轉(zhuǎn)錄終止子序列的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供新的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)序列，尤其是包含至少兩個(gè)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，其特征在于所述連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含至少第一和相距至多1000個(gè)核苷酸的第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，并且終止信號(hào)中至少一個(gè)具有或編碼RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】轉(zhuǎn)錄終止子序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及表達(dá)系統(tǒng)和多核苷酸構(gòu)建體的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]為了通過(guò)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)足夠產(chǎn)量的重組蛋白，在設(shè)計(jì)多核苷酸構(gòu)建體和重組表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，必須考慮多個(gè)方面。重要的方面是宿主細(xì)胞培養(yǎng)的類(lèi)型以及選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染系統(tǒng)，以保證在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的細(xì)胞活性和保證高表達(dá)效率。這些關(guān)注點(diǎn)常常是相悖的，因?yàn)楦叩谋磉_(dá)速率(expression rate) (二級(jí)蛋白的高表達(dá)速率對(duì)存活不是必要的)對(duì)細(xì)胞的健康和存活是有害的。需要可控的表達(dá)系統(tǒng)以允許對(duì)表達(dá)速率和對(duì)細(xì)胞代謝的修飾進(jìn)行特異性調(diào)整。重組表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)重要方面是轉(zhuǎn)錄效率，包括終止的效率。低終止效率導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄通讀和產(chǎn)生冗長(zhǎng)的mRNA,該mRNA本身對(duì)細(xì)胞造成負(fù)擔(dān)，但更嚴(yán)重的是該mRNA會(huì)導(dǎo)致不需要的蛋白的表達(dá)或擾亂轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的復(fù)制控制，尤其是在質(zhì)粒載體領(lǐng)域。不需要的復(fù)制反過(guò)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的許多拷貝數(shù)，因此給細(xì)胞系統(tǒng)增加了代謝負(fù)擔(dān)，使低效表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題加倍。
[0003]轉(zhuǎn)錄位于細(xì)胞基因表達(dá)的核心，因此可呈現(xiàn)出最強(qiáng)大的選擇來(lái)操控單基因或基因群的表達(dá)速率。當(dāng)三元復(fù)合體組成，其必足夠穩(wěn)定以允許，在非終止轉(zhuǎn)錄暫?；蜓舆t期間，每秒并入多達(dá)上百個(gè)堿基，而無(wú)需RNA聚合酶的解離。因此，延伸RNA聚合酶與模板DNA以及生成的RNA轉(zhuǎn)錄物的緊密結(jié)合，對(duì)于生產(chǎn)具有數(shù)百或上千核苷酸長(zhǎng)度的mRNA的能力而言是必不可少的。
[0004]在轉(zhuǎn)錄起始后以及異常穩(wěn)定的三元復(fù)合物組成后，酶沿著模板移動(dòng)，一個(gè)接一個(gè)地并入核苷酸并產(chǎn)生所需的RNA鏈。RNA的合成與單基因或轉(zhuǎn)錄操縱子的mRNA的釋放必須在模板上的不同位點(diǎn)上停止。這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄終止，這個(gè)過(guò)程與轉(zhuǎn)錄起始期間的事件相類(lèi)似但是順序相反，結(jié)果導(dǎo)致了 RNA聚合酶的解離以及轉(zhuǎn)錄的RNA的釋放。對(duì)模板DNA中的明確信號(hào)(所謂的轉(zhuǎn)錄終止子)作`出響應(yīng)時(shí)發(fā)生終止。就像每一個(gè)生物過(guò)程一樣，甚至終止也不是決定勝負(fù)的，因此終止并不以100%的程度發(fā)生。事實(shí)上，終止子在其終止效率上變化很廣泛，在終止效率(TE)上有巨大的差異。事實(shí)上，終止信號(hào)對(duì)給定的RNA聚合酶是高度特異的。非終止事件也被描述為聚合酶的通讀。
[0005]終止子可以分成幾組。在終止信號(hào)的第一組，核心酶可在體外在缺少任何其它因子的情況下在某些位點(diǎn)上終止(如體外實(shí)驗(yàn)所測(cè)試的)。這些終止位點(diǎn)稱(chēng)為固有(intrinsic)終止子或I類(lèi)終止子。固有終止子常常具有一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)特征，稱(chēng)為發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。一方面，發(fā)夾包含莖結(jié)構(gòu)，其由富含dG-dC序列的雙重對(duì)稱(chēng)(dyad asymmetric)結(jié)構(gòu)所編碼。另一方面，該終止子在緊隨莖結(jié)構(gòu)后的3’端又展示了富含dA-dT的區(qū)。當(dāng)RNA聚合酶在發(fā)夾結(jié)構(gòu)上暫停時(shí)，3’端富含鳥(niǎo)苷的區(qū)被認(rèn)為有助于轉(zhuǎn)錄物釋放。
[0006]很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)，在莖結(jié)構(gòu)內(nèi)的由G-C對(duì)所介導(dǎo)的發(fā)夾的穩(wěn)定性，被認(rèn)為是影響TE的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的最基本部分(compartment)。在莖結(jié)構(gòu)上插入假定的堿基,在理論上應(yīng)導(dǎo)致更高的整體Λ G值，并且因此整體TE應(yīng)升高。令人吃驚的是，通過(guò)插入G-C對(duì)來(lái)增加熱力學(xué)穩(wěn)定性，并未導(dǎo)致更高的TE，這說(shuō)明發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并不是終止的唯一基本決定因素。據(jù)推測(cè)，除了穩(wěn)定性之外，發(fā)夾的三維結(jié)構(gòu)在終止中也起重要作用。對(duì)最典型的固有終止子而言，從莖結(jié)構(gòu)的第一個(gè)封閉堿基對(duì)(closing base pair)到第一終止位置的距離是保守的。該不變性可看作是三維結(jié)構(gòu)重要性的假定證據(jù)。作為結(jié)論，發(fā)夾似乎具有(assume)一個(gè)截然不同的三維形狀以便與延伸聚合酶相互作用。
[0007]Wilson和 von Hippel (PNAS92, 1995; 8793-8797)描述了 tR2 發(fā)夾終止子的變體以及使用大腸桿菌(E.coli)RNA聚合酶的終止效率。最大終止效率的最佳發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有至多有8或9個(gè)G/C堿基對(duì)的莖以及有4-8個(gè)殘基跟隨其后是6-8個(gè)rU殘基的環(huán)。進(jìn)一步延長(zhǎng)該莖則降低轉(zhuǎn)錄效率。
[0008]Orosz 等人(Eur.J.Biochem201, 1991:653-659)調(diào)查了使用大腸桿菌 RNA 聚合酶的rrnB基因的大腸桿菌終止子的結(jié)構(gòu)需求。天然終止子區(qū)由兩個(gè)發(fā)夾終止子和兩段間斷的小重復(fù)組成，每段間斷的小重復(fù)被認(rèn)為各自都能形成小的莖。有意思的是，刪除第一終止子外的所有結(jié)構(gòu)不導(dǎo)致終止效率的降低。第一終止子的莖具有43%的G/C含量。
[0009]Jeng 等人(J Biol Chem267 (27)，1992:19306-19312)描述了使用噬菌體 T7RNA聚合酶的thr弱化子(attenuator)的體外終止。thr弱化子的終止可能受thr弱化子上游和遠(yuǎn)端(distal)的遠(yuǎn)端(remote)序列影響，具有7對(duì)G/C堿基對(duì)和可變A/T附加序列(additions)的富含G/C的莖環(huán)發(fā)夾,在發(fā)夾前的脫氧胸苷延伸(stretch)以及環(huán)結(jié)構(gòu)(偏好thr弱化子的反向序列)。隨后的調(diào)查顯示，對(duì)終止而言，莖環(huán)上游的腺苷殘基延伸是不需要的(Yang 等人，J Biol Chem270 (49)，1995:23330-23336)。
[0010]終止子包含在細(xì)菌的序列中，例如在質(zhì)粒pAPEC-01-ColBM(NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)acc.n0.NC_009837.1)或大腸桿菌 APEC 01 株的基因組中(NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù) acc.n0.NC_008563.1)。
[0011]Carafa 等人(J Mol Biol216(4) (1999):835-858)描述了 Rho 依賴(lài)性的大腸桿菌
轉(zhuǎn)錄終止子。
[0012]Mitra 等人(Nucleic Acids Research, 39 (2011):D129_D135)提供了 WebGeSTer數(shù)據(jù)庫(kù)的展示，轉(zhuǎn)錄終止子數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0013]Unniraman 等人(Nucleic Acids Research30 (3) (2002): 675-684)提供了某些終止子結(jié)構(gòu)和分類(lèi)的綜述。
[0014]Quiagen 的 QIAexpress pQE 載體(“The QIAexpress System”，TheQIAexpressionist06/2003,第5版，，第15頁(yè))包含兩個(gè)終止子。
[0015]Unniraman 等人(Journal of Biological Chemistry, 276 (45)(2001):41850-41855)涉及真細(xì)菌的固有轉(zhuǎn)錄終止子。
[0016]Friedman 等人(Annual Review of Genetics, 21(1) (1987): 453-488)提供了 I 類(lèi)和II類(lèi)終止子的綜述。
[0017]Lesnik 等人(Nucleic Acid Research, 29 (17) (2001): 3583-3594)描述了用于研究固有rho依賴(lài)性終止子的RNA基序項(xiàng)目(RNAMotif )。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]本發(fā)明的目的是通過(guò)有效的轉(zhuǎn)錄終止提供改進(jìn)的表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)系統(tǒng)具有提高的所需產(chǎn)物的表達(dá)效率，尤其是高度加工的RNA聚合酶，如T7RNA聚合酶的表達(dá)效率。[0019]這個(gè)目的通過(guò)權(quán)利要求的主題和本文描述的定義得以解決。
[0020]在第一方面，本發(fā)明提供包含至少兩個(gè)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，其中所述連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含至少第一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和至多相距1000個(gè)核苷酸的第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，并且終止信號(hào)中至少有一個(gè)具有或編碼RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，連續(xù)的終止信號(hào)能夠互相影響并導(dǎo)致終止效率的顯著增加，尤其是如果至少一個(gè)終止子包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)。所述發(fā)夾具有包含至少12對(duì)內(nèi)部堿基對(duì)的莖的結(jié)構(gòu)，其中具有至少60%的G或C("G/C")核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)夾有在第二方面所限定的特定結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供包含2、3、4或更多終止信號(hào)的組合的多核苷酸，終止信號(hào)是可操縱地連接的以允許在之前編碼的序列轉(zhuǎn)錄之后以協(xié)同的行動(dòng)(concerted action)終止，用于增加終止效率。
[0021]在第二方面，本發(fā)明還提供包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含具有序列Y-U/T-NNG-Z的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，
[0022]其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少70%的G/C含量的核苷酸序列；
[0023]Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，
[0024]Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，序列U/T-NNG是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)，其中N是選自T (U)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG優(yōu)選是U/T-U/T-CG。該第二方面與發(fā)明的第一方面可組合:考慮到滿(mǎn)足第一方面的限制(Y和Z至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng))，這種類(lèi)型的終止子也可以用作多核苷酸上的二級(jí)發(fā)夾，或者可進(jìn)一步限定一級(jí)發(fā)夾。尤其是如果用作特定基因或表達(dá)構(gòu)建體的唯一終止子時(shí)，優(yōu)選較長(zhǎng)的莖結(jié)構(gòu)，例如至少13、
14、15、16或更多堿基對(duì)(Y和Z)。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)進(jìn)一步增加G/C含量、莖的互補(bǔ)性以及對(duì)環(huán)進(jìn)行優(yōu)化(這些將在下文中詳述)可以提高終止效率。如根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的，所有這些選擇增加發(fā)夾的穩(wěn) 定性，其導(dǎo)致終止效率增加。一般而言，發(fā)夾的形成吉布斯能(Gibbs-energy, dG)通過(guò)這些結(jié)構(gòu)優(yōu)化得以降低。然而，如Wilson和von Hippel (見(jiàn)前)已發(fā)現(xiàn)的，單一的dG優(yōu)化并不必然導(dǎo)致終止效率的增加:增加莖長(zhǎng)度至超過(guò)9個(gè)堿基對(duì)-雖然其降低dG (并且增加發(fā)夾的穩(wěn)定性)-并不導(dǎo)致終止效率的增加。
[0025]如本文所用，在核苷酸序列中的“/”或用括號(hào)括起的核苷酸指的是替代的核苷酸，例如在RNA序列中替代的U取代在DNA序列中的T。因此，U/T或U(T)表示一個(gè)可以是U或是T的核苷酸位點(diǎn)。同樣地，A/T指的是核苷酸A或T ;G/C指的是核苷酸G或C。因?yàn)閁和T之間的功能的同一性，本文中任何對(duì)U或T的引用，也可被視作對(duì)T或U中另一個(gè)的公開(kāi)。例如，對(duì)(在RNA上的)序列UUCG的引用也可被理解為(在對(duì)應(yīng)的DNA上的)序列TTCG的公開(kāi)。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，這些選擇中只有一個(gè)可用于本文描述。
[0026]互補(bǔ)的核苷酸或堿基是那些能夠堿基配對(duì)的，例如A和T (或U) ；G和C ；G和U。
[0027]發(fā)夾或莖環(huán)(stem-loop)是RNA單鏈部分的RNA結(jié)構(gòu),RNA單鏈部分自身折疊形成莖內(nèi)的(內(nèi)部)堿基對(duì)以及在莖部分之間的中間環(huán)序列上沒(méi)有堿基配對(duì)。環(huán)優(yōu)選是短的，如長(zhǎng)度是3、4、5、6、7或8個(gè)核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸可有1、2、3、4個(gè)或更多的發(fā)夾，如本文所限定的至少1、2、3或4，其中至少一個(gè)具有至少12個(gè)堿基對(duì)的較大莖長(zhǎng)度，優(yōu)選在14到26堿基對(duì)范圍內(nèi)。
[0028]本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA (通常編碼終止子)或者RNA (其通常能夠折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并可包含發(fā)明的終止子)。多核苷酸可以是單鏈(尤其是對(duì)RNA)或者是雙鏈(尤其是對(duì)DNA)。
[0029]如本文所用，“同一性”意為當(dāng)比對(duì)序列以使序列匹配最大化時(shí)在兩個(gè)或多個(gè)序列中對(duì)應(yīng)位置上相同核苷酸所占的比例，即，考慮到空位(gaps)和插入。設(shè)計(jì)確定同一性的方法用于在測(cè)試的序列之間給出最大的匹配。此外，確定同一性的方法編碼于公開(kāi)可用的計(jì)算機(jī)程序。在兩序列間確定同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不僅限于GCG程序包、BLASTP, BLASTNjP FASTA。BLAST程序從NCBI和其它資源可以公開(kāi)獲得(BLAST手冊(cè),Altschul, S 等人.，NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S 等人.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)。公知的Smith Waterman算法也可用于確定同一性。能夠例如使用具有11.0的開(kāi)放空位(open gap)罰分和1.0的延伸空位(extended gap)罰分的默認(rèn)參數(shù)來(lái)運(yùn)行以及使用blosum-62矩陣來(lái)運(yùn)行BLASTN。 [0030]如本文所用，“包含”(comprising)可理解為對(duì)開(kāi)放式限定的引用，允許相似的其它成員或其它特征?！坝伞M成”(Consisting of)可理解為涉及有限范圍的特征的封閉式限定。
[0031]本文使用的“終止”(Termination)，如果沒(méi)有另外注明，指的是轉(zhuǎn)錄終止?！敖K止信號(hào)”或(Termination signal)僅“終止子”(terminator),如果沒(méi)有另外注明，指的是“轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)”(transcription termination signal)。終止子是妨礙或是阻止聚合酶轉(zhuǎn)錄的序列。本發(fā)明的終止子是為T(mén)7RNA聚合酶特別優(yōu)化的，但是也能在一定程度上影響其它RNA聚合酶的終止。
[0032]“0RF”或“開(kāi)放閱讀框”是能被翻譯成多肽的核苷酸序列。這樣的延伸序列的編碼序列(“CDS”)不能被終止密碼子打斷。終止密碼子可以存在于基因表達(dá)期間被刪除的內(nèi)含子中。代表全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的編碼序列的ORF起始于“起始”密碼子，通常是ATG，終止于“終止”密碼子之一。出于本申請(qǐng)的目的，ORF可以是編碼序列的任何部分，具有或沒(méi)有起始和/或終止密碼子。對(duì)編碼基因產(chǎn)物的序列而言，“0RF”和“⑶S”可以互換使用。
[0033]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”或“可操作地定位”(operably positioned)涉及0RF,例如在表達(dá)盒中(expression cassette),其意思是具有本發(fā)明的終止子活性的序列與該核酸分子的另一核苷酸組件在功能上相關(guān)。例如，如果終止子影響到編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該終止子與編碼序列可操作地連接。這樣的可操作的連接可以例如通過(guò)在和基因編碼序列相同的DNA分子上提供本發(fā)明的終止子。如果兩個(gè)或更多的終止子彼此被定位用于為之前的編碼序列提供協(xié)同的終止，那么它們可以是可操作地連接的。尤其優(yōu)選地，終止子序列位于編碼序列的下游，例如在編碼序列的3’位置。終止子可以在編碼序列的下游，例如至少I(mǎi)個(gè)、至少10個(gè)、至少30個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少150個(gè)、至少200個(gè)、至少250個(gè)、至少300個(gè)、至少400個(gè)、至少500個(gè)核苷酸處，或者終止子可與編碼序列直接相鄰。終止子序列，以其組合或其獨(dú)立的形式，可以位于編碼序列的下游10000個(gè)以?xún)?nèi)、8000個(gè)以?xún)?nèi)、6000個(gè)以?xún)?nèi)、5000個(gè)以?xún)?nèi)、4500個(gè)以?xún)?nèi)、4000個(gè)以?xún)?nèi)、3500個(gè)以?xún)?nèi)、3000個(gè)以?xún)?nèi)、2500個(gè)以?xún)?nèi)、2000個(gè)以?xún)?nèi)、1500個(gè)以?xún)?nèi)、1000個(gè)以?xún)?nèi)、750個(gè)以?xún)?nèi)、500個(gè)以?xún)?nèi)、250個(gè)以?xún)?nèi)、100個(gè)以?xún)?nèi)核苷酸處。
[0034]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸可包含第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，其任選地包含或編碼RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)(例如上文所限定的，然而獨(dú)立地選自任何其它發(fā)夾終止子，或其它)，所述第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)與第一或第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)相距至多1000個(gè)核苷酸。第一、第二和任選的第三終止子可以被放置在(相同的)基因或編碼序列的末端，用以停止所述基因或編碼序列的轉(zhuǎn)錄。多核苷酸可包含其它終止子。
[0035]在第一和第二終止子之間的核苷酸距離，在第一和第三終止子之間的和/或在第二和第三終止子之間的核苷酸距離可各自單獨(dú)地選自下述任何范圍，至多1000個(gè)核苷酸、至多900個(gè)核苷酸、至多800個(gè)核苷酸、至多700個(gè)核苷酸、至多600個(gè)核苷酸、至多500個(gè)核苷酸、至多400個(gè)核苷酸、至多300個(gè)核苷酸、至多250個(gè)核苷酸、至多200個(gè)核苷酸、至多180個(gè)核苷酸、至多160個(gè)核苷酸、至多150個(gè)核苷酸、至多140個(gè)核苷酸、至多130個(gè)核苷酸、至多120個(gè)核苷酸、至多110個(gè)核苷酸、至多100個(gè)核苷酸、至多90個(gè)核苷酸、至多80個(gè)核苷酸、至多70個(gè)核苷酸、至多60個(gè)核苷酸、至多50個(gè)核苷酸。此外，在第一和第二終止子之間的核苷酸距離，在第一和第三終止子之間的和/或在第二和第三終止子之間的核苷酸距離可各自單獨(dú)地選自下述任何范圍，至少10個(gè)核苷酸、至少15個(gè)核苷酸、至少20個(gè)核苷酸、至少30個(gè)核苷酸、至少40個(gè)核苷酸、至少50個(gè)核苷酸、至少60個(gè)核苷酸、至少70個(gè)核苷酸、至少80個(gè)核苷酸。終止子在多核苷酸上的放置可允許可操作的定位以影響其它終止子的終止。
[0036]發(fā)夾是包含分子內(nèi)堿基配對(duì)的莖環(huán)序列，發(fā)夾也是一種能在單鏈DNA或，更通常地，在RNA中發(fā)生的模式(pattern)。所述結(jié)構(gòu)也稱(chēng)為發(fā)夾環(huán)。當(dāng)同一鏈上的兩個(gè)區(qū)，以相反方向閱讀時(shí)核苷酸序列上大部分互補(bǔ)時(shí)，堿基對(duì)形成末端是未配對(duì)環(huán)的雙螺旋，而產(chǎn)生發(fā)夾。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成依賴(lài)于生成的螺旋和環(huán)區(qū)的穩(wěn)定性。顯然，第一前提是存在能夠自身回折以形成配對(duì)的雙螺旋的序列。該螺旋的穩(wěn)定性取決于其長(zhǎng)度、錯(cuò)配數(shù)或其包含的凸出(bulges)數(shù)(小數(shù)目是可容許的，尤其是在長(zhǎng)螺旋中)以及配對(duì)區(qū)的堿基組成。鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶之間的配對(duì)具有三個(gè)氫鍵，比腺嘌呤-尿嘧啶的配對(duì)(只有兩個(gè)氫鍵)更穩(wěn)定。在RNA中，以?xún)蓚€(gè)氫鍵為特征的鳥(niǎo)嘌呤-尿嘧啶配對(duì)也是常見(jiàn)和有利的。堿基堆積相互作用，使堿基的芳香環(huán)的Pi軌道以有 利的方向排列，也促進(jìn)螺旋的形成。
[0037]在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被序列Y-X-Z所限定，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，并具有至少40%的G/C含量，優(yōu)選至少50%，尤其優(yōu)選至少60%，
[0038]X是3至9核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，X是沒(méi)有與Y或Z (也沒(méi)有在X內(nèi)部)配對(duì)的堿基的環(huán)。優(yōu)選X在是3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)或8個(gè)核苷酸長(zhǎng)。這種一般結(jié)構(gòu)能夠通過(guò)增加莖的G/C含量、優(yōu)化環(huán)以及增加Y和Z之間的互補(bǔ)性來(lái)進(jìn)一步改善TE。X的四元環(huán)(tetraloop)(長(zhǎng)度為4)結(jié)構(gòu)是尤其優(yōu)選的。X可包含或可由序列U/T-NNG組成，或反之亦然，其中N是選自U (T)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG優(yōu)選是U/T-NCG，尤其是U/T-U/T-CG。在Y和Z上具有相鄰G/C的四元環(huán)形成非常穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)，其顯示出非常高的終止效率并且屬于本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中。
[0039]這樣的式X-Y-Z的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可位于第一、第二和/或第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上。其它終止信號(hào)可包含其它的發(fā)夾終止子或替代的非發(fā)夾(例如II類(lèi))終止子，或者當(dāng)然也可包含式X-Y-Z的發(fā)夾的終止子，其中Y、x和Z是獨(dú)立選擇的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含兩個(gè)發(fā)夾終止子，尤其優(yōu)選其中一個(gè)或兩個(gè)是本發(fā)明的X-Y-Z結(jié)構(gòu)。
[0040]本發(fā)明也提供包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，該轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含具有所述序列Y-U/T-NNG-Z的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，[0041]其中Y是至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，并具有至少60%的G/C含量，
[0042]Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，
[0043]Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，序列U/T-NNG是沒(méi)有與Y或Z相配對(duì)的堿基的環(huán)，其中N是選自T (U)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG優(yōu)選是U/T-U/T-CG。這樣的具有上述Y-X-Z結(jié)構(gòu)的多核苷酸，其中X是U/T-NNG (當(dāng)然任選地也包括反之亦然)，可包含僅一個(gè)終止子，尤其是其位置獨(dú)立于其它終止子，例如可操作地連接至ORF或可插入ORF的克隆位點(diǎn)。涉及χ-y-ζ發(fā)夾的上文和下文適用于本發(fā)明的所有方面。
[0044]在發(fā)夾的莖(Y或Z或兩者一起)中高G/C含量在能量上是有利的，導(dǎo)致高度穩(wěn)定的發(fā)夾，繼而增加終止效率。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在Y或Z或兩者的核苷酸中的G/C含量是至少50%、至少52%、至少54%、至少56%、至少58%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%。
[0045]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(第一、第二和/或第三)包含富含A/T (U)的區(qū)，該區(qū)是至少4個(gè)、優(yōu)選至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10個(gè)核苷酸長(zhǎng)，該區(qū)包含至少75%的A或T (U)，其中所述富含A/T (U)的區(qū)優(yōu)選位于發(fā)夾下游，尤其優(yōu)選地距所述發(fā)夾不多于20個(gè)核苷酸。富含A/T(U)的區(qū)可包含選自A/T (U)的至少3個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、或至少10個(gè)核苷酸,優(yōu)選至多I個(gè)、至多2個(gè)、至多3個(gè)G/C核苷酸。尤其優(yōu)選富含A/T(U)的區(qū)是與發(fā)夾直接相鄰，或者與發(fā)夾相距(通常下游)至多20個(gè)核苷酸、優(yōu)選至多15個(gè)核苷酸、至多12個(gè)核苷酸、至多10個(gè)核苷酸、至多8個(gè)核苷酸、至多7個(gè)核苷酸、至多6個(gè)核苷酸、至多5個(gè)核苷酸、至多4個(gè)核苷酸、至多3個(gè)核苷酸、至多2個(gè)核苷酸、至多I個(gè)核苷酸。富含A/T(U)的區(qū)可以是富含T(U)的，而且優(yōu)選包含至少3個(gè)T (U)、至少4個(gè)T (U)、至少5個(gè)T (U)、至少6個(gè)T (U)、至少7個(gè)T (U)或至少8個(gè)T(U)。富含A/T(U)的區(qū)在長(zhǎng)度上可以多至20、多至15、多至12、多至10、多至8個(gè)核苷酸。發(fā)夾下游的富含A/T(U)的區(qū)通常增加終止效率。其可與莖(Z)重疊。在這種情況下，優(yōu)選地，Z的最后I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)核苷酸可是A或T(U)，優(yōu)選T(U)。
[0046]在本發(fā)明的式Y(jié)-X-Z的發(fā)夾中，優(yōu)選Y在長(zhǎng)度上是9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30個(gè)核苷酸。Y的長(zhǎng)度，通過(guò)互補(bǔ)性決定Z的長(zhǎng)度，其可選自相同的核苷酸長(zhǎng)度?；旧匣パa(bǔ)的Y和Z，即發(fā)夾的莖，的長(zhǎng)度在堿基對(duì)上決定莖的長(zhǎng)度。該莖并不一定是100%互補(bǔ)的，如下文所述，而是對(duì)于Y和Z具有有限的非互補(bǔ)的不同喊基(opposing bases)。
[0047]尤其地，Y和Z可以是m個(gè)核苷酸長(zhǎng)，其中Y由核苷酸I1到y(tǒng)m組成，Z由核苷酸Z1到 zm 組成,發(fā)夾由序列 ymym-lym_2...Υ8Υ7Υ6Υ5Υ4Υ3Υ2Υ1_Χ_Ζ1Ζ2Ζ3Ζ4Ζ5Ζ6Ζ7Ζ8...ZnrlZm 組成。優(yōu)選Z1與I1互補(bǔ)，以及Zm與ym互補(bǔ)，意思是發(fā)夾的莖的端點(diǎn)是互補(bǔ)的。此外，任何一個(gè)ya都可以與Za互補(bǔ)，a是從I到m的整數(shù)，尤其是在73和Za之間的互補(bǔ)性，a可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或 30 以及其任意組合。尤其優(yōu)選地，莖的開(kāi)始的和\或最后的I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)核苷酸是互補(bǔ)的。
[0048]Y和Z需具有高互補(bǔ)性以形成高效和穩(wěn)定的發(fā)夾，例如，Y和Z至少80%互補(bǔ)，優(yōu)選至少82%、至少84%、至少85%、至少86%、至少88%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或者甚至100%互補(bǔ)。最優(yōu)選地，互補(bǔ)性是至少70%、優(yōu)選地至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或者至少100%G_C或A-T (U)互補(bǔ)性。[0049]在由X和Z形成的莖結(jié)構(gòu)中，應(yīng)該限制非互補(bǔ)性(non-complementarites)。某些有限的非互補(bǔ)性是可能的，但是不應(yīng)將其相鄰放置以避免形成“泡”(bubble)或額外的環(huán)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在發(fā)夾內(nèi)，Y和Z的核苷酸之間，至多3、2或I個(gè)G-U互補(bǔ)與另一個(gè)G-U互補(bǔ)相鄰，優(yōu)選無(wú)相鄰G-U互補(bǔ)的發(fā)夾。[0050]本發(fā)明的一個(gè)尤其優(yōu)選的終止子是SEQ ID N0:4編碼。本發(fā)明擴(kuò)充至與SEQ IDNO:4編碼的終止子有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的其它同源終止子。優(yōu)選地，非同一'I"生(non-1dentities)仍然如上文所限定的,例如,形成沒(méi)有或有限的非互補(bǔ)的莖結(jié)構(gòu)或者形成如前所述的富含A/T的區(qū)。SEQ ID NO:4描述一個(gè)人工優(yōu)化的終止子，具有莖(ntsl至16,21至36)、環(huán)(ntsl7至20)和莖之后的富含A/U的區(qū)(nts37至40)。其在莖結(jié)構(gòu)上(25/32nts)具有78%的G/C含量。[0051]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸的終止子中的至少一個(gè)是II類(lèi)終止子。[0052]與通常的發(fā)夾樣終止子相反，終止事件(II類(lèi)終止子的作用需要非編碼鏈的存在)，因此是雙鏈驅(qū)動(dòng)過(guò)程(He等人.，J Biol Chem267, 1998:19306-19312)。進(jìn)一步的證據(jù)是，在這些新序列上的轉(zhuǎn)錄終止，所謂的II類(lèi)終止信號(hào)，是通過(guò)獨(dú)立于I類(lèi)終止途經(jīng)的機(jī)制介導(dǎo)的，源于使用突變的T7RNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄分析。在20kDa N-端部分和80kDaC-端片段之間的突變導(dǎo)致該聚合酶的“切口 ”(nicked)形，其不能在II類(lèi)終止信號(hào)上終止，但是當(dāng)轉(zhuǎn)錄包含I類(lèi)終止信號(hào)的發(fā)夾時(shí)，其依然能夠阻止延伸(Lyakhov等人.，J MolBiol269, 1997:28-40)。因此，在大腸桿菌中有兩種不同的機(jī)制能夠完成轉(zhuǎn)錄的終止，并且兩種途徑是彼此獨(dú)立地操作。[0053]對(duì)推測(cè)的(putative)生物體的序列分析揭示存在其它II類(lèi)終止信號(hào)。這些不尋常的序列存在于大腸桿菌rrnB Tl終止位點(diǎn)內(nèi)、在水皰性口炎病毒(vesicular stomatitisvirus, VSV)的cDNA拷貝上、在腺病毒DNA中、以及在噬菌體的lambda DNA上(Zhang和Studier, 1995) (Sousa等人.，1992)。與固有終止信號(hào)上的U串(U_run)相比，所有這些新發(fā)現(xiàn)的序列共享7bp長(zhǎng)的共有序列(根據(jù)非模板鏈ATCTGTT)和3’端的不均衡的(unequally)長(zhǎng)串尿苷。[0054]II類(lèi)終止子的實(shí)例是:[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種包含至少兩個(gè)連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，其特征在于所述連續(xù)的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含至少第一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和相距至多1000個(gè)核苷酸的第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，并且終止信號(hào)中至少一個(gè)具有或編碼RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含具有至少60%G或C核酸的至少12對(duì)內(nèi)部堿基對(duì)的莖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其包含第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，任選地包含或編碼RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所述第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)距所述第一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)至多1000個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)由序列Y-X-Z所限定，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列， Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于X具有3、4、5、6、7、8或9個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，其特征在于X包含或由序列U/T-NNG組成，其中N是選自U (T)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG優(yōu)選是U/T-NCG，尤其是U/T-U/T-CG。
6.根據(jù) 權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于所述第一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、第二轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和/或第三轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含如權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所限定的所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)中至少一個(gè)包含如權(quán)利要求5所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且至少另一轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含權(quán)利要求3所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y、X和Z被獨(dú)立地選擇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中所述終止子信號(hào)中至少一個(gè)是II類(lèi)終止子。
8.一種包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的多核苷酸，所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含具有序列Y-U/T-NNG-Z的發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%的G/C含量的核苷酸序列， Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列， Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及序列U/T-NNG是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)，其中N是選自T (U)、A、C、G的任一核苷酸；序列U/T-NNG優(yōu)選是U/T-U/T-CG。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包含含有至少75°從或1'出)的至少4個(gè)核苷酸長(zhǎng)的富含A/T (U)的區(qū)，其中所述富含A/T (U)的區(qū)優(yōu)選位于發(fā)夾的下游，尤其優(yōu)選距所述發(fā)夾不多于20個(gè)核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于Y是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或 30 個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求3至10中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于Y和Z是m個(gè)核苷酸長(zhǎng)，Y由核苷酸Ii至ym組成，以及Z由核苷酸Z1至Zm組成,所述發(fā)夾由序列ymym-lym_2...y8y7y6y5y4y3y2y「X_ZlZ2Z3Z4Z5Z6Z7Z8...ZnriZm 組成,其中 Z1 與 Y1 互補(bǔ)，以及 Zm 與 ym 互補(bǔ)。
12.根據(jù)權(quán)利要求3至11中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于Y和z至少80%互補(bǔ)，優(yōu)選至少90%互補(bǔ)，尤其優(yōu)選100%互補(bǔ)，最優(yōu)選具有至少70%G-C或A-T⑶互補(bǔ)性。
13.根據(jù)權(quán)利要求3至12中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于在所述發(fā)夾中，在Y和Z的核苷酸之間，至多3、2或I個(gè)G-U互補(bǔ)與另一個(gè)G-U互補(bǔ)相鄰，優(yōu)選沒(méi)有相鄰的G-U互補(bǔ)的發(fā)夾。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述多核苷酸是DNA，其編碼如權(quán)利要求I至12中任一項(xiàng)所限定的終止信號(hào)；或者所述多核苷酸是包含權(quán)利要求1至12所限定的終止信號(hào)的RNA。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，所述多核苷酸尺寸是至多10000個(gè)核苷酸長(zhǎng)。
16.—種根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的多核苷酸,其特征在于所述多核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)，所述限制性位點(diǎn)位于所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的側(cè)面和/或位于轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上游的克隆位點(diǎn)的側(cè)面，或位于轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上游的編碼序列的側(cè)面，優(yōu)選編碼序列還與啟動(dòng)子可操作地連接。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)和第二終止子信號(hào)， 所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少80%互補(bǔ)性的核苷酸序列， Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第二終止子信號(hào)包含II類(lèi)終止信號(hào)，優(yōu)選地包含共有序列TCTGTT，尤其優(yōu)選地包含具有至少40%的T含量的至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)和第二終止子信號(hào)， 所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少14個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少90%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第二終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)；其中第一終止子和第二終止子相距至多1000個(gè)核苷酸以通過(guò)第一終止信號(hào)和第二終止信號(hào)提供協(xié)同的終止，其中第一終止子和第二終止子的Y、X和Z可獨(dú)立地選擇，尤其如權(quán)利要求4、5、10至13所限定。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)和第二終止子信號(hào)， 所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列，X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及Z是與Y具有至少80%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)；所述第二終止子信號(hào)包含II類(lèi)終止信號(hào)，優(yōu)選地包含共有序列TCTGTT，尤其優(yōu)選地包含具有至少40%的T含量的至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)、第二終止子信號(hào)和第三終止子信號(hào)， 所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列，X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及Z是與Y具有至少80%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第二終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第三終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)；` 其中所述第一終止子、第二終止子和第三終止子相距至多1000個(gè)核苷酸以通過(guò)第一終止信號(hào)、第二終止信號(hào)和第三終止信號(hào)提供協(xié)同的終止，其中第一終止子、第二終止子或第三終止子的Y、X和Z可獨(dú)立地選擇，尤其如權(quán)利要求4、5、10至13所限定。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)、第二終止子信號(hào)和第三終止子信號(hào)， 所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列，X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及Z是與Y具有至少80%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第二終止子信號(hào)包含II類(lèi)終止信號(hào)，優(yōu)選地包含共有序列TCTGTT，尤其優(yōu)選地包含具有至少40%的T含量的至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列； 所述第三終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)；其中第一終止子、第二終止子和第三終止子相距至多1000個(gè)核苷酸以通過(guò)第一終止信號(hào)、第二終止信號(hào)和第三終止信號(hào)提供協(xié)同的終止，其中第一終止子或第三終止子的Y、X和Z以及II類(lèi)終止信號(hào)的共有且富含T的序列可獨(dú)立地選擇，尤其如權(quán)利要求4、5、10至13所限定。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其包含第一終止子信號(hào)、第二終止子信號(hào)和第三終止子信號(hào)，所述第一終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的，其中Y是至少12個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少60%，優(yōu)選至少65%的G/C含量的核苷酸序列，X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及Z是與Y具有至少80%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)； 所述第二終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)，以及與所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)相鄰的II類(lèi)終止信號(hào)，優(yōu)選包含共有序列TCTGTT，尤其優(yōu)選地包含具有至少40%的T含量的至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列； 所述第三終止子信號(hào)包含由序列Y-X-Z所限定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中Y是至少8個(gè)核苷酸長(zhǎng)并具有至少40%，優(yōu)選至少50%，尤其至少60%的G/C含量的核苷酸序列， X是3至9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的核苷酸序列，以及 Z是與Y具有至少70%互補(bǔ)性的核苷酸序列，Z的互補(bǔ)核苷酸與Y的核苷酸堿基配對(duì)，以及X是沒(méi)有與Y或Z配對(duì)的堿基的環(huán)；其中第一終止子、第二終止子和第三終止子相距至多1000個(gè)核苷酸以通過(guò)第一終止信號(hào)、第二終止信號(hào)和第三終止信號(hào)提供協(xié)同的終止，其中第一終止子、第二終止子或第三終止子的Y、X和Z以及II類(lèi)終止信號(hào)的共有且富含T的序列可獨(dú)立地選擇，尤其如權(quán)利要求4、5、10至13所限定。
23.一種表達(dá)盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列和編碼序列，其中為了終止所述編碼序列，對(duì)所述序列進(jìn)行可操作地定位。
24.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求18所述的表達(dá)盒，所述載體優(yōu)選是質(zhì)粒。
25.一種包含多核苷酸分子的細(xì)胞，其中基因，優(yōu)選在載體中，與根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可操作地連接。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含T7RNA聚合酶或編碼所述T7RNA聚合酶的多核苷酸。
27.一種生產(chǎn)基因產(chǎn)物的方法，其包括提供根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的細(xì)胞，以及在允許所述基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
28.一種生產(chǎn)mRNA的體外方法，其包括提供根據(jù)權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的多核苷酸和所述轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上游的編碼序列，以及使所述多核苷酸接觸所述T7RNA聚合酶。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103620038SQ201280026385
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月3日
【發(fā)明者】G·施特里德納, A·維特維爾 申請(qǐng)人:桑多斯股份公司, 勃林格殷格翰Rcv有限兩合公司