性 質(zhì)。發(fā)明詳述本發(fā)明解決了上述缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了聚合物前藥，其特征在于經(jīng)由 N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)連接聚合物至含胺藥物分子的伯或仲氨基，其 中聚合物經(jīng)由永久鍵合連接至N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)，且N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)和含胺藥物分子之間的鍵是臨時(shí)鍵合。N-二(羥乙基)甘氨 酸在本申請中用作N，N-二(2-羥乙基)-甘氨酰或N，N-二(2-羥乙基)-甘氨酰胺 或N，N-二(2-羥基)甘氨酸的同義詞。由于存在載體與N-二(羥乙基)甘氨酸 連接團(tuán)之間的永久鍵，本發(fā)明的聚合物前藥確保了未修飾原始藥物分子的 釋放(圖6)。本發(fā)明提供式Ia、 Ib或Ic的聚合物前藥及相應(yīng)的聚合物連接團(tuán)試劑。<formula>formula see original document page 26</formula>其中T、 X和R1至R12定義如下:通過聚合物取代的N-二(羥乙基)甘氨酸殘基的水解裂解自本發(fā)明聚合 物前藥釋放原始藥物是通過式Ia聚合物前藥示例說明，其中R2至R12是 氫。如上所述，原始藥物自聚合物載體的釋放可通過酶促或非酶促步驟介 導(dǎo)，如pH-依賴性水解或分子內(nèi)環(huán)化。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，裂解 通過非酶促方式實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明聚合物前藥在pH7.4的水性緩沖溶液中、在 37°C的裂解動(dòng)力學(xué)半衰期優(yōu)選為3小時(shí)至6個(gè)月、更優(yōu)選1天至3個(gè)月、 且最優(yōu)選1天至2個(gè)月。式Ia、 Ib或Ic中的X、 T、 R1至R12的定義 T是D或A在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)是聚合物前藥連接團(tuán)試劑的情況下，T是A,且A是 離去基團(tuán)。適合的離去基團(tuán)A的非限制性實(shí)例包括但不限于氯、溴、氟、硝基苯氧基、咪唑基、N-羥基琥珀酰亞胺基、N-羥基苯并三唑基、N-羥基 偶氮苯并三唑基、五氟苯氧基、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基或本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的任何其它離去基團(tuán)。在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)是聚合物前藥的情況下，T是D，且D是含胺生物活 性物質(zhì)的殘基，該生物活性物質(zhì)包括但不限于小分子生物活性部分或生物 聚合物如蛋白質(zhì)、多肽和寡核苷酸(RNA、 DNA)、核酸肽(PNA)。注意在本說明書中經(jīng)常提及前藥。真正的前藥在T是含胺生物活性物 質(zhì)或部分的殘基時(shí)成立。如果T是離去基團(tuán)A,則通式表示聚合物前藥連 接團(tuán)試劑。簡而言之，聚合物前藥連接團(tuán)試劑也被稱為本說明書中的前藥。 根據(jù)上下文應(yīng)當(dāng)理解所指的是真正的前藥還是聚合物前藥連接團(tuán)試劑。適合的有機(jī)小分子生物活性部分非限制性地包括如具有至少一個(gè)伯氨 基團(tuán)或仲氨基團(tuán)的心血管劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性劑、抗感染劑、抗腫瘤劑、 抗菌劑、抗真菌劑、鎮(zhèn)痛劑、避孕劑、抗炎劑、甾體劑、血管舒張劑和血 管收縮劑等部分。該類化合物的非排他性實(shí)例是柔紅霉素、阿霉素、伊達(dá) 比星、米托蒽醌、氨魯米特、金剛烷胺、氨苯砜、乙胺丁醇、磺胺嘧啶 (sulfadiazin)、磺胺甲嘧啶(sulfamerazin)、磺胺曱嗯唑(sulfamethoxazol)、 磺胺曱氧吡溱(sulfalen)、克林沙星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、諾 氟沙星、新霉素B、大觀霉素、卡那霉素A、美羅培南、多巴胺、多巴酚 丁胺、賴諾普利、5-羥色胺、氨磺丁脲(carbutamid)、阿西維辛(acivicin) 等。具有至少一個(gè)游離氨基的適合的蛋白質(zhì)和多肽包括但不限于ACTH、 腺苷脫氨酶、agalsidase、白蛋白、a-l抗胰蛋白酶(AAT)、 a-l蛋白酶抑制 劑(API)、組織纖維蛋白溶原酶激活劑、anistreplase、安克洛酶絲氨酸蛋白 酶、抗體類(單克隆或多克隆，以及片段或融合物)、抗凝血酶III、抗胰蛋 白酶、抑肽酶、門冬酰胺酶、biphalin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)、降釣素(鮭魚)、 膠原酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)啡肽、恩夫韋地(enfuvirtide)、腦啡肽、紅細(xì) 胞生成素、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、 纖溶酶、融合蛋白、促卵泡激素、粒細(xì)胞集落形成刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽如GLP-1、葡糖腦苷脂酶、粒細(xì) 胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、磷脂酶-活化蛋白(PLAP)、絨毛膜促 性腺激素(hCG)、血紅蛋白、乙型肝炎疫苗、蛭素、透明質(zhì)酸酶、艾杜糖 苷酸酶、免疫球蛋白、流感疫苗、白細(xì)胞介素類(la、 ip、 2、 3、 4、 6、 10、 11、 12)、 IL-1受體拮抗劑(rhIL-lra)、胰島素類、干擾素類(a2a、 a2b、 a2c、 pia、 pib、 yla、 丫lb)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長因子類、 乳糖酶、醋酸亮丙瑞林(leuprolide)、左甲狀腺素、黃體生成素、萊姆(lyme) 疫苗、利尿鈉肽、胰脂肪酶、木瓜蛋白酶、甲狀旁腺激素、PDGF、胃蛋 白酶、血小板激活因子乙?；饷?PAF-AH)、催乳素、蛋白C、抑生長 肽、胰泌素、舍莫瑞林、超氧化物歧化酶(SOD)、促生長素(生長激素)、生 長抑素、鏈激酶、蔗糖酶、破傷風(fēng)毒素片段、tilactase、凝血酶、胸腺素、 促甲狀腺激素、促曱狀腺素、腫瘤壞死因子(TNF)、 TNF受體-IgGFc、組 織纖溶酶原激活物(tPA)、 TSH、尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗類、植物蛋白 例如凝集素和蓖麻毒蛋白。本文還包括具有體內(nèi)生物活性的任何合成的多肽或多肽的任何部分。 此外，還包括由重組DNA方法制備的蛋白，包括上述蛋白的突變型、抗 體片段、單聯(lián)結(jié)合蛋白、催化抗體和融合蛋白。優(yōu)選的蛋白是抗體、降鈣素、G-CSF、 GM-CSF、紅細(xì)胞生成素類、 血紅蛋白類、白細(xì)胞介素類、胰島素類、干擾素類、SOD、生長激素、TNF、 TNF-受體-IgG Fc和GLP-1。X是間隔部分如R13-Y1。Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含 有游離電子對的任何雜原子，或者不存在。R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取 代的芳基、取代或未取代的雜芳基等。R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；?、包括聚合?；蛄u基保護(hù)基如三苯 甲基、甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的保護(hù)基。適合的保護(hù)基描述于TWGreene，P.G.M. Wuts，"有機(jī)合成中的保護(hù)基，，,1999, John Wiley & Sons,第3版。R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀 烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、羥基、 硝基、鹵素、羧基、羧酰胺等。R4至R12優(yōu)選獨(dú)立地選自氫、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀C, 至Cs烷基或雜烷基。R4至R12最優(yōu)選是氫。本發(fā)明上下文中的術(shù)語"雜烷基"表示(直鏈、環(huán)狀或支鏈)烷基鏈， 其中烷基鏈在任意位置含有一個(gè)或多個(gè)雜原子或基團(tuán)或者被一個(gè)或多個(gè)雜 原子或基團(tuán)取代，所述雜原子獨(dú)立地選自O(shè)、 S、 N、 P、 Si、 Cl、 F、 Br、 I等，所述基團(tuán)獨(dú)立地選自羧酰胺、羧酸酯、膦酸酯、磷酸酯、雙鍵或三 鍵、氨基甲酸酯、脲、硫脲、硫代氨基曱酸酯、肟、氰基、羧基、羰基等。Rl是聚合物。適合的聚合物的非限制性實(shí)例是基于聚烷氧基的聚合物如聚(丙二醇) 或聚(乙二醇)、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透明質(zhì)酸和衍生物、藻酸鹽、木 聚糖、甘露聚糖、角叉菜聚糖、瓊脂糖、纖維素、淀粉、羥乙基淀粉(HES) 和其它基于碳水化合物的聚合物、聚(乙烯醇類)、聚p悉唑啉類)、聚(酐類)、 聚(原酸酯類)、聚(碳酸酯類)、聚(氨基曱酸乙酯類)、聚(丙烯酸類)、聚(丙 烯酰胺類)如聚(羥丙基曱基丙烯酰胺)(HMPA)、聚(丙烯酸酯類)、聚(甲基 丙烯酸酯類)如聚(羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚(有機(jī)磷腈 類)(poly(organophosphazenes))、聚(硅氧烷類)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(氰 基丙烯酸酯類)、聚(酯類)如聚(乳酸)或聚(乙醇酸類)、聚(亞胺基碳酸酯類)、 聚(氨基酸類)如聚(谷氨酸)、膠原、明膠、共聚物類、接枝共聚物類、交聯(lián) 聚合物類、水凝膠類以及來自上述聚合物的嵌段共聚物類。水凝膠可定義為吸收大量水的三維、親水或兩親性聚合物網(wǎng)狀物。該 網(wǎng)狀物由均聚物或共聚物組成，由于存在共價(jià)化學(xué)或物理(離子、疏水性相 互作用、纏繞)交聯(lián)而不能溶解。該交聯(lián)物提供網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和物理完整性。水 凝膠表現(xiàn)與水具有熱力學(xué)相容性，這使得它們在水性介質(zhì)中膨脹(參見N. A. Peppas， P, Bures， W. Leobandung, H. Ichikawa,"藥物制劑中的7JC 凝膠"，Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000， 50， 27-46)。所述網(wǎng)狀物的鏈以這 樣的方式連接，即存在孔并且這些孔的大部分的尺寸為1至1000nm。通 過選擇特定聚合條件，水凝膠可以以無定形凝膠的形式獲得或者為珠狀樹 脂。這種軟珠粒具有1至1000微米的直徑。水凝膠可以從上述聚合物或共聚物合成，并且通過自由基、陰離子或 陽離子、通過化學(xué)反應(yīng)如縮合或加成反應(yīng)進(jìn)行物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)，如 W.E. Hennink and CF.糧Nostrum, Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54， 13-36 中所述。進(jìn)一步的實(shí)例包括支化或超支化(hyperbranched)聚合物。這些聚合物 的實(shí)例包括樹狀聚體和其它密集星形聚合物(dense star polymer)(R. Esfand， D. A. Tomalia， Drug Discov Today, 2001， 6(8)， 427-436; P.M. Heegaard, U. Boas, Chem. Soc. Rev. 2004 (33(1)， 43-63; S.M. Grayson, JM. Frechet， Chem. Rev. 2001， 101 (12)， 3819-3868)。Rl還可以是生物聚合物如蛋白質(zhì)。這些聚合物的非限制性實(shí)例包括白 蛋白、抗體、轉(zhuǎn)4失蛋白、纖維蛋白、酪蛋白和其它血漿蛋白。各R1聚合物可以攜帶一個(gè)或多個(gè)生物活性物質(zhì)，該生物活性物質(zhì)通 過與本文所述的第二前藥連接團(tuán)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它連接團(tuán) 綴合而連接至聚合物。所述聚合物可具有其它取代基，并且可以被官能化 以連接至間隔部分X。這些官能團(tuán)的非限制性實(shí)例包括羧酸和活化衍生物、 氨基、馬來酰亞胺、硫醇、磺酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯 和衍生物、羥基、酪、酮、肼、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磷酸和衍生物、 膦酸和衍生物、卣代乙?；?、烷基卣化物、丙烯酰基、芳化劑如芳基氟、 羥胺、二硫化物如二吡咬基二硫、乙烯基砜、乙烯基曱酮、重氮烷類、重 氫乙?；衔铩h(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷和氮丙啶。Rl聚合物的優(yōu)選官能團(tuán)包括但不限于硫醇、馬來酰亞胺、氨基、羧酸 和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、醛和卣代乙?；?。尤其優(yōu)選的官能團(tuán)包括硫醇、馬來酰亞胺、氨基、羧酸和衍生物、氨基曱酸酯和衍生物和碳酸酯及其衍生物。X和Rl之間形成的適合的鍵或基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括二硫化物、 S-琥珀酰亞胺基、酰胺基、氨基、羧酸酯、磺酰胺、氨基曱酸酯、碳酸酯、 醚、將、硫醚、腙、脲、硫脲、磷酸酯、膦酸酯等。X和Rl之間形成的優(yōu)選的鍵或基團(tuán)包括S-琥珀酰亞胺基、酰胺基、 氨基甲酸酯和脲。優(yōu)選地，Rl聚合物是適當(dāng)水合的、可降解或可排泄的，對哺乳動(dòng)物無 毒或無免疫原性。優(yōu)選的Rl聚合物包括基于聚烷氧基的聚合物如聚乙二 醇和描述于Nektar Inc. 2003 catalog "Nektar Molecule Engineering -Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation，， 中的那些聚乙二醇試劑，和支化的、超支化的、交聯(lián)聚合物和水凝膠類，以及蛋白 類3口白蛋白。聚合物前藥的 一般性合成工藝本發(fā)明聚合物前藥的代表性實(shí)例的合成描述于實(shí)施例部分。 本發(fā)明前藥可以以各種不同的方式制備。圖8顯示了合成本發(fā)明式Ic 的聚合物前藥的第一種 一般途徑。在該第 一種方法中，通過用原料(II)替換固定化原料(III)的離去基團(tuán) A，提供固相固定化中間體(IV)。任選地，該取代可以在溶液中用可溶性原 料(III)進(jìn)行。(III)中的X可以用適合的保護(hù)基PG保護(hù)。適合的保護(hù)基描 述于TW Greene, P.G.M. Wuts，"有機(jī)合成中的保護(hù)基，，，1999， John Wiley & Sons,第3版。將中間體(V)從固相中裂解，并且所有保護(hù)基用試劑如三氟乙酸或 DTT裂解。然后使中間體(V)與聚合物R1反應(yīng)，得到聚合物前藥(Ica)。式lb的聚合物前藥可以通過如上對式Ic前藥所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的類似方法、使用例如原料IIa制備。圖9顯示了合成本發(fā)明式Ia聚合物前藥的第二種一般途徑。 在該第二種方法中，固相固定化中間體(VII)從原料(VI)、通過一個(gè)或 兩個(gè)親核取代步驟或者一個(gè)或兩個(gè)還原烷基化步驟提供。任選地，該取代 或還原烷基化步驟可以在溶液中用可溶性原料(VI)進(jìn)行。(III)中的X可以 用適合的保護(hù)基PG保護(hù)。將中間體(V)從固相中裂解，并且所有保護(hù)基用試劑如三氟乙酸或DTT裂解。然后使中間體(VIII)與聚合物R1反應(yīng)，得到聚合物前藥(Iaa)。 圖10顯示了合成本發(fā)明式Ia聚合物前藥的另一種一般途徑。 在該方法中，固相固定化中間體(X)從原料(IX)、通過一個(gè)或兩個(gè)親核 取代步驟或者一個(gè)或兩個(gè)還原烷基化步驟提供。任選地，該取代或還原烷 基化步驟可以在溶液中用可溶性原料(IX)進(jìn)行。(X)中的X可以用適合的保 護(hù)基PG保護(hù)。將中間體(XI)從固相中用試劑如六氟異丙醇裂解，但不裂 解保護(hù)基。在第一途徑中，將中間體(XI)用試劑如碳二亞胺類和N-羥基琥珀酰亞 胺活化，得到(XII)。使中間體(XII)與含胺藥物分子反應(yīng)，得到中間體(XIII)。 將保護(hù)基PG從中間體(XIII)裂解之后，使該化合物與聚合物R1反應(yīng)，得 到聚合物前藥Iaa。在第二途徑中，將保護(hù)基用試劑如三氟乙酸或DTT從(XI)中裂解，使 殘基與聚合物R1反應(yīng)，得到中間體(XIV)。將中間體(XIV)用試劑如碳二 亞胺類和N-羥基琥珀酰亞胺活化，得到中間體(XV),使其與含胺藥物反應(yīng)，形成聚合物前藥Iaa。在第三途徑中，將保護(hù)基PG從活化中間體(XII)中裂解，使殘基與聚 合物R1反應(yīng)，得到中間體(XV)，然后使其與含胺藥物反應(yīng)，形成聚合物 前藥Iaa。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明所述并攜帶合成相應(yīng)聚合物前藥中所述和所用 的保護(hù)基或離去基團(tuán)的連接團(tuán)結(jié)構(gòu)被視為在本發(fā)明范圍內(nèi)。聚合物前藥在分子治療中的應(yīng)用本發(fā)明的關(guān)鍵優(yōu)勢是從聚合物前藥釋放未修飾的生物活性部分。在 Greenwald等人(Greenwald等人，J. Med.Chem. 2004， 47， 726-734)描述的 前藥中，生物活性部分從聚合物載體中釋放，作為N-二(羥乙基)甘氨酸修 飾的藥物分子而具有不可預(yù)測的藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性、毒性和藥效學(xué)特 征。在本發(fā)明前藥中釋放N-二(羥乙基)甘氨酸修飾的藥物分子是不可能的， 因?yàn)榫酆衔镙d體與N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)永久鍵合。對于聚合物前藥，需要臨時(shí)鍵合的裂解動(dòng)力學(xué)在人體血液中(pH7.4， 37。C)存在的條件下進(jìn)行。最重要的是，該臨時(shí)鍵合的裂解應(yīng)該基于水解，化學(xué)實(shí)體如酶、鹽或結(jié)合蛋白的依賴性。本發(fā)明聚合物前藥的進(jìn)一步關(guān)鍵優(yōu)勢是它們的優(yōu)勢非酶促裂解前藥 的體內(nèi)半衰期至少為前藥在pH7.4的無酶緩沖溶液中的半衰期的50%。這 種優(yōu)勢非酶促裂解使得在施用于活有機(jī)體之后對釋放速率具更好的預(yù)測性 和控制性，并且降低了患者間的差異性。現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)連接N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)與藥物分子氨 基的臨時(shí)鍵合的裂解速率可通過由N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)的不同取代 或聚合物連接介導(dǎo)的鄰近基團(tuán)效應(yīng)來控制。通過基本上非酶促的化學(xué)反應(yīng) 來控制釋放速率，該化學(xué)反應(yīng)又依賴于該連接團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的 系統(tǒng)性或隨機(jī)性修飾、例如通過改變聚合物在N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán) 上的連接位點(diǎn)，使得可以產(chǎn)生具有不同釋放速率的前藥連接團(tuán)。因此，可能產(chǎn)生多種前藥連接團(tuán)，并根據(jù)給定醫(yī)藥或治療應(yīng)用所提出的要求選擇快 速或慢速裂解的前藥連接團(tuán)。不依賴于酶的釋放控制使得不需要包封的貯庫型制劑成為可能。到目 前為止，許多生物相容性材料如大孔徑水凝膠類不能用于貯庫型制劑，原 因是它們?nèi)狈Π庑阅?。對于大多?shù)治療應(yīng)用而言，生物活性部分將自這 種適當(dāng)7JC合且機(jī)械上軟性的生物相容性材料中釋放得太快。結(jié)合本發(fā)明所 述的前藥連接團(tuán)，可以優(yōu)化載體材料的生物相容性，因?yàn)獒尫艃H僅受到連 接團(tuán)裂解動(dòng)力學(xué)的控制，并且不需要聚合物載體本身的化學(xué)和酶促降解。


圖l顯示栽體連接的前藥。圖2顯示酶依賴性載體連接的前藥。圖3顯示級(jí)聯(lián)前藥，其中掩蔽基團(tuán)是載體的一部分。圖4顯示酶依賴性級(jí)聯(lián)前藥，其中掩蔽基團(tuán)與載體分離，且栽體被永 久地連接到活化基團(tuán)。圖5顯示具有N-二(羥乙基)甘氨酸活化基團(tuán)的載體連接的級(jí)聯(lián)前藥， 其中掩蔽基團(tuán)是載體的一部分。圖6顯示具有N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)的載體連接的前藥，其中載 體被永久地連接到N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)。圖7顯示聚合物前藥的體內(nèi)裂解。圖8顯示一般合成方法。圖9顯示一般合成方法。圖IO顯示一般合成方法。實(shí)施例 材料Fmoc-氨基酸、樹脂和PyBOP購自Novabiochem，并根據(jù)產(chǎn)品目錄命 名。Fmoc-Ado-OH得自Neosystem。所有其它化學(xué)品購自Sigma Aldrich。重組人胰島素來自ICN Biomedicals (USA)。馬來酰亞胺-PEG5k得自 Nektar(USA)。 5-(和-6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(混合的異構(gòu)體)得自 Molecular Probes 。分析質(zhì)i普法(MS)在Waters ZQ 4000 ESI儀上進(jìn)行，如果必要，光語通過 Waters軟件MaxEnt解析。尺寸排阻色傳法使用配備Superdex 200柱的 Amersham Bioscience AEKTAbasic系統(tǒng)(Amersham Bioscience)進(jìn)行。1的合成將lg(5.5mmo1) 3，6-二氧雜辛烷-1，8-二硫醇溶于10ml DMF，加入 lg(3.6mmol)三苯甲基氯和1ml p比咬。將該溶液在室溫?cái)嚢?0min，將單-S-三苯甲基保護(hù)的3，6-二氧雜辛烷-1，8-二硫醇通過RP-HPLC純化(產(chǎn)率 850mg， 2mmo1， 56%)。將300mg(0.71mmo1) S-三苯曱基-3，6-二氧雜辛烷-l，8-二硫醇溶于5ml 19/1(v/v)甲醇/7jc中，加入300nl表氯醇、500fil吡啶和50pl DIEA。將該溶 液在40。C攪拌14小時(shí)，然后加入50ml水。過濾收集沉淀物，在真空中 干燥。將沉淀物溶于5ml二漲烷，加入IOO[U水和500nl 2-氨基乙醇。將 該溶液在60。C攪拌72小時(shí)。加入lml乙酸后，將產(chǎn)物1通過RP-HPLC 純化(產(chǎn)率215mg, 0.4mmo1， 56%)。MS [M+Na+=564.9 (MW+Na計(jì)算值=564.8g/mol)。2的合成<formula>formula see original document page 37</formula>2是如1所述、使用lg 1，4-二硫蘇糖醇合成。MS [M+Na+=536.8 (MW+Na計(jì)算值=536.7g/mol)。3和4的合成<formula>formula see original document page 37</formula>Lys28 ivDde 側(cè)鏈保護(hù)的 GLP(7-36)(序歹ij : HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR-酰胺)在Rink-酰 胺樹月旨上、4吏用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg,德、國) 合成。將N-末端fmoc-保護(hù)基除去，將樹脂用DCM洗滌，干燥。將50mg 樹脂(0.11mmol/g，5.5nmol)混懸于42mg溴乙酸(300nmol)和47nl(300nmo1) DIC在500^1 DMF中的溶液中。在室溫將該混合物振搖30分鐘。用DMF 洗滌樹脂6次之后，將該樹脂在20mg 2和10^1 DIEA在200^1 DMF中的 溶液中溫育2小時(shí)。用DMF洗滌樹脂6次之后，通過用含5%肼的DMF 溫育樹脂3次，將ivDde保護(hù)基裂解達(dá)20分鐘。將樹脂各用DMF和DCM洗滌6次。從樹脂裂解肽和保護(hù)基的除去用96/2/2(v/v/v)TFA/三乙基曱硅 烷/水進(jìn)4于卯min而完成。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)。將3a通過RP-HPLC 純化，冷凍干燥。MS: [M+3H3+=1204.2,M+2H2+=1806.3(MW計(jì)算值-3609g/mo1)。 對于3b的合成，將150mg樹脂(0.11mmol/g， 16.5nmol)混懸于126mg 溴乙酸(900nmol)和141nl(900jimol)DIC在1.5ml DMF中的溶液中。將該 混合物在室溫振搖30分鐘。用DMF洗滌樹脂6次之后，將該樹脂在60mg 2和30nl DIEA在600fil DMF中的溶液中溫育2小時(shí)。用DMF洗滌樹脂 6次之后，通過用含5%肼的DMF溫育樹脂3次，將ivDde保護(hù)基裂解達(dá) 20分鐘。將樹脂各用DMF洗滌6次。將20mg Fmoc-8-氨基-3，6-二氧雜辛酸(50nmol)與8.2jd DlC(50nmo1)、 8mgHOBt(50jimol)和0.5mlDMF混合，在室溫溫育30分鐘。然后將樹脂 與反應(yīng)混合物溫育2小時(shí)，用DMF洗滌樹脂6次。用含20%旅，定的DMF 除去Fmoc保護(hù)基達(dá)15分鐘。用DMF洗滌樹脂6次，與12mg 5-(和-6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(25nmol)和lOpl DIEA在500fil DMF中的溶液 溫育1小時(shí)。將樹脂各用DMF和DCM洗滌6次，千燥。從樹脂中裂解 肽和保護(hù)基的除去用96/2/2(v/v/v) TFA/三乙基曱硅烷/水進(jìn)行90分鐘而完 成。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)。將3b通過RP-HPLC純化，冷凍干燥。 MS: [M+3H13+=1372.0,M+2H2+=2057.5(MW計(jì)算值-4113g/mo1)。 對于4的合成，將50mg樹脂(0.11mmol/g， 5.5nmol)混懸于25mg boc-卩 丙氨酸(80jimol)、29jd DIEA和42mg PyBop(80junol)在500jU DMF中的溶 液中。將該混合物在室溫振搖30分鐘。用DMF洗滌樹脂6次之后，通過 用含5o/。肼的DMF溫育樹脂3次，將ivDde保護(hù)基裂解達(dá)20分鐘。如上 述偶聯(lián)溴乙酸。用DMF洗滌樹脂6次之后，將樹脂在20mg 2和10^1 DIEA 在200filDMF中的溶液中溫育14小時(shí)。將樹脂各用DMF和DCM洗滌6 次。從樹脂中裂解肽和保護(hù)基的除去用96/2/2(v/v/v) TFA/三乙基甲硅烷/ 水完成。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)，將4通過RP-HPLC純化，冷凍干 燥。MS: [M+3H3+=1227.9，M+2Hf+=1841.4(MW計(jì)算值-3680g/mo1)。 5和6的合成5: RsH & R豕H9: R-S恥-PEG5k 10: RsSuc"PEG5k如3和4所述、分別使用20mg 1合成5和6。5: MS: [M+3H4+=1213.4， [M+2IT|3+=1819.3(MW計(jì)算值-3637g/mo1) 6: MS: [M+3H4+=1237.4, [M+2H3+=1855.2(MW計(jì)算值-3708g/mo1)化合物14的合成方案<formula>formula see original document page 40</formula>化合物11的合成將750mg 6-(l，3-二氧代-l，3-二氫異吲哚-2-基)己酸(2.9mmol)和180mg 紅磷(5.8mmol)混懸于7ml CC14中，分兩批加入600^1 Br2(11.7mmol)。將 反應(yīng)混合物在90。C攪拌5小時(shí)。冷卻之后，將該混合物用20ml水和20ml 二乙醚稀釋，用NaHCO;j中和。通過加入NaHSO;j還原過量的Br2。將分離的有機(jī)層用NaHC03水溶液萃取。合并水層，用濃HC1酸化。過濾收集 粗產(chǎn)物，從EtOH-水中重結(jié)晶。 產(chǎn)率350mg(36。/。)。MS [M+Na+=364.2 (MW+Na計(jì)算值=363.0g/mol)?；衔?3的合成側(cè) 鏈 保 護(hù) 的GLP(7-36)( 序 歹。
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-酰胺)在Rink-酰胺樹脂 上、使用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg,德國)合成。 將N-末端fmoc-保護(hù)基除去，將樹脂用DCM洗涂，干燥。將3.6mg ll(lOjimol)、 1.5mg HOBt(10nmol)和1.6jil DIC(lOnmol)在 300nlDMF中的溶液加至10mg荷載的樹脂(0.22mmol/g, 2.2nmol)中，將 該混合物在RT振搖3小時(shí)。用DMF和DCM洗滌樹脂之后，加入19mg 二(2-羥乙基)胺(180mmol)在400ml DMF中的溶液，將該混懸液在70。C溫 育2小時(shí)，得到12。用DMF和EtOH洗滌樹脂，然后在60°C用400jil l/99(v/v) N2H4—水合物/乙醇處理1小時(shí)，除去苯鄰二甲酰亞胺保護(hù)基。 用EtOH和DMF洗滌之后，加入3.8mgMmt-巰基丙酸(10mmo1)、 1.5mg HOBt(10nmol)和1.6jil DIC(lOnmol)在300^1 DMF中的溶液，將該混合物 在RT振搖3小時(shí)，隨后用DMF和DCM洗滌樹脂。從樹脂中裂解肽和 保護(hù)基的除去用96/2/2(v/v/v) TFA/三乙基甲硅烷/水完成。在氮?dú)饬飨鲁?揮發(fā)性物質(zhì)，將13通過RP-HPLC純化，冷凍干燥。13:產(chǎn)率1.2mg(14%)。MS [M+2H2+=1801.4;M+3H13+=1201.2(MW計(jì)算值-3604g/mo1)。綴合物7、 8、 9、 10和14的合成將3 (O.lnmol)在1/1(v/v)乙腈/水(30nl)中的溶液與馬來酰亞胺-PEG5k (0.2fimol)混合于1/1(v/v)乙腈/水(50jU)和50jU 0.5M磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4) 中。將該混合物在RT溫育10分鐘。使用10mM磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)、150mM NaCl和0.005% Tween 20作為流動(dòng)相，將綴合物7通過RP-HPLC 純化，通過SEC(柱Superdex 200，流速0.75ml/min)分析，使用10mM 磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 、 150mM NaCl和0.005 % Tween 20作為流動(dòng)相。7: SEC保留時(shí)間19.5min。8、 9和10分別從如上所述的4、 5和6合成。14從如上所述的13合成，并通過SEC(柱Superdex 200,流速0.75 ml/min)純化，使用10mM磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)、 150mM NaCl和0.005% Tween 20作為流動(dòng)相。將收集的洗脫液(約l.Oml)用0.5ml含有0.05% NaN3 的緩沖溶液稀釋，直接用于用于釋放速率測定。14: SEC保留時(shí)間19.7分鐘?；衔?7的合成方案<formula>formula see original document page 43</formula>O——2d-Trt樹脂1. 哌啶2, Trt-巰基丙酸，DIC0— 2d-Trt樹脂(lv)Dde'化合物16的合成將170mg 2-氯三苯甲基氯樹脂(荷載1.2mmol/g， 0.2mmol)與200mg Dde-Lys(Fmoc)-OH(0.4mmol)和140nl DIEA (0.8mmol)在4ml DCM中溫<formula>formula see original document page 43</formula>1.3%N2IVDMF2. NaCNBH3 : 了 1。HO" 、0'2-CI-Trt樹脂2. HFIP/DCMO-M育1.5小時(shí)。將Fmoc-保護(hù)基用哌力DMF裂解，用DCM和DMF洗滌樹 脂。將樹脂在室溫與209mg Trt-巰基丙酸(0.6mmo1)、 93mg HOBt(0.6mmo1) 和97[U DlC(0.6mmol)在DMF中的溶液振搖2小時(shí)。將樹脂用含2%肼的 DMF處理三次，除去Dde保護(hù)基。用DMF洗滌之后，加入240mg乙醇 醛二聚物(glycole aldehyde dimer)(2.00mmo1)、 252mg NaCNBH3(4.00mmol) 和200jU乙酸在20ml DMF中的溶液，將該混合物振搖過夜，得到15。將 樹脂用DMF洗滌，在RT與309mg Mmt-Cl(1.00mmol)在2ml吡啶中的攪 4半3小時(shí)。將樹脂用DCM洗滌，干燥。用l/7(v/v) HFIP/DCM(2 x 2min) 將產(chǎn)物16從樹脂解離。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)，將16通過硅膠柱色 譜法、使用DCM/MeOH/Et3N (85:15:0.03 (v/v))作為流動(dòng)相純化。Rf (DCM/MeOH/Et3N(85:15:0.03 (v/v))=0.5。16:產(chǎn)率108mg(50%)。MS [M+Na+=1131.9 (MW+Na計(jì)算值=1131.6g/mol)。化合物17的合成將4ml乙腈中的65mg 16(59nmol)、 9,3^1 DlC(60nmol)和13.8mg HOSu(120pmol)在RT攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，將17通過硅膠柱色傳法、 使用庚烷/EtOAc/Et3N (50:50:0.03 (v/v))作為流動(dòng)相純化。Rf (庚烷/EtOAc/Et3N (50:50:0.03 (v/v))=0.4。17:產(chǎn)率56mg(77%)，為TFA鹽。MS [M+Nal+=1228.7 (MW+Na計(jì)算值=1228.6g/mol)?；衔?8的合成胰鳥素>^29-熒光素胰島素的合成將80mg(13.8jimo1) rh-胰島素溶于4ml l/l(v/v) DMF/DMSO中，加入 40jUDIEA。加入8mg(17fimol)5-(和-6)-羧基焚光素琥珀酰亞胺基酯，將該 溶液在室溫?cái)嚢?0分鐘。加入4ml 5/5/1 (v/v/v)乙腈/7K/乙酸，將產(chǎn)物NeB29-熒光素胰島素通過RP-HPLC純化，冷凍干燥。通過用1，4-二硫蘇糖醇還 原>^29-熒光素胰島素、蛋白酶消化和MS分析驗(yàn)證綴合位點(diǎn)。MS: [M+2H2+=3084.0; [M+3H3+=2054.6(MW計(jì)算值-6166g/mo1)。將DMF(20jU)中的4.4mg 16(4.0jimo1)、 0.6&1 DlC(4.0fimol)和0.9mg HOSu(8.0jimol)在RT反應(yīng)2小時(shí)。將該溶液加至DMSO(60nl)中的6.2mg N"29-焚光素-rh-胰島素(1.0fimol)和DIEA(2pl)，將該混合物在RT攪拌90 分鐘。將反應(yīng)混合物用乙酸中和，用乙腈/1120稀釋。RP-HPLC純化，得 到適合的Mmt-和Trt-保護(hù)的中間體。冷凍干燥之后，將該Mmt-和Trt-保護(hù)的中間體與95:5(v/v) TFA/三乙 基甲硅烷混合，攪拌5分鐘。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)，將18通過 RP-HPLC純化，冷凍干燥。MS [M+2H2+=3238.2; [M+3H3+=2157.2(MW計(jì)算值-6472g/mo1)?；衔?9的合成八NH2sB29胰烏素 19將18 (1.5nmol)在1/4 (v/v)乙腈/水(20jd)中的溶液與馬來酰亞胺 -PEG5k (1.9nmol)在1/4 (v/v)乙腈/水(10nl)和50jil 0.5M磷酸鹽緩沖溶液 (pH7.4)中混合，在RT溫育2分鐘。將化合物通過SEC(柱Superdex 200， 流速0.75mL/min)、使用10mM HEPES緩沖溶液(pH7.4)、 150mMNaCl、 3mM EDTA和0.005% Tween 20作為流動(dòng)相純化。將收集的洗脫液(約1.5mL)直接用于釋放速度測定。19: SEC保留時(shí)間18.8分鐘。]^829綴合的化合物20的合成oA1\ / bB29 m 胰烏素 2Q將NMP中的8pl 83mM 17(0.6fimol)加至DMSO(60fil)中的6.2mg rh誦 胰島素(1.0nmol)和DIEA(0.5nl)，將該混合物在RT攪拌90分鐘。將反應(yīng) 混合物用乙酸中和，用乙腈/H20稀釋。RP-HPLC純化，得到適當(dāng)?shù)腡rt-和Mmt-保護(hù)的中間體。冷凍干燥之后，將Trt-和Mmt-保護(hù)的中間體與 95:5(v/v)TFA/三乙基甲硅烷混合，攪拌5分鐘。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物 質(zhì)，將20通過RP-HPLC純化，冷凍干燥。通過DTT還原和MS分析驗(yàn) 證胰島素修飾的位置。MS [M+3H3+=2038.1; [M+4H廣-1528.1(MW計(jì)算值-6112g/mo1)?；衔?1的合成八，乂 /圖gB29 胰島素 2121如19所述從20合成。 21: SEC保留時(shí)間18.6分鐘。22的合成GLP-1s28J1一Ado—熒光素Lys28 ivDde 側(cè)鏈保護(hù)的 GLP(7-36)( 序歹'J : HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK(ivDde)GR-酰胺)在Rink-酰 胺樹脂上、使用fmoc-法(Specialty Peptide Laboratories, Heidelberg,德國) 合成。除去N-末端fmoc-保護(hù)基，將樹脂用DCM洗滌，干燥。將150mg 樹脂(0.11mmol/g, 16.5nmol)在20mg Fmoc-Ado-OH(50jimo1) 、 25mg PyBop(50nmol)和17jil DIEA在500^1 DMF中的溶液中溫育1小時(shí)。用 96/2/2 DMF/哌咬/DBU除去fmoc保護(hù)基之后，用17.4mg Trt-巰基丙酸 (50jimo1)、 25mg PyBop(50nmol)和17jd DIEA(100junol)在500jil DMF中 的溶液將樹脂溫育1小時(shí)。通過在500jil 9/l(v/v) DMF/肼中將樹脂溫育2 小時(shí)而除去ivDde保護(hù)基。用DMF洗滌樹脂之后，將Fmoc-Ado-OH偶 聯(lián)，如上所述除去fmoc保護(hù)基。然后將樹脂用16mg 5-(和-6)-羧基熒光素 琥珀酰亞胺基酯和6pl DIEA在500ml DMF中的溶液溫育2小時(shí)。從樹脂 中裂解肽和保護(hù)基的除去用96/2/2(v/v/v) TFA/三乙基曱硅烷/水進(jìn)行90分 鐘而完成。在氮?dú)饬飨鲁]發(fā)性物質(zhì)。將22通過RP-HPLC純化，冷凍 干燥。MS:M+3H3+=1345.9， [M+2H]2+=2016.9(MW計(jì)算值-4034g/mo1)。 rHSA-馬來酰亞胺(23)的合成23將500nl在145mM NaCl、32mM辛酸鈉、0.0015% Tween畫80中的3mM rHSA(1.5jimol)溶液與lOOjil 0.5M磷酸鹽緩沖溶液pH7.0混合。加入1.5mgN，N'-二馬來酰亞胺基丙?；?2-羥基-l，3-二氨基丙烷(3.75nmo1),將該混合 物在RT反應(yīng)20分鐘。將化合物23通過SEC(柱Superdex 200 26/60, 流速4ml/min)、使用10mM磷酸鈉緩沖溶液pH7.4、 150mMNaCl作為 流動(dòng)相純化。ESI-MS=66900(MW計(jì)算值-66864g/mo1)。氟硼焚(Bodipy)標(biāo)記的rHSA(24)的合成將500jil在145mM NaCl、32mM辛酸鈉、0.0015% Tween-80中的3mM rHSA(1.5nmol)溶液與250pl 0.5M硼酸鈉緩沖溶液pH8.0混合。加入 DMSO中的43fd 100mM BODIPY TR-X， STP酉旨(Molecular Probes), 將該混合物在RT反應(yīng)20分鐘。將Bodipy標(biāo)記的rHSA(24)通過SEC(柱 Superdex 200 26/60，流速4ml/min)、使用10mM磷酸鈉緩沖溶液pH7.4、 150mM NaCl作為流動(dòng)相純化。25的合成e2S 1 ,—Ad。一熒光素26將0.75ml 10mM磷酸鈉、150mM NaCl pH6中的45mg 23與250nl 0.5ml硼酸鈉pH8混合，加入50jU DMSO中的8mg 22。將該溶液在室溫 溫育20分鐘。將25通過SEC(柱Superdex 200 26/60，流速4ml/min)、 使用10mM礴酸鈉緩沖溶液pH7.4、 150mM NaCl作為流動(dòng)相純化。MS: 70870(MW計(jì)算值-70898g/mo1)。26的合成〉cf h26如25所述、使用23和3b合成。 MS: 70950(MW計(jì)算值-70977g/mo1)。在體內(nèi)從rHSA綴合物26釋放熒光素-GLP-l在體內(nèi)熒光素-GLP-l自rHSA綴合物26的釋放是通過減量法、通過 測定注入大鼠之后保持與綴合物連接的熒光素-GLP-l的量而測得。這通過 比較兩種不同的rHSA-熒光素-GLP-l綴合物完成，其一的熒光素-標(biāo)記的 GLP-1以可逆連接團(tuán)(綴合物26)連接至白蛋白，對照物中標(biāo)記的GLP-1 永久連接至rHSA(綴合物25)。為了獲得高度準(zhǔn)確的體內(nèi)動(dòng)力學(xué)并控制注 射位置的差異性，使用了內(nèi)標(biāo)物。該內(nèi)標(biāo)物是通過共同注入未綴合的 Bodipy標(biāo)記的rHSA(24)而得到。在對照試驗(yàn)中，使用 一組5只雄性Sprague Dawley大鼠。將56nmo1 25 和97nmo1 24在450fU 10mM磷酸鈉pH7.4、 150mM NaCl中的混合物經(jīng) 皮下注入每只大鼠中。在各時(shí)間間隔取血漿樣品，測定熒光素和Bodipy 熒光。將熒光素/Bodipy熒光的歸一比對時(shí)間繪圖(圖7,三角形)。在主試驗(yàn)中，使用 一組3只雄性Sprague Dawley大鼠。將40mno1 26 和72nmo1 24在450fil 10mM磷酸鈉pH7.4、 150mM NaCl中的混合物經(jīng) 皮下注入每只大鼠中。在與對照試驗(yàn)中相同的各時(shí)間間隔取血漿樣品，測 定焚光素和Bodipy熒光。將焚光素/Bodipy熒光的歸一比(normalized ratio) 對時(shí)間繪圖(圖7，方形)。主試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)除以由對照試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)對時(shí)間繪圖，得到熒光 素-GLP-l從綴合物26中的釋放動(dòng)力學(xué)。在緩沖溶液dH7.4中肽或熒光素-肽自綴合物中的釋放(熒光素)-肽自(熒光素)-肽綴合物7、 8、 9、 10、 14、 19、 21和26中的 釋放是通過在水性緩沖溶液pH7.4中的連接團(tuán)水解完成。將冷凍干燥的綴 合物溶解于10mMHEPES緩沖溶液(pH7.4)、 150mMNaCl、 3mM EDTA 和0.005% Tween 20中。將重新溶解的綴合物和收集的(熒光素)肽綴合物 的SEC洗脫液在37°C溫育，在各時(shí)間間隔取樣品，通過RP-HPLC(肽綴 合物)在215nm處UV檢測分析，或通過SEC(熒光素肽綴合物)在500nm 處檢測分析。分別對與原始肽或熒光素-肽的保留時(shí)間關(guān)聯(lián)的峰積分，并對 溫育時(shí)間繪圖，應(yīng)用曲線擬合軟件估計(jì)相應(yīng)的釋放半衰期?；衔飔w緩沖液pH7.4tl/2體內(nèi)7nd8nd910 dnd10lldnd1412 dnd1922 dnd2174 dnd266d3,75 d縮寫Ado 8-氨基-3,6-二氧雜辛酸Boc 叔丁氧基羰基Bodipy BODIPY TR國XDBU 1 ，3-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十 一碳烯DCM 二氯甲烷(iv)Dde 1 -(4，4-二甲基-2，6-二氧代-環(huán)己基亞基)3-甲基-丁基DIC 二異丙基碳二亞胺DIEA 二異丙基乙胺DMAP 二甲氨基-吡啶DMF N,N-二曱基甲酰胺DMSO 二曱基亞砜DSC 二琥珀酰亞胺基碳酸酯EDTA 乙二胺四乙酸eq 化學(xué)計(jì)算當(dāng)量fmoc 9-芴基甲氧基羰基Fmoc-Ado-OH Fmoc-8-氨基-3.，6-二氧雜辛酸HFIP 六氟異丙醇HEPES N-(2-羥乙基)哌溱-N'-(2-乙磺酸)HOBt N-羥基苯并三唑LCMS 質(zhì)語偶聯(lián)液相色語Mal 馬來酰亞胺丙酰基Mmt 4-甲氧基三苯甲基MS 質(zhì)語MW 分子量Npys 3-硝基-2-吡啶亞磺?；?sulfenyl)PyBOP 苯并三唑-l-基-氧基-三-吡咯烷子基-鱗六氟磷酸鹽rHSA 重組人血清白蛋白R(shí)P-HPLC 反相高效液相色i普法RT 室溫SEC 尺寸排阻色鐠法Sue 琥珀酰亞胺基丙?；鵗ES 三乙基曱硅烷TFA 三氟乙酸THF 四氫呋喃UV 紫外光VIS 可見光
權(quán)利要求
1、一種聚合物前藥，包括經(jīng)由至少一個(gè)永久鍵連接到N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)的至少一種聚合物，該N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)通過臨時(shí)鍵合連接到含胺生物活性部分。
2、 具有以下結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的前藥或相應(yīng)的聚合物前藥連接團(tuán)試劑<formula>formula see original document page 2</formula>其中T是D或A，D是含胺生物活性部分的殘基，且A是離去基團(tuán)；X是間隔部分如R13-Y1 ，Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的 芳基、取代或未取代的雜芳基， R2和R3獨(dú)立地選自氫、酰基或羥基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、卣 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
3、具有以下結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的前藥或相應(yīng)的聚合物前藥連接團(tuán)試<formula>formula see original document page 3</formula>其中T是D或A，D是含胺生物活性部分的殘基，且A是離去基團(tuán)；X是間隔部分如R13-Y1,Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基，R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；蛄u基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、離 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
4、具有以下結(jié)構(gòu)的權(quán)利要求1的前藥或相應(yīng)的聚合物前藥連接團(tuán)試劑<formula>formula see original document page 3</formula>其中T是D或A，D是含胺生物活性部分的殘基，且A是離去基團(tuán)；X是間隔部分如R13-Y1 ，Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的 芳基、取代或未取代的雜芳基， R2和R3獨(dú)立地選自氫、酰基或羥基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、卣 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
5、 權(quán)利要求1至4之一的前藥，其中所述生物活性部分選自下組生物 學(xué)部分小分子生物活性劑或生物聚合物。
6、 權(quán)利要求5的前藥，其中所述生物聚合物選自下組生物聚合物蛋 白質(zhì)、多肽、寡核苷酸和核酸肽。
7、 權(quán)利要求6的前藥，其中所述多肽選自下組多肽ACTH、腺苷脫 氨酶、agalsidase、白蛋白、a-l抗胰蛋白酶(AAT)、 a-l蛋白酶抑制劑(API)、 組織纖維蛋白溶原酶激活劑、anistreplase、安克拉酶絲氨酸蛋白酶、抗體 (單克隆或多克隆，以及片段或融合物)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑酶 肽、天冬酰胺酶、biphalin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)、降鈣素(鮭魚)、膠原酶、 脫氧核糖核酸酶、內(nèi)啡肽、恩夫韋地、腦啡肽、紅細(xì)胞生成素、凝血因子 VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、纖溶酶、融合蛋白、 促卵泡激素、粒細(xì)胞集落形成刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖 素、胰高血糖素樣肽如GLP-1、葡糖腦苷脂酶、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激 因子(GM-CSF)、磷脂酶-活化蛋白(PLAP)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、血 紅蛋白、乙型肝炎疫苗、蛭素、透明質(zhì)酸酶、艾杜糖苷酸酶、免疫球蛋白、流感疫苗、白細(xì)胞介素類(lou ip、 2、 3、 4、 6、 10、 11、 12)、 IL-1受體 拮抗劑(rhIL-lra)、胰島素類、干擾素類(a2a、 a2b、 a2c、卩l(xiāng)a、 |51b、 yla、 ylb)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長因子、乳糖酶、醋酸亮丙 瑞林、左曱狀腺素、黃體生成素、萊姆疫苗、利尿鈉肽、胰脂肪酶、木瓜 蛋白酶、甲狀旁腺激素、PDGF、胃蛋白酶、血小板激活因子乙?；?酶(PAF-AH)、催乳素、蛋白C、抑生長肽、胰泌素、舍莫瑞林、超氧化物 歧化酶(SOD)、促生長素(生長激素)、生長抑素、鏈激酶、蔗糖酶、破傷風(fēng) 毒素片段、tilactase、凝血酶、胸腺素、促甲狀腺激素、促曱狀腺素、肺瘤 壞死因子(TNF)、 TNF受體-IgG Fc、組織纖溶酶原激活物(tPA)、 TSH、 尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗類和植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白。
8、 權(quán)利要求6的前藥，其中所述蛋白質(zhì)是通過重組DNA技術(shù)制備的 蛋白質(zhì)。
9、 權(quán)利要求6的前藥，其中所述蛋白質(zhì)選自下組蛋白質(zhì)抗體片段、 單鏈結(jié)合蛋白、催化抗體和融合蛋白。
10、 權(quán)利要求6的前藥，其中所述蛋白質(zhì)選自下組蛋白抗體、降4丐 素、G-CSF、 GM-CSF、紅細(xì)胞生成素、血紅蛋白、白細(xì)胞介素、胰島素、 干擾素、SOD、生長激素、TNF、 TNF-受體-IgG Fc、胰高血糖素樣肽如 GLP-1。
11、 權(quán)利要求5的前藥，其中所述小分子生物活性劑選自具有至少一 個(gè)伯氨基或仲氨基的下組活性劑中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性劑、抗感染劑、抗腫 瘤劑、抗菌劑、抗真菌劑、鎮(zhèn)痛劑、避孕劑、抗炎劑、甾體劑、血管舒張 劑、血管收縮劑和心血管劑。
12、 權(quán)利要求5的前藥，其中所述小分子生物活性劑選自下組化合物 柔紅霉素、阿霉素、伊達(dá)比星、米托蒽醌、氨魯米特、金剛烷胺、氨苯砜、 乙胺丁醇、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺曱氧吡噪、克林沙 星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、諾氟沙星、新霉素B、大觀霉素、 卡那霉素A、美羅培南、多巴胺、多巴酚丁胺、賴諾普利、5-羥色胺、阿 西維辛和氨磺丁脲。
13、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中R4至R12獨(dú)立地選自氫， 取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀d至Cs烷基或雜烷基。
14、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中R1選自下組聚合物基于 聚烷氧基的聚合物如聚(丙二醇)或聚(乙二醇)、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透 明質(zhì)酸和4汙生物、藻酸鹽、木聚糖、甘露聚糖、角叉菜聚糖、瓊脂糖、纖 維素、淀粉、羥乙基淀粉(HES)和其它基于碳水化合物的聚合物、聚(乙烯 醇類)、聚0i唑啉類)、聚(酐類)、聚(原酸酯類)、聚(碳酸酯類)、聚(氨基曱 酸乙酯類)、聚(丙烯酸類)、聚(丙烯酰胺類)如聚(羥丙基曱基丙烯酰胺) (HMPA)、聚(丙烯酸酯類)、聚(曱基丙烯酸酯類)如聚(羥乙基曱基丙烯酸 酯)、聚(有機(jī)磷腈類)、聚(硅氧烷類)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(氰基丙烯酸 酯類)、聚(酯類)如聚(乳酸)或聚(乙醇酸類)、聚(亞胺基碳酸酯類)、聚(氨基 酸類)如聚(谷氨酸)、膠原、明膠、共聚物類、接枝共聚物類、交聯(lián)聚合物 類以及來自上述聚合物的嵌段共聚物類。
15、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中R1是水凝膠。
16、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中Rl是支化或超支化聚合物。
17、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中Rl是樹狀聚體或密集星形 聚合物。
18、 權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)的前藥，其中R1是生物聚合物。
19、 權(quán)利要求18的前藥，其中R1是蛋白質(zhì)。
20、 權(quán)利要求19的前藥，其中所述蛋白質(zhì)是白蛋白、抗體、纖維蛋白、 酪蛋白或任意其它血漿蛋白。
21、 權(quán)利要求2至20任一項(xiàng)的前藥，其中Rl進(jìn)一步包括一種或多種 生物活性物質(zhì)。
22、 權(quán)利要求2至21任一項(xiàng)的前藥，其中Rl具有至少一個(gè)官能團(tuán)以 與X連接。
23、 權(quán)利要求22的前藥，其中所述至少一個(gè)官能團(tuán)選自下組官能團(tuán) 羧酸和活化衍生物、氨基、馬來酰亞胺、硫醇、磺酸和衍生物、碳酸酯和 衍生物、氨基甲酸酯和衍生物、羥基、醛、酮、肼、異氰酸酯、異硫氰酸酯、磷酸和衍生物、膦酸和衍生物、卣代乙?；?、烷基卣化物、丙烯酰基、 芳化劑如芳基氟化物、羥胺、二硫化物如二吡咬基二硫、乙烯基砜、乙烯 基曱酮、重氮烷類、重氮乙酰基化合物、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷和氮丙咬。
24、 權(quán)利要求22或23的前藥，其中所述至少一個(gè)官能團(tuán)選自下組官 能團(tuán)硫醇、馬來酰亞胺、氨基、羧酸和衍生物、碳酸酯和衍生物、氨基 曱酸酯和衍生物、醛和卣代乙酰基。
25、 權(quán)利要求22至24之一的前藥，其中X和R1之間形成的鍵或基 團(tuán)選自下組鍵或基團(tuán)二硫化物、S-琥珀酰亞胺基、酰胺基、氨基、羧酸 酯、磺酰氨、氨基甲酸酯、碳酸酯、醚、硫醚、亞胺、將、腙、脲、硫脲、
26、 權(quán)利要求22至25任一項(xiàng)的前藥，其中X和R1之間形成的鍵或 基團(tuán)選自下組鍵或基團(tuán)S-琥珀酰亞胺基、酰胺基、氨基甲酸酯、硫醚和 脲。
27、 權(quán)利要求2至26任一項(xiàng)的聚合物前藥連接團(tuán)試劑，其中A選自 下組離去基團(tuán)氯、溴、氟、硝基苯氧基、咪唑基、N-羥基琥珀酰亞胺基、 N-羥基苯并三唑基、N-羥基偶氮苯并三唑基、五氟苯氧基、N-羥基磺基琥 珀酰亞胺基或雜芳基。
28、 以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的聚合物前藥連接團(tuán)試劑前藥，其中T是離 去基團(tuán)A，用于與生物活性部分共價(jià)綴合并與載體鍵合。
29、 合成聚合物前藥的方法，包括 -提供式III的起始分子，<formula>formula see original document page 7</formula>-用式II的起始分子替代A，<formula>formula see original document page 8</formula>-將所得中間體從固相裂解，將所有存在的保護(hù)基裂解，形成式v中間體，和<formula>formula see original document page 8</formula>-將聚合物Rl連接到式V中間體的X，形成聚合物前藥； 其中D是含胺生物活性部分的殘基； X是間隔部分如R13-Y1 ，Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基，R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；蛄u基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、囟 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
30、合成聚合物前藥的方法，包括 -提供式VI的起始分子，<formula>formula see original document page 9</formula>-通過至少一個(gè)取代或還原烷基化步驟形成式VII中間體，<formula>formula see original document page 9</formula>-將式VII中間體從所述固相裂解，將所有存在的保護(hù)基裂解，形成式VIII中間體，和<formula>formula see original document page 9</formula>-將聚合物Rl連接到式V中間體的X，形成聚合物前藥； 其中D是含胺生物活性部分的殘基； X是間隔部分如R13-Y1,Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基，R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；蛄u基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、囟 素、羧基、羧酰胺，Rl是聚合物。
31、合成聚合物前藥的方法，包括: -提供式IX的起始分子，<formula>formula see original document page 10</formula>(IX)-通過至少一個(gè)取代或還原烷基化步驟形成式X中間體，<formula>formula see original document page 10</formula>相(X)-將式X中間體從所述固相裂解，但不將所有存在的保護(hù)基解離，形成式 XI中間體，和<formula>formula see original document page 10</formula>(XI)-用活化試劑將式XI中間體活化，形成式XII中間體，<formula>formula see original document page 10</formula>(XH)-使式XII中間體與含胺藥物D反應(yīng)，形成式XIII中間體，和<formula>formula see original document page 10</formula> (XIII)-裂解保護(hù)基PG后，將聚合物R1連接到式XII中間體的X，形成聚合物前藥； 其中D是含胺生物活性部分的殘基；A是離去基團(tuán)X是間隔部分如R13-Y1，Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基，R2和R3獨(dú)立地選自氫、酰基或羥基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、面 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
32、合成聚合物前藥的方法，包括 -提供式XI的起始分子，-裂解保護(hù)基PG后，將聚合物R1連接到式XI中間體的X,形成式XIV 中間體；-用活化試劑將式XIV中間體活化，形成式XV聚合物前藥試劑，和-使式XII中間體與含胺藥物D反應(yīng)，形成聚合物前藥； 其中D是含胺生物活性部分的殘基；A是離去基團(tuán)X是間隔部分如R13-Y1,Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的 芳基、取代或未取代的雜芳基， R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；蛄u基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氬、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、卣 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
33、合成聚合物前藥的方法，包括 -提供式XII的起始分子，<formula>formula see original document page 12</formula>-裂解保護(hù)基PG后，將聚合物Rl連接到式XII中間體的X，形成式XV 聚合物連接團(tuán)試劑，和-使式XII中間體與含胺藥物D反應(yīng)，形成聚合物前藥； 其中D是含胺生物活性部分的殘基；A是離去基團(tuán)X是間隔部分如R13-Y1 ，Yl是O、 S、 NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游 離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的 芳基、取代或未取代的雜芳基， R2和R3獨(dú)立地選自氫、?；蛄u基的保護(hù)基，R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基 或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、卣 素、羧基、羧酰胺， Rl是聚合物。
34、 斗又利要求31和32之一的方法，其中所述活化劑是碳二亞胺N-幾基琥珀酰亞胺混合物。
35、 權(quán)利要求31至33之一的方法，其中A選自氯、溴、氟、硝基苯 氧基、咪唑基、N-羥基琥珀酰亞胺基、N-羥基苯并三唑基、N-幾基偶氮苯 并三唑基、五氟苯氧基和N-羥基磺基琥珀酰亞胺基。
36、 水解權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)的前藥的方法，包括將所述前藥置于 pH約7.4的溶液中的步驟。
37、 權(quán)利要求36的方法，其中所述溶液是細(xì)胞外液。
38、 向活有機(jī)體施用含胺部分的方法，包括 腳第一步，提供權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)的聚合物前藥；一第二步，向活有機(jī)體施用所述聚合物前藥；和-第三步，通過基本上非酶促反應(yīng)將所述含胺部分從所述聚合物前藥裂
39、 權(quán)利要求38的方法，其中所述含胺部分是生物活性部分。
40、 權(quán)利要求39的方法，其中所述生物活性部分選自下組生物學(xué)部分 小分子生物活性劑或生物聚合物。
41、 權(quán)利要求40的前藥，其中所述生物聚合物選自下組生物聚合物 蛋白、多肽、寡核苷酸和核酸肽。
42、 權(quán)利要求41的方法，其中所述多肽選自下組多肽ACTH、腺苷 脫氨酶、agalsidase、白蛋白、a-l抗胰蛋白酶(AAT)、 a-l蛋白酶抑制劑(API)、 組織纖維蛋白溶原酶激活劑、anistreplase、安克洛酶絲氨酸蛋白酶、抗體 類(單克隆或多克隆，以及片段或融合物)、抗凝血酶III、抗胰蛋白酶、抑 肽酶、門冬酰胺酶、biphalin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)、降鈣素(鮭魚)、膠原酶、 脫氧核糖核酸酶、內(nèi)啡肽、恩夫韋地、腦啡肽、紅細(xì)胞生成素、凝血因子 VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、纖溶酶、融合蛋白、 促卵泡激素、粒細(xì)胞集落形成刺激因子(G-CSF)、半乳糖苷酶、胰高血糖 素、胰高血糖素樣肽如GLP-1、葡糖腦苷脂酶、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激 因子(GM-CSF)、磷脂酶-活化蛋白(PLAP)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、血 紅蛋白、乙型肝炎疫苗、蛭素、透明質(zhì)酸酶、艾杜糖苷酸酶、免疫球蛋白、 流感疫苗、白細(xì)胞介素類(la、 l卩、2、 3、 4、 6、 10、 11、 12)、 IL-1受體 拮抗劑(rhIL-lra)、胰島素類、干擾素類(a2a、 a2b、 a2c、 pia、卩l(xiāng)b、 yla、 ylb)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、轉(zhuǎn)化生長因子類、乳糖酶、醋酸亮 丙瑞林、左甲狀腺素、黃體生成素、萊姆疫苗、利尿鈉肽、胰脂肪酶、木 瓜蛋白酶、甲狀旁腺激素、PDGF、胃蛋白酶、血小板激活因子乙?；?解酶(PAF-AH)、催乳素、蛋白C、抑生長肽、胰泌素、舍莫瑞林、超氧化 物歧化酶(SOD)、促生長素(生長激素)、生長抑素、鏈激酶、蔗糖酶、破傷 風(fēng)毒素片段、tilactase、凝血酶、胸腺素、促甲狀腺激素、促甲狀腺素、腫 瘤壞死因子(TNF)、 TNF受體-IgGFc、組織纖溶酶原激活物(tPA)、 TSH、尿酸氧化酶、尿激酶、疫苗類和植物蛋白如凝集素和蓖麻毒蛋白。
43、 權(quán)利要求41的方法，其中所述蛋白質(zhì)是通過重組DNA技術(shù)制備 的蛋白質(zhì)。
44、 權(quán)利要求41的方法，其中所述蛋白質(zhì)選自下組蛋白質(zhì)抗體片段、 單鏈結(jié)合蛋白、催化抗體和融合蛋白。
45、 權(quán)利要求40的方法，其中所述小分子生物活性劑選自具有至少一 個(gè)伯氨基或仲氨基的下組活性劑中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性劑、抗感染劑、抗胂 瘤劑、抗菌劑、抗真菌劑、鎮(zhèn)痛劑、避孕劑、抗炎劑、甾體劑、血管舒張 劑、血管收縮劑和心血管劑。
46、 權(quán)利要求40的方法，其中所述小分子生物活性劑選自下組化合物 柔紅霉素、阿霉素、伊達(dá)比星、米托蒽醌、氨魯米特、金剛烷胺、氨苯砜、 乙胺丁醇、磺胺嘧啶、磺胺曱嘧啶、磺胺甲嗯唑、磺胺曱氧吡溱、克林沙 星、莫西沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、諾氟沙星、新霉素B、大觀霉素、 卡那霉素A、美羅培南、多巴胺、多巴酚丁胺、賴諾普利、5-羥色胺、阿 西維辛和氨磺丁脲。
47、 權(quán)利要求38至46之一的方法，其中所述第三步在細(xì)胞外液中進(jìn)行。
48、 權(quán)利要求38至47之一的方法，其中所述基本上非酶促反應(yīng)包括 水解的步驟。
49、 權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)的聚合物前藥中，通過含親核體的連接團(tuán) 的基本上非iHl反應(yīng)，將所述含胺部分從所述載體中裂解的方法。
50、 權(quán)利要求49的方法，其中所述基本上非酶促反應(yīng)在約7.4的pH 進(jìn)行。
51、 權(quán)利要求49或50的方法，其中與所述載體連接的所述含胺部分 在細(xì)胞外液中裂解。
52、 權(quán)利要求49至51之一的方法，其中所述基本上非酶促反應(yīng)包括 水解的步驟。
53、 權(quán)利要求49至52任一項(xiàng)的方法，其中所述含胺部分是生物活性部分。
54、通過在體內(nèi)從權(quán)利要求1至26任一項(xiàng)的前藥裂解生物活性分子 以提供治療有用濃度的生物活性分子的方法。
全文摘要
本發(fā)明描述了聚合物前藥，其包括經(jīng)由至少一個(gè)永久鍵連接到N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)的至少一種聚合物。該N-二(羥乙基)甘氨酸連接團(tuán)通過臨時(shí)鍵合連接到含胺生物活性部分。所述含胺生物活性部分—如藥物—可通過裂解臨時(shí)鍵合而被釋放。在一個(gè)實(shí)施例中，所述前藥或相應(yīng)的聚合物前藥連接團(tuán)試劑具有以下結(jié)構(gòu)(式Ia)，其中T是D或A(D是含胺生物活性部分的殘基，且A是離去基團(tuán))，X是間隔部分如R13-Y1，Y1是O、S、NR6、琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺、不飽和碳-碳鍵或者含有游離電子對的任何雜原子，或者不存在，R13選自取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基，R2和R3獨(dú)立地選自氫、酰基或羥基的保護(hù)基。R4至R12獨(dú)立地選自氫、X-R1、取代或未取代的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基或雜烷基、芳基、取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、氰基、硝基、鹵素、羧基、羧酰胺，R1是聚合物。在其它實(shí)施例中聚合物R1位于其它位置。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101242859SQ200680030506
公開日2008年8月13日 申請日期2006年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月22日
發(fā)明者D·費(fèi)特爾, H·拉烏, T·韋格, U·赫澤爾 申請人:復(fù)合生物系統(tǒng)股份有限公司