專利名稱：綴合方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于綴合的方法。特別地，它涉及使用還原胺化的糖和蛋白質(zhì)的綴合。
背景技術：
細菌莢膜多糖已廣泛用于免疫學許多年用于預防細菌疾病。然而，關于此類使用的問題是免疫應答的T不依賴性特性。這些抗原因此在幼兒中是弱免疫原性的。這個問題已通過將多糖抗原與載體蛋白質(zhì)(T輔助表位的來源)綴合得到克服，其隨后可以用于甚至在生命的第一年中引發(fā)T依賴性免疫應答。多種綴合技術是本領域已知的。綴合物可以通過如US200710184072(Hausdorff)US 4365170 (Jennings)和US 4673574 (Anderson)中所述的直接還原胺化法進行制備。其他方法在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中描述。綴合法可以可替代地依賴 綴合物在 PCT 公開申請 WO 93/15760 Uniformed Services University 以及 WO 95/08348和 TO 96/29094 中描述。還參見 Chu C.等人 Infect. Immunity, 1983 245 256。還原胺化涉及兩個步驟，(I)抗原的氧化，(2)抗原和載體蛋白質(zhì)的還原，以形成綴合物。氧化步驟可以涉及與高碘酸鹽的反應，然而，通過高碘酸鹽的氧化可以導致尺寸減小(W094/05325)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)在低磷酸鹽的存在下使用較低濃度的高碘酸鹽可以導致尺寸的保留和/或表位的保留。在本發(fā)明的第一個方面，提供了用于綴合細菌糖類的方法，其包括步驟
a)將細菌糖類與O. 001-0. 7,0. 005-0. 5,0. 01-0. 5,0. 1-1. 2,0. 1-0. 5,0. 1-0. 2、
O.5-0. 8,0. 1-0. 8,0. 3-1. O或O. 4-0. 9摩爾當量的高碘酸鹽反應，以形成活化的細菌糖類；
b)將活化的細菌糖類與載體蛋白質(zhì)混合；
c)將活化的細菌糖類和載體蛋白質(zhì)與還原劑反應，以形成綴合物；
或
a)將細菌糖類與O. 001-0. 7,0. 005-0. 5,0. 01-0. 5,0. 1-1. 2,0. 1-0. 5,0. 1-0. 2、
O.5-0. 8,0. 1-0. 8,0. 3-1. O或O. 4-0. 9摩爾當量的高碘酸鹽反應，以形成活化的細菌糖類；
b)將活化的細菌糖類與接頭混合；
C，)使用還原劑將活化的細菌糖類與接頭反應，以形成細菌糖類-接頭；
d)將細菌糖類-接頭與載體蛋白質(zhì)反應，以形成綴合物；
其中步驟a)在不含胺基團的緩沖液中發(fā)生，并且所述緩沖液具有I-IOOmM的濃度。在本發(fā)明的第二個方面，提供了可通過本發(fā)明的方法獲得的綴合物。在本發(fā)明的第三個方面，提供了通過本發(fā)明的方法獲得的綴合物。在本發(fā)明的第四個方面，提供了免疫原性組合物，其包含本發(fā)明的綴合物和藥學可接受的賦形劑。在本發(fā)明的第五個方面，提供了包含本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗。在本發(fā)明的第六個方面，提供了本發(fā)明的免疫原性組合物或本發(fā)明的疫苗在預防或治療細菌疾病中的用途。在本發(fā)明的第七個方面，提供了本發(fā)明的免疫原性組合物或本發(fā)明的疫苗在制備用于預防或治療細菌疾病的藥物中的用途。在本發(fā)明的第八個方面，提供了預防或治療細菌感染的方法，其包括給患者施用本發(fā)明的免疫原性組合物或本發(fā)明的疫苗。在本發(fā)明的第九個方面，提供了活化的細菌糖類，其中所述活化的細菌糖類包含式(I)的重復單位
權(quán)利要求
1.一種用于綴合細菌糖類的方法，其包括步驟a)將所述細菌糖類與O. 001-0. 7,0. 005-0. 5,0. 01-0. 5,0. 1-1. 2,0. 1-0. 5,0. 1-0. 2、O. 5-0. 8,0. 1-0. 8,0. 3-1. O或O. 4-0. 9摩爾當量的高碘酸鹽反應，以形成活化的細菌糖類； b)將所述活化的細菌糖類與載體蛋白質(zhì)混合； c)將所述活化的細菌糖類和所述載體蛋白質(zhì)與還原劑反應，以形成綴合物； 或a)將所述細菌糖類與O. 001-0. 7,0. 005-0. 5,0. 01-0. 5,0. 1-1. 2,0. 1-0. 5,0. 1-0. 2、O.5-0. 8,0. 1-0. 8,0. 3-1. O或O. 4-0. 9摩爾當量的高碘酸鹽反應，以形成活化的細菌糖類； b)將所述活化的細菌糖類與接頭混合； C，)使用還原劑將所述活化的細菌糖類與所述接頭反應，以形成細菌糖類-接頭； d)將所述細菌糖類-接頭與載體蛋白質(zhì)反應，以形成綴合物； 其中步驟a)在不含胺基團的緩沖液中發(fā)生，并且所述緩沖液具有I-IOOmM的濃度。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液和檸檬酸鹽緩沖液。
3.權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中所述緩沖液是無機緩沖液。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述緩沖液具有l(wèi)-50mM、l-25mM、l-10mM、5-15mM、8-12mM、或 10_50mM 或約 IOmM 的濃度。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述步驟a)中的pH是pH3. 5-8.0,5. 0-7.0,或 pH 5. 5-6. 5 或約 pH 6. O。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述細菌糖類包含細菌莢膜糖類。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述細菌糖類源于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、沙門氏菌Vi或表皮葡萄球菌。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述細菌糖類選自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎鏈球菌莢膜糖類。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述細菌糖類選自5、6B、6A、7F、9V、14、19F或23F。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述細菌糖類是肺炎鏈球菌莢膜糖類23F。
12.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述細菌糖類是肺炎鏈球菌莢膜糖類6B。
13.權(quán)利要求1-10中任一項的方法，其中所述細菌糖類是肺炎鏈球菌莢膜糖類6A。
14.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述細菌糖類是流感嗜血桿菌b(Hib)多糖或寡糖。
15.權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其中所述細菌糖類含有鄰位二醇。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的方法，其中所述細菌糖類是天然多糖，或在大小中減少不超過x20倍(例如通過微流化)。
17.權(quán)利要求1-16中任一項的方法，其中在步驟a)前，所述細菌糖類是微流化的。
18.權(quán)利要求16-17中任一項的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是20kDa-2000kDa 或 30kDa - IOOOkDa0
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是750-1500kDa。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述天然多糖的平均分子量是100- 250 kDa。
21.權(quán)利要求1-20中任一項的方法，其中在步驟a)前，所述細菌糖類的平均分子量是l-1100kDa、100-470kDa、200-300kDa、600-1100kDa 或800-1000kDa。
22.權(quán)利要求11的方法，其中在步驟a)后，所述23F糖類的平均分子量是100_470kDa或 200-300kDa。
23.權(quán)利要求14的方法，其中在步驟a)后，所述Hib細菌糖類的平均分子量是I- 50kDa 或 5 - IOkDa0
24.權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其中所述載體蛋白質(zhì)選自破傷風類毒素、破傷風類毒素的片段C、白喉類毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白質(zhì)D、PhtD, PhtDE和N19。
25.權(quán)利要求1-25中任一項的方法，其中步驟a)在黑暗中進行。
26.權(quán)利要求15的方法，其中小于O.001%,O. 01%,O. 1%、0· 5%、1%、2%或5%的所述細菌糖類的鄰位二醇在步驟a)過程中變得氧化。
27.權(quán)利要求26的方法，其中在步驟c)過程中，所述羰基與所述載體蛋白質(zhì)上的氨基反應。
28.權(quán)利要求1-27中任一項的方法，其中在步驟a)中，所述細菌糖類以O.2g/l - 14g/l、8g/l - 12g/l、10g/l - 12g/l、lg/l - 4g/l 0. 2g/l - lg/1 或0. 4g/l - 0. 6g/l 的濃度存在。
29.權(quán)利要求1-28中任一項的方法，其中在步驟b)中，所述載體蛋白質(zhì)的起始濃度是05.g/Ι - 35 g/l、25g/l - 35g/l、或 O. 5g/l - 5g/l。
30.權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中在步驟b)中，所述活化的細菌糖類的起始濃度是 O. 2g/l - 20g/l、10g/l - 28g/l、或 O. 2g/l - 4g/l。
31.權(quán)利要求1-30中任一項的方法，其中在步驟b)中，所述活化的細菌糖類的起始比值是 2. O: I 至 O. 1:1、1.8:1 至 0.4:1、1:1 至 1·4:1、1·8:1 至 1·6:1、1·4:1 至 1·6:1、0·8:1至 O. 4:1、O. 7:1 至 O. 5:1、或 O. 7:1 至 O. 6:1 (wt/wt)。
32.權(quán)利要求1-31中任一項的方法，其中在步驟c)或c’)后，所述載體蛋白質(zhì)與細菌糖類的最終比值是 O. 5:1 至 4:1、0· 8:1 至 3. 2:1、0· 5:1 至 L 8: I、L 4:1 至 L 8: I、I: I 至I.2:1、2:1 至 2. 4: I、或 2. 5:1 至 3. 5:1。
33.權(quán)利要求1-32中任一項的方法，其中在步驟a)中的所述反應溫度維持在4-40°C、10-32。。、17-30。?；?22-27 0C ο
34.權(quán)利要求1-33中任一項的方法，其中在步驟c)中的所述反應溫度維持在4-40°C、10-32。。、17-30。?；?22-27 0C ο
35.權(quán)利要求1-34中任一項的方法，其中步驟a)具有小于30小時或15- 25小時、或10 - 20小時、30分鐘-25小時、I小時-35小時的持續(xù)時間。
36.權(quán)利要求1-35中任一項的方法，其中步驟c)具有10- 60小時或20 - 60小時的持續(xù)時間。
37.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其中所述活化的細菌糖類與所述載體蛋白質(zhì)直接三雙口 ο
38.權(quán)利要求1-36中任一項的方法，其中所述活化的細菌糖類通過接頭與所述載體蛋白質(zhì)綴合。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述接頭是長度I- 20埃。
40.權(quán)利要求38或39中任一項的方法，其中所述接頭包含ADH接頭。
41.權(quán)利要求1-40中任一項的方法，其中所述還原劑包含氰基硼氫化物。
42.權(quán)利要求1-40中任一項的方法，其中所述還原劑包含三乙酰氧基硼氫化鈉。
43.權(quán)利要求42的方法，其中O.5 - 2或O. 8 - I. 2摩爾當量的還原劑用于步驟c)中。
44.權(quán)利要求43的方法，其中2- 10摩爾當量的還原劑用于步驟c)中。
45.權(quán)利要求1-44中任一項的方法，其中任何未反應的羰基通過與硼氫化鈉(NaBH4)反應進行加帽。
46.權(quán)利要求45的方法，其中使用約2M當量的硼氫化鈉。
47.權(quán)利要求45或46中任一項的方法，其中所述步驟c)的產(chǎn)物與硼氫化鈉反應15分鐘-15小時、15分鐘-45分鐘、2-10小時或3-5小時。
48.權(quán)利要求1-47中任一項的方法，其中在步驟b)前，所述活化的細菌糖類和所述載體蛋白質(zhì)是凍干的。
49.權(quán)利要求1-48中任一項的方法，其中在步驟c)前，所述活化的細菌糖類和所述載體蛋白質(zhì)是凍干的。
50.權(quán)利要求48-49中任一項的方法，其中所述活化的細菌糖類和所述載體蛋白質(zhì)在非還原糖的存在下凍干。
51.權(quán)利要求48-50中任一項的方法，其中所述非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、右旋糖酐、甘露醇、拉克替醇和palatinit。
52.權(quán)利要求1-51中任一項的方法，步驟b)和/或c)在DMSO溶劑中進行。
53.權(quán)利要求1-51中任一項的方法，步驟b)和/或c)在DMF溶劑中進行。
54.權(quán)利要求1-53中任一項的方法，其包含純化所述綴合物的另外步驟e)。
55.權(quán)利要求54的方法，其中步驟e)包含使用滲濾純化所述綴合物。
56.權(quán)利要求54-55中任一項的方法，其中步驟e)包含使用離子交換層析純化所述綴合物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中步驟e)包含使用尺寸排阻層析純化所述綴合物。
58.權(quán)利要求1-57中任一項的方法，其包含其中將所述綴合物無菌過濾的另外步驟f)。
59.權(quán)利要求1-58中任一項的方法，其含有將所述綴合物與另外的抗原混合的另外步驟。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述另外的抗原包含選自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的至少 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20種肺炎鏈球菌糖類。
61.權(quán)利要求59-60中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類4、9V、14、18C和 19F。
62.權(quán)利要求59-61中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類19A。
63.權(quán)利要求59-62中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6A。
64.權(quán)利要求50-63中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類I。
65.權(quán)利要求59-64中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類5。
66.權(quán)利要求59-65中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類7F。
67.權(quán)利要求59-66中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類3。
68.權(quán)利要求59-67中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類23F。
69.權(quán)利要求59-68中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6B。
70.權(quán)利要求59-70中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6B。
71.權(quán)利要求59-70中任一項的方法,其中所述另外的抗原包含選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白質(zhì)(或融合物)、肺炎球菌溶血素(？17)、？8 4、？犯4、3 128、3 101、Spl30、Spl25和Spl33的一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)。
72.權(quán)利要求60-71中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、和被殺死的全細胞百日咳博得特菌pertussis) (Pw)、或兩種或更多種無細胞百日咳組分(Pa)。
73.權(quán)利要求60-72中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含乙型肝炎表面抗原(HepB)0
74.權(quán)利要求60-73中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含流感嗜血桿菌b(Hib)多糖或寡糖。
75.權(quán)利要求60-74中任一項的方法，其中所述另外的抗原包含載體蛋白質(zhì)和選自下述的細菌的莢膜多糖的一種或多種綴合物腦膜炎奈瑟菌A型(MenA)、腦膜炎奈瑟菌C型(MenC)、腦膜炎奈瑟菌W型(MenW)和腦膜炎奈瑟菌Y型(MenY)。
76.權(quán)利要求1-75中任一項的方法，其中將所述綴合物與佐劑混合。
77.權(quán)利要求76的方法，其中所述佐劑是鋁鹽。
78.權(quán)利要求1-77中任一項的方法，其中將所述綴合物與藥學可接受的賦形劑混合。
79.—種可通過權(quán)利要求1-78中任一項的方法獲得的綴合物。
80.一種通過權(quán)利要求1-78中任一項的方法獲得的綴合物。
81.—種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求79-80中任一項的綴合物和藥學可接受的賦形劑。
82.權(quán)利要求81的免疫原性組合物，其中所述藥學賦形劑不含氯化物鹽。
83.權(quán)利要求81-82中任一項的免疫原性組合物，其中所述藥學賦形劑包含緩沖液。
84.權(quán)利要求83的免疫原性組合物，其中所述緩沖液是馬來酸鹽緩沖液。
85.權(quán)利要求84的免疫原性組合物，其包含至少一種另外的抗原。
86.權(quán)利要求86的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含選自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎鏈球菌糖類。
87.權(quán)利要求85-86中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類 4、9V、14、18C 和 19F。
88.權(quán)利要求85-87中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類19A。
89.權(quán)利要求85-88中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6A。
90.權(quán)利要求85-89中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類I。
91.權(quán)利要求85-90中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類5。
92.權(quán)利要求85-91中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類7F。
93.權(quán)利要求85-92中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類3。
94.權(quán)利要求85-93中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類23F。
95.權(quán)利要求85-94中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6B。
96.權(quán)利要求85-95中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含肺炎鏈球菌糖類6C。
97.權(quán)利要求85-96中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含選自聚組氨酸三聯(lián)體家族(PhtX)、膽堿結(jié)合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白質(zhì)(或融合物)、肺炎球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SplOl、Spl30、Spl25和Spl33的一種或多種肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)。
98.權(quán)利要求85-97中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)、和被殺死的全細胞百日咳博得特菌iBordetella pertussis)(Pw)、或兩種或更多種無細胞百日咳組分(Pa)。
99.權(quán)利要求85-98中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含流感嗜血桿菌b (Hib)多糖或寡糖。
100.權(quán)利要求85-99中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含乙型肝炎表面抗原(HepB)。
101.權(quán)利要求85-100中任一項的免疫原性組合物，其中所述另外的抗原包含載體蛋白質(zhì)和選自下述的細菌的莢膜多糖的一種或多種綴合物腦膜炎奈瑟菌A型(MenA)、腦膜炎奈瑟菌C型(MenC)、腦膜炎奈瑟菌W型(MenW)和腦膜炎奈瑟菌Y型(MenY)。
102.權(quán)利要求85-101中任一項的免疫原性組合物，其另外包含佐劑。
103.權(quán)利要求102的免疫原性組合物，其中所述佐劑是鋁鹽。
104.一種疫苗，其包含權(quán)利要求81-103中任一項的免疫原性組合物。
105.權(quán)利要求81-103中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求104的疫苗在預防或治療細菌疾病中的用途。
106.權(quán)利要求81-103中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求104的疫苗在制備用于預防或治療細菌疾病的藥物中的用途。
107.一種預防或治療細菌感染的方法，其包括給患者施用權(quán)利要求81-103中任一項的免疫原性組合物或權(quán)利要求104的疫苗。
108.一種活化的細菌糖類，其中所述活化的細菌糖類包含式(I)的重復單位
109.權(quán)利要求108 的化合物，其中小于 O. 001%,O. 1%、0· 5% 1%、2%、3%、5%、10%、30% 或50%的S2是
110.權(quán)利要求108或109的化合物，其中小于O.1%、0· 5%、1%、2%、3%、5%、10%、30%或50%%的S3是
全文摘要
本文提供了通過還原胺化用于綴合細菌糖類包括肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌糖類的方法。
文檔編號A61K39/02GK102883745SQ201180023322
公開日2013年1月16日 申請日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者R.L.比曼斯, P.杜維維耶, O.F.N.加瓦爾 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司