具有降低的非特異性活性的Sso7-聚合酶綴合物的制作方法
【專利摘要】提供了改進的Sso7-聚合酶綴合蛋白。本發(fā)明提供Sso7聚合酶綴合蛋白，其包含與聚合酶連接的Sso7結(jié)構(gòu)域；其中：所述Sso7結(jié)構(gòu)域的與SEQ?ID?NO：2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K)；和／或所述Sso7結(jié)構(gòu)域的與SEQ?ID?NO：2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)，其中所述綴合蛋白與在其它方面相同的對照綴合蛋白相比具有降低的非特異性擴增活性，在所述對照綴合蛋白中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域的與SEQ?ID?NO：2的K28對應(yīng)的氨基酸是賴氨酸(K)，且所述Sso7結(jié)構(gòu)域的與SEQ?ID?NO：2的R43對應(yīng)的氨基酸是精氨酸(R)。
【專利說明】具有降低的非特異性活性的SS07-聚合酶綴合物
[0001]對相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年4月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1 / 473，682和2011年6月22日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1 / 499，873的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，它們各自通過引用并入。
【背景技術(shù)】
[0003]核酸擴增反應(yīng)，諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，一般是模板依賴性反應(yīng)，其中所需的核酸序列通過使用過量的兩種寡核苷酸引物處理靶核酸的分離的互補鏈來擴增。所述引物延伸形成互補引物延伸產(chǎn)物，所述產(chǎn)物起模板作用，以用于合成所需的核酸序列。在這樣的過程中，選擇性擴增各DNA鏈上的引物之間的核酸序列。
[0004]通過將非序列特異性的雙鏈核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至酶或它的催化域，可以提高聚合酶的活性(參見，例如，W00192501)。這樣的經(jīng)修飾的聚合酶表現(xiàn)出與未修飾的酶相比增加的持續(xù)合成能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了 Sso7聚合酶綴合蛋白，其包含與聚合酶連接的Sso7結(jié)構(gòu)域；其中:
[0006]所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸⑷；和/或
[0007]所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)，
[0008]其中所述綴合蛋白與在其它方面相同的對照綴合蛋白相比具有降低的非特異性擴增活性，在所述對照綴合蛋白中`，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸是賴氨酸(K)，且所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸是精氨酸(R)。
[0009]在一些實施方案中，與對照綴合蛋白的非特異性擴增活性相比，所述Sso7聚合酶綴合蛋白的非特異性擴增活性降低至少10%。
[0010]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
[0011]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。
[0012]在一些實施方案中，所述聚合酶基本上沒有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0013]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的前58或60個氨基酸或與SEQ ID NO:2的全長基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0014]在一些實施方案中，所述聚合酶與SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
[0015]在一些實施方案中，所述聚合酶結(jié)構(gòu)域具有熱穩(wěn)定的聚合酶活性。在一些實施方案中，所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是家族A聚合酶結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是Δ Taq聚合酶結(jié)構(gòu)域。
[0016]在一些實施方案中，所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是家族B聚合酶結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述聚合酶結(jié)構(gòu)域得自熱球菌屬(Pyrococcus)。
[0017]本發(fā)明也提供了反應(yīng)混合物，其包含如上面或本文別處所述的Sso7聚合酶綴合蛋白。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含至少一種或多種寡核苷酸引物、一種或多種可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸探針、緩沖液、核苷三磷酸(dNTP)、鹽、DNA結(jié)合染料或穩(wěn)定劑。
[0018]本發(fā)明也提供了試劑盒，其包含如上面或本文別處所述的Sso7聚合酶綴合蛋白。在一些實施方案中，所述試劑盒進一步在含有所述綴合蛋白的相同或不同的容器中包含下述的至少一種:一種或多種寡核苷酸引物、一種或多種可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸探針、緩沖液、核苷三磷酸(dNTP)、鹽或穩(wěn)定劑。
[0019]在一些實施方案中，所述組合物包含當(dāng)在20°C至37°C之間時具有不超過0.027pH單位/ 0C的變化的緩沖液(當(dāng)在0.1M濃度測量時)。在一些實施方案中，所述緩沖液選自由以下各項組成的組:HEPES、ACES、PIPES、MOPSO, BES, MOPS、TES, TAPSO, P0PS0、BICINE、TAPS 和 AMPSO。
[0020]本發(fā)明也提供了擴增樣品中的靶核酸的方法。在一些實施方案中，所述方法包括，在允許用引物擴增靶核酸的條件下，在反應(yīng)混合物中溫育所述靶核酸，所述反應(yīng)混合物包含:`
[0021]a.至少一種引物；和
[0022]b.如上面或本文別處所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，
[0023]由此擴增所述靶核酸。
[0024]在一些實施方案中，所述方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
[0025]本發(fā)明也提供了核酸，其包含編碼如上面或本文別處所述的Sso7聚合酶綴合蛋白的多核苷酸。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(U、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸⑴。
[0026]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。[0027]在一些實施方案中，所述聚合酶基本上沒有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0028]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的前58或60個氨基酸或與SEQ ID NO:2的全長基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0029]在一些實施方案中，所述聚合酶與SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
[0030]本發(fā)明也提供了包含重組表達盒的細胞，所述表達盒包含與編碼如上面或本文別處所述的Sso7聚合酶綴合蛋白的多核苷酸可操作地連接的啟動子。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:絲氨酸
(S)、蘇氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
[0031]在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。
[0032]在一些實施方案中，所述聚合酶基本上沒有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0033]在一些實施方案中，所`述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的前58或60個氨基酸或與SEQ ID NO:2的全長基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0034]在一些實施方案中，所述聚合酶與SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些實施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1.不同的Sso7氨基酸序列(分別是SEQ ID NO:2、3、6、4和5)的比對。
[0036]定義
[0037]除非另外定義，本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常理解的相同含義。一般地，本文中使用的術(shù)語和下述的細胞培養(yǎng)實驗室程序、分子遺傳學(xué)、有機化學(xué)、和核酸活性和雜交是本領(lǐng)域中公知并普遍使用的那些。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來進行核酸和肽分析。所述技術(shù)和程序通常按照本領(lǐng)域中常規(guī)方法和多種一般參考文件(一般參見，Sambrook 等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (分子克隆:實驗室手冊)，第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社)，ColdSpring Harbor (冷泉港)，N.Y.,其通過引用并入本文)來進行，其在本文全文中提供。本文中使用的術(shù)語和下述分析化學(xué)、和有機合成的實驗室程序是本領(lǐng)域中公知和普通使用的那些。[0038]術(shù)語“Sso7”或“Sso7DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“Sso7_樣DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“Sso7結(jié)構(gòu)域”表示這樣的核酸和多肽多形變體、等位基因、突變體、種間同源物:(1)其氨基酸序列與SEQ ID NO:2具有大于約60%氨基酸序列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的氨基酸序列同一性；(2)其在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID NO:1的Sso7d核酸序列及其保守修飾的變體特異性地雜交；或⑶其核酸序列與SEQ ID NO:1具有大于約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
或更高的核苷酸序列同一性。該術(shù)語包括全長Sso7d多肽和所述多肽的具有序列非特異性雙鏈結(jié)合活性的片段。Sso7_樣蛋白包括、但不限于:Sso7d、Sac7d和Sac7e。
[0039]“結(jié)構(gòu)域”表示蛋白或蛋白復(fù)合物的單元，其包括多肽序列、完整多肽序列、或許多多肽序列，其中所述單元具有定義的功能。理解所述功能是廣泛定義的，且可以是配體結(jié)合、催化活性或可以對蛋白的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。
[0040]關(guān)于蛋白的部分使用的“異源的”表示所述蛋白包括兩個或多個在自然界彼此間不以相同關(guān)系存在的結(jié)構(gòu)域。這樣的蛋白，例如，融合蛋白，含有兩個或多個來自被安排形成新的功能性蛋白的無關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)域。
[0041]“連接”表示本領(lǐng)域中關(guān)于功能性連接蛋白結(jié)構(gòu)域的任何已知方法，包括但不限于具有或不具有干擾結(jié)構(gòu)域的重組融合、內(nèi)含肽-介導(dǎo)的融合、非共價連接、和共價鍵結(jié)合、包括二硫鍵結(jié)合；氫鍵結(jié)合；靜電結(jié)合；和構(gòu)象結(jié)合，例如，抗體-抗原，和生物素-抗生物素蛋白連接。
[0042]本文中使用的“熱穩(wěn)定的聚合酶”表示利用DNA或RNA作為模板，通過將核苷酸單元加入至核苷酸鏈來催化多核苷酸合成的任何酶，并在高于45°C的溫度下具有最佳活性。
[0043]“棲熱菌屬(Thermus)聚合酶”指由任何棲熱菌屬物種分離的家族ADNA聚合酶，包括但不限于水生棲熱菌(Thermus` aquaticus)、Thermus brockianus、和嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus);源自棲熱菌屬物種的任何重組聚合酶,及其任意功能性衍生物，無論是通過遺傳修飾或化學(xué)修飾或本領(lǐng)域中已知的其它方法來衍生。
[0044]術(shù)語“擴增反應(yīng)”表示用于增加核酸靶序列拷貝的任意體外方法。這樣的方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA連接酶鏈反應(yīng)(參見美國專利號4，683，195和
4,683, 202 ；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR 流程:方法和應(yīng)用指導(dǎo))(Innis等編，1990))，(LCR)、QBeta RNA復(fù)制酶、和基于RNA轉(zhuǎn)錄的(諸如TAS和3SR)的擴增反應(yīng)以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。
[0045]“擴增”表示使溶液經(jīng)歷足以容許擴增多核苷酸的條件的步驟，條件是反應(yīng)的全部組分是完整的。擴增反應(yīng)的組分包括，例如，引物，多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù)語“擴增”典型地表示靶核酸的“指數(shù)”增加。然而，本文中使用的“擴增”還可以表示核酸的選擇靶序列數(shù)量的線性增加，諸如使用循環(huán)測序獲得的。
[0046]術(shù)語“擴增反應(yīng)混合物”表示包含用于擴增靶核酸的多種試劑的水溶液。這些包括酶、水性緩沖液、鹽、擴增引物、靶核酸、和核苷三磷酸。如本文中進一步討論地，擴增反應(yīng)混合物還可以進一步包括穩(wěn)定劑和其它用于最優(yōu)化效率和特異性的添加劑。根據(jù)上下文，所述混合物可以是完全的或不完全的擴增反應(yīng)混合物。
[0047]“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”表示這樣的方法，通過該方法以幾何級數(shù)擴增靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子序列。PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)；參見，例如，美國專利號4,683，195 和 4，683，202 jPIPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR流程:方法和應(yīng)用指導(dǎo))，Innis等編，1990。示范性PCR反應(yīng)條件典型地包括兩步驟或三步驟循環(huán)。兩步驟循環(huán)具有變性步驟，隨后是雜交/延伸步驟。三步驟循環(huán)包括變性步驟，隨后是雜交步驟，隨后是單獨的延伸步驟。
[0048]關(guān)于核酸擴增使用的術(shù)語“特異性”表示，與非特異性擴增產(chǎn)物相比，產(chǎn)生特異性擴增產(chǎn)物的核酸擴增反應(yīng)的可能性?！疤禺愋詳U增產(chǎn)物”表示，通過用正確配對的引物和模板(即，正確靶序列)的擴增產(chǎn)生的多核苷酸。“非特異性擴增產(chǎn)物”表示，通過用錯配的引物和模板的擴增產(chǎn)生的多核苷酸。 [0049]關(guān)于核酸擴增使用的短語“提高特異性”或“改善特異性”表示，與產(chǎn)生的非特異性擴增產(chǎn)物的量相比，在核酸擴增中產(chǎn)生的特異性擴增產(chǎn)物的量的可檢測的增加。擴增反應(yīng)的特異性可以根據(jù)任意方法來測量，包括、但不限于解鏈曲線分析或凝膠分析。在一些實施方案中，如下確定核酸擴增反應(yīng)的特異性:對比兩種產(chǎn)物的相對產(chǎn)率，其中一種產(chǎn)物是具有預(yù)期的Tm的特異性產(chǎn)物，且另一種產(chǎn)物是非特異性產(chǎn)物，其具有比特異性產(chǎn)物的Tm更低或更高的Tm。與具有含野生型Sso7結(jié)構(gòu)域的對照聚合酶的反應(yīng)混合物中的特異性產(chǎn)物相對于非特異性產(chǎn)物的相對產(chǎn)率相比，包含Sso7-聚合酶綴合物(其具有如本文中所述的含K28和/或R43突變的Sso7結(jié)構(gòu)域)的反應(yīng)混合物將在擴增反應(yīng)中具有更高的特異性產(chǎn)物相對于非特異性產(chǎn)物的相對產(chǎn)率(即，通過特異性產(chǎn)物的解鏈峰的高度與非特異性產(chǎn)物的解鏈峰的高度之比測得的產(chǎn)率之比)。在一些實施方案中，與其中對照聚合酶具有野生型Sso7結(jié)構(gòu)域的反應(yīng)相比，具有如本文中所述的含K28和/或R43突變的Sso7結(jié)構(gòu)域的Sso7-聚合酶綴合物將具有所述比率增加至少10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、40 %、50 %、100%,2倍(200% )、2.5倍(250% )、3倍(300% )或更大的提高的擴增特異性。
[0050]“引物”表示與靶核酸上的序列雜交并擔(dān)當(dāng)核酸合成的起始點的多核苷酸序列。引物可以具有不同的長度，且通常長度小于50個核苷酸，例如，長度為12-30個核苷酸。用于PCR中的引物的長度和序列可以基于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原則來設(shè)計，參見，例如，Inni s等,見上文。
[0051]“模板”表示這樣的多核苷酸序列，其包括側(cè)連引物雜交位點的待擴增的多核苷酸。因此，“靶模板”包括側(cè)連關(guān)于5’弓丨物和3’引物的雜交位點的靶多核苷酸序列。
[0052]本文中使用的“核酸”表示DNA、RNA、單鏈、雙鏈或更加高度聚集的雜交基序，及其任意化學(xué)修飾。修飾包括，但不限于，向核酸配體堿基或向作為整體的核酸配體提供結(jié)合另外的電荷、極性、氫鍵結(jié)合、靜電相互作用、連接點和功能性的化學(xué)基團的那些。這樣的修飾包括，但不限于，肽核酸(PNAs)，磷酸二酯基修飾，(例如，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2 ^ -位糖修飾，5-位嘧啶修飾，8-位嘌呤修飾，環(huán)外胺的修飾，4-硫尿苷的置換，5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的置換；主鏈修飾，甲基化，不尋常堿基配對組合諸如異堿基(isobase),異胞苷(isocytidine)和異胍(isoguanidine)等。核酸還可以包括非天然堿基，諸如，例如，硝基吲哚。修飾還可以包括3'和5'修飾諸如用熒光團(例如，量子點)或另一種結(jié)構(gòu)部分加帽。
[0053]術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換使用，表示氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人造化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0054]術(shù)語“氨基酸”表示天然存在和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及稍后修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸，Y-羧基谷氨酸，和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物表示與天然存在的氨基酸具有相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，與氫原子、羧基、氨基、和R基結(jié)合的α碳原子)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這樣的類似物具有修飾的R基(例如，正亮氨酸)或修飾肽主鏈，但是保持與天然存在的氨基酸相同的基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物表示具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化學(xué)化合物。
[0055]氨基酸在本文中可以通過其普遍已知的三字母符號或通過由IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會推薦的一字母符號來提及。同樣地，核苷酸可以通過其普遍接受的單字母密碼來提及。
[0056]“保守修飾變體”應(yīng)用于氨基酸和核酸序列二者。關(guān)于特定的核酸序列，保守修飾變體表示編碼相同或基本相同氨基酸序列，或其中核酸不編碼氨基酸序列的那些核酸，基本相同序列。由于遺傳密碼的簡并，大量功能相同的核酸編碼任何給定蛋白。例如，密碼子GCA,GCC,GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在通過密碼子指定丙氨酸的各個位置處，該密碼子可以改變?yōu)樗鱿鄳?yīng)密碼子中任一個，而不改變編碼的多肽。這樣的核酸變化是“沉默變化”，其是保守修飾變化的一種。本文中編碼多肽的各核酸序列也描述各種可能的核酸的沉默變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到，核酸中的各密碼子(除AUG(其通常僅編碼甲硫氨酸)和TGG(其通常僅編碼色氨酸外)可以修飾為產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的各沉默變化是各所述序列中固有的。
[0057]關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到，在編碼的序列中改變、添加或缺失單氨基酸或小比例氨基酸的各置換、缺失或添加核酸、肽、多肽、或蛋白序列是“保守修飾的變體”，其中變化導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)類似的氨基酸置換。提供功能相似氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域中公知的。這樣的保守修`飾變體是本發(fā)明多形變體、種間同源物、和等位基因以外的，但不排除這些。
[0058]術(shù)語“編碼”表示編碼一個或多個氨基酸的多核苷酸序列。該術(shù)語不需要起始密碼子或終止密碼子。氨基酸序列可以以由多核苷酸序列提供的6種不同閱讀框中任一種來編碼。
[0059]術(shù)語“啟動子”表示位于轉(zhuǎn)錄起始上游和/或下游并參與識別和結(jié)合RNA聚合酶和其它蛋白以起始轉(zhuǎn)錄的區(qū)域或序列。
[0060]“載體”表示這樣的多核苷酸，其在獨立于宿主染色體時，能夠在宿主生物體中復(fù)制。優(yōu)選的載體包括質(zhì)粒，且典型地具有復(fù)制起點。載體可以包括，例如，轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列，和有效用于調(diào)節(jié)特定核酸表達的啟動子。
[0061]“重組體”表示人操作的多核苷酸或人操作的多核苷酸的拷貝或補體。例如，包括與第二多核苷酸可操作連接的啟動子的重組表達盒可以包括與所述第二多核苷酸異源的啟動子，這是人操作(例如，通過Sambrook等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual (分子克隆:實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)，ColdSpring Harbor (冷泉港)，Ν.Υ.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology (當(dāng)前分子生物學(xué)方案)第1-3卷，John Wiley & Sons, Inc.(1994-1998)所述的方法)包含表達盒的分離的核酸的結(jié)果。在另一個實例中，重組表達盒可以包括以這樣的方式組合的多核苷酸，所述方式使得所述多核苷酸極不可能在自然界中找到。例如，人操作的限制位點或質(zhì)粒載體序列可以使啟動子側(cè)連所述第二多核苷酸或使啟動子與所述第二多核苷酸分開。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到，多核苷酸可以以許多方式來操作并不限于以上實例。
[0062]“聚合酶”表示進行多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)的模板指導(dǎo)的合成的酶。該術(shù)語包括具有聚合酶活性的全長多肽和結(jié)構(gòu)域。DNA聚合酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于，由激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus), Thermococcus Iitoralis,和海棲熱袍菌(Thermotoga maritime),或其修飾形式分離或來源的DNA聚合酶。它們包括DNA-依賴性聚合物和RNA-依賴性聚合酶(諸如逆轉(zhuǎn)錄酶)二者。已知至少5個DNA-依賴性DNA聚合酶家族，盡管大部分屬于家族A、B和C。不同家族之間存在很少或不存在序列相似性。大多數(shù)家族A聚合酶是單鏈蛋白，其可以含有多酶功能包括聚合酶、3'至5'外切核酸酶活性和5'至3'外切核酸酶活性。家族B聚合酶典型地具有聚合酶的單催化結(jié)構(gòu)域和3'至5'外切核酸酶活性，以及輔助因子。家族C聚合酶典型地是多亞單元蛋白，其具有聚合和3'至5'外切核酸酶活性活性。在大腸桿菌(E.coli)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)三種類型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I (家族A)、II (家族B)和III (家族C)。在真核細胞中，三種不同的家族B聚合酶，即DNA聚合酶α、δ和ε，參與核復(fù)制，且家族A聚合酶，即聚合酶Y，用于線粒體DNA復(fù)制。其它類型的DNA聚合酶包括噬菌體聚合酶。類似地，RNA聚合酶典型地包括真核RNA聚合酶1、II和III，和細菌RNA聚合酶以及噬菌體和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA-依賴性和RNA-依賴性的。
[0063]兩個核酸序列或多肽被稱為“相同”，如果這兩個序列中的核苷酸或氨基酸殘基序列在如下所述比對以獲得最大對應(yīng)性時，分別相同。術(shù)語“相同”或百分比“同一性”在兩個或多個核酸或多肽序列的背景下，表示當(dāng)比較和比對以在比較窗中獲得最大對應(yīng)性時，相同或具有特定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸的兩個或多個序列或子序列，其如使用一種以下序列比較算法或通過手工比對和視覺觀察來測量。當(dāng)序列同一性的百分比關(guān)于蛋白或多肽使用時，認(rèn)為不相同的殘基位置通常由于保守氨基酸置換而不同，其中氨基酸殘基被置換為具有類似化學(xué)特性(例`如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基并因此不改變該分子的功能特性。當(dāng)序列在保守置換中不同時，百分比序列同一性可以上調(diào)，以校正置換的保守天性。用于進行該調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。典型地，這涉及將保守置換作為部分而非完全錯配來評分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，當(dāng)相同的氨基酸給分為I且非保守置換給分為O時，保守置換給分在O和I之間。保守置換的評分根據(jù)例如，Meyers & Miller 的算法，Computer Applic.Biol.Sc1.(計算機應(yīng)用生物科學(xué))4:11-17 (1988)來計算，例如，如以程序 PC / GENE (Intelligenetics, Mountain View,加利福尼亞，USA)進打。
[0064]在下述情況下，序列是彼此“基本上相同的”:當(dāng)比較和比對以在比較窗或特定區(qū)域中獲得最大對應(yīng)性時，它們具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸殘基(例如，在特定區(qū)域內(nèi)至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97 %、98 %或99 %同一性)，其中使用一種以下序列比較算法或通過手工比對和視覺觀察
來測量。[0065]為了序列比較，典型地，一個序列擔(dān)當(dāng)參考序列，測試序列與所述參考序列進行比較。當(dāng)使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，如果需要，指定子序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)。可以使用默認(rèn)的程序參數(shù)，或可以指定備選的參數(shù)。序列比較算法然后基于程序參數(shù)，計算測試序列相對于參考序列的百分比序列同一性。
[0066]本文中使用的“比較窗”包括選自由20-600，通常約50-約200，更通常約100-約150組成的組的任一連續(xù)位置數(shù)量的區(qū)段，其中當(dāng)兩序列最佳比對后，序列可以與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列進行比較。比對序列以進行比較的方法是本領(lǐng)域中公知的。用于比較的最佳序列比對可以，例如，通過Smith & Waterman, Adv.Appl Math.(現(xiàn)代應(yīng)用數(shù)學(xué))2:482 (1981)的局部同源比對算法,通過Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)48:443 (1970)的同源比對算法,通過Pearson & Lipman,Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)85 =2444(1988)的相似方法的搜索，通過計算機化執(zhí)行這些算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package (威斯康辛州遺傳學(xué)軟件包)，Accelrys中),或通過人工比對和視覺觀察來進行。
[0067]適合用于確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0 算法，其分別記述在 Altschul 等(Nuc.Acids Res.25 =3389-402,1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-10，1990)中。用于進行BLAST分析的軟件可公共地獲白國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http: / / www.ncb1.nlm.nih.gov / )。該算法包括首先通過識別查詢序列中長度W的短詞來識別高評分序列對(HSPs)，其在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞比對時，匹配或滿足一些正值閾值評分。T指鄰近詞評分閾值(Altschul等，見上文)。這些起始鄰近詞擊中(word hits)擔(dān)當(dāng)開始搜索的種子，以發(fā)現(xiàn)包含它們的較長的HSPs。詞擊中以兩個方向沿各序列延伸，以直至可以增加累積比對評分。詞擊中在各方向的延伸中以下時刻停止:累積比對評分通過量X由其最大獲得值下降；累積評分變?yōu)镺或以下，這歸因于一個或多個負評分殘基比對的累積；或達到各序列的末端。BLAST算法參數(shù)W，T，和X確定算法的靈敏性和速度。BLAST程序在默認(rèn)詞`長(W) 11時，使用BL0SUM62評分矩陣(參見HenikofT &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)89:10915(1989))比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，和兩條鏈比較。
[0068]BLAST算法也進行兩序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(參見，例如，Karlin &Altschul，Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的一個測量值是最小綜合可能性(P (N))，其提供兩核苷酸或氨基酸序列之間的匹配偶然發(fā)生的可能性指示。例如，核酸被認(rèn)為與參考序列相似，條件是測試核酸與參考核酸的比較中的最小總和可能性小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，且最優(yōu)選小于約0.001。
[0069]術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”指這樣的條件下，在該條件下，探針與其靶子序列，典型地在核酸的復(fù)雜混合物中進行雜交，而不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中應(yīng)該不同。較長的序列特別在較高溫度下雜交。核酸雜交的廣泛指導(dǎo)參見Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic
Probes (生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)-使用核探針的雜交)，"Overview of principles
of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (雜交原理和核酸測定策略綜述)"(1993)。一般地，高嚴(yán)格條件被選為比特定序列在確定的離子強度pH下熱熔點(Tm)低約5-10°C。低嚴(yán)格條件通常被選為比Tm低約15-30°C。Tm是這樣的溫度(在確定的離子強度、pH、和核濃度下)，在該溫度下，50%的與靶標(biāo)互補的探針平衡地雜交靶序列(當(dāng)靶序列過量存在時，在Tm，50%的探針平衡地被占據(jù))。雜交條件典型地是那樣的，其中鹽濃度在pH7.0-8.3下，低于約1.0M鈉離子，典型地約0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)并且溫度對于短探針(例如，10-50核苷酸)是至少約30°C且對于長探針(例如，大于50核苷酸)是至少約60°C。嚴(yán)格條件還可以使用添加去穩(wěn)定劑諸如甲酰胺來實現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號是至少兩倍背景，優(yōu)選10倍背景雜交。
[0070]在嚴(yán)格條件下不相互雜交的核酸仍然是基本相同的，條件是它們編碼的多肽基本相同。這，例如，在使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并創(chuàng)建核酸拷貝時發(fā)生。在這樣的情形中，核酸典型地在中度嚴(yán)格雜交條件下雜交。示范性“中度嚴(yán)格雜交條件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl，l%SDS緩沖液中，在37°C下雜交和在IX SSC，在45°C下洗滌。示范性“嚴(yán)格雜交條件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl，l% SDS緩沖液中，在37°C下雜交和在0.2X SSC,在溫度至少約50°C，通常約55°C -約60°C下至少一次20分鐘的洗滌，或等價條件。陽性雜交是至少兩倍背景。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易認(rèn)識到，可以使用備選的雜交和洗滌條件來提供類似嚴(yán)格性的條件。
【具體實施方式】
[0071]I?引言
[0072]本發(fā)明提供了變體Sso7聚合酶綴合物，其與包含野生型Sso7結(jié)構(gòu)域的Sso7聚合酶綴合物相比，表現(xiàn)出降低的非特異性擴增活性。所述變體Sso7聚合酶綴合物包含至少ー個與變體Sso7結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接的聚合酶結(jié)構(gòu)域。所述變體Sso7DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含在2個位置(對應(yīng)于SEQ ID NO:2中的K28和/或R43)中的ー個或兩個處的氨基酸變化(相對于該位置處的野生型氨基酸)。如在實施例中所證實的，已經(jīng)證實在這些位置處的許多相對于野生型的不同氨基酸置換會降低非特異性聚合酶活性。非特異性聚合酶活性包括，由于除雜交引物的模板特異性延伸以外的`原因而發(fā)生的核酸擴增。
[0073]II?本發(fā)明的Sso7結(jié)構(gòu)域
[0074]本發(fā)明的聚合酶綴合物包含與天然(野生型)Sso7d序列相比具有氨基酸置換的Sso7多肽序列。Sso7d是得自超嗜熱古細菌硫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)的小型(63個氨基酸，約7kd MW)堿性染色體蛋白。所述蛋白富含賴氨酸，且具有高熱、酸和化學(xué)穩(wěn)定性。它以不依賴于序列的方式結(jié)合DNA，并且當(dāng)結(jié)合時，會使DNA的Tm在相同條件下増加至多 40 0C (McAfee 等，Biochemistry (生物化學(xué))34:10063-10077，1995)。通常認(rèn)為Sso7d和它的同源物參與包裝基因組DNA并在升高的溫度下穩(wěn)定基因組DNA。Sso7d蛋白序列顯示在SEQ ID NO:2中。
[0075]存在幾種已知的Sso7d_樣蛋白(也被稱作“ Sso7蛋白”)，包括、但不限于，得自超嗜熱古細菌酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的 Sac7a、Sac7b、Sac7d (SEQ IDNO:4)、Sac7e(SEQ ID NO:5);得自 Sulfolobus tokodaii 的 Sto7e (SEQ ID NO:6)，以及得自芝田硫化葉菌(Sulfolobus shibatae)的 Ssh7a 和 Ssh7b(SEQ ID NO:3)(參見，例如，UniProt 數(shù)據(jù)庫登錄號:P39476 (Sso7d) ；059632 (Ssh7b) ；P13123 (Sac7d) ；P13125 (Sac7e)；和Q96X56(Sto7e))。這些蛋白與Sso7d具有在78%至98%范圍內(nèi)的同一性。用于本發(fā)明中的其它Sso7結(jié)構(gòu)域也可以如下面所述來鑒別。
[0076]如本文中所指出的，本發(fā)明提供了在與SEQ ID NO:2的K28和/或R43相對應(yīng)的位置處相對于天然氨基酸的氨基酸變化。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的位置命名不指示要求保護的分子本身的氨基酸的數(shù)目，而是指示當(dāng)要求保護的分子序列與SEQ ID NO:2最大程度地比對時要求保護的分子殘基所在的位置。在變體Sso7結(jié)構(gòu)域的背景下，與Sso7-樣蛋白序列的“對應(yīng)”是基于下述慣例:根據(jù)特定序列(即，SEQ ID N0:2)的氨基酸位置編號進行編號，然后以使與SEQ ID NO:2的序列同一性百分比最大化的方式與Sso7-樣蛋白序列比對。比對可以手工進行，或者使用序列比較算法進行(例如，使用具有默認(rèn)參數(shù)的NCBI BLAST程序(參見，例如，Altschul 等，Nucl.Acids Res.25:3389-3402, 1997)。與幾種含有 SEQ IDNO:2的Sso7-樣蛋白的比對的一個例子顯示在圖1中。對應(yīng)的序列可以總結(jié)如下:
【權(quán)利要求】
1.一種Sso7聚合酶綴合蛋白，其包含與聚合酶連接的Sso7結(jié)構(gòu)域；其中: 所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K);和/或 所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)， 其中所述綴合蛋白與其它方面相同的對照綴合蛋白相比具有降低的非特異性擴增活性，在所述對照綴合蛋白中，所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID N0:2的K28對應(yīng)的氨基酸是賴氨酸⑷，且所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸是精氨酸(R)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中與對照綴合蛋白的非特異性擴增活性相比，所述Sso7聚合酶綴合蛋白的非特異性擴增活性降低至少10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸不是賴氨酸(K)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2的K28對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸⑴。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸不是精氨酸(R)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2的R43對應(yīng)的氨基酸選自由以下各項組成的組:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、`甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸⑵。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶基本上沒有3’-5’外切核酸酶活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2的前58或60個氨基酸或與SEQ ID NO:2的全長基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述Sso7結(jié)構(gòu)域與SEQID NO:2至少90%相同。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶與SEQID NO:33或SEQ ID NO:61 基本(例如，至少 60、75、80、85、90 或 95% )相同。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶包含SEQID NO:33 或 SEQ ID NO:61。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶結(jié)構(gòu)域具有熱穩(wěn)定的聚合酶活性。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是家族A聚合酶結(jié)構(gòu)域。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是ATaq聚合酶結(jié)構(gòu)域。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶結(jié)構(gòu)域是家族B聚合酶結(jié)構(gòu)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的Sso7聚合酶綴合蛋白，其中所述聚合酶結(jié)構(gòu)域來自熱球菌屬(Pyrococcus)。
17.一種反應(yīng)混合物，其包含權(quán)利要求1-16中任一項所述的Sso7聚合酶綴合蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物進一步包含至少一種或多種寡核苷酸引物、一種或多種可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸探針、緩沖液、核苷三磷酸、鹽、DNA結(jié)合染料、或穩(wěn)定劑。
19.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-16中任一項所述的Sso7聚合酶綴合蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，在含有所述綴合蛋白的相同或不同容器中，所述試劑盒進一步包含以下各項中的至少一種:一種或多種寡核苷酸引物、一種或多種可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸探針、緩沖液、核苷三磷酸、鹽、DNA結(jié)合染料、或穩(wěn)定劑。
21.—種擴增樣品中的靶核酸的方法，所述方法包括:在允許用引物擴增靶核酸的條件下，在反應(yīng)混合物中溫育所述靶核酸，所述反應(yīng)混合物包含: a.至少一種引物；和 b.權(quán)利要求1-16中任一項所述的Sso7聚合酶綴合蛋白， 由此擴增所述靶核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。`
23.—種核酸，其包含編碼權(quán)利要求1-16中任一項所述的Sso7聚合酶綴合蛋白的多核苷酸。
24.一種包含重組表達盒的細胞，所述表達盒包含與權(quán)利要求23的多核苷酸可操作地連接的啟動子。
【文檔編號】C12Q1/68GK103562410SQ201280026591
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月8日
【發(fā)明者】程曼, 王巖, 約翰·蘇利文 申請人:伯樂實驗室公司