專(zhuān)利名稱(chēng)：：綴合疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改進(jìn)的肺炎鏈球菌(&re;tococcz^/wewmo"/a)疫苗。
背景技術(shù)：
：不到2歲的兒童對(duì)大多數(shù)多糖疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，所以一直以來(lái)必須通過(guò)與蛋白栽體進(jìn)行化學(xué)綴合使多糖成為免疫原性的。將作為非T細(xì)胞依賴(lài)性抗原的多糖與作為T(mén)細(xì)胞依賴(lài)性抗原的蛋白偶聯(lián)賦予多糖T細(xì)胞依賴(lài)性特性，所述特性包括同種型轉(zhuǎn)換、親和力成熟和記憶誘導(dǎo)。然而，重復(fù)給予多糖-蛋白綴合物或?qū)⒍嗵?蛋白綴合物聯(lián)合成多價(jià)疫苗可能有問(wèn)題。例如，已有報(bào)道指出在一定劑量范圍內(nèi)測(cè)試了使用破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT)作為蛋白載體的乙型流感嗜血桿菌(//aewo;/2//^/"y/we"加e)多糖(PRP)疫苗，該疫苗與(游離的)TT和肺炎鏈球菌多糖-TT綴合疫苗按照標(biāo)準(zhǔn)嬰兒免疫程序同時(shí)免疫。當(dāng)肺炎鏈球菌疫苗的劑量增加時(shí)，對(duì)Hib綴合疫苗的PRP多糖部分的免疫應(yīng)答降低，這表明很可能通過(guò)使用相同載體蛋白引起了多糖免疫干擾(Dagan等，InfectImmun,(1998);敏2093-2098)。已證實(shí)載體-蛋白劑量對(duì)針對(duì)蛋白自身的體液免疫應(yīng)答的影響是多方面的。據(jù)報(bào)道在人類(lèi)嬰兒中增加四價(jià)破傷風(fēng)類(lèi)毒素綴合物的劑量導(dǎo)致對(duì)破傷風(fēng)載體的應(yīng)答下降(Dagan等，出處同上)。對(duì)于聯(lián)合疫苗的這些效應(yīng)的經(jīng)典分析一直纟皮描述為載體誘導(dǎo)的表位抑制，這一點(diǎn)還沒(méi)有完全弄清楚，但一般認(rèn)為是由過(guò)量的載體蛋白引起的(Fattom,vaccine12:126(1999))。這似乎導(dǎo)致針對(duì)載體蛋白的B細(xì)胞和針對(duì)多糖的B細(xì)胞竟?fàn)嶵h細(xì)胞。如果針對(duì)載體蛋白的B細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，則沒(méi)有足夠的Th細(xì)胞可用于為多糖特異性B細(xì)胞提供必需的輔助。然而，觀察到的免疫效果一直不一致，載體蛋白的總量在某些情況下增加免疫應(yīng)答，在另一些情況下降低免疫應(yīng)答。因此，將多種多糖綴合物組合成單一的、有效的疫苗制劑仍有技術(shù)難度。肺炎鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可導(dǎo)致相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率(尤其是對(duì)年紀(jì)小的人和上年紀(jì)的人)，引起諸如肺炎、菌血癥和腦膜炎等侵襲性疾病以及與建群相關(guān)的疾病，如急性中耳炎。在美國(guó)，60歲以上的人患有肺炎鏈球菌性肺炎的比例估計(jì)為十萬(wàn)分之3-8。其在20%的病例中會(huì)引發(fā)菌血癥和例如腦膜炎的其它情況，即便采用抗生素治療死亡率也4妄近30%。肺炎鏈球菌被化學(xué)連接的多糖包裹，所述多糖賦予血清型特異性。有90種公知的肺炎鏈球菌血清型，莢膜是肺炎鏈球菌毒力的主要決定因素，因?yàn)榍v膜不但保護(hù)細(xì)菌內(nèi)表面不受補(bǔ)體影響，而且其本身是弱免疫原性的。多糖是非T細(xì)胞依賴(lài)性抗原，不能被加工或呈遞到MHC分子上，從而不能與T細(xì)胞相互作用。但它們能通過(guò)一種涉及B細(xì)胞表面受體交聯(lián)的替代機(jī)制來(lái)刺激免疫系統(tǒng)。一些實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)侵襲性肺炎鏈球菌疾病的防護(hù)作用與莢膜特異性抗體的相關(guān)非常強(qiáng)，且該防護(hù)作用是血清型特異性的。肺炎鏈球菌是嬰兒和兒童侵襲性細(xì)菌疾病和中耳炎的最常見(jiàn)致病因素。同樣，老年人對(duì)肺炎鏈球菌疫苗的應(yīng)答較弱[Roghmann等,(1987),J.Gerontol.42:265-270]，因此，在該人群中細(xì)菌性肺炎的發(fā)病率升高[Verghese和Berk,(1983)Medicine(Baltimore)62:271-285]。肺炎鏈球菌引起的主要臨床癥狀是公知的，并在所有的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)教科書(shū)中有論述(FedsonDS,MuscherDM.載于PlotkinSA,OrensteinWA編輯，Vaccines.第4版.PhiladelphiaWBSaundersCo,2004a:529-588)。例如，侵入性肺炎鏈球菌疾病(IPD)被定義為由血液或另一個(gè)正常情況下無(wú)菌的部位分離出肺炎鏈球菌的任何感染(MusherDM.14Streptococcuspneumoniae.InMandellGL,BennettJE,DolinR(編輯).PrinciplesandPracticeofInfectiousdiseases(第5片反).NewYork,ChurchillLivingstone,2001,2128-2147頁(yè))。慢性阻塞性肺病(COPD)被認(rèn)為包括幾種經(jīng)常共存的病癥(氣流阻塞、慢性支氣管炎、支氣管炎或小氣道病變和肺氣腫)?；颊咴馐艹Ｅc增加的呼吸困難相關(guān)的病癥惡化，并經(jīng)常出現(xiàn)咳嗽增多，該咳嗽可產(chǎn)生粘液或含膿的痰(Wilson,EurRespirJ200117:995-1007)。COPD在生理學(xué)上被定義為在患有慢性支氣管炎和/或肺氣腫的患者中存在不可逆的或部分可逆的氣道阻塞(Standardsforthediagnosisandcareofpatientswithchronicobstructivepulmonarydiseases.AmericanThoracicSociety.AmJRespirCritCareMed.1995年11月；152(5Pt2):S77-121)。COPD的惡化經(jīng)常由細(xì)菌(例如肺炎鏈球菌)感染引起(SethiS,MurphyTF,Bacterialinfectioninchronicobstructivepulmonarydiseasesin2000:astate-of-the-artreview.ClinMicrobiolRev.2001年4月；14(2):336-63)。盡管含有血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的糖的市售疫苗Prevnar，所述糖均綴合載體蛋白CRM197(—種無(wú)毒的白喉毒素變體)的，但幾乎不知道有關(guān)該疫苗的生產(chǎn)方法或其糖的特征。已知O-或N-乙?；卺槍?duì)多種抗原性糖的保護(hù)性表位的形成中是重要的取代基。一般無(wú)法預(yù)測(cè)乙酰基團(tuán)的存在對(duì)表位是有益還是有害。因此，本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種改進(jìn)的多種血清型肺炎鏈球菌多糖綴合疫苗的制劑，具體地說(shuō)，本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)一種具有有益的乙酰化特征的疫苗。具體地說(shuō)，本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，血清型18C的莢膜糖的脫-O-乙?；捎欣趯⒚庖邞?yīng)答集中于骨架表位，這可能有利于提升抗高度O-乙?；?8C菌林和O-乙?；^差的18C菌林這二者的保護(hù)性免疫應(yīng)答。附圖簡(jiǎn)述圖1:來(lái)自用SP1008或Prevnar免疫的小鼠的混合血清的ELISA15抑制。圖2:來(lái)自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制。圖3:來(lái)自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的小鼠的混合血清的調(diào)理吞噬抑制。圖4:來(lái)自用SP1008或Prevnar免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制。圖5:來(lái)自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制。圖6:來(lái)自用SP1008或含有PS18-DTAH或PS18-TTAH綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的豚鼠的混合血清的調(diào)理吞噬抑制。圖7:來(lái)自用SP1008和Prevnar免疫的11PnPD&Di007嬰兒的混合血清的抑制作用。發(fā)明描述因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供含有不同肺炎鏈球菌血清型的9種以上、IO種以上、11種以上或13種以上綴合載體蛋白的莢膜糖的肺炎鏈球菌免疫原性組合物，其中所述組合物包含0-乙?；潭鹊陀?0%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或10%的綴合莢膜糖18C。。/oC)-或N-乙?；庵附o定糖樣品乙酰化的相對(duì)于100%(其中每個(gè)重復(fù)單元就其乙?；Y(jié)構(gòu)而言被完全乙酰化)的百分率。為易于參考，以下給出了多種糖重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)。PS1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>CH;。H可通過(guò)本領(lǐng)域已知的眾多方法對(duì)糖進(jìn)行脫-O-乙酰化?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法;險(xiǎn)測(cè)乙?；?；例如可以使用NMR。一方面，莢膜糖18C在其綴合前通過(guò)用酸處理進(jìn)行脫-O-乙?；＠?，用1M乙酸于60。C處理40小時(shí)(參見(jiàn)WO96/05859的實(shí)施例4)產(chǎn)生18C糖，依據(jù)NMR，約17%的該糖被O-乙?；?。于100。C類(lèi)似處理5-6小時(shí)產(chǎn)生30-50%的O-乙?；?8C。來(lái)自乙?；?8C菌4木的天然18C傾向于被高度0-乙酰化(>90%)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的18C糖綴合破傷風(fēng)類(lèi)毒素(TT),任選地，其中18C為唯一綴合TT的肺炎鏈球菌莢膜糖。不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜糖可以綴合2種以上不同的載體蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，18C未綴合肺炎球菌溶血素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，18C未綴合CRM197。本發(fā)明的18C莢膜糖可以通過(guò)許多已知方法(參見(jiàn)下文)綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，其不通過(guò)還原胺化化學(xué)法綴合，在又一個(gè)實(shí)施方案中，其通過(guò)還原胺化化學(xué)法綴合(參見(jiàn)下文)。通常，本發(fā)明的肺炎鏈球菌免疫原性組合物(或疫苗)含有莢膜糖抗原(優(yōu)選綴合的)，其中所述糖衍生自至少9種或至少10種肺炎鏈球菌血清型。肺炎鏈球菌莢膜糖的數(shù)量可在9種或IO種不同血清型(或21"V"，價(jià))至23種不同血清型(23V)的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，有9、10、11、13或15種不同血清型。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗可含有綴合的肺炎鏈球菌糖和未綴合的肺炎鏈球菌糖。優(yōu)選地，糖血清型的總數(shù)少于或等于23。例如，本發(fā)明可包含10種綴合的血清型和13種未綴合的糖。以類(lèi)似的方式，疫苗可含有13種或16種綴合的糖，并相應(yīng)地含有10種或7種未綴合的糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多價(jià)肺炎鏈球菌疫苗選自以下血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F,但要認(rèn)識(shí)到的是，根據(jù)接受疫苗的接受者的年齡和將給予疫苗的地理位置，可以替換1種或2種其它血清型。例如，IO價(jià)疫苗可含有血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。11價(jià)疫苗還可以包含血清型3的莢膜糖。12價(jià)或13價(jià)兒科(嬰兒)疫苗還可以包含血清型6A和19A、或6A和22F、或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B(分別針對(duì)10或11價(jià)制劑)，而13價(jià)老年疫苗可以包含血清型8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F(針對(duì)ll價(jià)制劑)。14價(jià)兒科疫苗可包括補(bǔ)加血清型3、6A、19A和22F;血清型6A、8、19A和22F;血清型6A、12F、19A和22F;血清型6A、15B、19A和22F;血清型3、8、19A和22F;血清型3、12F、19A和22F;血清型3、15B、19A和22F;血清型3、6A、8和22F;血清型3、6A、12F和22F;或血清型3、6A、15B和22F的上述10價(jià)制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含衍生自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖(優(yōu)選綴合的)。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少11種糖抗原(優(yōu)選綴合的)，例如衍生自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，包含至少12種或13種糖抗原，例如疫苗可22含有衍生自血清型l、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的莢膜糖，或者衍生自血清型l、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的莢膜糖，然而本發(fā)明還考慮到其它糖抗原，例如23價(jià)糖抗原(例如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型4的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型9V的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%和/或O-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型14的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型1的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙?；潭瘸^(guò)500/。、60%、70%、80%、90%和/或O-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型5的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型7F的莢膜糖的情況下，其N(xiāo)-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%和/或O-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%。在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型4的莢膜糖的情況下，在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在血清型4的莢膜糖的情況下，本發(fā)明的疫苗可含有流感嗜血桿菌的D蛋白(PD)(參見(jiàn)例如EP0594610)，尤其是衍生自非分型流感嗜血桿菌(ntHi)的D蛋白。ntHi是中耳炎的關(guān)鍵致病生物，本發(fā)明人已表明，將該蛋白納入肺炎鏈球菌疫苗中將提供針對(duì)流感嗜血桿菌相關(guān)性中耳炎的一定水平的保護(hù)(Prymula等,2006TheLancet367:740-748)。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物含有D蛋白。一方面，PD作為一種或多種糖的載體蛋白存在。另一方面，D蛋白可作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。又一方面，D蛋白作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。D蛋白可作為全長(zhǎng)蛋白或作為片段使用(W00056360)。又一方面，D蛋白作為大部分糖的載體蛋白存在，例如6、7、8、9種以上的糖可與D蛋白綴合。在該方面，D蛋白也可作為游離蛋白存在。本發(fā)明的疫苗可含有2種以上的不同類(lèi)型的載體蛋白。每類(lèi)載體蛋白均可用作多于1種的糖的載體，所述糖可相同或不同。糖可以在同一反應(yīng)中綴合同一載體，或者可以單獨(dú)地綴合同一載體蛋白。例如，血清型3和4可綴合相同載體蛋白，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，2種以上的不同的糖可與相同載體蛋白綴合，或者綴合同一載體蛋白分子，或者綴合相同載體蛋白的不同分子。每種/任何肺炎鏈球菌莢膜糖都可獨(dú)立地與選自以下的載體蛋白綴合TT、DT、CRM197、TT的片段C、PhtD、PhtDE融合蛋白(尤其是在WO01/98334和WO03/54007中描述的那些)、解毒的肺炎鏈球菌溶血素和D蛋白。一方面，血清型19F的莢膜糖可以綴合DT或CRM197,優(yōu)選DT。以下提供了可用于本發(fā)明綴合物的蛋白載體的更完整清單。本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的綴合物中，與一種或多種肺炎鏈球菌莢膜糖綴合的載體蛋白任選為聚組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)蛋白成員、其片段或融合蛋白。PhtA、PhtB、PhtD或Phffi蛋白可具有與WO00/37105或WO00/39299中公開(kāi)的序歹^(例如與WO00/37105中關(guān)于PhtD的SEQIDNO:4的氨基酸序列1-838或21-838)共享80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。例如，融合蛋白由PhtA、PhtB、PhtD、PhtE中的2、3或4種的全長(zhǎng)或片段組成。融合蛋白的實(shí)例為PhtA/B、PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中所述蛋白在N末端與所提及的第一個(gè)連接(參見(jiàn)例如WO01/98334)。在使用Pht蛋白片段(獨(dú)立的或作為融合蛋白的一部分)時(shí)，每個(gè)片段任選地含有一個(gè)或多個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序和/或這些多肽的巻曲24螺旋區(qū)。組氨酸三聯(lián)體基序是多肽的一部分，具有序列HxxHxH，其中H為組氨酸，x為非組氨酸的氨基酸。巻曲螺旋區(qū)是通過(guò)"Coils"算法預(yù)測(cè)的區(qū)域(Lupus,A等，(1991)Science252;1162-1164)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該片段或每個(gè)片段含有一個(gè)或多個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序以及至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該片段或每個(gè)片段含有恰好或至少2、3、4或5個(gè)組氨酸三聯(lián)體基序(任選地，在所述2個(gè)或多個(gè)三聯(lián)體之間具有天然Pht序列，或者具有三聯(lián)體內(nèi)序列，該三聯(lián)體內(nèi)序列與天然肺炎鏈球菌三聯(lián)體內(nèi)Pht序列一例如示于WO00/37105針對(duì)PhtD的SEQIDNO:4的三聯(lián)體內(nèi)序列的同一性超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%或100%)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該片段或每個(gè)片段含有恰好或至少2、3或4個(gè)巻曲螺旋區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的Pht蛋白包括連接信號(hào)序列的全長(zhǎng)蛋白、除去信號(hào)肽(例如在N-末端的20個(gè)氨基酸)的成熟全長(zhǎng)蛋白、Pht蛋白的天然變體和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WO00/37105或WO00/39299的氨基酸序列中至少15個(gè)或20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對(duì)WO00/37105或WOOO/39299中所述氨基酸序列的特異性免疫應(yīng)答)。具體地說(shuō)，本文使用的術(shù)語(yǔ)"PhtD"包括連接信號(hào)序列的全長(zhǎng)蛋白、除去信號(hào)肽(例如在N-末端的20個(gè)氨基酸)的成熟全長(zhǎng)蛋白、PhtD的天然變體和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段，或含有WOOO/37105或WOOO/39299的PhtD氨基酸序列中至少15個(gè)或20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，其中所述多肽能夠激發(fā)對(duì)WOOO/37105或WO00/39299中所述PhtD^J^酸序列(例如WO00/37105中針對(duì)PhtD的SEQIDNO:4)的特異性免疫應(yīng)答)。如果用于組合物中2種以上的糖的蛋白載體相同，則該糖可與所述蛋白載體的同一分子綴合(載體分子具有2個(gè)以上與其綴合的不同的糖)[參見(jiàn)例如WO04/083251]?；蛘撸鎏强筛髯元?dú)立地綴合所述蛋白載體的不同分子(每個(gè)蛋白載體分子均僅具有1類(lèi)與其綴合的糖)?？捎糜诒景l(fā)明的載體蛋白的實(shí)例為DT(白喉類(lèi)毒素)；TT(破傷風(fēng)類(lèi)毒素)或TT的C片段；DTCRM197(DT突變體)，其它DT點(diǎn)突變，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem.218;3838-3844,1973);CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及由Nicholls和Youle在GeneticallyEngineeredToxins,Frankel纟扁豐專(zhuān)，MaecelDekkerInc,1992中描述的其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp、Gin或Ser，和/或Ala158缺失或突變?yōu)镚ly，以及在US4709017或US4950740中公開(kāi)的其它突變；Lys516、Lys526、Phe530和/或Lys534中至少一個(gè)或多個(gè)殘基的突變，以及在US5917017或US6455673中公開(kāi)的其它突變；或者在US5843711中公開(kāi)的片段；肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素[Ply](Kuo等，(1995)InfectImmun63;2706-13)，包括以某些方式解毒的ply,例如以化學(xué)方式dPLY-GMBS(WO04081515、PCT/EP2005/010258)或dPLY-曱醛；或遺傳突變?yōu)檩^低毒性(利用例如本領(lǐng)域所知的突變)，PhtX,包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE以及Pht蛋白的融合體，例如PhtDE融合體、PhtBE融合體(WO01/98334和WO03/54007)(PhtA-E詳述于下文)；OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常由腦膜炎奈瑟氏球菌(iV.wem"g/"afe)血清群B提取-EP0372501);PorB(得自腦膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血桿菌D蛋白-參見(jiàn)例如EP0594610B)或其免疫學(xué)功能等同物；合成肽(EP03788S1、EP0427347);熱激蛋白(WO93/17712、WO94/03208);百日咳蛋白(WO98/58668、EP0471177);細(xì)胞因子；淋巴因子；生長(zhǎng)因子或激素(WO91/01146);含有來(lái)自多種病原體衍生抗原的多個(gè)人CD4+T細(xì)胞表位的人工蛋白(Falugi等，(2001)EurJImmunol31;3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等，(2004)InfectImmun72;48S4-7);肺炎鏈球菌表面蛋白PspA(WO02/091998);鐵吸收蛋白(WO01/72337);艱難梭菌(C4^"7e)的毒素A或B(WO00/61761)。Nurkka等，/W/aWc/"/ec"'owsD/seaseJowma/.23(77」..2004年11月描述了所有血清型均綴合PD的ll價(jià)肺炎鏈球菌疫苗。26然而，本發(fā)明人已表明，相比于綴合PD的19F,對(duì)于用具有綴合DT的19F的綴合物誘導(dǎo)的抗體的調(diào)理吞噬活性有改善。另外，本發(fā)明人已表明，用綴合DT的19F觀察到對(duì)19A的更大交叉反應(yīng)性。因此，本發(fā)明組合物的特征在于血清型19F與DT或CRM197綴合。一方面，血清型19F與DT綴合。余下的免疫原性組合物糖血清型可全部與一種或多種不是DT的載體蛋白綴合(即僅有19F綴合DT)，或者可以在一種或多種不是DT或CRM197的載體蛋白之間和DT或CRM197自身之間分?jǐn)偂Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，所有余下的血清型綴合PD。在又一個(gè)實(shí)施方案中，19F綴合DT或CRM197,余下的血清型在PD和TT或DT或CRM197之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，不多于1種(或2或3種)糖綴合TT。在該實(shí)施方案的一方面，所述1種(或2種)糖為18C或12F。在又一個(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，不多于2種糖與TT綴合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，余下的血清型在PD、TT和DT或CRM197之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，余下的血清型在PD、TT和肺炎鏈球菌溶血素之間分?jǐn)?。在又一個(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，余下的血清型在PD、TT和CRM197之間分?jǐn)偂Ｔ谟忠粋€(gè)實(shí)施方案中，19F與DT或CRM197綴合，余下的血清型在PD、TT、肺炎鏈球菌溶血素和任選的PhtD之間分?jǐn)?。在本發(fā)明的又一方面，18C莢膜糖綴合TT[任選地具有1種或2種綴合TT的其它糖]，余下的血清型在PD、DT(或CRM197)、肺炎球菌溶血素和任選的PhtD之間分?jǐn)?。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有來(lái)自流感嗜血桿菌的D蛋白。在該實(shí)施方案中，如果PD不是用于綴合任何糖的載體蛋白中的一種，則PD可在疫苗組合物中作為游離蛋白存在。如果PD是用于綴合本發(fā)明組合物中的糖的載體蛋白中的一種，則PD可任選地作為游離蛋白存在于疫苗組合物中。27術(shù)語(yǔ)"糖"在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)中可表示多糖或寡糖，并包括這二者。多糖分離自細(xì)菌，并可以通過(guò)已知方法(參見(jiàn)例如EP497524和EP497525;Szu等，CarbohydrateResearch,152巻，7-20頁(yè)(1986))調(diào)整尺寸至某種程度并優(yōu)選通過(guò)微流化調(diào)整尺寸。可對(duì)多糖調(diào)整尺寸，以便降低多糖樣品的粘度和/或改善綴合產(chǎn)物的過(guò)濾性。寡糖具有少量重復(fù)單元(通常5-30個(gè)重復(fù)單元)，并通常為水解的多糖。肺炎鏈球菌的莢膜多糖包含可含有至多8個(gè)糖殘基的重復(fù)寡糖單元。關(guān)于關(guān)鍵肺炎鏈球菌血清型的寡糖單元的綜述，參見(jiàn)JONES,Christopher.Vaccinebasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacteria.爿/i爿cad5ra義O&c.,2005年6月,第77巻,第2冊(cè)，293-324頁(yè)，ISSN0001-3765。在一個(gè)實(shí)施方案中，莢膜糖抗原可為天然或全長(zhǎng)多糖(即由肺炎鏈球菌制備的多糖，未經(jīng)任何尺寸調(diào)整或水解步驟)，但是在其它實(shí)施方案中其可為一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單元(寡糖)，或者為比重復(fù)單元的天然長(zhǎng)度的多糖或寡糖鏈短的。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗中存在的所有糖都是多糖。全長(zhǎng)多糖可^皮"調(diào)整尺寸"，即它們的尺寸可通過(guò)多種方法減小，例如酸水解處理；過(guò)氧化氫處理；通過(guò)emulsiflex⑧調(diào)整尺寸，然后過(guò)氧化氫處理，以產(chǎn)生寡糖片段；或者微流化。本發(fā)明人還已注意到，本技術(shù)的核心是使用易于生產(chǎn)綴合物的寡糖。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用天然的或稍微調(diào)整尺寸的多糖綴合物，可實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)以下優(yōu)勢(shì)l)具有高免疫原性的可過(guò)濾的綴合物，2)可改變綴合物中多糖對(duì)蛋白的比率，因而可增加綴合物中多糖對(duì)蛋白的比率(重量/重量)(其可對(duì)載體抑制作用有影響)，3)傾向于水解的免疫原性綴合物可通過(guò)使用較大的糖進(jìn)行綴合來(lái)穩(wěn)定。使用較大的多糖可導(dǎo)致與綴合物載體更多的交聯(lián)，并可以減少由綴合物釋放游離的糖。在先有技術(shù)中描述的綴合疫苗傾向于在綴合前解聚多糖，以便改善綴合。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，保留較大的糖尺寸的糖綴合疫苗可提供抵御肺炎鏈球菌疾病的良好免疫應(yīng)答。本發(fā)明的免疫原性組合物因此可以包含一種或多種糖綴合物，其中在綴合前每種糖的平均尺寸(例如，重均分子量；Mw)在80xl03、100《103、200><103、300><103、400><103、500><103或lOOOxlO3(例如80xl03至100(^103;90><103至500><103;10(^103至40(^103;20(^103至300><103)以上。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種或多種糖綴合物應(yīng)具有的綴合前糖的平均大小為50-1600、80-1400、100-1000、150-500或200-400kDa(注意，在平均大小為Mw時(shí)，'kDa，單位在此應(yīng)當(dāng)用'x103，替代)。在一個(gè)實(shí)施方案中，綴合后的綴合物應(yīng)可易于通過(guò)0.2(im濾器過(guò)濾，使得與過(guò)濾前樣品相比在過(guò)濾后獲得50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的收率。就本發(fā)明而言，"天然的多糖"是指未經(jīng)處理(例如純化后)的糖，該處理的目的是減小糖的尺寸。在常規(guī)純化工藝中多糖的尺寸可被輕微降低。這樣的糖仍是天然的。只要多糖經(jīng)過(guò)調(diào)整尺寸的技術(shù)的處理，就不認(rèn)為該多糖是天然的。就本發(fā)明而言，"以約x2的因數(shù)調(diào)整尺寸"是指對(duì)糖進(jìn)行處理，以減小糖尺寸，但仍保留超過(guò)天然多糖尺寸的一半的尺寸。x3、x4等等以相同的方式解釋?zhuān)磳?duì)糖進(jìn)行處理，以減小多糖的尺寸，但仍保留天然多糖尺寸的1/3、1/4等等以上的尺寸。在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含至少9種或10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少l、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或每種肺炎鏈球菌糖為天然多糖。在本發(fā)明的一方面，免疫原性組合物包含來(lái)自至少9種或10種血清型的綴合載體蛋白的肺炎鏈球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、lO種或每種肺炎鏈球菌糖-波以至多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因數(shù)調(diào)整尺寸。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，大部分糖，例如以至多x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或x10的因數(shù)對(duì)6、7、8種以上的糖調(diào)整尺寸。糖的分子量或平均分子量(或大小)在本文是指在綴合前檢測(cè)的糖的重均分子量(Mw)，通過(guò)MALLS來(lái)檢測(cè)。MALLS技術(shù)在本領(lǐng)域眾所周知(如在實(shí)施例2中所述)。就肺炎鏈球菌糖的MALLS分析而言，可組合使用兩種柱子(TSKG6000和5000PWxl),并用水洗脫糖。用光散射檢測(cè)器(例如配有10mW488nm氬激光器的WyattDawnDSP)和干涉儀折射計(jì)(例如裝備P100光電元件和498nm紅色濾光片的WyattOtilabDSP)檢測(cè)糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌糖為天然多糖，或者為在常規(guī)提取步驟中己經(jīng)減小了尺寸的天然多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)機(jī)械裂解，例如通過(guò)微流化或超聲，調(diào)整肺炎鏈球菌糖的尺寸。微流化和超聲具有充分減小較大天然多糖大小從而足以提供可過(guò)濾綴合物的優(yōu)點(diǎn)。尺寸調(diào)整以不超過(guò)x20、x10、x8、x6、x5、x4、x3或x2的因數(shù)進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含肺炎鏈球菌綴合物，該綴合物由天然多糖和以不超過(guò)x20的因數(shù)調(diào)整尺寸的糖的混合物制備。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，大部分糖，例如6、7、8種或更多種糖以至多x2、x3、x4、x5或x6的因數(shù)調(diào)整尺寸。在一個(gè)實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌糖通過(guò)接頭例如雙功能接頭與載體蛋白綴合。任選地，接頭為異雙功能或同雙功能接頭，具有例如1個(gè)反應(yīng)性氨基和1個(gè)反應(yīng)性羧基、2個(gè)反應(yīng)性氨基或者2個(gè)反應(yīng)性羧基。例如，接頭具有4-20、4-12、5-10個(gè)碳原子?？赡艿慕宇^是ADH。其它接頭包括B-丙酰胺基(WO00/10599)、硝基苯-乙胺(Gever等,(1979)Med.Microbiol.Immunol.165;171-288)、卣代烷基囟化物(US4057685)、糖苷鍵(US4673574、US4808700)、己烷二胺和6-#J^己酸(US4459286)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ADH用作綴合血清型18C的糖的接頭。在本發(fā)明的免疫原性組合物中存在的糖綴合物可用任何己知的偶聯(lián)技術(shù)制備。綴合方法可依賴(lài)于用l-氰基-4-二曱基氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)活化糖而形成氰酸酯。由此，活化的糖可直接或經(jīng)由間隔臂(接頭)基團(tuán)偶聯(lián)至載體蛋白上的氨基。例如，間隔臂可以是胱胺或半胱胺，以得到硫醇化多糖，所述硫醇化多糖可經(jīng)由與馬來(lái)酰亞胺活化的載體蛋白(例如使用GMBS)或卣乙酰載體蛋白(例如使用碘乙酰亞胺[例如乙基碘乙酰亞胺HC1]或N-琥珀酰亞胺基溴乙酸鹽或SIAB、或SIA、或SBAP)反應(yīng)后所獲得的硫醚鍵與載體偶聯(lián)。優(yōu)選地，氰酸酯(任選地以CDAP化學(xué)法制備)可與己二胺或ADH偶聯(lián)，并采用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學(xué)法經(jīng)蛋白載體上的羧基使氨基衍生化的糖與載體蛋白綴合。這樣的綴合物描述于PCT公開(kāi)申請(qǐng)WO93/15760(UniformedServicesUniversity)以及WO95/08348和WO96/29094。其它的合適技術(shù)使用碳二亞胺、酰肼、活化酯、降水片烷、對(duì)硝基苯曱酸、N-輕基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多所述技術(shù)都描述于WO98/42721。綴合可涉及羰基接頭，其可如下形成糖的游離羥基先與CDI反應(yīng)(Bethell等，丄Biol.Chem.1979,254;2572-4,Hearn等，J.Chromatogr.1981.218;509-18)，再與蛋白反應(yīng)，形成氨基曱酸酯鍵。該過(guò)程可涉及異頭末端還原成伯羥基，任選地，涉及伯羥基與CDI的伯羥基反應(yīng)的保護(hù)/去保護(hù)，以形成CDI氨基甲酸酯中間體，并將CDI氨基曱酸酯中間體與蛋白的氨基偶聯(lián)。綴合物也可通過(guò)如US4365170(Jennings)、US4673574(Anderson)和WO96/05859所述的直接還原胺化法制備。其它方法描述于EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508。進(jìn)一步的方法涉及通過(guò)碳二亞胺縮合(ChuC.等，Infect.Immunity,1983245256)，例如使用EDAC，將溴化氰(或CDAP)活化的、被己二酰肼(ADH)衍生化的糖與蛋白載體偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖上的羥基(優(yōu)選活化的羥基，例如被活化以制備氰酸酯的羥基(例如使用CDAP))直接或間接(通過(guò)接頭)與蛋白的氨基或羧基連接。當(dāng)存在接頭時(shí)，糖上的羥基優(yōu)選地與接頭上的氨基連接，例如通過(guò)使用CDAP綴合。接頭如ADH中的其余氨基可綴合蛋白上的羧酸基團(tuán)，例如通過(guò)使用碳二亞胺化學(xué)，例如通過(guò)使用EDAC。在一個(gè)實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌莢膜糖在接頭與載體蛋白綴合之前先與接頭綴合?；蛘撸宇^可在與糖綴合之前與載體綴合。還可以使用技術(shù)組合，一些糖-蛋白綴合物通過(guò)CDAP制備，一些通過(guò)還原胺化法制備。通常，蛋白載體上可用于偶^/綴合的化學(xué)基團(tuán)的類(lèi)型如下A)羧基(例如經(jīng)由天冬氨酸或谷氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)直接與糖上的氨基連接，或者用碳二亞胺化學(xué)法(例如用EDAC)與接頭上的氨基連接。B)氨基(例如經(jīng)由賴(lài)氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)直接與糖上的羧基連接，或者用碳二亞胺化學(xué)法(例如用EDAC)與接頭上的羧基連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)直接與糖上用CDAP或CNBr活化的羥基連接，或者與接頭上的這些基團(tuán)連接；與具有醛基的糖或接頭連接；與具有琥珀酰亞胺酯基團(tuán)的糖或接頭連接。C)巰基(例如經(jīng)由半胱氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)與溴乙酰糖或氯乙酰糖連接，或者用馬來(lái)酰亞胺化學(xué)法與接頭連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮聯(lián)苯胺活化/改性。D)羥基(例如經(jīng)由酪氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮聯(lián)苯胺活化/改性。E)咪唑基(例如經(jīng)由組氨酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該基團(tuán)用雙重氮聯(lián)苯胺活化/改性。F)胍基(例如經(jīng)由精氨酸)。G)吲哚基(例如經(jīng)由色氨酸)。在糖上，能夠用于偶聯(lián)的通常是以下基團(tuán)OH、COOH或NH2。醛基能夠在本領(lǐng)域已知的不同處理后產(chǎn)生，所述處理例如高碘酸鹽、酸水解、過(guò)氧化氫等。直接偶聯(lián)法糖-OH+CNBr或CDAP-——>氰酸酯+NH2-Prot——〉綴合物32糖-醛+NH2-Prot——>席夫堿+NaCNBH3——>綴合物糖國(guó)COOH+NH2-Prot+EDAC-—>綴合物糖畫(huà)NH2+COOH-Prot+EDAC——>綴合物通過(guò)間隔臂(接頭)間接偶聯(lián)的方法糖-OH+CNBr或CDAP—>氰酸酯+NH2——NH2——〉糖——NH2+COOH-Prot+EDAC——〉綴合物糖-OH+CNBr或CDAP——〉氰酸酯+NH2-國(guó)—國(guó)SH誦——〉糖——SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通過(guò)例如SPDP將蛋白的氨基改性后獲得的天然蛋白)—一>糖-S-S-Prot糖畫(huà)OH+CNBr或CDAP誦隱畫(huà)〉氰酸酯+NH2——SH------->糖——SH+馬來(lái)酰亞胺-Prot(氛基的改性物)-->綴合物糖-OH+CNBr或CDAP—〉氰酸酯+NH2-——SH—〉糖-SH+卣代乙酰胺-Prot——>綴合物糖-COOH+EDAC+NH2國(guó)-誦誦-NH2-—〉糖——NH2+EDAC+COOH-Prot——>綴合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH-——>糖——SH+SH-Prot(具有暴露的半胱氨酸的天然蛋白，或是通過(guò)例如SPDP將蛋白的M改性后獲得的天然蛋白)—一〉糖-S-S-Prot糖-COOH+EDAC+NH2——SH-——>糖——SH+馬來(lái)酰亞胺-Prot(氨基的改性物)--〉綴合物糖-COOH+EDAC+NH2——SH—〉糖-SH+鹵代乙酰胺-Prot——〉綴合物糖國(guó)醛+NH2-誦陽(yáng)隱國(guó)NH2陽(yáng)—〉糖——NH2+EDAC+COOH-Prot—■隱>綴合物注意除了以上的EDAC，還可以使用任何合適的-灰二亞胺。總之，通常可以用于與糖偶合的蛋白載體化學(xué)基團(tuán)的類(lèi)型是氨基(例如賴(lài)氨酸殘基上的)、COOH基團(tuán)(例如天冬氨酸和谷氨酸殘基上的)和SH基團(tuán)(如果能夠獲得的話(huà))(例如半胱氨酸殘基上的)。優(yōu)選地，載體蛋白對(duì)肺炎鏈球菌糖的比率在1:5至5:1(重量/重量)之間；例如在1:0.5-4:1、1:1-3.5:1、1.2:l國(guó)3:1、1.5:1-2.5:1(重量/重量)之間；例如在1:2-2.5:1、1:1-2:1(重量/重量)之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，大部分綴合物，例如6、7、8、9種或更多種綴合物，具有大于1:1的載體蛋白對(duì)糖的比率，例如1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1,5:1或1.6:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用CDAP和EDAC使至少一種肺炎鏈球菌糖經(jīng)接頭(例如ADH)與栽體蛋白綴合。例如，可使用如上所述的CDAP和EDAC使18C經(jīng)接頭(例如在其末端具有兩個(gè)肼基的那些接頭，例如ADH)與蛋白綴合。在使用接頭時(shí)，CDAP可用于使糖與接頭綴合，然后可使用EDAC使接頭與蛋白綴合，或者可首先使用EDAC使接頭與蛋白綴合，此后可使用CDAP使接頭與糖綴合。通常，本發(fā)明的免疫原性組合物可含有的每種糖綴合物的劑量在0.1-20|Lig、l-10iiig或l畫(huà)3pg凈唐之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有劑量為0.1-20jxg、0.5-10嗎、0.5-5叫或1-3iug糖的每種肺炎鏈球菌莢膜糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，莢膜糖可以不同劑量存在，例如某些莢膜糖可以恰好1嗎的劑量存在，或者某些莢膜糖可以恰好3(ig的劑量存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，血清型3、18C和19F(或者4、18C和19F)的糖以高于其它糖的劑量存在。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，血清型3、18C和19F(或4、18C和19F)以近似或恰好3jig的劑量存在，而本發(fā)明的免疫原性組合物中的其它糖以近似或恰好1pg的劑量存在。"約"或"近似"就本發(fā)明而言被定義為在給定值的10%左右。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖與載體蛋白直接綴合(例如使用上述化學(xué)法中的一種)；優(yōu)選地，至少一種肺炎鏈球菌莢膜糖通過(guò)CDAP直接綴合。在一個(gè)實(shí)施方案中，大部分莢膜糖，例如5、6、7、8、9種或更多種，通過(guò)CDAP與載體蛋白直接連接(參見(jiàn)WO95/08348和WO96/29094)。免疫原性組合物可包含肺炎鏈球菌蛋白，本文稱(chēng)為本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白。這些蛋白可用作載體蛋白，或者可作為游離蛋白存在，或者可作為載體蛋白和游離蛋白這二者存在。本發(fā)明的肺炎鏈球菌蛋白或者至少在肺炎鏈球菌部分生命周期當(dāng)中為表面暴露的，或者為由肺炎鏈球菌分泌或釋放的蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白選自以下類(lèi)別，例如具有LXXC的II型信號(hào)序列基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX))、膽堿結(jié)合蛋白(CbpX)、具有I型信號(hào)序列基序的蛋白(例如Spl01)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X為任何氨基酸，例如Spl28、Spl30)和毒素(例如Ply)。這些類(lèi)別(或基序)中的優(yōu)選實(shí)例為以下蛋白或其免疫學(xué)功能等效物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Sp133。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物含有2種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物含有2種或多種蛋白，所述蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)、肺炎鏈球菌溶血素(Ply)和Spl28。Pht(聚組氨酸三聯(lián)體)家族包括蛋白質(zhì)PhtA、PhtB、PhtD和Phffi。該家族具有以下特征脂質(zhì)化序列；由脯氨酸富集區(qū)和幾個(gè)組氨酸三聯(lián)體分隔開(kāi)的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，可能涉及金屬或核苷的結(jié)合或酶活性；(3-5)巻曲螺旋區(qū)；保守的N-末端和異源的C-末端。它存在于已檢驗(yàn)的所有肺炎鏈球菌菌抹中。還已在其它鏈球菌和奈瑟氏球菌屬中發(fā)現(xiàn)同源蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的Pht蛋白為PhtD。然而，要理解的是，術(shù)語(yǔ)PhtA、B、D和E是指具有在以下引用文獻(xiàn)中公開(kāi)的序列的蛋白，以及其天然(和人工制備的)變體，所述變體與參比蛋白具有至少90%相同的序列同源性。優(yōu)選地為至少95%相同，最優(yōu)選97%相同。對(duì)于PhtX蛋白而言，PhtA在WO98/18930中公開(kāi)，也稱(chēng)作Sp36。如上所述，其是來(lái)自聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白，并具有II型信號(hào)基序LXXC。PhtD在WO00/37105中公開(kāi)，也稱(chēng)為Sp036D。如上所述，它也是來(lái)自聚組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白，并具有II型LXXC信號(hào)基序。PhtB在WO00/37105中公開(kāi)，也稱(chēng)為Sp036B。PhtB家族的另一成員是C3-降解多肽，在WO00/17370中公開(kāi)。該蛋白也來(lái)自聚組氨酸三聚體家族，并具有II型LXXC信號(hào)基序。優(yōu)選的免疫功能等效物為在WO98/18930中公開(kāi)的蛋白Sp42。PhtB截短物(約79kD)在WO99/15675中公開(kāi)，它也被認(rèn)為是PhtX家族成員。Ph伍在WO00/30299中公開(kāi)，稱(chēng)作BVH-3。當(dāng)本文提到任何Pht蛋白時(shí)，意味著可使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。例如，提到的PhtX包括來(lái)自任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合體。提到PhtD或PhtB也就提到了可見(jiàn)于例如WO0198334的PhtDE或PhtBE。肺炎鏈球菌溶血素是一種具有獨(dú)特的溶細(xì)胞(溶血)作用和補(bǔ)體活化活性的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.CitCareMed,153:1339-1346(1996))。該毒素不由肺炎鏈球菌分泌，而是在肺炎鏈球菌于自溶素影響下裂解時(shí)釋放。其作用包括例如刺激人體單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，抑制人體呼吸上皮纖毛顫動(dòng)，降低嗜中性粒細(xì)胞的殺菌活性和遷移性。肺炎鏈球菌溶血素最明顯的作用在于紅細(xì)胞裂解方面，該作用涉及與膽固醇結(jié)合。因?yàn)榉窝祖溓蚓苎厥且环N毒素，因此在其可以體內(nèi)給藥前必須解毒(即以適于保護(hù)的劑量提供時(shí)對(duì)人無(wú)毒)。在本領(lǐng)域已知野生型或天然肺炎鏈球菌溶血素的表達(dá)和克隆。36參見(jiàn)例如Walker等(InfectImmun,55:1184-1189(1987))，Mitchell等(BiochimBiophysActa,1007:67-72(1989)和Mitchell等(NAR,18:4010(1990))。ply的解毒可以用化學(xué)方法進(jìn)行，例如進(jìn)行福爾馬林或戊二醛處理或二者的組合(WO04081515,PCT/EP2005/010258)。這些方法在本領(lǐng)域眾所周知用于多種毒素?；蛘?，ply可以用基因方法解毒。因此，本發(fā)明包括肺炎鏈球菌蛋白衍生物，該衍生物可為例如突變蛋白。術(shù)語(yǔ)"突變的"在本文用于指已使用公知的定點(diǎn)誘變技術(shù)或任何其它常規(guī)方法缺失、增加或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸的分子。例如，如上所述，突變型ply蛋白可以被改變，以使其生物失活，但仍保持其致免疫表位，參見(jiàn)例如WO90/06951,Berry等，(InfectImmun,67:981-985(1999))和WO99/03884。要理解的是，此處所用的術(shù)語(yǔ)"Ply"是指適于醫(yī)用(即無(wú)毒的)的突變或解毒的肺炎鏈球菌溶血素。關(guān)于膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)，該家族的成員最初被鑒定為能用膽堿親和層析純化的肺炎鏈球菌蛋白。所有膽堿結(jié)合蛋白都非共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸和膜結(jié)合脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。雖然該蛋白質(zhì)的確切性質(zhì)(氨基酸序列、長(zhǎng)度等)可以不同，但整個(gè)家族具有數(shù)個(gè)在結(jié)構(gòu)上相同的區(qū)域。一般來(lái)說(shuō)，膽堿結(jié)合蛋白包含N末端區(qū)(N)、保守重復(fù)區(qū)(R1和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守的膽堿結(jié)合區(qū)(C)，該膽堿結(jié)合區(qū)由多個(gè)重復(fù)序列組成，約占該蛋白的一半。本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)"膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)"選自W097/41151中所鑒定的膽堿結(jié)合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開(kāi)于W097/41151,CbpD和CbpG公開(kāi)于W000/29434,PspC公開(kāi)于WO97/09994,PbcA公開(kāi)于W098/21337。SpsA為WO98/39450中公開(kāi)的膽石咸結(jié)合蛋白。優(yōu)選地，膽^5威結(jié)合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為CbpX截短物，其中"CbpX"在上文定義，"截短物"是指缺少50y。以上的膽堿結(jié)合區(qū)(C)的CbpX蛋白。優(yōu)選地，這樣的蛋白質(zhì)缺少整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。更優(yōu)選地，這樣的蛋白截短物缺少(i)膽堿結(jié)合區(qū)和(ii)該蛋白質(zhì)的N末端一半的一部分，但保留至少一個(gè)重復(fù)區(qū)(R1或R2)。再更優(yōu)選地，該截短物具有兩個(gè)重復(fù)區(qū)(R1和R2)。這些優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例是在W099/51266或W099/51188中舉例說(shuō)明的NRlxR2和RlxR2，但是，其它沒(méi)有相似的膽堿結(jié)合區(qū)的膽堿結(jié)合蛋白也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。LytX家族是與細(xì)胞裂解有關(guān)的膜結(jié)合蛋白。N末端結(jié)構(gòu)域包含膽堿結(jié)合域，但是，LytX家族并不具有在上述CbpA家族中發(fā)現(xiàn)的所有特征，因此，對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，LytX家族被認(rèn)為不同于CbpX家族。與CbpX家族相比，C末端結(jié)構(gòu)域包含LytX蛋白家族的催化域。該家族包含LytA、B和C。對(duì)于LytX家族而言，LytA公開(kāi)于Ronda等，EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB公開(kāi)于WO98/18930，也被稱(chēng)為Sp46。LytC也公開(kāi)于WO98/18930,還被稱(chēng)為Sp91。該家族的優(yōu)選成員為L(zhǎng)ytC。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為L(zhǎng)ytX截短物，其中"LytX，，在上文定義，"截短物"是指缺少50%以上膽堿結(jié)合區(qū)的LytX蛋白。優(yōu)選地，這樣的蛋白質(zhì)缺少整個(gè)膽堿結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合體)。優(yōu)選地，該蛋白包含CbpX的NRlxR2(或RlxR2)和LytX的C末端部分(Cterm,即缺少膽堿結(jié)合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更優(yōu)選地，CbpX選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。再更優(yōu)選地，其為CbpA。優(yōu)選地，Lytx為L(zhǎng)ytC(也^f皮稱(chēng)為Sp91)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案為PspA或PsaA截短物，其缺少膽堿結(jié)合域(C)，并與LytX—起表達(dá)為融合蛋白。優(yōu)選地，LytX為L(zhǎng)ytC。PsaA和PspA這二者在本領(lǐng)域都是已知的。例如，Berry和Paton,InfectImmun1996年12月；64(12):5255-62已描述了PsaA和其跨膜缺失變體。例如US5804193、WO92/14488和WO99/53940公開(kāi)了PspA和其跨膜缺失變體。38Spl28和Spl30公開(kāi)于WO00/76540。Spl25是帶有細(xì)胞壁錨定基序LPXTG(其中X為任何氨基酸)的肺炎鏈球菌表面蛋白的實(shí)例。具有此基序的這類(lèi)肺炎鏈球菌表面蛋白中的任何蛋白在本發(fā)明范圍內(nèi)都已被發(fā)現(xiàn)是有用的，因此將其視為本發(fā)明的另一種蛋白。Spl25本身公開(kāi)于WO98/18930，也稱(chēng)為ZmpB—鋅金屬蛋白酶。Spl01公開(kāi)于WO98/06734(其中它的索引為#y85993)。其特征為I型信號(hào)序歹'〗。Spl33公開(kāi)于WO98/06734(其中它的索引為存y85992)。其也以I型信號(hào)序列為特征。莫拉卡他菌(Morajce〃a0^廳/20//力蛋白抗原的實(shí)例為OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21或其片段(WO0018910);LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME等，(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(德克薩斯大學(xué))];OmpCD(EP737085);HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipo18(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03Q38);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257);和OmpE?？砂诼?lián)合疫苗(尤其是用于預(yù)防中耳炎的聯(lián)合疫苗)中的非分型流感嗜血桿菌抗原或其片段的實(shí)例包括絲束蛋白[(US5766608-俄亥俄州研究基金會(huì))]和含有來(lái)自其的肽的融合體[例如LBl(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(紐約州立大學(xué))];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(WO94/12641);P2;和P5(WO94/26304)。本發(fā)明的蛋白也可以進(jìn)行有益的組合。所述"組合"是指免疫原性組合物包含來(lái)自以下組合中的所有蛋白，其或者為載體蛋白，或者為游離蛋白，或者為二者的混合物。例如，在后文陳述的兩種蛋白的組合中，兩種蛋白都可以用作載體蛋白，或者兩種蛋白都可以作為游離蛋白存在，或者兩種蛋白都可以作為載體和游離蛋白存在，或者一個(gè)可作為載體蛋白和游離蛋白存在，而另一個(gè)僅作為載體蛋白或僅作為游離蛋白存在，或者一個(gè)作為載體蛋白存在，另一個(gè)作為游離蛋白存在。當(dāng)給出3種蛋白的組合時(shí)，存在類(lèi)似的可能性。優(yōu)選的組合包括但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Spl28、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NRlxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、函xR2+PspA、NRlxR2+PsaA、顧xR2+Sp128、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Spl28、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。優(yōu)選地，NRlxR2(或RlxR2)來(lái)自CbpA或PspC。更優(yōu)選地，其來(lái)自CbpA。其它組合包括3種蛋白組合，例如PhtD+NRlxR2+Ply以及PhtA+NRlxR2+PhtD。在一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物包含作為載體蛋白的解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE。在又一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物包含作為游離蛋白的解毒的肺炎鏈球菌溶血素以及PhtD或PhtDE。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的H武形劑的疫苗。本發(fā)明的疫苗可被佐劑化，尤其是在計(jì)劃用于老年人群時(shí)。適宜的佐劑包括鋁鹽，例如氫氧化鋁凝膠(鋁佐劑)或^^酸鋁，而且可以為鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可為?；野彼峄蝓；?、陽(yáng)離子或陰離子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混懸液。優(yōu)選選擇佐劑為T(mén)H1型應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物。這些高水平的Thl型細(xì)胞因子傾向于支持誘導(dǎo)針對(duì)給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而Thl和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別不是絕對(duì)的。實(shí)際上，個(gè)體將支持被描述為以Thl為主或以Th2為主的免疫應(yīng)答。然而，經(jīng)常便利地根據(jù)Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT細(xì)胞克隆中所描述的(Mosmann,T.R.和Coffman,R丄.(1989)THlandTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties.(AnnualReviewofImmunology,7,145-173頁(yè))考慮細(xì)胞因子家族。傳統(tǒng)上，Thl型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-y和IL-2細(xì)胞因子有關(guān)。經(jīng)常與Thl型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)直接相關(guān)的其它細(xì)胞因子不由T細(xì)胞產(chǎn)生，例如IL-12。相比之下，Th2型應(yīng)答與Il-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有關(guān)。促進(jìn)Thl為主的應(yīng)答的適宜佐劑系統(tǒng)包括單力粦酰脂質(zhì)A或其衍生物(或通常為解毒的脂質(zhì)A-參見(jiàn)例如WO2005107798),尤其是3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)(關(guān)于其制備參見(jiàn)GB2220211A);以及單磷酰脂質(zhì)A、優(yōu)選3-脫-0-酰化單磷酰脂質(zhì)A連同鋁鹽(例如磷酸鋁或氬氧化鋁)或水包油乳劑的組合。在這些組合中，抗原和3D-MPL包含在同一顆粒結(jié)構(gòu)中，允許更有效地傳遞抗原性和免疫刺激性信號(hào)。研究表明，3D-MPL能夠進(jìn)一步增強(qiáng)鋁吸附抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A(或解毒的脂質(zhì)A)和^苷衍生物的組合，尤其是如在WO94/00153中公開(kāi)的QS21和3D-MPL的組合，或者如在WO96/33739中公開(kāi)的反應(yīng)原性較低的組合物，其中QS21用膽固醇猝滅。在WO95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其包含在水包油乳劑中的QS21、3D-MPL(或解毒的脂質(zhì)A)和生育酚。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。制劑還可以包含水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。含有寡核苷酸的未曱基化CpG(WO96/02555)和其它免疫調(diào)諧寡核苷酸(W00226757和WO03507822)也是TH1應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物，適用于本發(fā)明。具體的佐劑選自金屬鹽、水包油乳劑、Toll樣受體激動(dòng)劑(尤其是Toll樣受體2激動(dòng)劑、Toll樣受體3激動(dòng)劑、Toll樣受體4激動(dòng)劑、Toll樣受體7激動(dòng)劑、Toll樣受體8激動(dòng)劑和Toll樣受體9激動(dòng)劑)、41皂苷或其組合?？捎糜诒景l(fā)明的疫苗組合物的佐劑為革蘭氏陰性細(xì)菌菌抹的小泡或外膜嚢泡制備物，例如由WO02/09746教導(dǎo)的那些一尤其是腦膜炎奈瑟氏球菌小泡。小泡的佐劑特性可通過(guò)在其表面上保留LOS(脂多糖)(例如通過(guò)用低濃度去污劑[例如0-0.1%脫氧膽酸鹽]提取)而改善。LOS可通過(guò)WO02/09746所論述的msbB(-)或htrB(-)突變解毒。佐劑特性還可以通過(guò)保留腦膜炎球菌小泡的PorB(并任選地除去PorA)而改善。佐劑特性還可以通過(guò)截短腦膜炎^^菌小泡上的LOS的外核心的糖結(jié)構(gòu)而改"i一例如經(jīng)由WO2004/014417所論述的lgtB(-)突變?；蛘?，前述LOS(例如分離自msbB(-)和/或lgtB(-)菌抹)可被純化并用作本發(fā)明組合物中的佐劑。可用于本發(fā)明組合物的其它佐劑可選自皂苷、脂質(zhì)A或其衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳劑或其組合。其它優(yōu)選佐劑為與另一種佐劑組合的金屬鹽。優(yōu)選佐劑為T(mén)oll樣受體激動(dòng)劑，尤其是Toll樣受體2、3、4、7、8或9的激動(dòng)劑，或皂苷，尤其是Qs21。還優(yōu)選佐劑系統(tǒng)包括以上列出的兩種或多種佐劑。具體而言，組合優(yōu)選包含皂苷(尤其是Qs21)佐劑和/或Toll樣受體9激動(dòng)劑，例如含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它優(yōu)選組合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4激動(dòng)劑，例如單磷酰脂質(zhì)A或其3脫酰衍生物3D-MPL，或急普(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體，例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。特別優(yōu)選的佐劑為3D-MPL和QS21的組合(EP0671948Bl)、含有3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO95/17210、WO98/56414)或者與其它載體一起配制的3D-MPL(EP0689Bl)。其它優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)包含如在US6558670、US6544518中描述的3DMPL、QS21和CpG寡核香酸的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑為(或包含)Toll樣受體(TLR)4配體，優(yōu)選地為激動(dòng)劑，例如脂質(zhì)A衍生物，尤其是單;粦酰脂質(zhì)A，或者更具體地說(shuō)為3脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL可得自北美葛蘭素史克生物制品公司(GlaxoSm池KlineBiologicalsNorthAmerica),主要促進(jìn)具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。其可依據(jù)GB2220211A中公開(kāi)的方法生產(chǎn)。在化學(xué)上，3D-MPL是具有3、4、5或6條?；湹?-脫酰單磷酰脂質(zhì)A的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有的粒徑使得其可通過(guò)0.22ixm濾器除菌過(guò)濾。在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O94/21292中描述了這些制備物。脂質(zhì)A的合成衍生物是已知的，并纟皮認(rèn)為是TLR4激動(dòng)劑，其包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二酰氧十四?；被鵠-4-o-膦?；?P-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四?；被鵠-a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四酰基氨基]-4-氧代基-5-氮雜-9(11)-[(11)-3-羥基十四?；被鵠癸-1,10-二醇,1,10-雙(二氫磷酸酯)(WO99/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S,9R)-3-[(R)-十二酰氧十四?；被鵠-4-氧代基-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰基氨基]癸-l,10-二醇，l-二氫磷酸酯10-(6-絲己酸酉旨)(WO01/46127)其它可用的TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如在WO9850399或US6303347中公開(kāi)的那些(還公開(kāi)了用于制備AGP的方法)，或如在US6764840中所公開(kāi)的AGP的藥學(xué)上可接受的鹽。有些AGP是TLR4激動(dòng)劑，而有些是TLR4拮抗劑。兩者都被認(rèn)為可用作佐劑。另一個(gè)用于本發(fā)明的優(yōu)選免疫刺激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是從南美奎拉雅屬皂樹(shù)(QuilajaSaponariaMolina)中分離出來(lái)的皂苷制劑，并且由Dalsgaard等在1974年首次描述為具有佐劑活性("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,44巻,SpringerVerlag,Berlin,243-254頁(yè))。通過(guò)HPLC已經(jīng)分離了QuilA的純化片段，其保留了佐劑活性，沒(méi)有與QuilA相關(guān)的毒性(EP0362278)，例如QS7和QS21(也稱(chēng)為QA7和QA21)。QS-21是來(lái)源于查拉雅屬皂樹(shù)樹(shù)皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、Thl細(xì)胞和占優(yōu)的IgG2a抗體反應(yīng)，在本發(fā)明背景下為優(yōu)選皂苷。已經(jīng)描述了特別優(yōu)選的具體QS21制劑，這些制劑還包含固醇(W096/33739)。本發(fā)明的皂苷形成部分可以是獨(dú)立的膠束形式、混合的膠束形式(優(yōu)選但非僅具有膽汁鹽)，或者當(dāng)用膽固醇和脂質(zhì)制備時(shí)可以是ISCOM基質(zhì)(EP0109942Bl)、脂質(zhì)體或相關(guān)膠體結(jié)構(gòu)的形式，如似螺旋形或環(huán)形多聚體復(fù)合物或者油脂/分層的結(jié)構(gòu)和薄片，或者是水包油乳劑形式(例如WO95/17210)。皂苷優(yōu)選可與金屬鹽結(jié)合，諸如氫氧化鋁或-舞酸鋁(WO98/15287)。優(yōu)選地，急苷以脂質(zhì)體、ISCOM或水包油乳劑的形式存在。增強(qiáng)的系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A(或解毒的脂質(zhì)A)和皂苷衍生物的組合，尤其是如在WO94/00153中公開(kāi)的QS21和3D-MPL的組合，或如在WO96/33739中公開(kāi)的其中QS21用膽固醇猝滅的反應(yīng)原性車(chē)交低的組合物。在WO95/17210中描述了一種特別有效的佐劑制劑，其在水包油乳劑中包含生育酚，有或沒(méi)有QS21和/或3D-MPL。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物另外含有皂苷，其可為QS21。還可以使用免疫刺激性寡核苷酸或任何其它的Toll樣受體(TLR)9激動(dòng)劑。用于本發(fā)明佐劑或疫苗的優(yōu)選寡核苷酸為包含CpG的寡核苷酸，其優(yōu)選包含兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸CpG基序，這些基序由至少三個(gè)、更優(yōu)選至少六個(gè)或更多個(gè)核苷酸分隔。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鳥(niǎo)嘌呤核苦酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸內(nèi)的核苷酸間是二硫代磷酸酯鍵，或更優(yōu)選為硫代磷酸酯鍵，但磷酸二酯鍵和其它核苷酸間鍵也在本發(fā)明范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸。用于生產(chǎn)碌^代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。優(yōu)選寡核苷酸的實(shí)例具有以下序列。這些序列優(yōu)選包含辟u(mài)代z疇酸酯修飾的核苦酸間鍵。OLIGOl(SEQIDNO:1):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)OLIGO2(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)備選的CpG寡核苷酸可包含以上的優(yōu)選序列，因?yàn)樗鼈兙哂行蛄袃?nèi)無(wú)關(guān)緊要的缺失或添加。本發(fā)明所用的CpG寡核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)城已知的任一方法合成(例如參見(jiàn)EP468520)。為方便起見(jiàn)，這些寡核苷酸可利用自動(dòng)合成4義合成。佐劑可為水包油乳劑，或者可以包含與其它佐劑組合的水包油乳劑。乳劑系統(tǒng)的油相優(yōu)選地含有可代謝油。術(shù)語(yǔ)可代謝油的含義在本領(lǐng)域眾所周知。可代謝油可被定義為"能夠通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化的"(道蘭氏圖解醫(yī)學(xué)詞典，W.B.SandersCompany,第25版，(1974》。所述油可為任何植物油、魚(yú)油、動(dòng)物油或合成油，其對(duì)接受者無(wú)毒，能夠通過(guò)代謝轉(zhuǎn)化。堅(jiān)果、種子和谷物是常見(jiàn)的植物油來(lái)源。合成油也是本發(fā)明的一部分，可包括市售油，例如NEOBEE⑧等。鯊烯(2,6,10,15,19,23-六曱基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是不飽和油，可大量存在于鯊魚(yú)肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。鯊烯是可代謝油依據(jù)以下事實(shí)其是膽固醇生物合成的中間體(默克索引，第10版，編目流水號(hào)8619)。45母育酚(例如維生素E)也經(jīng)常用于油性乳化佐劑(EP0382271Bl;US5667784;WO95/17210)。用于本發(fā)明的油性乳劑(優(yōu)選地為水包油乳劑)的母育酚可以如EP0382271Bl所述配制，即母育酚可為母育酚液滴分散液，任選地含有乳化劑，優(yōu)選地^f氐于1)Lim直徑。或者，母育酚可與另一種油聯(lián)合使用，以形成油性乳劑的油相。本文描述了可與母育酚聯(lián)合使用的油性乳劑的實(shí)例，例如上述可代謝油。業(yè)已表明，水包油乳劑佐劑自身可用作佐劑組合物(EP0399843B),水包油乳劑和其它活性物質(zhì)的組合也已被描述為疫苗佐劑(WO95/17210;WO98/56414;WO99/12565;WO99/11241)。已表述了其它油性乳化佐劑，例如油包水乳劑(US5,422,109;EP0480982B2)和水包油包水乳劑(US5,424,067;EP0480981B)。所有這些都構(gòu)成了優(yōu)選的油性乳劑系統(tǒng)(尤其是在摻入母育酚時(shí))，以形成本發(fā)明的佐劑和組合物。最優(yōu)選地，油性乳劑(例如水包油乳劑)還包含乳化劑，例如吐溫80和/或固醇，例如膽固醇。優(yōu)選的油性乳劑(優(yōu)選地水包油乳劑)含有可代謝油；無(wú)毒性油，例如角莖烷、鯊烯或生育酚，例如a生育酚(和優(yōu)選地鯊烯和ot生育酚這二者)，以及任選的乳化劑(或表面活性劑)，例如吐溫80。還可以包括固醇(例如膽固醇)。生產(chǎn)水包油乳劑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常，該方法包括將含母育酚的油相與表面活性劑如PBS/吐溫80tm溶液混合，然后用勻漿器進(jìn)行勻漿，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見(jiàn)的是，包括將混合物兩次通過(guò)注射器針頭的方法應(yīng)適于勻化少量液體。同樣地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可修改在微射流儀(M110S微流體機(jī)器，在6巴的最大壓力輸入下在2分鐘的時(shí)間段(輸出壓力為約850巴)最多通過(guò)50次)中的乳化方法，以產(chǎn)生更小體積或更大體積的乳劑。該修改可通過(guò)常規(guī)^實(shí)驗(yàn)完成，包括測(cè)量所得乳劑，直到得到具有所需直徑的油滴的制劑。在水包油乳劑中，油和乳劑應(yīng)處于水性載體中。水性載體可為例如磷酸緩沖鹽水。在穩(wěn)定的水包油乳劑中存在的油滴大小優(yōu)選地可小于1微米，可在基本上30-600nm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地基本為約30-500納米直徑，最優(yōu)選地基本為約150-500nm直徑，尤其為約150nm直徑，如按光子相關(guān)光譜法所測(cè)量的。在這點(diǎn)上，以數(shù)目計(jì)80%的油滴應(yīng)在該優(yōu)選范圍內(nèi)，更優(yōu)選地以數(shù)目計(jì)超過(guò)90%的油滴和最優(yōu)選地以數(shù)目計(jì)超過(guò)95%的油滴在限定的尺寸范圍內(nèi)。按照常規(guī)，本發(fā)明的油性乳劑中所存在組分的量為0.5-20%或2-10%的油(總劑量體積)，例如鯊烯；且如果有ot生育酚則為2-10%;以及0.3-3%的表面活性劑，如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。優(yōu)選地，油(優(yōu)選鯊烯)母育酚(優(yōu)選a-生育酚)的比率等于或小于l，因?yàn)檫@樣提供更穩(wěn)定的乳劑。諸如吐溫80或司盤(pán)85的乳劑也可以以約1%的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗還包含有穩(wěn)定劑可能是有利的。優(yōu)選乳化系統(tǒng)的實(shí)例描述于WO95/17210、WO99/11241和WO99/12565,其公開(kāi)了基于鯊烯、a生育酚和吐溫80的乳化佐劑，其任選地與免疫刺激劑QS21和/或3D-MPL—起配制。因此，在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的佐劑可另外含有其它的免疫刺激劑l例如LPS或其衍生物|和/或皂苷。其它免疫刺激劑的實(shí)例描述于本文禾口"VaccineDesign-TheSubunitandAdjuvantApproach"1995,PharmaceuticalBiotechnology,第6巻，Powell,M.F.和Newman,M丄編輯，PlenumPress,NewYorkandLondon,ISBN0-306-44867-X。在一個(gè)優(yōu)選方面，本發(fā)明的佐劑和免疫原性組合物包含在上述油性乳劑中的皂香(優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL),任選地具有固醇(優(yōu)選膽固醇)。另外，油性乳劑(優(yōu)選地水包油乳劑)可含有司盤(pán)85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳劑、固醇和皂苷的佐劑描述于WO99/12565。通常，對(duì)于人類(lèi)給藥而言，皂苷(優(yōu)選QS21)和/或LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)在免疫原性組合物人用劑量中以1|ng-200iLig/劑存在，例47如lOjLtg-100pg/劑，優(yōu)選10iLig/劑。通常，油性乳劑(優(yōu)選地為水包油乳劑)包含2-10%可代謝油。優(yōu)選地，其包含2-10%鯊烯、2-10%a生育酚和0.3-3%(優(yōu)選地0.4-2%)乳劑(優(yōu)選地吐溫80[聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯])。在鯊烯和a生育酚這二者均存在時(shí)，優(yōu)選地鯊烯:a生育酚的比率等于或小于1，因?yàn)檫@提供更穩(wěn)定的乳劑。司盤(pán)85(脫水山梨糖醇三油酸酯)也可以在用于本發(fā)明的乳劑中以0.5-1%的水平存在。在某些情況下，本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗還包含穩(wěn)定劑可能是有利的，所述穩(wěn)定劑例如為其它乳劑/表面活性劑，包括辛酸(默克索引第10版，編目流水號(hào)1739)，其中特別優(yōu)選三辛酸甘油酯。在含有鯊烯和皂苷(優(yōu)選為QS21)時(shí)，制劑還包含固醇(優(yōu)選為膽固醇)是有益的，因?yàn)檫@可使乳劑中的總油量降低。這導(dǎo)致生產(chǎn)成本降低，接種的總體舒適性改善，還定量和定性地改善了所獲免疫應(yīng)答，例如改善了IFN-y的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)通常包含在200:1-300:1范圍內(nèi)的可代謝油皂苷(重量/重量)比率，還可以以"低油"形式使用本發(fā)明，其優(yōu)選范圍為1:1-200:1,優(yōu)選為20:1-100:1，最優(yōu)選基本為48:1，該疫苗保留了所有組分的有益佐劑特性和顯著降低的反應(yīng)原性曲線(xiàn)。因此，特別優(yōu)選的實(shí)施方案具有的鯊烯QS21(重量/重量)比率在1:1-250:1的范圍內(nèi)，還優(yōu)選20:1-200:1的范圍，優(yōu)選20:1-100:1，最優(yōu)選基本為48:1。優(yōu)選地，還包括以如本文所述的皂苦固醇比率存在的固醇(最優(yōu)選地為膽固醇)。本發(fā)明的乳化系統(tǒng)優(yōu)選地具有在亞微米范圍內(nèi)的小油滴尺寸。最優(yōu)選地，油滴尺寸為直徑120-750nm范圍，最優(yōu)選直徑為120-600nm范圍。特別有效的佐劑制劑(用于在本發(fā)明的免疫原性組合物中與A1P04最終組合)包括皂苷(優(yōu)選QS21)、LPS衍生物(優(yōu)選3D-MPL)和油性乳劑(優(yōu)選在水包油乳劑中的鯊烯和a生育酚)，其描述于WO95/17210或WO99/12565(尤其是在實(shí)施例2表1中的佐劑制劑11)。TLR2激動(dòng)劑的實(shí)例包括肽聚糖或或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如咪喹莫特和雷西莫特，是已知的TLR7激動(dòng)劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動(dòng)劑(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而雙鏈RNA和聚合IC(聚肌芬酸-聚胞嘧啶核普酸，其為市售的病毒RNA的合成才莫擬物)是TLR3激動(dòng)劑的示例。3D-MPL是TLR4激動(dòng)劑的實(shí)例，而CPG是TLR9激動(dòng)劑的實(shí)例。免疫原性組合物可以包含吸附在金屬鹽上的抗原和免疫刺激劑。免疫刺激劑基于鋁的疫苗制劑描述于EP0576478Bl、EP0689454Bl和EP0633784Bl，其中抗原和免疫刺激劑3-脫-0-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)吸附于相同顆粒上。那么，在這些情況下，抗原首先吸附到鋁鹽上，之后將免疫刺激劑3D-MPL吸附到相同鋁鹽顆粒上。這些方法首先包括在水浴中通過(guò)超聲懸浮3D-MPL，直至顆粒達(dá)到80-500nm的尺寸。典型地，在室溫下攪拌1小時(shí)將抗原吸附在鋁鹽上。然后將3D-MPL懸浮液加入吸附的抗原，并將制劑于室溫溫育l小時(shí)，然后保持于4。C,直至使用。在另一種方法中，免疫刺激劑和抗原在單獨(dú)的金屬顆粒上，如在EP1126876中所述。改善的方法包括將免疫刺激劑吸附到金屬鹽顆粒上，接著將抗原吸附到另一種金屬鹽顆粒上，之后混合所述單獨(dú)的金屬顆粒，以形成疫苗。用于本發(fā)明的佐劑可為包含免疫刺激劑的佐劑組合物，所述刺激劑吸附到金屬鹽顆粒上，其特征在于金屬鹽顆?；緵](méi)有其它抗原。此外，本發(fā)明提供疫苗，所述疫苗特征在于免疫刺激劑吸附到基本沒(méi)有其它抗原的金屬鹽顆粒上，并且吸附抗原的金屬鹽顆?；緵](méi)有其它免疫刺激劑。因此，本發(fā)明提供含有已吸附到金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑的佐劑制劑，該制劑特征在于所述組合物基本沒(méi)有其它抗原。此外，該佐劑制劑可為中間體，如果使用這樣的佐劑，則該中間體是生產(chǎn)疫苗所必需的。因此，提供一種生產(chǎn)疫苗的方法，該方法包括將作為一種或多種吸附到金屬顆粒上的免疫刺激劑的佐劑組合物與抗原混合。優(yōu)選地，抗原已預(yù)先吸附到金屬鹽上。所述金屬鹽可與吸附到免疫刺激劑49上的金屬鹽相同或相似。優(yōu)選地，金屬鹽為鋁鹽，例如磷酸鋁或氫氧化鋁。本發(fā)明還提供含有吸附到第一金屬鹽顆粒上的免疫刺激劑和吸附到金屬鹽上的抗原的疫苗組合物，其特征在于第一和笫二金屬鹽顆粒為單獨(dú)的顆粒。本文描述的LPS或LOS衍生物或突變或脂質(zhì)A衍生物設(shè)計(jì)得比天然脂多糖毒性低(例如3D-MPL)，就本文描述的這些部分的任何用途而言是可互換的等效物。它們可為如上所述的TLR4配體。其它這樣的衍生物描述于WO020786737、WO9850399、WO0134617、WO0212258、WO03065806。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的組合物的佐劑包含脂質(zhì)體載體(通過(guò)已知技術(shù)由磷脂(例如二油酰磷脂酰膽堿[DOPC])和任選的固醇[例如膽固醇]制備)。這些脂質(zhì)體載體可攜帶脂質(zhì)A衍生物[例如3D-MPL-參見(jiàn)上文]和/或皂苷(例如QS21-參見(jiàn)上文)。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑含有(每0.5mL劑量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg或0.5-1mg(例如0.4-0.6mg、0.9-1.1mg、0.5mg或1mg)石岸脂(例如DOPC);0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例々口0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)；5-60貼、10-50叫或20-30貼(例如5-15jug、40-50嗎、10pg、20^g、30pg、40)xg或50(ig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL);以及5-60jxg、10-50pg或20-30jig(例如5-15pg、40-50|ug、10(xg、20(ig、30嗎、40昭或50嗎)皂苷(例如QS21)。該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類(lèi)接種者中針對(duì)一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯劣于Prevnar疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包含由可代謝油(例如鯊烯)、乳劑(例如吐溫80)和任選的母育酚(例如a生育酚)制備的水包油乳劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑含有(每0.5mL劑量)0.5-15mg、1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2國(guó)3mg、5-6mg或10-11mg)可代謝油(例如鯊烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg或2-3mg(例如0.9-1.1mg、2-3mg或4-5mg)乳劑(例如吐溫80);和任選的0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg或2-3mg)母育酚(例如oc生育酚)。該佐劑任選地還可以包含5-60嗎、10-50)ng或20-30|ug(例如5-15pg、40-50(xg、10jig、20|ug、30pg、40jxg或50iug)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。這些佐劑尤其適合于嬰兒或老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類(lèi)接種者中針對(duì)一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯劣于Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。該佐劑任選地可含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)固醇(例如膽固醇)；5-60嗎、10-50|ug或20-30)tig(例如5-15pg、40-50|ig、10pg、20|ig、30pg、40pg或50pg)月旨質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL);和5-60|ig、10-50嗎或20-30(ig(例如5陽(yáng)15jxg、40-50jxg、10pg、20)ig、30pg、40pg或50ng)皂苷(例如QS21)。該佐劑尤其適合于老年疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖綴合物4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類(lèi)接種者中針對(duì)一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯劣于Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明組合物的佐劑包^^磷酸鋁和脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑可包含(每0.5mL劑量)100-750貼、200-500嗎或300-400貼作為磷酸鋁的Al，和5-60嗎、10-50嗎或20-30pg(侈寸長(zhǎng)口5-15jxg、40-50pg、10|tig、20jxg、30jig、40pg或50)iig)脂質(zhì)A衍生物(例如3D-MPL)。該佐劑尤其適合于老年或嬰兒疫苗制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有此佐劑的疫苗組合物包含衍生自至少以下所有血清型的糖綴合物:4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(并還可以包含來(lái)自血清型3、6A、19A和22F的一種或多種糖綴合物)，其中在人類(lèi)接種者中針對(duì)一種或多種(或全部)疫苗組分4、6B、9V、14、18C、19F和23F誘導(dǎo)的GMC抗體效價(jià)不明顯劣于Prevnar⑧疫苗誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。通過(guò)將含有本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗制品經(jīng)全身或粘膜途徑給藥，所述疫苗可用于保護(hù)或治療對(duì)感染易感的哺乳動(dòng)物。這些給藥可包括經(jīng)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑注射；或經(jīng)粘膜給予至口/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。可將用于治療肺炎或中耳炎的疫苗進(jìn)行鼻內(nèi)給藥(由于能更有效地阻止肺炎鏈球菌的鼻咽攜帶，因此能在其最早期減弱感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑給予，但其組分也可以同時(shí)或在不同時(shí)間一起共給予(例如為了彼此之間免疫應(yīng)答的最佳協(xié)調(diào)，肺炎鏈球菌糖綴合物可單獨(dú)給予、同時(shí)給予或在給予疫苗的任何細(xì)菌蛋白組分之后l-2周給予)。對(duì)于共給予，任選的Thl佐劑可存在于任意的或全部的不同給藥中。除了單一給藥途徑之外，還可使用2種不同的給藥途徑。例如，糖或糖綴合物可IM(或ID)給予，細(xì)菌蛋白可IN(或ID)給予。另外，本發(fā)明的疫苗可IM給予致敏劑量，IN給予加強(qiáng)劑量。疫苗中的蛋白抗原的含量通常在1-100pg的范圍內(nèi)，優(yōu)選為5-50fig，最通常在5-25iLig的范圍內(nèi)。在初始接種后，受試者可接受1次或數(shù)次間隔時(shí)間足夠的加強(qiáng)免疫。疫苗制劑一4殳4苗述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.禾口NewmanM.J.編輯)(1995)PlenumPressNewYork)。Fullerton,美國(guó)專(zhuān)利4,235,877描述了在脂質(zhì)體中的嚢化。本發(fā)明的疫苗可儲(chǔ)存在溶液中或凍干儲(chǔ)存。優(yōu)選地，溶液在糖如蔗糖或乳糖存在下凍干。還優(yōu)選它們;波凍干，并在使用前臨時(shí)重配。凍干可產(chǎn)生更穩(wěn)定的組合物(疫苗)，并在存在3D-MPL和沒(méi)有基于鋁的佐劑的情況下可能產(chǎn)生更高的抗體效價(jià)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種疫苗試劑盒，其包括含有本發(fā)明的免疫原性組合物(任選地為凍干形式)的小瓶，并還包括含有本文所迷佐劑的小瓶?？深A(yù)見(jiàn)的是，在本發(fā)明的該方面，佐劑將用于重配凍干的免疫原性組合物。盡管本發(fā)明的疫苗可通過(guò)任何途徑給予，但將所述疫苗給予到皮膚中(ID)構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。人皮膚含有外部"角質(zhì)"表皮，叫做角質(zhì)層，其覆蓋表皮。在此表皮下面是叫做真皮的層，其又覆蓋皮下組織。研究者已表明，將疫苗注射到皮膚中，尤其是真皮中，刺激免疫應(yīng)答，其還可能與許多其它優(yōu)勢(shì)有關(guān)。用本文所述疫苗皮內(nèi)接種構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選特征。皮內(nèi)注射的常規(guī)技術(shù)"芒圖操作(mantouxprocedure)"包括下述步驟清潔皮膚，然后伸出一只手，使小號(hào)針(26-31號(hào))的斜面朝上，以10-15。的角度將針插入。一旦針斜面^皮插入，就降低針管并前推，同時(shí)輕壓使其在皮膚下抬高。然后將液體非常緩慢地注入，這樣便在皮膚表面上形成一個(gè)大包或腫塊，接著緩慢抽出針。近來(lái)，已描述了特別設(shè)計(jì)用于皮內(nèi)或經(jīng)(across)皮膚給予液體制劑的裝置，例如在WO99/34850和EP1092444中描述的裝置，以及例如在WO01/13977、US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5，993，412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、53US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537中描述的噴射注射裝置。疫苗制劑的真皮內(nèi)給藥替代方法可包括常規(guī)注射器和針，或設(shè)計(jì)用于固體疫苗的彈道式釋藥(ballisticdelivery)的裝置(WO99/27961)，或經(jīng)皮貼劑(WO97/48440;WO98/28037);或皮膚表面給藥(經(jīng)真皮或經(jīng)皮傳送，WO98/20734;WO98/28037)。當(dāng)將本發(fā)明的疫苗給予至皮膚時(shí)，或更具體地說(shuō)給予到真皮中時(shí)，疫苗為小液體體積，具體地說(shuō)為約0.05ml至0.2ml的體積。本發(fā)明皮膚或皮內(nèi)疫苗中的抗原含量可類(lèi)似于肌內(nèi)疫苗中存在的常規(guī)劑量(參見(jiàn)上文)。然而，皮膚或皮內(nèi)疫苗的一個(gè)特點(diǎn)是制劑可以為"低劑量"。因此，"低劑量"疫苗中蛋白抗原的存在優(yōu)選低至每劑0.1-10)iig或0.1-5)iig;糖(優(yōu)選綴合的)抗原的存在可以為每劑0.01-1pg、伊C選0.01-0.5iuglt。此處所用的術(shù)語(yǔ)"皮內(nèi)傳送"是指將疫苗給至皮膚的真皮區(qū)域。然而，疫苗不一定僅定位于真皮內(nèi)。真皮層是距離人體皮膚表面約1.0mm和約2.0mm的皮層，但個(gè)體之間和機(jī)體的不同部位之間存在一定量的差異。一般地，預(yù)計(jì)疫苗可以通過(guò)進(jìn)入皮膚表面下1.5mm達(dá)到真皮層。真皮位于在表面的角質(zhì)層和表皮以及下面的皮下層之間。根據(jù)給藥模式，可以使疫苗最終僅存在于或主要存在于真皮內(nèi)，或最終可分布于表皮和真皮內(nèi)。本發(fā)明還通過(guò)加入為游離或綴合形式的流感嗜血桿菌蛋白(參見(jiàn)上文)如D蛋白，提供預(yù)防或減輕流感嗜血桿菌所致中耳炎的改良疫苗。另外，本發(fā)明還通過(guò)依靠向本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合組合物加入作為游離或綴合蛋白的一種或兩種肺炎鏈球菌蛋白(參見(jiàn)上文)，提供在嬰兒中預(yù)防或減輕肺炎鏈球菌感染(例如中耳炎)的改良疫苗。所述肺炎鏈球菌游離蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。一種或多種游離或綴合形式的莫4立卡他菌(A/oraxe〃acato廳/wto)蛋白抗原(參見(jiàn)上文)也可以包含在聯(lián)合疫苗中。因此，本發(fā)在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為通過(guò)給予安全有效量的本發(fā)明疫苗在嬰兒(0-2歲)中激發(fā)(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法。此外，本發(fā)明的實(shí)施方案包括提供用于藥物的本發(fā)明的抗原性肺炎鏈球菌綴合組合物以及本發(fā)明的肺炎鏈球菌綴合物在制備用于預(yù)防(或治療)肺炎鏈^^菌疾病的藥物中的用途。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明為通過(guò)給予安全有效量的本發(fā)明疫苗，優(yōu)選地連同一種或兩種作為游離或綴合蛋白存在的肺炎鏈球菌蛋白，在老年人群(在本發(fā)明背景下患者年齡如果為50歲或以上、通常超過(guò)55歲以及更通常超過(guò)60歲，則被視為老年人)中激發(fā)(保護(hù)性)免疫應(yīng)答的改良方法，所述游離的肺炎鏈球菌蛋白可與用作載體蛋白的任何肺炎鏈球菌蛋白相同或不同。本發(fā)明的又一方面是使人類(lèi)宿主免疫肺炎鏈球菌和任選的流感嗜血桿菌感染所致疾病的方法，該方法包括給予宿主免疫保護(hù)劑量的本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒。本發(fā)明的又一方面為用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌和任選的流感嗜血桿菌感染所致疾病的免疫原性組合物。本發(fā)明的又一方面為本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗或試劑盒在制備用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌和任選的流感嗜血桿菌感染所致疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或預(yù)防O-乙酰化血清型18C菌抹和脫-O-乙?；逍?8C菌抹的肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或預(yù)防血清型19A菌抹的肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途，所述免疫原性組合物或疫苗包含血清型19F的莢膜糖綴合物，但不含血清型19A的莢膜糖。在所有情況下，本發(fā)明人都意欲用術(shù)語(yǔ)"由……組成"分別任選地取代本文的術(shù)語(yǔ)"包含"、"含有"和"包括"。55涉及本發(fā)明的"疫苗組合物"的本文的實(shí)施方案也適用于涉及本發(fā)明的"免疫原性組合物"的實(shí)施方案，反之亦然。在本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)中提及的所有參考文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。為了可更好地理解本發(fā)明，提供以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅用于闡述目的，無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:D蛋白的表達(dá)流感嗜血桿菌D蛋白用于D蛋白表達(dá)的遺傳構(gòu)建起始物質(zhì)編碼D蛋白的DNAD蛋白在所有血清型以及非分型的流感嗜血桿菌菌抹中都高度保守。含有編碼整個(gè)D蛋白基因的DNA序列的載體pfflC348由A.Forsgren博士，DepartmentofMedicalMicrobiology,UniversityofLund,Malm6GeneralHospital,Malmd,Sweden處獲得。D蛋白的DNA序列由Janson等，(1991)Infect.Immun.59:119-125發(fā)表。表達(dá)載體pMGl表達(dá)載體pMGl為pBR322衍生物(Gross等，1985)，其中導(dǎo)入了來(lái)源于噬菌體X的控制元件，該控制元件用于外源插入基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯(Shatzman等，1983)。此外，氨芐青霉素抗性基因被替換成卡那霉素抗性基因。大腸桿菌菌林AR58用預(yù)先在SA500衍生物(galE::TN10,入KircI857AHl)中生長(zhǎng)的PI噬菌體原液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99產(chǎn)生大腸桿菌菌抹AR58。N99和SA500為大腸桿菌K12菌抹，得自國(guó)立衛(wèi)生研究所(NIH)的MartinRosenberg博士實(shí)驗(yàn)室。表達(dá)載體pMGl為生產(chǎn)D蛋白，將編碼該蛋白的DNA克隆到表達(dá)載體pMGl中。該質(zhì)粒使用X噬菌體DNA的信號(hào)來(lái)驅(qū)動(dòng)插入的外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。該載體含有啟動(dòng)子PL、操縱子OL和2個(gè)可用位點(diǎn)(NutL和NutR)，從而在提供N蛋白時(shí)緩解轉(zhuǎn)錄極性效應(yīng)(Gross等，1985)。將含有PL啟動(dòng)子的載體引入一種大腸桿菌溶原性宿主，以穩(wěn)定質(zhì)粒DNA。溶原性宿主菌林含有整合到基因組中的復(fù)制缺陷型人噬菌體DNA(Shatzman等，1983)。染色體中的人噬菌體DNA引導(dǎo)cl阻抑蛋白的合成，所述cl阻抑蛋白結(jié)合載體的OL阻抑物，阻止RNA聚合酶與PL啟動(dòng)子結(jié)合，從而防止插入基因轉(zhuǎn)錄。表達(dá)菌林AR58的cl基因含有溫度敏感性突變，使得可通過(guò)溫度變化來(lái)調(diào)控PL引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，即提高培養(yǎng)溫度可使阻抑物失活，并開(kāi)始合成外源蛋白。該表達(dá)系統(tǒng)可使外源蛋白(尤其是可能對(duì)細(xì)胞有毒性的那些外源蛋白)受控合成(Shimataka和Rosenberg,1981)。大腸桿菌菌林AR58用于產(chǎn)生D蛋白載體的AR58溶原性大腸桿菌菌抹衍生自標(biāo)準(zhǔn)Nffl大腸桿菌K12菌林N99(F-siTgalK2，lacZ-thr-)。它含有缺陷型溶原性X噬菌體(galE::TN10,人KircI857AH1)。KiK表型防止宿主停止合成大分子。cI857突變賦予cl阻抑物溫度敏感性損傷。AH1缺失去除人噬菌體的右側(cè)操縱子以及宿主的bio、uvr3和chlA基因座。用預(yù)先在SA500衍生物(gaffi::TN10,入Kil-cI857AH1)中生長(zhǎng)的PI噬菌體原液轉(zhuǎn)導(dǎo)N99產(chǎn)生AR58菌林。由于編碼四環(huán)素抗性的TN10轉(zhuǎn)座子存在于附近的galE基因中，因而利用四環(huán)素對(duì)N99中缺陷型溶菌原的導(dǎo)入情況進(jìn)行選擇。57載體pMGMDPPrD的構(gòu)建使用含有流感病毒非結(jié)構(gòu)性Sl蛋白編碼基因的pMGl載體(pMGNSl)構(gòu)建pMGMDPPrD。利用在5'和3'端分別含有Ncol與Xbal限制位點(diǎn)的PCR引物經(jīng)PCR由pfflC348載體(Janson等，1991,Infect.Immun.59:119-125)擴(kuò)增D蛋白基因。然后將NcoI/Xbal片段引入到pMGNSl的Ncol與Xbal之間，由此產(chǎn)生含有NS1蛋白的N端81個(gè)氨基酸并后接PD蛋白的融合蛋白。該載體稱(chēng)為pMGNSlPrD?；谏鲜鰳?gòu)建體產(chǎn)生用于D蛋白表達(dá)的最終構(gòu)建體。從pMGNSlPrD中除去BamHI/BamHI片段。該DNA水解反應(yīng)除去除前3個(gè)N端殘基之外的NS1編碼區(qū)。在該載體重新連接時(shí)，產(chǎn)生編碼具有以下N端氨基酸序列的融合蛋白的基因-隱一函PSSHSS畫(huà)ANT畫(huà)——NS1D蛋白D蛋白不含有前導(dǎo)肽或通常連接脂質(zhì)鏈的N端半胱氨酸。因此，該蛋白不會(huì)被分泌到周質(zhì)中，也不會(huì)被脂化，而是以可溶形式保留在細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)于37。C熱激將最終構(gòu)建體pMG-MDPPrD導(dǎo)入到AR58宿主菌株中。在卡那霉素存在下選擇含有質(zhì)粒的細(xì)菌。用選定的內(nèi)切核酸酶消化分離的質(zhì)粒DNA來(lái)證實(shí)編碼DNA插入序列的D蛋白的存在。重組的大腸桿菌菌株稱(chēng)為ECD4。D蛋白的表達(dá)處于入PL啟動(dòng)子/(\操縱子控制之下。宿主菌抹AR58的基因組中含有溫度敏感性cl基因，該基因在低溫下可通過(guò)與ol結(jié)合來(lái)阻斷由人pl啟動(dòng)的表達(dá)。一旦溫度提高，cI就由Ol幹放，D蛋白得以表達(dá)。小規(guī)模制備在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，可將細(xì)胞濃縮并冷凍。如下進(jìn)行收集細(xì)胞的提取和D蛋白純化。將冷凍的細(xì)胞培養(yǎng)物沉淀融解，并重懸浮于細(xì)胞裂解液(檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)中，使最終OD65。=60。使該懸浮液兩次流經(jīng)P-1000bar的高壓勻漿器。通過(guò)離心澄清細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿，并過(guò)濾去除細(xì)胞碎片。在笫一個(gè)純化步驟中，將過(guò)濾的裂解物上樣于陽(yáng)離子交換層析柱(SPSepharoseFastFlow)。PD可通過(guò)離子相互作用與凝膠基質(zhì)結(jié)合，并可通過(guò)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟洗脫P(yáng)D。在第二個(gè)純化步驟中，雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)(QSepharoseFastFlow)上。PD未結(jié)合到凝膠上，并可收集在流出物中。兩個(gè)柱層析步驟均利用OD監(jiān)測(cè)分部收集物。通過(guò)超濾濃縮含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過(guò)0.2pm膜。大規(guī)厲制備如下進(jìn)行收集細(xì)胞的提取和D蛋白的純化。冷卻收集的培養(yǎng)液，并直接通過(guò)約800bar壓力的高壓勻漿器2次。在第一個(gè)純化步驟中，稀釋細(xì)胞培養(yǎng)物勻漿物，并上樣于陽(yáng)離子交換層析柱(SPSepharoseBigbeads)。PD通過(guò)離子相互作用結(jié)合于凝膠基質(zhì)，通過(guò)增加洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度的步驟洗脫P(yáng)D，并過(guò)濾。在第二個(gè)純化步驟中，雜質(zhì)保留在陰離子交換基質(zhì)(QSepharoseFastFlow)上。PD未結(jié)合到凝膠上，并可收集在流出物中。兩個(gè)柱層析步驟均利用OD監(jiān)測(cè)分部收集物。通過(guò)超濾濃縮并滲濾含有純化的D蛋白的陰離子交換柱層析的流出物。最后，使含有D蛋白的超濾保留物通過(guò)0.2pm膜。實(shí)施例lb:PhtD的表達(dá)PhtD蛋白是肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體(Pht)蛋白家族的成員，其特征在于存在組氨酸三聯(lián)體(HXXHXH基序)。PhtD是838個(gè)氨基酸的分子，具有5個(gè)組氨酸三聯(lián)體(參見(jiàn)MedlmmuneWO00/37105SEQIDNO:4的氨基酸序列和SEQIDNO:5的DNA序列)。PhtD還在中部(氨基酸位置348-380)含有富集脯氨酸的區(qū)域。PhtD具有20個(gè)氨基酸的N末端信號(hào)序列，該序列含有LXXC基序。遺傳構(gòu)建體使用攜帶p入啟動(dòng)子的自制pTCMP14載體將成熟的MedlmmimePhtD蛋白(由氨基酸21至氨基酸838)的基因序列重組轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中。大腸桿菌宿主菌株為AR58,其攜帶cI857熱敏感性阻抑物，允許熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子。實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以從Medlmmune質(zhì)粒擴(kuò)增p//D基因(如在WO00/37105中所述的攜帶肺炎鏈球菌菌抹Norway4(血清型4)的基因-SEQIDNO:5:)。僅對(duì)pM)基因特異的引物用于擴(kuò)增兩個(gè)片段中的p&D基因。引物或攜帶iVcfel和K，IP艮制位點(diǎn)，或攜帶^pwl和；^wl限制位點(diǎn)。這些引物不與該載體的任何核苷酸雜交，而是僅與特異性基因序列雜交。使用攜帶iVcfel限制位點(diǎn)的第一引物插入人工ATG起始密碼子。然后將產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物插入到pGEM-T克隆載體(Promega)中，并檢驗(yàn)DNA序列。然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在TCMP14表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)片段亞克隆，并將載體轉(zhuǎn)化入v4W5S大腸桿菌中。PhtD純化如下實(shí)現(xiàn)PhtD純化□在卡那霉素存在下大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)于30。C生長(zhǎng)30小時(shí)，然后于39.5。C誘導(dǎo)18小時(shí)。。在作為蛋白酶抑制劑的5mMEDTA和2mMPMSF存在下以O(shè)D±115破碎來(lái)自完整培養(yǎng)物的大腸桿菌細(xì)胞Rannie,2次通過(guò)，1000bar。d于室溫(20。C)用膨脹床模式StreamlineQXL層析去除抗原捕獲物和細(xì)月包石爭(zhēng)片；柱子用NaCl150mM+Empigen0.25%pH6.5洗滌，并用NaCl400mM+Empigen0.25%的25mM磷酸鉀緩沖溶液pH7.4洗脫?！跤肧artobran150濾器(0.45+0.2pm)過(guò)濾?！踉?mM咪唑存在下于4。C抗原結(jié)合在螯合Zn^的SepharoseFFIMAC層析柱pH7.4上；該柱用5mM咪唑和1%Empigen洗滌，并用50mM咪唑洗脫，二者均在25mM磷酸鉀緩沖液pH8.0中。□以陽(yáng)離子模式在FractogelEMDDEAEpH8.0(25mM磷酸鉀)上于4'C進(jìn)行弱陰離子交換層析；該柱用140mMNaCl洗滌，并用200mMNaCl洗脫，同時(shí)雜質(zhì)(蛋白和DNA)仍吸附在交換劑上。。用50kDa膜以2mM磷酸鈉/鉀pH7.15濃縮和超濾。d純化的半成品經(jīng)0.2pmMillipak-20濾器除菌過(guò)濾。實(shí)施例lc:肺炎鏈球菌溶血素的表達(dá)如在WO2004/081515和WO2006/032499中所述地制備和解毒肺炎鏈球菌性肺炎鏈球菌溶血素。實(shí)施例2:綴合物的制備在本領(lǐng)域眾所周知如何制備純化的肺炎鏈球菌多糖。就這些實(shí)施例而言，多糖基本如EP072513所述地制備，或者通過(guò)緊密相關(guān)的方法制備。在綴合前，多糖可通過(guò)如下所述的微流化調(diào)整尺寸?；罨团悸?lián)條件對(duì)每一種多糖都是特異性的。這些條件在表l中給出。將調(diào)整過(guò)尺寸的多糖(PS5、6B和23F除外)溶解在2MNaCl、0.2MNaCl或注射用水(WFI)中。評(píng)估所有血清型的最佳多糖濃度。除血清型18C之外的所有血清型都如以下詳述地與載體蛋白直接綴合。產(chǎn)生2種替代血清型22F綴合物；1種直"j妄綴合，1種通過(guò)ADH4妻頭綴合。將CDAP在乙腈或乙腈/水50%/50%中的100mg/ml儲(chǔ)備液(CDAP/PS比率為0.5-1.5mg/mgPS)加入多糖溶液。1.5分鐘后，加入0.2M-0.3MNaOH，以獲得特定活化pH。在此pH于25。C在3分鐘內(nèi)進(jìn)行多糖的活化。將純化的蛋白(D蛋白、PhtD、肺炎鏈球菌溶血素或DT)(其量取決于初始PS/載體蛋白的比值)加入活化的多糖中，在該特定pH于pH調(diào)節(jié)下進(jìn)行至多2小時(shí)(取決于血清型)的偶聯(lián)反應(yīng)。為了猝滅未反應(yīng)的氰酸酯基團(tuán)，隨后將2M甘氨酸溶液加入混合物。調(diào)節(jié)pH至猝滅pH(pH9.0)。于25。C攪拌溶液30分鐘，然后在持續(xù)的緩慢攪拌下于2-8。C過(guò)夜。18C的制備18C經(jīng)接頭己二酰肼(ADH)與載體蛋白連接。多糖血清型18C在綴合前被微流化。用EDAC衍生化破傷風(fēng)類(lèi)毒素為衍生化破傷風(fēng)類(lèi)毒素，用0.2MNaCl將純化的TT稀釋至25mg/ml，加入ADH間隔臂，以便達(dá)到0.2M終濃度。當(dāng)間隔臂完全溶解時(shí)，將pH調(diào)節(jié)至6.2。然后加入EDAC(l-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亞胺)，以達(dá)到0.02M終濃度，在pH調(diào)節(jié)下攪拌混合物1小時(shí)。通過(guò)于25°C增加pH至9.0保持至少30分鐘終止縮合反應(yīng)。然后滲濾(IOkDaCO膜)衍生化的TT，以便除去殘余的ADH和EDAC試劑。最后除菌過(guò)濾TTAH塊狀物，直至偶聯(lián)步驟，并儲(chǔ)存于-70。C。TTah與PS18C的化學(xué)偶聯(lián)詳細(xì)的綴合參數(shù)可見(jiàn)于表1。以限定的濃度用水稀釋2g微流化PS，并通過(guò)加入NaCl粉末調(diào)節(jié)至2MNaCl。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，在50/50體積/體積乙腈/WFI中新鮮制備)，以達(dá)到適宜的CDAP/PS比率。通過(guò)加入0.3MNaOH將pH升高至活化pH9.0,并在此pH穩(wěn)定，直至加入TTah。3分鐘后，加入衍生化的TTah(20mg/ml的0.2MNaCl溶液)，以使TTah/PS比率達(dá)到2;將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH9.0。在pH調(diào)節(jié)下靜置溶液l小時(shí)。為了猝滅，向混合物PS/TTah/CDAP加入2M甘氨酸溶液。調(diào)節(jié)pH至猝滅pH(pH9.0)。將溶液于25。C攪拌30分鐘，然后在連續(xù)纟爰慢攪拌下于2-8。C靜置過(guò)夜。PS22FM-PhtD綴合物在用于該糖的第二種綴合方法(第一種為表1中顯示的直接PS22-PhtD綴合方法)中，22F與載體蛋白經(jīng)接頭己二酰肼(ADH)連接。多糖血清型22F在綴合前^皮微流化。PS22F衍生化活化和偶聯(lián)在連續(xù)攪拌下于25。C在控溫水浴中進(jìn)行。稀釋微流化的PS22F,以獲得在0.2MNaCl中6mg/m的最終PS濃度，用0.1NHCl將該溶液調(diào)節(jié)至pH6.05±0.2。加入CDAP溶液(IOOmg/ml，在50/50的乙腈/WFI中新鮮制備)，以達(dá)到適宜的CDAP/PS比率(1.5/1重量/重量)。通過(guò)加入0.5MNaOH將pH升高至活化pH9.00±0.05，并穩(wěn)定在此pH,直至加入ADH。3分鐘后，加入ADH，以達(dá)到適宜的ADH/PS比率(8.9/1重量/重量)；將pH調(diào)節(jié)至偶聯(lián)pH9.0。在pH調(diào)節(jié)下靜置溶液1小時(shí)。濃縮并滲濾PSah右1"生物。偶聯(lián)向PS22Fah衍生物加入10mg/ml在0.2MNaCl中的PhtD，以便達(dá)到4/1(重量/重量)的PhtD/PS22FAH比率。用HC1將pH調(diào)節(jié)至5.0±0.05。在10分鐘內(nèi)(250pl/分鐘)手動(dòng)加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1MTris-HCl溶液，pH7.5),以達(dá)到1mgEDAC/mgPS22FAH。所獲溶液在攪拌和pH調(diào)節(jié)下于25。C溫育150分鐘(盡管也可以使用60分鐘)。通過(guò)加入1MTris-HClpH7.5(1/10終體積)中和溶液，并于25°C靜置30分鐘。在SephacrylS400HR上洗脫前，使用5pmMinisart濾器澄清綴合物。獲得的綴合物具有4/1(重量/重量)的最終PhtD/PS比率，游離PS含量在1。/。以下，抗原性(ct-PS/ot-PS)為36.3。/。，抗PhtD抗原性為7.4%。綴合物的純化使用經(jīng)0.15MNaCl平衡的SephacrylS400HR凝膠過(guò)濾柱(對(duì)于18C為S500HR)通過(guò)凝膠過(guò)濾純化綴合物，以除去小分子(包括DMAP)和未綴合的PS和蛋白?；诜磻?yīng)組分的不同分子大小，首先洗脫出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎鏈球菌溶血素或PS-DT綴合物，之后洗脫出游離PS,然后洗脫出游離PD或游離DT，最后洗脫出DMAP和其它鹽(NaCl、甘氨酸)。含有綴合物的級(jí)分通過(guò)UV28。nm檢測(cè)。按照級(jí)分的Kd將其合并，除菌過(guò)濾(0.22pm),并儲(chǔ)存于+2-8。C。測(cè)定綴合制備物中的PS/蛋白比率。PS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/PW綴合物的特異性活化/偶聯(lián)/猝滅條件其中出現(xiàn)在行標(biāo)題中的"fifluid"表示糖在綴合前通過(guò)微流化調(diào)整尺寸。微流化后的糖的尺寸在表2中給出。表lPS肺炎鏈球菌-D蛋白/TT/DT/PhtD/Plv綴合物的特異性活化/<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>備注pHa、c、q分別對(duì)應(yīng)于活化pH、偶聯(lián)pH和猝滅pH。鑒定對(duì)每一綴合物進(jìn)行鑒定，它們都符合表2中描述的標(biāo)準(zhǔn)。用Resorcinol檢測(cè)法檢測(cè)多糖含量((iig/inl),用Lowry檢測(cè)法檢測(cè)蛋白含量Og/ml)。用濃度比值測(cè)定最終的PS/PD比值(重量/重量)。游離多糖含量(％):將綴合物與a-載體蛋白抗體和飽和硫酸銨溫育，之后離心，得到上清液，在該上清液中測(cè)定保持于4。C或在37。C儲(chǔ)存7天時(shí)綴合物的游離多糖含量。用a-PS/a-PSELISA對(duì)上清液中的游離多糖定量。也通過(guò)a-載體蛋白/a-PSELISA控制綴合物的不存在?？乖杂脢A心型ELISA分析同一綴合物的抗原性，其中抗體的捕獲和檢測(cè)分別為a-PS和a-蛋白。游離蛋白含量(％):未綴合的載體蛋白可在純化步驟中從綴合物分離。游離的殘余蛋白的含量使用尺寸排阻層析(TSK5000-PWXL)繼之以UV檢測(cè)(214nm)來(lái)測(cè)定。洗脫條件可分離游離載體蛋白和綴合物。然后對(duì)比校準(zhǔn)曲線(xiàn)(0-50jug/ml載體蛋白)測(cè)定綴合物原液中的游離蛋白含量。游離載體蛋白(％)如下獲得％游離載體-(游離載體(iug/ml)/(通過(guò)Lowry法檢測(cè)的相應(yīng)載體蛋白的總濃度(嗎/1111)*100%)。穩(wěn)定性對(duì)于保持于4。C和于37°C儲(chǔ)存7天的綴合物，用HPLC-SEC凝膠過(guò)濾CTSK5000-PWXL)檢測(cè)分子量分布(Kav)和穩(wěn)定性。10/11/13/14價(jià)特征在表2中給出(參見(jiàn)其下的注釋)。蛋白綴合物可吸附到磷酸鋁上，并合并，以形成最終疫苗。結(jié)論已生產(chǎn)出免疫原性綴合物，隨后已表明其為有前景的疫苗的組表2-綴合物的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>天然PS微流化后的PS大小通過(guò)混合血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F綴合物(例如以每份人用劑量分別含l、3、1、1、1、1、1、3、3、l貼糖的劑量)制備10價(jià)疫苗。通過(guò)又加入表5的血清型3綴合物(例如以每份人用劑量含1pg糖)制備11價(jià)疫苗。通過(guò)又加入以上的血清型19A和22F綴合物(22F直接連接至PhtD，或者通過(guò)ADH接頭連接)[例如以每份人用劑量各含3叫糖的劑量]制備13價(jià)疫苗。可以通過(guò)又加入以上的血清型6A綴合物[例如以每份人用劑量含1)iig糖的劑量]制備14價(jià)疫苗。實(shí)施例3:在本發(fā)明的免疫原性組合物中包含流感嗜血桿菌D蛋白可提供抵御急性中耳炎(AOM)的改善的保護(hù)作用的證據(jù)研究設(shè)計(jì)研究使用11Pn-PD疫苗，其含有血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F，每種血清型均綴合流感嗜血桿菌的D蛋白(參閱實(shí)施例4中的表5)。將受試者隨機(jī)分為2組，以在約3、4、5和12-15月齡時(shí)接受4劑11Pn-PD疫苗或//aw/;c。所有受試者都在3、4和5月齡時(shí)伴隨接受GSK生物制品公司的/w/aw/jc-/je;c<3(DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。/"/a"h;c-/2ejca是在給藥前混合的尸e^7hx和Hib的組合。在給予第3劑疫苗后2周開(kāi)始"依照方案"的隨訪(fǎng)效力分析，并持續(xù)至24-27月齡。在選定的受試者亞組中評(píng)價(jià)肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況。如果孩子生病、耳痛、鼓膜自發(fā)穿孔或自發(fā)耳溢液，則建議孩子的雙親咨詢(xún)研究者。如果研究者懷疑AOM事件，則立即將孩子轉(zhuǎn)移至耳鼻喉(ENT)專(zhuān)業(yè)醫(yī)師處證實(shí)診斷結(jié)果。AOM的臨床診斷基于目測(cè)鼓膜外觀(即發(fā)紅、膨脹、失去光反射)或存在中耳液體滲出(通過(guò)簡(jiǎn)易耳鏡或氣式耳鏡或通過(guò)顯微鏡證實(shí))。另外，必須存在以下跡象或癥狀中的至少兩種耳痛、耳溢液、聽(tīng)力喪失、發(fā)燒、嗜睡、過(guò)敏、食欲不振、嘔吐或腹瀉。如果ENT專(zhuān)業(yè)醫(yī)師證實(shí)臨床診斷結(jié)果，則通過(guò)鼓膜穿刺術(shù)收集中耳液的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。對(duì)于因復(fù)發(fā)疾病就診的受試者，如果自先前的事件開(kāi)始以后已過(guò)去了30天以上，則認(rèn)為新的AOM事件已開(kāi)始。另外，如果所分離的細(xì)菌/血清型不同于先前的分離林，則AOM事件^皮認(rèn)為是新細(xì)菌事件，無(wú)論兩個(gè)連續(xù)事件之間的間隔是多少。試驗(yàn)結(jié)果招募了總共4968名嬰兒，11Pn-PD組中2489名，對(duì)照組中2479名。兩組之間的人口統(tǒng)計(jì)特征或危險(xiǎn)因素沒(méi)有顯著差異。臨床事件和AOM病例定義在每個(gè)依照方案的隨訪(fǎng)期當(dāng)中，在11Pn-PD組中記錄到總共333件臨床AOM事件，在對(duì)照組中記錄到499件。表3提供了11Pn-PD疫苗和先前在芬蘭測(cè)試的兩種7價(jià)疫苗(Eskola等，NEnglJMed2001;344:403-409和Kilpi等，ClinInfectDis200337:1155-64)抗任何AOM事件和由不同肺炎鏈球菌血清型、流感嗜血桿菌、A/T州和莫拉卡他菌(Mcator/2afe)所致的AOM的保護(hù)效力。采用11Pn-PD，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性和臨床相關(guān)性降低至整體AOM疾病負(fù)荷的33.6%,與病因無(wú)關(guān)(表3)。由于11Pn-PD疫苗中包含的11種肺炎鏈^^菌血清型中的任一種的抗AOM事件的整體效力為57.6%(表3)。該研究的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是由11Pn-PD疫苗提供的抗流感嗜血桿菌所致AOM的35.6%的保護(hù)作用(具體地說(shuō)由NTHi提供35.3%的保護(hù)作用)。該發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，其指出了在肺炎鏈球菌綴合物接種時(shí)代中流感嗜血桿菌作為AOM主因的重要性增加。與所提供的抗AOM保護(hù)作用相一致，11Pn-PD疫苗也降低了在生命的第2年在加強(qiáng)劑量后的流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況。這些發(fā)現(xiàn)與先前在芬蘭的觀察結(jié)果相反，在芬蘭，對(duì)于兩種7價(jià)肺炎鏈球菌綴合疫苗，觀察到歸因于流感嗜血桿菌的AOM事件增加，(Eskola等和Kilpi等)，作為病因取代的證明。在歸因于Hi的抗AOM事件的保護(hù)作用與抗載體蛋白D的抗體水平之間不能建立清晰關(guān)聯(lián)，因?yàn)樵谌员３譄o(wú)HiAOM事件的11Pn-PD接種者中的初免后抗PDIgG抗體濃度與在效力隨訪(fǎng)期當(dāng)中發(fā)生至少一種HiAOM事件的llPn-PD接種者中檢測(cè)的初免后抗PDIgG抗體水平基本相同。然而，盡管在疫苗的生物學(xué)影響和初免后IgG抗PD免疫原性之間不能建立關(guān)聯(lián)，但可以合理地假定在流感嗜血桿菌菌林之間高度保守的PD載體蛋白較大程度地有助于誘導(dǎo)抗Hi的保護(hù)作用。對(duì)AOM疾病的作用伴隨著對(duì)鼻咽攜帶的作用，后一作用對(duì)于疫苗血清型肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌具有相似的效果(圖1)。在PD綴合物接種者中流感嗜血桿菌的鼻咽攜帶情況的下降支持以下假設(shè)PD綴合疫苗具有抗流感嗜血桿菌的直接保護(hù)作用，即便通過(guò)ELISA檢測(cè)不能關(guān)聯(lián)保護(hù)效力與抗PDIgG免疫應(yīng)答。在以下的試驗(yàn)中，使用灰鼠中耳炎模型和用該實(shí)施例的11價(jià)制劑或?qū)嵤├?的IO價(jià)疫苗(另參見(jiàn)表1和2以及其下的備注)免疫的嬰兒的血清合并液。相對(duì)于免疫前血清合并液，兩種合并液誘導(dǎo)的患有中耳炎的動(dòng)物百分率均顯著降低。在10價(jià)和11價(jià)免疫合并液之間沒(méi)有顯著差異。這表明兩種疫苗在該;漠型中誘導(dǎo)抗非分型流感嗜血桿菌所致中耳炎的保護(hù)作用的潛力相似。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>NP=未公開(kāi)；N=在ATP療效組(e伍cacycohort)中的受試者數(shù)目；n-事件數(shù)目*疫苗肺炎鏈球菌血清型對(duì)于1lPn-PD=11種血清型，對(duì)于Prevnar和7v-0MP=7種血清型MEF=中耳液體實(shí)施例4:用于血清型19F的栽體蛋白的選擇使用的ELISA測(cè)定22F抑制ELISA方法基本上基于Conc印cion和Frasch在2001年所提出的測(cè)定，并由Henckaerts等，2006,ClinicalandVaccineImmunology13:356-360報(bào)道。簡(jiǎn)而言之，純化的肺炎鏈球菌多糖與甲基化人血清白蛋白混合，并于4。C過(guò)夜吸附到NuncMaxisorpTM(Roskilde,DK)高結(jié)合微量滴定板。該板用10。/。胎牛血清(FBS)的PBS溶液在攪拌下于室溫封閉1小時(shí)。血清樣品用含10%FBS、10嗎/mL細(xì)胞壁多糖(SSI)和2|ig/mL肺炎鏈球菌多糖血清型22F(ATCC)的PBS稀釋?zhuān)⒃谖⒘康味ò迳嫌孟嗤彌_液進(jìn)一步稀釋。以相同方式處理內(nèi)標(biāo)并加入每塊板，在89-SF中使用各濃度的血清型特異性IgG對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)血清89-SF校準(zhǔn)所述內(nèi)標(biāo)。在洗滌后，使用綴合過(guò)氧化物酶的抗人IgG單克隆抗體(StratechScientificLtd.,Soham,UK)檢測(cè)結(jié)合抗體，所述單克隆抗體用10。/。FBS(在PBS中)稀釋?zhuān)⒃跀嚢柘掠谑覝販赜?小時(shí)。使用現(xiàn)成的單組分四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶免疫測(cè)定底物試劑盒(BioRad,Hercules,CA，US)在暗室中于室溫顯色。用0.18MHbS04終止反應(yīng)，于450nm讀取光密度。通過(guò)對(duì)照內(nèi)標(biāo)血清曲線(xiàn)的限定限度內(nèi)的光密度點(diǎn)計(jì)算樣品中血清型特異性IgG濃度(ing/mL),該內(nèi)標(biāo)血清曲線(xiàn)通過(guò)用SoftMaxPro(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)軟件計(jì)算的4參數(shù)邏輯斯蒂對(duì)數(shù)方程建立。在考慮檢測(cè)限度和定量限度的情況下，對(duì)所有血清型的ELSIA截取值都為0.05pg/mLIgG。調(diào)理吞噬測(cè)定在2003年6月的WHO磋商會(huì)上，推薦使用如Romero-Steiner等，ClinDiagnLabImmunol200310(6):1019-1024頁(yè)陳述的OPA測(cè)定。該方案用于在以下測(cè)試中檢驗(yàn)血清型的OPA活性。綴合物的制備在研究llPn-PD&Di-001和11Pn國(guó)PD&Di畫(huà)007中,包括3種11價(jià)疫苗制劑(表4),該研究中3ng的19F多糖綴合白喉類(lèi)毒素(19F-DT)，而不是1嗎多糖綴合D蛋白(19F-PD)。用于研究11Pn-PD、11Pn-PD&Di-001和11Pn-PD&Di-007的綴合參數(shù)分別公開(kāi)于表5、6和7。在用這些19F-DT制劑初免后1個(gè)月的抗肺炎鏈球菌抗體應(yīng)答和抗血清型19F的OPA活性分別示于表8和9。表10顯示了22F-ELISA抗體濃度和在23價(jià)普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后達(dá)到0.2pg/mL閾值的受試者的百分率。已表明用這些19F-DT制劑誘導(dǎo)的抗體的調(diào)理吞噬活性;波明顯改善，這由初免接種后1個(gè)月時(shí)較高的血清陽(yáng)性率(調(diào)理吞噬效價(jià)>1:8)和OPAGMT得以證實(shí)(表9)。在23價(jià)普通多糖加強(qiáng)接種之后1個(gè)月，19F抗體的調(diào)理吞噬活性仍顯著好于用19F-DT制劑初免的兒童(表11)。表12提供了與連續(xù)第4劑尸"wa^)相比較，在預(yù)先用19F-DT或19F-PD綴合物初免的學(xué)步兒童中的11Pn-PD加強(qiáng)劑量之后的免疫原性數(shù)據(jù)。盡管已知在美國(guó)引入/Vew2a/^)后所報(bào)告的成就，在綴合DT載體蛋白時(shí)抗血清型19F的改善的調(diào)理吞噬活性可能對(duì)候選疫苗有利。表13提供了19F-DT綴合物對(duì)于交叉反應(yīng)性血清型19A的ELISA和OPA數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)19F-DT誘導(dǎo)抗19A的低但顯著的OPA活性。表4在臨床研究中使用的肺炎鏈球菌綴合疫苗制劑制劑肺炎鏈球菌血清型嗎/載體蛋白Al3+mg13456B7F9V1418C19F23F11Pn-PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD1/PD<0.819F-DT制劑13/PD3/PD3/PD3/PD10/DT3/PD3/PD3/PD3/PD3/DT5/DT《0.3519F-DT3/PD2/PD2/PD3/PD5/DT3/PD2/PD2/PD2/PD3/DT5/DT《0.3574<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>表7用于11Pn-PD&Di-007研究的PS肺炎鏈球菌D蛋白/DT綴合物的特異性活^/偶聯(lián)/猝滅條件<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>表8在1照19F陽(yáng)PD、3ng19F-DT或iVevwfl/"(2照19F陽(yáng)CRM)初免接種后1個(gè)月19F抗體濃度>0.20fig/inL的受試者百分率和19F抗體幾何平均抗體濃度(95%CI下的GMC;嗎/mL)(總組)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>'在表4中提供不同制劑的組合物。表9在用1將19F-PD、3照19F-DT或(2嗎19F-CRM)初免接種后1個(gè)月19FOPA效價(jià)>1:8的受試者百分率和19FOPAGMT(總組)<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>在表4中提供不同制劑的組合物(表10在用1將19F畫(huà)PD、3嗎19F誦DT或iVev聰r(2嗎19F畫(huà)CRM)初免接種的兒童中于23價(jià)普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后1個(gè)月19F抗體濃度>0.20嗎/ml的受試者百分率和19F抗體GMC0ig/ml)(總組)<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>'在表4中提供不同制劑的組合物。表11在用1嗎19F誦PD、3將19F-DT或/Vev"flr(2嗎19F-CRM)初免接種的兒童中于23價(jià)普通多糖加強(qiáng)接種之前和之后1個(gè)月19FOPA效價(jià)>1:8的受試者百分率和19FOPAGMT(總組)初免組別llPn-PD&Di-002在加強(qiáng)接種之前在23價(jià)PS加強(qiáng)接種后1個(gè)月N%》1:8(95%CI)GMT(95%CI)N8(95%CI)GMT(95%CI)11Pn-PD2927,6(12.7-47.2)10.9(5.0-23.7)2882.1(63.1-93.9)408.0(157.3-1058.3)19F-DT制劑lr1947.4(24.4-71.1)18.1(7.2-45.7)1894.4(72.7-99.9)1063.8(386.6"2927.5)19F-DT制劑2r2733.3(16.5-54.0)8.5(4.7-15.3)28100(87.7-100)957.6(552.8-1659.0)2412.5(2.7-32.4)8.1(3.4-19.6)2382.6(61.2-95.0)380.9(133.2-1089.5)'在表4中提供不同制劑的組合物。表12在用1照19F-PD、3|ng19F-DT或iVwflr(2嗎19F-CRM)初免接種的兒童中于llPn-PD或Prevnar加強(qiáng)接種后1個(gè)月抗體濃度>0，2|ag/mL、OPA>l:8的受試者百分率和抗19F肺炎鏈球菌的GMC/GMT(總組)初免組別llPn-PD&Di-00222F-ELISA測(cè)定OPA測(cè)定N%》0.20|Hg/inLi(95%CI)GMC(嗎/ml)(95%CI)N8(95%CI)GMT(95%CI)1lPn-PD70100(94.9-100)4.52(3.7-5.5)21100(83.9-100)255.6(135.5-481.9)19F-DT制劑lr6698.5(91.8-100)3.45(2.8-4.3)2395.7(78.1-99.9)374.0(192.6-726.2)19F-DT制劑2r7098.6(92.3-100)3.80(2.9-4.9)2996.6(82.2-99.9)249.1(144.7-428.7)6997.1(89.9-99.6)2.56(2.0-3.3)3196.8(83.3-99.9)528.7(319.4-875.2)'在表4中提供不同制劑的組合物。80表13在用1叫19F-PD、3將19F-DT或尸r^v"ar(2|ng19F-CRM)初免接種后1個(gè)月抗體濃度>0.2pg/mL、OPA^1:8的受試者百分率和抗19A肺炎鏈球菌的GMC/GMT(總組)<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>'在表4中提供不同制劑的組合物。實(shí)施例5:具有不同0-乙酖化水平的多糖對(duì)抗-PS18C抗體的抑制1.引言開(kāi)發(fā)肺炎鏈球菌莢膜型特異性抗體(抗-PnPS抗體)抑制測(cè)定，以比較天然形式或綴合處理后的肺炎鏈球菌莢膜多糖(PS)表位。除了表征本發(fā)明人的綴合物以夕卜，這些測(cè)試還用于研究在Prevnar18C(-CRM)綴合物中存在的O-乙酰化水平。本文報(bào)告的實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是在這些測(cè)定中比較天然多糖18C批次和在PS上存在不同水平O-乙?；钠渌?8CPS。已應(yīng)用了抗-SP1008(實(shí)施例3)、18C-TT(實(shí)施例2)、18C-DT和Prevnar血清。2.材fl"和方法多糖PS18Cox007:17%O-乙?；?通過(guò)NMR)-按照在WO96/O5859的實(shí)施例4(通過(guò)乙酸水解)中描述的方法產(chǎn)生，之后用高碘酸鹽氧化PS18Cox011:79%O-乙?；?通過(guò)NMR)-由微流化的PS產(chǎn)生，之后用過(guò)氧化氬溫和水解，并用高碘酸鹽氧化血清通過(guò)合并用SP1008(11Pn-PD)或用Prevnar免疫的研究11PnPD&Di007的嬰兒的血清，獲得型特異性抗體。由用SP1008、Prevnar或含有PS18-DTah或PS18-TTah(AH=具有ADH接頭)綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的動(dòng)物獲得小鼠和豚鼠混合血清。友逢ELISA:'用天然18CPS包被微量培養(yǎng)板。*通過(guò)與79%O-乙?；蛎?O-乙?；腜S的連續(xù)2倍稀釋液預(yù)溫育抑制抗-PnPS18C抗體，然后加入包被的微量培養(yǎng)板。然后按照通常的抗-PSElisa測(cè)定程序處理平板。計(jì)算抗-PnPS血清的抑制百分率(受抑制的對(duì)未受抑制的)，并將該百分率對(duì)抑制劑濃度作圖。調(diào)理吞噬稀釋抗-PnPS18C抗體，以在經(jīng)典調(diào)理吞噬測(cè)定中獲得對(duì)肺炎鏈球菌18C菌抹的95-100%的殺傷作用，所述抗體通過(guò)與79%O-乙酰化或脫-O-乙?；腜S的連續(xù)2倍稀釋液預(yù)溫育而受抑制，并引入到調(diào)理吞噬反應(yīng)混合物中。*隨后，按照慣例實(shí)施對(duì)肺炎鏈球菌的調(diào)理吞噬測(cè)試。計(jì)算抗-PnPS血清的抑制百分率(受抑制的對(duì)未受抑制的)，并將該百分率對(duì)抑制劑濃度作圖。3.結(jié)果為了確定0-乙?；綄?duì)18CPS的重要性，實(shí)施抑制ELISA和調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)。通過(guò)乙酸水解和高碘酸鹽氧化獲得低O-乙?；?8CPS。在抑制ELISA和OPA中測(cè)試的兩種PS為PS18C007=17%O乙?；鳳S18C011=79%0乙?；?.1小鼠ELISA和調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)國(guó)得自用SP1008或Prevnar免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制(圖1)。畫(huà)得自用SP1008或含有PS18畫(huà)DTah或PS18畫(huà)TTah綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的小鼠的混合血清的ELISA抑制(圖2)。ELISA使用O-乙?；?天然"PS作為包被抗原，并使用增加濃度的PSOAc(01l)或脫-OAcPS(007)作為抑制劑。引人注目的是，抗-Prevnar抗體被79%0-乙?；蛎?OAc的PS18C等同抑制，而與此相反，79%O-乙?；腜S18C比脫-Oac的PS18C更易于抑制抗-18C-PD、抗-18C-TTah和抗-18C-DTah血清。這提示用PS18C-PD綴合物免疫的小鼠產(chǎn)生的抗體與PS的0-乙?；砦缓凸羌鼙砦环磻?yīng)。如果該綴合物的18CPS是高度O-乙酰化的并且Balb\c'j、鼠B-細(xì)胞庫(kù)與0-乙?；砦环磻?yīng)的傾向性，該發(fā)現(xiàn)是有意義的。盡管存在這種偏好性，但用Prewar免疫的小鼠幾乎不產(chǎn)生與O-乙?；砦环磻?yīng)的抗體(79%O-乙?；暮兔?O-乙?；腜S類(lèi)似地抑制抗-Prevnar抗體與天然PS的結(jié)合)，這強(qiáng)有力地提示，PrevnarPS18C(-CRM)是非O-乙?；幕虻蚈-乙?；摹?得自用SP1008或含PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的小鼠的混合血清的調(diào)理吞噬抑制(圖3)。在OPA測(cè)定中，用高度0-乙?；亩嗵且灿^察到對(duì)所述抗體介導(dǎo)的殺傷作用的較高抑制作用。不過(guò)，在調(diào)理吞噬測(cè)定中使用的菌林的O-乙?；渴俏粗?。3.2豚鼠ELISA和調(diào)理吞噬實(shí)驗(yàn)-得自用SP1008或Prevnar免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制(圖4)。-得自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的豚鼠的混合血清的ELISA抑制(圖5)。-得自用SP1008或含有PS18-DTah或PS18-TTah綴合物的實(shí)驗(yàn)制劑免疫的豚鼠的混合血清的調(diào)理吞噬抑制(圖6)。在豚鼠中，在抑制ELISA或在OPA中沒(méi)有觀察到明顯差異，提示豚鼠產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)多糖18C的骨架表位，不受該抗原的O-乙酰基含量影響。3.3人血清實(shí)驗(yàn)得自用SP1008或Prevnar免疫的11PnPD&Di007嬰兒的混合血清的抑制(圖7)。如用小鼠抗血清所觀察到的，用79%0-乙酰化的PS觀察到嬰兒抗-18C-PD抗體的更強(qiáng)的抑制作用。用于產(chǎn)生SP1008綴合物的18CPS是高度O-乙酰化的(超過(guò)90%)。這表明，嬰兒不但針對(duì)18CPS的骨架表位產(chǎn)生抗體，而且針對(duì)18CPS的O-乙?；砦划a(chǎn)生抗體。抗-prevnar(18C-CRM)血清受到79%O-乙?；腜S和脫-O-乙酰化的PS的類(lèi)似抑制的觀察結(jié)果表明，抗-Prevnar抗體幾乎僅與骨架PS表位反應(yīng)。該結(jié)果連同小鼠血清觀察結(jié)果一起表明，在Prevnar18C-CRM綴合物中的18CPS是非0-乙?；?，或者O-乙?；浅５偷?。-4.—.過(guò)i金*在ELISA和調(diào)理吞噬這兩個(gè)測(cè)定中，具有79%O-乙?；腜S18C表現(xiàn)出比僅有17%O-乙酰基的PS18C更好地將小鼠和嬰兒抗體84中和至11Pn-PD(SP1008)抗體的能力。*具有79%O-乙?；?7%O-乙?；腜S18C均顯示出相同的中和Prevnar血清的能力。.這提示，相比于GSK18C綴合疫苗，Prevnar疫苗的PS18C的0-乙酰化非常低或未0-乙?；?使免疫應(yīng)答集中針對(duì)骨架表位可能有益于激發(fā)針對(duì)高度0-乙?；暮偷投萇-乙?；倪@兩種18C菌抹的抗體應(yīng)答。權(quán)利要求1.一種肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含9種以上、10種以上、11種以上或13種以上綴合載體蛋白的不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜糖，其中所述組合物包含的綴合莢膜糖18C的O-乙?；潭鹊陀?0％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％。2.權(quán)利要求1的免疫原性組合物，其中所述綴合莢膜糖18C沒(méi)有綴合肺炎球菌溶血素。3.權(quán)利要求1或2的免疫原性組合物，其中所述綴合莢膜糖18C沒(méi)有綴合CRM197。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述綴合莢膜糖18C沒(méi)有用還原胺化化學(xué)法綴合。5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述綴合莢膜糖18C用還原胺化化學(xué)法綴合。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖18C在其綴合前通過(guò)酸處理脫-O-乙酰化。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖18C綴合TT，任選地，其中18C是唯一綴合TT的肺炎鏈球菌莢膜糖。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜糖綴合2種以上的不同栽體蛋白。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中18C莢膜糖直接綴合所述載體蛋白。10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中18C莢膜糖經(jīng)接頭與所述載體蛋白綴合。11.權(quán)利要求10的免疫原性組合物，其中所迷接頭為雙功能的。12.權(quán)利要求10或11的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中通過(guò)石灰二亞胺化學(xué)法使所述接頭與所述載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。14.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述載體蛋白與所述接頭綴合前使所述糖與所述接頭綴合。15.權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在糖與4妻頭綴合前使載體蛋白與接頭綴合。16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)法使所述18C糖與所述載體蛋白或接頭綴合。17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用還原胺化使所述18C糖與所述載體蛋白或接頭綴合。18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中載體蛋白對(duì)18C糖的比率在1:5-5:1(重量/重量)之間、1:1-4:1(重量/重量)之間、1.5:1-3:1(重量/重量)之間或2:1-2.5:1(重量/重量)之間。19.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述18C糖的Mw高于20x103，任選地低于5x105。20.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述18C糖的Mw在20xl()3-100xl03之間。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述18C糖或者為天然多糖，或者調(diào)整過(guò)尺寸。22.權(quán)利要求21的免疫原性組合物，其中所述18C糖已通過(guò)微流化調(diào)整尺寸。23.權(quán)利要求21的免疫原性組合物，其中所述18C糖已通過(guò)酸水解調(diào)整尺寸。24.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中18C糖綴合物的劑量在1-10貼、1-5蹄或1-3蹄糖之間。25.權(quán)利要求24的免疫原性組合物，其中所述18C糖綴合物的劑量為3jxg凈唐。26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物還包含任選地作為肺炎鏈球菌莢膜糖的載體蛋白的流感嗜血桿菌(//aemop/H'/i^/wy/wewzae)的D蛋白。27.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的肺炎鏈球菌免疫原性組合物，其中所述疫苗包含綴合白喉類(lèi)毒素(DT)或CRM197的血清型19F莢膜糖，任選地，其中19F是組合物中唯一綴合白喉類(lèi)毒素(DT)或CRM197的糖。28.權(quán)利要求27的免疫原性組合物，其中血清型19F莢膜糖與白喉類(lèi)毒素綴合。29.權(quán)利要求27或28的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖與所述載體蛋白直接綴合。30.權(quán)利要求27或28的免疫原性組合物，其中19F莢膜糖經(jīng)接頭與所述載體蛋白綴合。31.權(quán)利要求30的免疫原性組合物，其中所述接頭為雙功能的。32.權(quán)利要求30或31的免疫原性組合物，其中所述4^頭為ADH。33.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中通過(guò)石友二亞胺化學(xué)法使所述接頭與所述載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。34.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述載體蛋白與所述接頭綴合前使所述糖與所述接頭綴合。35.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述糖與所述接頭綴合前使所述載體蛋白與所述接頭綴合。36.權(quán)利要求27-35中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)法使所述19F糖與所述載體蛋白或所述接頭綴合。37.權(quán)利要求27-36中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中載體蛋白對(duì)19F糖的比率在1.4:1-1.5:1(重量/重量)之間。38.權(quán)利要求27-37中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述19F糖的Mw高于100x103，并任選地低于5xl05。39.權(quán)利要求38的免疫原性組合物，其中所述19F糖的Mw在125xl()3畫(huà)150xl03之間。40.權(quán)利要求27-39中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述19F糖或者為天然多糖，或者以不超過(guò)x5的因數(shù)調(diào)整過(guò)尺寸。41.權(quán)利要求27-40中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述19F糖已通過(guò)微流化調(diào)整尺寸。42.權(quán)利要求27-41中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述19F糖綴合物的劑量在1-10嗎、1-5略或1-3昭糖之間。43.權(quán)利要求27-42中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述19F莢膜糖的N-乙?；潭瘸^(guò)50。/Q、60%、70%、80%或90%。44.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少8種莢膜糖綴合相同的載體蛋白。45.權(quán)利要求44的免疫原性組合物，其中所述相同的載體蛋白不是白喉類(lèi)毒素和/或不是破傷風(fēng)類(lèi)毒素。46.權(quán)利要求44或45的免疫原性組合物，其中所述相同的載體蛋白為流感嗜血桿菌(//.,"y/wewzae)D蛋白。47.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有2種不同的載體蛋白。48.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有3、4或5種不同的載體蛋白。49.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含選自以下的一種或多種或全部載體蛋白DT、CRM197、TT、片段C、dPly、PhtA、PhyB、PhtD、PhtE、PhtDE、OmpC、PsaA、PspC、CbpA、PorB和流感嗜血桿菌D蛋白。50.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含作為載體蛋白的DT或CRM197。51.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含作為載體蛋白的TT。52.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含作為載體蛋白的PD。53.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含肺炎球菌溶血素作為載體蛋白，或作為游離蛋白。54.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述組合物包含PhtA、PhtB、PhtD、PhtE或PhtDE作為載體蛋白，或作為游離蛋白。55.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖作為綴合莢膜糖存在。56.權(quán)利要求55的免疫原性組合物，其中血清型4莢膜糖的N-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。57.權(quán)利要求55或56的免疫原性組合物，其中血清型9V莢膜糖的N-乙酰化程度超過(guò)50。/0、60%、70%、80%、90%,和/或0-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%。58.權(quán)利要求55-57中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中血清型14莢膜糖的N-乙酰化程度超過(guò)50。/。、60%、70%、80%、90%。59.權(quán)利要求55-58中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有作為綴合莢膜糖的血清型1莢膜糖。60.權(quán)利要求59的免疫原性組合物，其中血清型1莢膜糖的N-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。61.權(quán)利要求59或60的免疫原性組合物，其中血清型1莢膜糖的0-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。62.權(quán)利要求55-61中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有作為綴合莢膜糖的血清型5莢膜糖。63.權(quán)利要求62的免疫原性組合物，其中血清型5莢膜糖的N-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70o/o、80%、90%。64.權(quán)利要求55-63中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有作為綴合莢膜糖的血清型7F莢膜糖。65.權(quán)利要求64的免疫原性組合物，其中血清型7F莢膜糖的N-乙?；潭瘸^(guò)50%、60%、70%、80%、90%，和/或0-乙酰化程度超過(guò)50%、60%、70%、80%、90%。66.權(quán)利要求55-65中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中血清型1、4、5、6B、7F、9V、14和23F的莢膜糖全部綴合D蛋白。67.權(quán)利要求55或66的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有作為綴合糖存在的血清型3莢膜糖。68.權(quán)利要求67的免疫原性組合物，其中血清型3莢膜糖綴合D蛋白。69.權(quán)利要求55-68中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型6A和/或15B的綴合莢膜糖。70.權(quán)利要求55-69中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型19A的綴合莢膜糖。71.權(quán)利要求55-70中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型22F的綴合莢膜糖。72.權(quán)利要求55-71中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型8的綴合莢膜糖。73.權(quán)利要求55-72中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有血清型12F的綴合莢膜糖。74.權(quán)利要求55-73中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少一種莢膜糖與栽體蛋白直接綴合。75.權(quán)利要求55-74中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中至少一種芙膜糖經(jīng)接頭與所述載體蛋白綴合。76.權(quán)利要求75的免疫原性組合物，其中所述接頭為雙功能的。77.權(quán)利要求75或76的免疫原性組合物，其中所述接頭為ADH。78.權(quán)利要求75-77中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中通過(guò)石友二亞胺化學(xué)法使所述4妄頭與載體蛋白連接，優(yōu)選使用EDAC。79.權(quán)利要求75-78中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述載體蛋白與所述接頭綴合前使所述糖與所述"l矣頭綴合。80.權(quán)利要求75-78中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中在所述糖與所述接頭綴合前使所述載體蛋白與所述接頭綴合。81.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用CDAP化學(xué)法使至少一種莢膜糖與所述載體蛋白和/或接頭綴合。82.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中使用還原胺化使至少一種莢膜糖與所述載體蛋白和/或接頭綴合。83.權(quán)利要求82的免疫原性組合物，其中使用還原胺化使莢膜糖3與所述載體蛋白和/或接頭綴合。84.權(quán)利要求82或83的免疫原性組合物，其中使用還原胺化使莢膜糖1與所述載體蛋白和/或接頭綴合。85.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中載體蛋白對(duì)糖的比率在1:2-2.5:1(重量/重量)之間。86.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述糖的Mw高于50x103，任選地低于lx106。87.權(quán)利要求86的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于30(^103-400><103之間的血清型1莢膜糖。88.權(quán)利要求86或87的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于75xlO、125xl()S之間的血清型4莢膜糖。89.權(quán)利要求86-88中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于350xl0、450xl(^之間的血清型5莢膜糖。90.權(quán)利要求86-89中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于1000><103-140(^103之間的血清型6B莢膜糖。91.權(quán)利要求86-90中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于200><103-30(^103之間的血清型7F莢膜糖。92.權(quán)利要求86-91中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于250><103-300><103之間的血清型9V莢膜糖。93.權(quán)利要求86-92中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于20(^103-250><103之間的血清型14莢膜糖。94.權(quán)利要求86-93中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有Mw介于900xl0、1000xl(^之間的血清型23F莢膜糖。95.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有作為天然莢膜糖綴合物的血清型5、6B和23F。96.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述莢膜糖綴合物的劑量在1-10昭糖/綴合物、1-5嗎糖/綴合物或1-3昭糖/綴合物之間。97.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物以3昭糖/綴合物的劑量含有血清型4、18C和19F的莢膜糖綴合物。98.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物以1昭糖/綴合物的劑量含有血清型1、5、6B、7F、9V、14和23F的綴合物。99.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有未綴合的肺炎鏈球菌糖，該糖的血清型不同于那些已綴合的糖的血清型，以使已綴合的和未綴合的糖血清型的數(shù)目低于或等于23。100.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有一種或多種未綴合的或綴合的肺炎鏈球菌蛋白。101.權(quán)利要求100的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有一種或多種未綴合的肺炎鏈球菌蛋白。102.權(quán)利要求100或101的免疫原性組合物，其中所述一種或多種肺炎鏈球菌蛋白選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白、解毒肺炎鏈球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、Spl01、Spl30、Spl25和Sp133。103.權(quán)利要求100-102中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有肺炎鏈球菌溶血素。104.權(quán)利要求101-103中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有PhtX蛋白。105.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有作為游離蛋白或載體蛋白的肺炎鏈球菌溶血素(例如用于肺炎鏈球菌莢膜糖)。106.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有作為游離蛋白或載體蛋白的PhtX蛋白(例如用于肺炎鏈球菌莢膜糖)。107.權(quán)利要求106的免疫原性組合物，其中所述PhtX蛋白為PhtD或PhtBD或PhtDE融合蛋白。108.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物還含有佐劑。109.權(quán)利要求108的免疫原性組合物，其中所述佐劑為T(mén)hl應(yīng)答的優(yōu)先誘導(dǎo)物。110.權(quán)利要求108或109的免疫原性組合物，其中所述佐劑包括選自QS21、MPL⑧或免疫刺激性寡核香酸的一種或多種組分。111.權(quán)利要求108-110中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，其中所述佐劑包括QS21和MPL。112.權(quán)利要求111的免疫原性組合物，其中所述佐劑為脂質(zhì)體制劑。113.權(quán)利要求111的免疫原性組合物，其中所述佐劑為水包油制劑。114.一種疫苗試劑盒，所述疫苗試劑盒含有權(quán)利要求1-107中任一項(xiàng)的免疫原性組合物，并還含有用于伴隨或序貫給藥的如在權(quán)利要求109-113中任一項(xiàng)中定義的佐劑。115.—種疫苗，所述疫苗含有權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑。116.—種用于制備權(quán)利要求115的疫苗的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合的步驟。117.—種免疫人類(lèi)宿主以抵雄卩肺炎鏈^求菌感染所致疾病的方法，所述方法包括給予宿主免疫保護(hù)劑量的權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或權(quán)利要求115的疫苗。118.用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌感染所致疾病的權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或權(quán)利要求115的疫苗。119.權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或權(quán)利要求115的疫苗在制備用于治療或預(yù)防肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途。120.權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或權(quán)利要求115的疫苗在制備用于治療或預(yù)防O-乙?；逍?8C菌林和脫-O-乙?；逍?8C菌林的肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途。121.權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或權(quán)利要求115的疫苗在制備用于治療或預(yù)防血清型19A菌抹的肺炎鏈球菌感染所致疾病的藥物中的用途，所述免疫原性組合物或疫苗含有血清型19F的莢膜糖綴合物，但不含血清型19A莢膜糖。122.—種在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括序貫或伴隨給予作為單獨(dú)組分或聯(lián)合組分的(i)權(quán)利要求1-115中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或疫苗，和(ii)來(lái)自流感嗜血桿菌的D蛋白，所述D蛋白可為游離的或綴合的。123.—種在嬰兒中激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或疫苗。124.—種在老年人中激發(fā)抵御肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法序貫或伴隨地聯(lián)合給予(i)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或疫苗，(ii)一種或多種選自PhtX家族和肺炎鏈i^菌溶血素的肺炎鏈球菌表面蛋白。125.—種在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法給予前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性組合物或疫苗。126.—種在嬰兒中激發(fā)抵御中耳炎的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法序貫或伴隨給予作為單獨(dú)組分或聯(lián)合組分的(i)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的疫苗，(ii)選自PhtX家族和肺炎球菌溶血素的一種或多種肺炎鏈球菌表面蛋白。127.—種疫苗試劑盒，所述疫苗試劑盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有肺炎鏈球菌免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有9種以上、IO種以上、11種以上或13種以上綴合載體蛋白的不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜糖，其中不少于和不超過(guò)l(或2或3)種莢膜糖綴合破傷風(fēng)類(lèi)毒素，所述第二容器含有DTPa或DTPw疫苗。128.—種疫苗試劑盒，所述疫苗試劑盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有肺炎鏈球菌免疫原性組合物，所述免疫原性組合物含有9種以上、IO種以上、11種以上或13種以上綴合載體蛋白的不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜糖，其中不少于和不超過(guò)l(或2或3)種莢膜糖綴合破傷風(fēng)類(lèi)毒素，所述第二容器含有MenACWY(腦膜炎奈瑟氏球菌(Mmem"g/^fo)A、C、W135和Y的綴合莢膜糖)，其中第二容器中的一種或多種或全部綴合莢膜糖綴合破傷風(fēng)類(lèi)毒素。129.權(quán)利要求127或128的疫苗試劑盒，其中在第一容器中所述血清型18C莢膜糖與破傷風(fēng)類(lèi)毒素綴合。130.權(quán)利要求127-129中任一項(xiàng)的疫苗試劑盒，其中在第一容器中的免疫原性組合物為權(quán)利要求1-113中任一項(xiàng)的免疫原性組合物。131.—種用權(quán)利要求127-130中任一項(xiàng)的疫苗試劑盒免疫患者的方法，所述方法包括伴隨給予免疫保護(hù)量的第一和第二容器的疫苗的步驟。全文摘要本發(fā)明屬于肺炎球菌莢膜糖綴合疫苗領(lǐng)域。具體地說(shuō)，提供具有多種(例如9種以上)不同肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型的綴合莢膜糖的多價(jià)肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)免疫原性組合物，其中所述組合物含有O-乙?；潭鹊陀?0％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％或10％的綴合莢膜糖18C。文檔編號(hào)A61K39/09GK101460193SQ200780021080公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年4月5日優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日發(fā)明者J·P·普里爾斯,J·普爾曼,P·德內(nèi)爾,R·L·比曼斯申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司