專利名稱：用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在真核生物中增強結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，其與多肽的同源和異源產(chǎn)生相關(guān)。
背景技術(shù)：
真核生物作為宿主細(xì)胞在工業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)例如藥用和工業(yè)應(yīng)用的多肽。操縱基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的能力是提供更高產(chǎn)量的基礎(chǔ)。
通常，在真核生物中基因最大表達(dá)的獲得是通過擴增染色體上的表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含可操縱地連接至編碼目的多肽基因的單個啟動子以及擴增篩選標(biāo)志。
在編碼目的多肽的結(jié)構(gòu)基因上游存在著一段RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列區(qū)域(通常稱為啟動區(qū))。RNA聚合酶催化與多肽編碼區(qū)的合適DNA鏈互補的mRNA進行裝配。多數(shù)“啟動區(qū)”包含位于編碼區(qū)(結(jié)構(gòu)基因)起始點上游的RNA聚合酶識別位點(通常為TATA盒)和轉(zhuǎn)錄精確起始的位點。
對“啟動區(qū)”的修飾可以導(dǎo)致增強的轉(zhuǎn)錄水平，這又可以導(dǎo)致增加的表達(dá)和產(chǎn)量。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及與相應(yīng)的親本真核宿主細(xì)胞相比，調(diào)節(jié)真核宿主細(xì)胞，特別是真菌生物體，尤其是絲狀真菌的轉(zhuǎn)錄水平的DNA序列，以使轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)水平提高。
定義術(shù)語“DNA序列”和“核酸序列”在下文中可互換使用。
術(shù)語“可操縱地連接”于此定義為例如本發(fā)明的DNA序列置于相對于編碼多肽的DNA序列的適當(dāng)位置以便獲得轉(zhuǎn)錄水平增強的構(gòu)型。
“編碼序列”于此定義為這樣的核酸或DNA序列，當(dāng)其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的控制之下時，其轉(zhuǎn)錄為mRNA并翻譯為多肽。編碼序列的邊界通常確定為位于mRNA 5’末端開放閱讀框緊上游的核糖體結(jié)合位點和位于mRNA 3’末端開放閱讀框緊下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列。編碼序列可以包括但并不限于基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核酸序列。
“核酸構(gòu)建體”或“DNA構(gòu)建體”于此定義為單鏈或雙鏈核酸分子，其分離自天然存在的基因或者被修飾以含有在天然狀態(tài)下并不存在的方式組合或相鄰的核酸片斷。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有所有表達(dá)編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語表達(dá)盒同義。
“RNA”聚合酶為1)在DNA雙鏈狀態(tài)能夠識別啟動子或類似調(diào)控元件；2)能夠在正確的啟動區(qū)“嵌入”DNA雙鏈體并解旋基因的起始位點以利轉(zhuǎn)錄；3)復(fù)制基因；4)當(dāng)其遇到并識別終止子序列時終止轉(zhuǎn)錄。在真核生物中已知3種RNA聚合酶并稱之為RNA聚合酶I、II和III。在本發(fā)明上下文中，最相關(guān)的為RNA聚合酶II。
兩個RNA聚合酶結(jié)合位點或者啟動子“緊密相連”或“相鄰近”是指沒有或僅有少數(shù)幾個堿基對隔開第一RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子的5’末端與相鄰的第二RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子的3’末端。在本發(fā)明的一個實施方案中，在兩個RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子之間可以存在0到100bp的堿基對。這也適用于第二和第三RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子以及第三和第四RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子等之間的間隔。
術(shù)語“終止子”是指轉(zhuǎn)錄結(jié)束的位點。
“轉(zhuǎn)錄因子”許多轉(zhuǎn)錄因子是對細(xì)胞的刺激物(例如添加碳水化合物)起反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，其通過結(jié)合至TATA盒(RNA聚合酶識別位點)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的活化或者抑制。
“轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點”為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA位點。
在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“同源”或“重組”表達(dá)或產(chǎn)生是指所討論多肽由供體細(xì)胞的內(nèi)源基因表達(dá)，或者包含編碼所討論多肽的基因的DNA構(gòu)建體被導(dǎo)入供體細(xì)胞并在這種遺傳修飾的供體細(xì)胞中表達(dá)。
術(shù)語“供體細(xì)胞”是指獲得編碼多肽的基因的細(xì)胞。
附圖簡述

圖1顯示pJaL 700的限制性圖譜。
圖2顯示pJaL 701的限制性圖譜。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及與相應(yīng)的親本真核宿主細(xì)胞相比，調(diào)節(jié)真核宿主細(xì)胞，特別是真菌生物，尤其是絲狀真菌的轉(zhuǎn)錄水平的DNA序列，以使轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)水平提高。
本發(fā)明的DNA序列包含一個或多個RNA聚合酶結(jié)合位點或區(qū)域和一個或多個mRNA起始位點。本發(fā)明DNA序列可以包含一個、兩個、三個或者多個RNA聚合酶結(jié)合位點或者啟動子的部分或者全部。
本發(fā)明DNA序列還包含一個或者多個RNA聚合酶識別位點，尤其是TATA盒等等。
因此，在第一方面，本發(fā)明涉及在真核宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，其包含i)RNA聚合酶結(jié)合的第一DNA序列，該DNA序列包含mRNA起始位點；并且還包含ii)具有或者不具有mRNA起始位點的、與RNA聚合酶結(jié)合的一個或多個DNA序列。在一個實施方案中，如ii)所定義的第二DNA序列可以具有與i)所定義的RNA結(jié)合區(qū)域基本相同的RNA結(jié)合區(qū)域。因此，在一實施方案中RNA聚合酶結(jié)合位點可以為串聯(lián)位點或者重復(fù)位點。在一個優(yōu)選實施方案中兩個或者多個RNA結(jié)合位點(區(qū)域)的每一個都由一個或多個啟動子序列的部分或者全部所構(gòu)成。啟動子的RNA結(jié)合位點至少包含RNA聚合酶結(jié)合所需的部分。
本發(fā)明DNA序列一般也包括RNA聚合酶識別位點。這可以為TATA盒等。然而例如不具有TATA盒的真核啟動子的例子也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)。在一個實施方案中，僅僅與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因最近的RNA結(jié)合位點具有RNA聚合酶識別位點。所述識別位點可以位于結(jié)構(gòu)基因的上游，但位于第二、第三或多個RNA結(jié)合位點的下游。
本發(fā)明的DNA序列可以包含與RNA聚合酶結(jié)合的第三DNA序列。在一個實施方案中，該位點或區(qū)域可以為不含mRNA起始位點的啟動子的全部，并且也可以不含有RNA聚合酶識別位點。在另一實施方案中，與RNA聚合酶結(jié)合的第三DNA序列可以包括含有RNA聚合酶識別位點和/或mRNA起始位點的區(qū)域。在一個優(yōu)選的實施方案中，RNA聚合酶結(jié)合位點為如SEQ ID NO1中所示的Pna2-tpi啟動子的全部或者其功能部分，或者為如在SEQ ID NO1的1到510位或SEQ ID NO1的7到510位所示的NA2啟動子的全部或者其功能部分。ii)中所定義的第二、笫三或多個DNA序列可以優(yōu)選為具有或不具有RNA聚合酶識別位點和/或mRNA起始位點的如SEQ ID NO1中所示的Pna2-tpi啟動子的全部或者其功能部分，或者為具有或不具有RNA聚合酶識別位點和/或mRNA起始位點的如SEQ ID NO1的1到510位或SEQ ID NO1的7到510位所示的NA2啟動子的全部或者其功能部分。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，第二、第三和/或多個RNA聚合酶結(jié)合位點的3’末端位于第一RNA聚合酶結(jié)合位點的5’末端上游，所述第一RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游。此外，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，第三RNA聚合酶結(jié)合位點位于第二RNA聚合酶結(jié)合位點5’末端的上游，所述第二RNA聚合酶結(jié)合位點位于第一RNA聚合酶結(jié)合位點的上游，所述第一RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游。包含mRNA起始位點和/或RNA聚合酶識別位點的一個或多個如ii)中所定義的DNA序列也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
按照本發(fā)明，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明DNA序列可以包含2個或多個重復(fù)RNA聚合酶結(jié)合位點，特別是2-5個。在一個實施方案中，RNA聚合酶位點彼此串聯(lián)或彼此緊密并可操縱地相連。應(yīng)該定位RNA結(jié)合位點，以使它們的功能對整個轉(zhuǎn)錄水平或表達(dá)水平具有影響。這可以通過將所獲得的轉(zhuǎn)錄或者表達(dá)水平與相應(yīng)的親本真核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平比較來測試，所述親本真核宿主細(xì)胞僅包含如上述i)中所定義的DNA序列或啟動子。
在一個優(yōu)選實施方案中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明DNA序列包含2個或3個RNA聚合酶結(jié)合位點，其中僅最靠近編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的(第一)RNA聚合酶結(jié)合位點具有mRNA起始位點并任選地具有RNA聚合酶識別位點。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明DNA序列可以包含一個或多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點位于第一RNA聚合酶識別位點和/或mRNA起始位點的上游。在一個優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點為曲霉屬(Aspergillus)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，例如來自黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)或米曲霉(A.oryzae)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，尤其是在WO98/01470(其于此引用作為參考)中描述的曲霉屬amyR結(jié)合位點。
RNA聚合酶結(jié)合位點可以如上所提及為啟動子，尤其為選自米曲霉TAKA淀粉酶、NA2-tpi(來源于編碼黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和米曲霉(Aspergillus oryzae)磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因的啟動子雜合體)和gla A的啟動子，或者為如下所述。
在本發(fā)明DNA序列的一個優(yōu)選實施方案中，第二RNA聚合酶結(jié)合位點位于包括mRNA起始位點的第一RNA聚合酶結(jié)合位點5’末端的上游。在一個實施方案中，這些位點緊密相連。這包括這些位點可由0到100bp，特別是10到50bp，尤其是4到30bp的堿基對彼此隔開。
構(gòu)成本發(fā)明DNA序列的部分或本發(fā)明DNA序列的全部可以為人工合成或者可以來源于真核生物，特別是絲狀真菌，特別是曲霉屬、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢屬(Fusarium)的菌株或者任何在下文“真核宿主細(xì)胞”一節(jié)中所描述的真核生物。
結(jié)構(gòu)基因可以編碼任何多肽。在一個實施方案中，結(jié)構(gòu)基因編碼具有生物學(xué)活性的多肽。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)構(gòu)基因編碼展示酶活性的多肽，所述酶活性特別是選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或者連接酶，例如選自氨肽酶、α或β或生麥芽糖淀粉酶、CGT酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、α-1，6-葡聚糖酶(dextranase)、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、α-1，3-葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶(如果膠酸裂解酶、果膠酯酶)、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶(如蛋白酶或肽酶)、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明DNA構(gòu)建體正如下述所定義在真核生物中起作用，并且本發(fā)明的DNA序列與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因以及終止子可操縱地相連。DNA構(gòu)建體還可以包含下述調(diào)控序列。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體。DNA構(gòu)建體還可以包含信號肽編碼區(qū)。在這樣的實施方案中，轉(zhuǎn)錄和表達(dá)多肽將被分泌，特別是分泌至培養(yǎng)基。本發(fā)明的表達(dá)載體可以包含這樣的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，其中本發(fā)明DNA序列可操縱地與編碼多肽的單拷貝結(jié)構(gòu)基因相連，并任選地前導(dǎo)序列位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因上游。
調(diào)控序列如上所提及的本發(fā)明DNA構(gòu)建體還可以包含調(diào)控序列。本發(fā)明DNA序列可以認(rèn)為是調(diào)控序列并且可以作為啟動子發(fā)揮作用并可以包含一個或多個啟動子。
調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的本發(fā)明DNA序列包含轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，其調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。本發(fā)明的DNA序列可以包含啟動子、其突變體，或者截短的啟動子或雜合啟動子。啟動子可以為任意核酸序列，其在所選擇的真核宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性并可以獲得自編碼胞外或胞內(nèi)多肽的基因，所述基因可以與宿主細(xì)胞同源或者異源。每一啟動子序列可以為編碼多肽的核酸序列(結(jié)構(gòu)基因)的天然或者外源啟動子序列，并且可為所討論的真核細(xì)胞的天然或者外源啟動子序列。每一調(diào)控序列可以為編碼所討論多肽的結(jié)構(gòu)基因的天然或外源調(diào)控序列，來調(diào)控轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
這些調(diào)控序列包括但并不限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子或其部分、信號序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。調(diào)控序列可以帶有接頭，所述接頭目的是引入特異的限制性位點以利于與本發(fā)明調(diào)控元件可操縱相連的編碼所討論多肽的核酸序列的連接。
真核啟動子本發(fā)明的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列可以包含啟動子序列，其含有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列，其調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。啟動子可以為任何核酸序列。
真核啟動子為在轉(zhuǎn)錄起始階段提供基因表達(dá)調(diào)節(jié)的DNA序列，并且其可以獲得自編碼胞外或者胞內(nèi)多肽的、與所討論宿主細(xì)胞同源或者異源的基因。啟動子具有復(fù)合的區(qū)組模塊結(jié)構(gòu)并含有多個短的功能元件，例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、RNA聚合酶識別位點、mRNA起始位點。這些序列并無精確一致的定位并且分散于轉(zhuǎn)錄開始的mRNA起始位點的上游約1kb的5’側(cè)翼區(qū)域。
本發(fā)明DNA序列可以包含引導(dǎo)RNA聚合酶至mRNA起始位點的RNA聚合酶識別位點，所述本發(fā)明DNA序列包含至少一個包括有至少一個mRNA起始位點的RNA聚合酶結(jié)合位點。屬于這些識別位點的為具有TATA(A/T)A(A/T)共有序列的TATA盒以及具有YYAN(T/A)YY共有序列的Inr。轉(zhuǎn)錄起始開始于RNA聚合酶結(jié)合區(qū)域基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。依次，通過TATA結(jié)合蛋白質(zhì)(TBP)識別TATA盒，在含TATA區(qū)域/啟動子處組裝基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。
TATA盒
TATA盒或類似結(jié)構(gòu)可以在多種生物種類中發(fā)現(xiàn)，從簡單的真核生物例如面包酵母到較為復(fù)雜的生物例如絲狀真菌和人類，其可以包含在本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列中。TATA盒幫助引導(dǎo)RNA聚合酶(RNA聚合酶II)至mRNA起始位點的下游。RNA聚合酶結(jié)合至的DNA區(qū)域，即RNA聚合酶結(jié)合位點，其通常稱為啟動子。TATA盒在大多數(shù)情況下為轉(zhuǎn)錄所需要，因為RNA聚合酶一般并不能自己識別起始位點。一旦RNA聚合酶結(jié)合至TATA盒，TATA盒即引導(dǎo)RNA聚合酶至mRNA起始位點。當(dāng)RNA聚合酶尋找TATA盒時，另一個問題出現(xiàn)了。RNA聚合酶不能自己識別TATA盒。它必須利用轉(zhuǎn)錄因子找到TATA盒。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合至TATA盒后，RNA聚合酶可以識別并結(jié)合至TATA盒。隨后，RNA聚合酶結(jié)合至轉(zhuǎn)錄因子，由轉(zhuǎn)錄因子識別TATA盒。隨后TATA盒引導(dǎo)RNA聚合酶至mRNA起始位點，由此轉(zhuǎn)錄開始。
翻譯調(diào)節(jié)子本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列還可以包含一個或多個翻譯調(diào)節(jié)序列。翻譯調(diào)節(jié)子或者前導(dǎo)序列可以位于第一RNA聚合酶結(jié)合位點的下游，特別是位于mRNA起始位點的下游和編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游。合適的前導(dǎo)序列或翻譯調(diào)節(jié)序列可以為來源于構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)或其它曲霉屬的磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(tpi)。
絲狀真菌啟動子絲狀真菌宿主細(xì)胞啟動子的例子為獲得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶基因(EP238023)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶(EP383779)、黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(如美國專利號4,288,627所描述，其于此引用作為參考)的啟動子，以及它們的雜合體。特別優(yōu)選地在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的啟動子為TAKA淀粉酶、NA2、NA2-tpi(來自編碼黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)基因啟動子的雜合體)以及glaA的啟動子。
酵母啟動子在酵母宿主細(xì)胞中啟動子的例子為獲得自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)以及釀酒酵母3-磷酸甘油激酶基因的啟動子。其它有用的酵母宿主細(xì)胞啟動子描述在Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488中。
轉(zhuǎn)錄終止子正如上述，本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄終止子序列，其作為宿主細(xì)胞識別并終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操縱地與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的3’末端相連。任何在所選擇的宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的終止子都可以用于本發(fā)明。
真菌終止子用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的終止子例子為獲得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因的終止子。
酵母終止子用于酵母宿主細(xì)胞的終止子例子為獲得自編碼釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYC1)或者釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其它酵母宿主細(xì)胞有用的終止子描述在Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488。用于哺乳動物宿主細(xì)胞的終止子序列為本領(lǐng)域所公知。
前導(dǎo)序列本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以包含適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列，其為mRNA的非翻譯區(qū)，對于宿主細(xì)胞的翻譯非常重要。前導(dǎo)序列可操縱地與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的5’末端相連。任何在所選擇宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的前導(dǎo)序列都可以用于本發(fā)明。
真菌前導(dǎo)序列優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列獲得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpi)的基因。
酵母前導(dǎo)序列合適的用于酵母宿主細(xì)胞的前導(dǎo)序列獲得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油激酶基因、釀酒酵母α-因子以及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。
多聚腺苷酸化序列本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可以包含多聚腺苷酸化序列，所述序列與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的3′末端可操縱得地相連，并且，當(dāng)進行轉(zhuǎn)錄時，其作為向轉(zhuǎn)錄的mRNA上添加多聚腺苷殘基的信號被宿主細(xì)胞識別。任何在所選擇宿主細(xì)胞中執(zhí)行功能的多聚腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。
真菌多聚腺苷酸化序列優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的多聚腺苷酸化序列為獲得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶以及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
酵母多聚腺苷酸化序列用于酵母宿主細(xì)胞的有用多聚腺苷酸化序列描述在Guo和Sherman，1995，分子細(xì)胞生物學(xué)(Molecular Cellular Biology)155983-5990中。用于哺乳動物宿主細(xì)胞的多聚腺苷酸化序列為本領(lǐng)域所公知。
信號肽本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以包含信號肽編碼區(qū)，其編碼連接至多肽氨基末端的氨基酸序列，其可以指導(dǎo)所表達(dá)的蛋白質(zhì)進入細(xì)胞分泌途徑。結(jié)構(gòu)基因編碼序列的5′末端可以固有地含有以翻譯讀碼框架與編碼區(qū)片段天然連接的信號肽編碼區(qū)，其編碼分泌蛋白質(zhì)。另外，編碼序列的5′末端可以包含對編碼序列部分而言為外源的信號肽編碼區(qū)域，其編碼分泌蛋白質(zhì)。外源信號肽編碼區(qū)在當(dāng)編碼序列正常情況下不含信號肽編碼區(qū)時需要。另外，外源信號肽編碼區(qū)可以簡單地替換天然信號肽編碼區(qū)以便獲得相對于正常情況下與編碼序列相連的天然信號肽編碼區(qū)而言，具有增強的蛋白質(zhì)分泌。信號肽編碼區(qū)可以獲得自曲霉屬的葡糖淀粉酶或者淀粉酶基因、來自根毛霉屬(Rhizomucor)的脂肪酶或蛋白酶基因、釀酒酵母α-因子的基因、芽孢桿菌屬(Bacillus)的淀粉酶或蛋白酶基因或者小牛的前原凝乳酶(preprochymosin)基因。然而，任何能夠指導(dǎo)所表達(dá)蛋白質(zhì)進入所選擇宿主細(xì)胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)都可以在本發(fā)明中應(yīng)用。
真菌信號肽序列用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)為獲得自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola lanuginosa纖維素酶基因或米黑根毛霉脂肪酶基因的信號肽編碼區(qū)。
酵母信號肽序列用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號肽為獲得自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其他有用的信號肽編碼區(qū)參見Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488中的描述。
前肽序列本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可包含前肽編碼區(qū)，其編碼定位在多肽氨基末端的氨基酸序列。產(chǎn)生的多肽稱為酶原(proenzyme)或多肽原(或者在某些情況下稱為酶原(Zymogen))。多肽原通常為沒有活性的并且可以通過將來自多肽原的前肽催化或者自身催化裂解為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可以獲得自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子基因或嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophilum)漆酶基因(WO 95/33836)。
其他調(diào)控序列本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可以包含一個或者多個這樣的核酸序列，其編碼一個或者多個有利于多肽表達(dá)的因子，例如激活子(例如順式作用因子)、侶伴蛋白以及加工蛋白酶。任何在所選擇宿主細(xì)胞中執(zhí)行功能的因子都可以用于本發(fā)明。編碼一個或者多個這些因子的核酸并不必須與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)。
激活因子為激活編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因進行轉(zhuǎn)錄的多肽(Kudla等人，1990，EMBO雜志(EMBO Journal)91335-1364；Jarai和Buxton，1994，現(xiàn)代遺傳學(xué)(Current Genetics)262238-224；Verdier，1990，酵母(Yeast)6271-297)。編碼激活子的DNA序列可以獲得自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)NprA(nprA)、釀酒酵母血紅素激活子蛋白質(zhì)1(hap1)、釀酒酵母半乳糖代謝蛋白質(zhì)4(gal4)以及構(gòu)巢曲霉氨調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(areA)。多個例子參見Verdier，1990，同上述以及MacKenzie等人，1993，普通微生物學(xué)雜志(Journal of GeneralMicrobiology)1392295-2307。
侶伴蛋白為輔助另一多肽正確折疊的蛋白質(zhì)(Hartl等人，1994，TIBS1920-25；Bergeron等人，1994，TIBS 19124-128；Demolder等人，1994，生物技術(shù)雜志(Journal of Biotechnology)32179-189；Craig，1993，科學(xué)(Science)2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然(Nature)35533-45；Puig和Gilbert，1994，生物化學(xué)雜志(Journalof Biological Chemistry)2697764-7771；Wang和Tsou，1993，TheFASEB Journal 71515-11157；Robinson等人，1994，生物/技術(shù)(Bio/Technology)1381-384)。編碼侶伴蛋白的核酸序列可以獲得自編碼枯草芽孢桿菌GroE蛋白、米曲霉蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶、釀酒酵母鈣聯(lián)接蛋白、釀酒酵母Bip/GRP78以及釀酒酵母Hsp70的基因。多個實例參見Gething和Sambrook等人，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，以及Hartl等人，1994，TIBS 1920-25。
加工蛋白酶為裂解前肽產(chǎn)生成熟生物化學(xué)活性多肽的蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母(Yeast)1067-79；Fuller等人，1989，美國國家科學(xué)院院報(Proceedings of the National Academy ofSciences USA)861434-1438；Julius等人，1984，細(xì)胞(Cell)371075-1089；Julius等人，1983，細(xì)胞(Cell)32839-852)。編碼加工蛋白酶的核酸序列可以獲得自編碼黑曲霉Kex2、釀酒酵母二肽氨肽酶、釀酒酵母Kex2和Yarrowia lipolytica二元加工內(nèi)蛋白酶(xpr6)的基因。
調(diào)節(jié)序列本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可以包含調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)多肽表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子為那些對化學(xué)或物理刺激物(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)起反應(yīng)而引起基因表達(dá)開啟或者關(guān)閉的系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或者GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可以用作調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其他例子為那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括二氫葉酸還原酶基因，其在氨甲蝶呤存在下擴增，以及金屬硫蛋白基因，其在重金屬存在下擴增。在這些情況下，編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因以串聯(lián)形式與調(diào)節(jié)基因一起放置。
表達(dá)載體本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列或DNA構(gòu)建體以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。上述多種DNA和調(diào)控序列可以連接到一起產(chǎn)生一個重組表達(dá)載體，其可以包括一個或多個方便的限制性位點以允許在這些位點處插入或替換編碼多肽的核酸序列。另外，編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因可以通過將本發(fā)明的DNA序列或者DNA構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體而表達(dá)。對創(chuàng)建表達(dá)載體而言，多肽編碼序列位于載體內(nèi)并使編碼序列可操縱地與適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)(和可能分泌)的調(diào)控序列相連。
重組表達(dá)載體可以為任何載體(例如質(zhì)?；蛘卟《?，其可以方便地進行重組DNA操作并且可以使編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。載體的選擇一般決定于載體與其將要導(dǎo)入的真核宿主細(xì)胞的相容性。載體可以為線性或者閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以為自主復(fù)制載體，即為在染色體外存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、粘粒或者人工染色體。載體可以含有任何保證自主復(fù)制的元件。另外，載體可以為當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合入基因組并與所整合的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以為一種載體或質(zhì)粒，或者為2種或者多種的載體或質(zhì)粒，其合起來含有導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總DNA，或者為轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明載體優(yōu)選含有一個或多個可選擇標(biāo)記，該標(biāo)記使得轉(zhuǎn)化細(xì)胞易于篩選?？蛇x擇標(biāo)記為其產(chǎn)物提供生物毒性或者病毒抗性、重金屬抗性、自養(yǎng)生物的原養(yǎng)型等等的基因。細(xì)菌可選擇標(biāo)記的例子為來源于枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或者賦予抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。哺乳動物中經(jīng)常使用的標(biāo)記為二氫葉酸還原酶基因。合適的酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的可選擇標(biāo)記可以選自(包括但并不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸鹽還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)和草銨膦抗性標(biāo)記，以及來自其它種類的等同物。優(yōu)選在曲霉屬的細(xì)胞中使用的標(biāo)記為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標(biāo)記以及吸水鏈霉菌(Steptomyces hygroscopicus)的bar標(biāo)記。此外，篩選可以通過共轉(zhuǎn)化完成，例如如在WO 91/17243中描述，其中可選擇標(biāo)記位于不同的載體。
本發(fā)明載體優(yōu)選含有允許載體穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組或者在細(xì)胞中獨立于細(xì)胞基因組之外進行載體自主復(fù)制的元件。
當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，本發(fā)明的載體可以整合進入宿主細(xì)胞基因組。為進行整合，載體可能依賴于編碼多肽的核酸序列或載體任何其它的載體元件以使該載體通過同源或非同源重組穩(wěn)定整合至基因組。另外，載體可以含有額外的核酸序列以通過同源重組指導(dǎo)整合進入宿主細(xì)胞的基因組。額外的核酸序列使載體能夠在染色體的精確位置整合入宿主細(xì)胞基因組。為增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)優(yōu)選含有足量數(shù)目的核酸，例如100到1500個堿基對，優(yōu)選400到1500個堿基對，并且最優(yōu)選800到1500個堿基對，其與相應(yīng)靶序列高度同源以增強同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可以為非編碼或者編碼核酸的序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組。這些核酸序列可以為與宿主細(xì)胞基因組靶序列同源的任意序列，并且，可以為非編碼或編碼序列。
為進行自主復(fù)制，載體還可以包含能夠使載體在所使用宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點。細(xì)菌復(fù)制起點的例子為質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制起點。用于酵母宿主細(xì)胞的復(fù)制起點的例子為2微米復(fù)制起點、CEN6和ARS4的組合，以及CEN3和ARS1的組合。復(fù)制起點可以為具有突變的復(fù)制起點，其可以在宿主細(xì)胞中形成溫度敏感型(參見例如Ehrlich，1978，美國國家科學(xué)院院報(Procedings of the National Academy of SciencesUSA)751433)。
也可以使用公開在WO 00/24883中的游離型復(fù)制AMA1質(zhì)粒載體。
可以將多于一個拷貝的編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因插入到宿主細(xì)胞以增加結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。結(jié)構(gòu)基因的穩(wěn)定擴增可以通過利用本領(lǐng)域公知的方法將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組并篩選轉(zhuǎn)化子而獲得。
連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明重組表達(dá)載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見例如Sambrook等人，1989，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning，A laboratory Manual)第二版，冷泉港，紐約)。
真核宿主細(xì)胞本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列或者本發(fā)明DNA構(gòu)建體或者本發(fā)明表達(dá)載體的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的真核宿主細(xì)胞包含編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括任何親本細(xì)胞的子代，其由于在復(fù)制過程中發(fā)生突變而與親本細(xì)胞并不相同。該細(xì)胞優(yōu)選用包含與結(jié)構(gòu)基因可操縱相連的本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄DNA序列的載體轉(zhuǎn)化，并特別是，緊接著該載體整合入宿主染色體。
宿主細(xì)胞為真核生物細(xì)胞，例如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或者真菌細(xì)胞。有用的哺乳動物細(xì)胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細(xì)胞、COS細(xì)胞，或者例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的任何數(shù)目的其它永生細(xì)胞系。
在優(yōu)選實施方案中，宿主細(xì)胞為真菌細(xì)胞。于此使用的“真菌”包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(如Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，大學(xué)出版社，英國劍橋中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等人，1995，上述，171頁所引用)和所有有絲分裂孢子的真菌(Hawksworth等人，1995，上述)。子囊菌門的代表性群體包括例如脈孢菌屬(Neurospora)、正青霉屬(Eupenicillium)(＝青霉屬(Penicillium))、Emericella(＝曲霉屬)、散囊菌屬(Eurotium)(＝曲霉屬)以及上文所列的真酵母。擔(dān)子菌門的例子包括蘑菇、銹菌和黑粉菌。壺菌門的代表性群體包括例如異水霉屬(Allomyces)、小芽枝霉屬(Blastocladiella)、雕蝕菌屬(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌門的代表性群體包括例如水霉屬(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉)如綿霉(Achlya)。有絲分裂孢子的真菌例子包括曲霉屬、青霉屬、念珠菌屬(Candida)和鏈格孢屬(Alternaria)。接合菌門的代表性群體包括例如根霉屬(Rhizopus)和毛霉屬(Mucor)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。于此使用的“酵母”包括產(chǎn)子囊孢子(ascosporogenous)酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子(basidiosporogenous)酵母和屬于半知菌類(Fungi Imperfecti)(芽孢綱(Blastomycetes))的酵母。產(chǎn)子囊孢子酵母分為蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者由4個亞科組成裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces))、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和酵母屬(Saccharomyces))。產(chǎn)擔(dān)孢子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidium)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)、Filobasidium屬和Filobasidiella屬。屬于半知菌類的酵母分為2個科，擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如Sorobolomyces屬和布勒彈孢酵母屬(Bullera))和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如念珠菌屬)。由于酵母的分類在未來可能改變，對本發(fā)明而言，酵母如酵母的生物學(xué)和活性(Biology and Activities of Yeast)一書中的描述所定義(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.主編，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)。酵母的生物學(xué)和酵母遺傳學(xué)的操作為本領(lǐng)域所公知(參見例如酵母的生物化學(xué)和遺傳學(xué)(Biochemistry and Geneticsof Yeast)，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.編輯，第二版，1987；酵母(The Yeasts)，Rose，A.H.和Harrison，J.S.編輯，第二版，1987；以及酵母Saccharomyces的分子生物學(xué)(The Molecular Biology ofthe Yeast Saccharomyces)，Strathem等人主編，1981)。
在一個更為優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為念珠菌屬、克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤酵母屬或Yarrowia屬細(xì)胞。在最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或Saccharomyces oviformis細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細(xì)胞。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細(xì)胞為Yarrowia lipolytica細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細(xì)胞為絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CABInternational，大學(xué)出版社，英國劍橋一書中所定義)。絲狀真菌的特征為營養(yǎng)菌絲體由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖構(gòu)成。其營養(yǎng)生長通過菌絲伸長并且碳代謝為需氧型。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長是通過單細(xì)胞原植體的出芽并且其碳代謝為發(fā)酵型。在一個更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為下列物種但并不限于這些物種的細(xì)胞小枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉屬、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium和木霉屬或它們的有性型或同物異名物種。在一個甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為曲霉屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為小枝頂孢屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為鐮孢屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為腐質(zhì)霉屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為毛霉屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為毀絲霉屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為脈孢菌屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為青霉屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為梭孢殼屬細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為Tolypocladium細(xì)胞。在另一甚至更為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為木霉屬細(xì)胞。在一個最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為變色(Discolor)(也稱為鐮孢屬)的鐮孢屬細(xì)胞。例如，絲狀真菌親本細(xì)胞可以為桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusariumsambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、Fusarium sulphureum或者Fusarium trichothecioides細(xì)胞。在另一優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親本細(xì)胞為Elegans的鐮孢屬菌株，例如尖鐮孢。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為Humicola insolens或Humicola lanuginose細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為米黑毛霉(Mucor miehei)細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為嗜熱毀絲霉細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細(xì)胞為Thielavia terrestris細(xì)胞。在另一最為優(yōu)選的實施方案中，木霉屬細(xì)胞為Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉(Trichoderma reesei)或綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞。
本發(fā)明宿主細(xì)胞可以為蛋白酶轉(zhuǎn)錄激活因子減弱型株系，特別是prtT基因刪除株系。特別是宿主細(xì)胞可以為曲霉屬菌株，例如在WO 00/20596中所描述的黑曲霉或者米曲霉菌株。
真核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以利用涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁再生的方法以本身公知的方式進行。適當(dāng)?shù)挠糜谇箤偎拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化的方法描述在EP 238 023和Yelton等人，1984，美國國家科學(xué)院院報(Procedings of the National Academy of Sciences USA)811470-1474。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化鐮孢屬的方法描述在Malardier等人，基因(Gene)78147-156或者參見共同未決的美國系列號08/269,449。酵母可以利用Abelson，J.N.和Simon，M.I.主編的酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南(Guide to YeastGenetics and Molecular Biology)，酶學(xué)方法，194卷中Becker和Guarente于182-187頁所述，學(xué)院出版公司，紐約；Ito等人，1983，細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology)153163；以及Hinnen等人，1978，美國國家科學(xué)院院報(Procedings of the National Academy of Sciences USA)751920中所描述的方法進行。哺乳動物細(xì)胞可以通過利用Graham和Van derEb的磷酸鈣沉淀法通過直接攝入的方法轉(zhuǎn)化(1978，病毒學(xué)(Virology)52546)。
宿主細(xì)胞的培養(yǎng)微生物或者植物宿主細(xì)胞培養(yǎng)的方法為本領(lǐng)域所公知。
本發(fā)明方法一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在適于多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞含有在本發(fā)明DNA序列調(diào)控下的結(jié)構(gòu)基因；以及(b)從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。
宿主細(xì)胞可為上述任何所提及的細(xì)胞。本發(fā)明的DNA序列可以定位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游，其可以為宿主細(xì)胞自身的或者外源的。
本發(fā)明也涉及增加真核宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)水平的方法，其包括向親本RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子上游引入一個或多個RNA聚合酶結(jié)合位點。術(shù)語“親本”RNA聚合酶結(jié)合位點或者啟動子是指修飾前存在于宿主細(xì)胞中的的位點或啟動子。該方法可以用于提供用來同源或者異源生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。在同源宿主中，啟動子可以用本發(fā)明的DNA序列替代。
在一個實施方案中，本發(fā)明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列被導(dǎo)入結(jié)構(gòu)基因的上游，或者將親本RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子用本發(fā)明DNA序列替代。在一個實施方案中，導(dǎo)入的RNA聚合酶結(jié)合位點包括一個或多個能夠結(jié)合RNA聚合酶的重復(fù)DNA序列。
在一個實施方案中，RNA聚合酶結(jié)合位點為串聯(lián)位點。
材料和方法作為緩沖液和底物的化學(xué)試劑至少為試劑級的商業(yè)產(chǎn)品。
培養(yǎng)基和溶液MY25培養(yǎng)基pH6.5每升含有25克麥芽糖，2.0克MgSO4·7H2O，10克KH2PO4、2克檸檬酸、10克酵母提取物，2.0克K2SO4，2.0克脲，1.0ml CaCl2·2H2O(100g/l貯液)和0.5ml痕量金屬溶液。MY25微滴定培養(yǎng)基利用490ml玻璃蒸餾水和500ml 2×MY鹽1∶100稀釋得到。培養(yǎng)物在30℃生長。
2×MY鹽pH6.5每升溶液含有4克MgSO4·7H2O，4克K2SO4，20克KH2PO4，4克檸檬酸，1ml痕量金屬溶液以及2mlCaCl2·2H2O(100g/l貯液)。
基本培養(yǎng)基轉(zhuǎn)化平板每升含有6克NaNO3，0.52克KCl，1.52克KH2PO4，1ml痕量金屬溶液，10克葡萄糖，500毫克MgSO4·7H2O，342.3克蔗糖以及20克純凈瓊脂(pH 6.5)?；九囵B(yǎng)基轉(zhuǎn)移平板(pH 6.5)每升含有6克NaNO3，0.52克KCl，1.52克KH2PO4，1ml痕量元素，1克葡萄糖，500毫克MgSO4·7H2O以及20克純凈瓊脂(pH 6.5)。
基本培養(yǎng)基每升含有6克NaNO3，0.52克KCl，1.52克KH2PO4，1ml痕量金屬，10克葡萄糖、500毫克MgSO4·7H2O，342.3克蔗糖以及20克純凈瓊脂(pH 6.5)。轉(zhuǎn)移平板與上述相同，只是不含蔗糖。
痕量金屬溶液(1000×)每升含有22克ZnSO4·7H2O，11克H3BO3，5克MnCl2·4H2O，5克FeSO4·7H2O，1.6克CoCl2·5H2O，1.6克(NH4)6Mo7O24以及50克Na4EDTA。
氯酸鹽平板在基本培養(yǎng)基中添加470mM氯酸鹽和10mM谷氨酸鹽作為唯一氮源。
YPM培養(yǎng)基每升含有5克酵母提取物，10克細(xì)菌用蛋白胨和2克麥芽糖。
AMG痕量元素溶液含有2.5克CuSO4·5H2O，6.8克ZnCl2，0.24克NiCl2·6H2O，13.9克FeSO4·7H2O，13.6克MnSO4·5H2O和3.0克一水合檸檬酸(Wako No.035-03495)，加水至1升。
GO-50含有50克葡萄糖，2克KH2PO4，2克MgSO4·7H2O，3克K2SO4，2克一水合檸檬酸(Wako No.035-03495)，50克草酸·2H2O，0.5mlAMG痕量元素溶液和50克草酸·2H2O(pH 4.5)，加水至1升。在使用前加入3ml 10％脲。
Cove-N平板含有342.3克蔗糖，3克NaNO3，20ml Cove鹽溶液和30克純凈瓊脂，加水至1升。
Cove鹽溶液含有26克KCl，26克MgSO4·7H2O，76克KH2PO4和50ml Cove痕量元素J溶液，加水至1升。
Cove頂層瓊脂糖含有342.3克蔗糖，20ml Cove鹽溶液，3克NaNO3和10克低熔點瓊脂糖，加水至1升。
Cove痕量元素J溶液含有0.04克NaB4O7·10H2O，0.4克CuSO4·5H2O，1.2克FeSO4·7H2O，1.0克MnSO4·H2O，0.8克Na2MoO2·2H2O和10.0克ZnSO4·7H2O，加水至1升。
Cove-N2平板含有30克蔗糖，20ml Cove鹽溶液，3克NaNO3和30克noble瓊脂，加水至1升。
MLC含有50克大豆粉，40克葡萄糖和4克一水合檸檬酸(WakoNo.035-03495)，加水至1升(pH5.0)。
STC緩沖液含有0.8M山梨醇，25mM Tris(pH8)和25mM CaCl2，加水至1升。
STPC緩沖液STC緩沖液中含有40％PEG4000YPG培養(yǎng)基含有4克酵母提取物，1克KH2PO4，0.5克MgSO4·7H2O和15克葡萄糖，加水至1升(pH 6.0)。
菌株JaL228該菌株的構(gòu)建在專利WO 98/12300中描述。
JaL250該菌株的構(gòu)建在實施例7中描述。
JaL294該菌株的構(gòu)建在實施例8中描述。
MBin119黑曲霉表達(dá)宿主MBin119為經(jīng)過遺傳修飾破壞葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α-淀粉酶、中性淀粉酶I和II、pyrG和α-1，6轉(zhuǎn)葡糖苷酶活性表達(dá)的菌株。
質(zhì)粒pNA2其構(gòu)建在專利WO 89/01969中描述。
p960其構(gòu)建在專利EP 0305,206A1中描述。
pJeRS4其構(gòu)建在專利US 5,861,280中描述。
pIC19H其構(gòu)建在Marsh等人，1984，基因(Gene)32481-485中描述。
pUC19其構(gòu)建在Vieira等人，1982，基因(Gene)19259-268中描述。
pSTA14描述在Unkles等人，1989，分子普通遺傳學(xué)(MolecularGeneral Genetics)21899-104。
pJaL211其構(gòu)建在實施例1中描述。
pJaL240其構(gòu)建在實施例2中描述。
pToC108其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL410其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL420其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL423其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL475其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL479其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL485其構(gòu)建在實施例3中描述。
pJaL535其構(gòu)建在實施例4中描述。
pJaL676其構(gòu)建在實施例5中描述。
pToC432其構(gòu)建在實施例6中描述。
pJaL419其構(gòu)建在實施例8中描述。
pJaL448其構(gòu)建在實施例8中描述。
pJaL700其構(gòu)建在實施例9中描述。
pJaL701其構(gòu)建在實施例10中描述。
pJaL724其構(gòu)建在實施例11中描述。
pJaL729其構(gòu)建在實施例12中描述。
pJaL719其構(gòu)建在實施例16中描述。
pJaL721其構(gòu)建在實施例17中描述。
質(zhì)粒pCaHj483包含黑曲霉中性淀粉酶2啟動子(NA2)、構(gòu)巢曲霉TPI前導(dǎo)序列、黑曲霉葡糖淀粉酶終止子和構(gòu)巢曲霉amdS基因。
黑曲霉的轉(zhuǎn)化黑曲霉的轉(zhuǎn)化可以通過常規(guī)的原生質(zhì)體方法實施。用于本發(fā)明的優(yōu)選步驟描述如下。
將宿主菌株在100ml非選擇YPG培養(yǎng)基中32℃下于旋轉(zhuǎn)振蕩器中120轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16小時。過濾收集細(xì)胞，用0.6M KCl洗滌并在含有600μl/ml商品化β-葡聚糖酶產(chǎn)物(GLUCANEXTM，Novozymes A/S)的20ml0.6M KCl中重懸。將懸液在32℃、80轉(zhuǎn)/分鐘孵育直至原生質(zhì)體形成，隨后用STC緩沖液洗滌2次。用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體計數(shù)，在8∶2∶0.1的STC∶STPC∶DMSO的溶液中重懸并調(diào)整至終濃度為2.5×107原生質(zhì)體/ml。向100μl的原生質(zhì)體懸液中加入約3微克的DNA，輕輕混勻并在冰上孵育20分鐘。加入1ml的SPTC并將原生質(zhì)體懸液在37℃下孵育30分鐘。向溶液中加入10ml 50℃的Cove頂層瓊脂糖后，將反應(yīng)液倒入Cove-N瓊脂平板并將該平板在32℃下孵育5天。由于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能在Cove-N培養(yǎng)基中生長，轉(zhuǎn)化子可以容易地篩選出。
實施例實施例1pJaL211的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL211構(gòu)建為含有黑曲霉中性淀粉酶2(NA2)啟動子。
將來自pNA2的923bp HindIII-BamHI片斷連接至來自p960的4278bp HindIII-BamHI片斷，從而產(chǎn)生pJaL211。
實施例2pJaL240的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL240構(gòu)建為含有黑曲霉中性淀粉酶2(NA2)啟動子的611bp片斷。
將來自pJaL211的611bp EcoRI-BamHI片斷連接至pIC19H的2690bp EcoRI-BamHI片斷，從而產(chǎn)生pJaL240。
實施例3pJaL485的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL485構(gòu)建為含有截短的niaD基因和表達(dá)盒，其中Humicolalanuginose脂肪酶基因位于NA2啟動子和黑曲霉AMG終止子之間。
將編碼米曲霉niaD基因的質(zhì)粒pSTA14(Unkles等人，1989，分子普通遺傳學(xué)(Molecular General Genetics)21899-104)用HindIII消化并將5136bp片斷純化并克隆至用HindIII消化的pUC19以產(chǎn)生質(zhì)粒pToC108。質(zhì)粒pToC108用BglII-SalI消化并將3700bp片斷純化并克隆至用BglII-SalI消化的pUC19以產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL410。該質(zhì)粒編碼一個截短的niaD基因，其中N末端的85個氨基酸已被移去。
將質(zhì)粒pJaL410用SacI-PstI消化并用克列諾酶和dNTP處理，將6018bp片斷純化并重新連接得到質(zhì)粒pJaL420。pJaL420上的BamHI位點通過利用Chameleon雙鏈定點突變試劑盒(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)按照制造商的方法進行沉默突變而除去從而得到質(zhì)粒pJaL423。BamHI位點通過利用下述引物將BamHI位點的T換成C而破壞掉5’-GGAACGATGGACCCGGAAGGTTTAAAAGC-3’(SEQ IDNO2)破壞的BamHI位點周圍的測序顯示在較下游存在一些非期待的改變，其導(dǎo)致niaD基因的編碼框架移位并產(chǎn)生了SmaI位點。為修復(fù)這個編碼框架移位，用pJaL420的相應(yīng)片斷替換pJaL423上291bp的AccI-DraI片斷以產(chǎn)生pJaL475。
將來自pJaL475的編碼截短的niaD基因的3381bp HindIII片斷克隆至質(zhì)粒pJaL211的HindIII位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL479。位置2上的HindIII位點利用HindIII的部分消化并緊接著利用克列諾酶和dNTP處理破壞。將858 bp片斷純化并重新連接產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL485。
實施例4pJaL535的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL535構(gòu)建為含有截短的niaD基因和表達(dá)盒，其中Humicolalanuginose脂肪酶基因位于NA2啟動子(如SEQ ID NO1的7-510位所顯示)和黑曲霉AMG終止子之間。
將pJaL240的644bp HindIII-BamHI片斷連接至pJaL485的7663bpHindIII-BamHI片斷，產(chǎn)生pJaL535。
實施例5
pJaL676的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL676為pJaL535的衍生物，其中如SEQ ID NO1中7-510位所示的NA2啟動子已通過簡單的PCR方法進行幾輪定點突變而修飾。
核苷酸135-145用SEQ ID NO5中所示的致突變引物從SEQ IDNO3改變?yōu)镾EQ ID NO4。
核苷酸407-422用SEQ ID NO8中所示的致突變引物從SEQ IDNO6改變?yōu)镾EQ ID NO7。
核苷酸424-437用SEQ ID NO11中所示致突變引物從SEQ ID NO9改變?yōu)镾EQ ID NO10。
核苷酸529-617用SEQ ID NO14中所示的致突變引物從SEQ IDNO12改變?yōu)镾EQ ID NO13。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pJaL676。
實施例6pToC432的構(gòu)建質(zhì)粒pToC432為pJaL535的衍生物，其中如SEQ ID NO1中7-510位所示的NA2啟動子通過簡單的PCR方法進行幾輪定點突變而修飾。
核苷酸135-145用SEQ ID NO5中所示的致突變引物從SEQ IDNO3改變?yōu)镾EQ ID NO4。
核苷酸407-422用SEQ ID NO8中所示的致突變引物從SEQ IDNO6改變?yōu)镾EQ ID NO7。
核苷酸529-617用SEQ ID NO14中所示的致突變引物從SEQ IDNO12改變?yōu)镾EQ ID NO13。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pToC432。
實施例7pyrG(-)米曲霉JaL250的分離篩選WO 98/12300中描述的米曲霉菌株JaL 228對5-氟-乳清酸的抗性以確定自發(fā)的pyrG突變株。一個菌株被鑒定為pyrG(-)，將其命名為JaL250。該突變體為尿嘧啶核苷依賴型，因此其可以用野生型pyrG基因轉(zhuǎn)化并且可以利用其在缺少尿嘧啶核苷的環(huán)境下生長的能力篩選轉(zhuǎn)化子。
實施例8米曲霉JaL294的構(gòu)建為構(gòu)建所定義的米曲霉niaD突變體，構(gòu)建了替換質(zhì)粒pJaL448，其中niaD基因的C末端部分被米曲霉pyrG基因所替代。
用KpnI消化質(zhì)粒pJaL410(其構(gòu)建在實施例3中描述)，將4307bp片斷純化并重新連接產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL419。將編碼米曲霉pyrG基因的質(zhì)粒pJeRS4用KpnI消化并純化1515bp片斷，并且將其與KpnI消化的pJaL419連接以產(chǎn)生pJaL448。
質(zhì)粒pJaL448為雙交換質(zhì)粒，其中米曲霉pyrG基因(來自pJeRS4的1515bp KpnI片斷)的兩側(cè)為782bp的編碼niaD蛋白質(zhì)85-276位氨基酸的BglII-KpnI片斷以及含有niaD終止子的841bp KpnI-HindIII片斷。
米曲霉JaL250的原生質(zhì)體制備米曲霉JaL250在100ml YEG培養(yǎng)基中34℃培養(yǎng)16-18小時，其間以160轉(zhuǎn)/分鐘搖動。菌絲體利用0.2μm濾器過濾回收直至約10ml留在濾器上，用約20ml 1M MgSO4·7H2O(已用0.2μm過濾)洗滌，并隨后利用無菌環(huán)收集并放置于125ml錐形瓶。隨后將菌絲體在溶于15ml 1M MgSO4·7H2O中的75mg NOVOZYM234TM(來自Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥)中重懸。將懸液在37℃下以50轉(zhuǎn)/分鐘輕輕搖動孵育約1小時以產(chǎn)生原生質(zhì)體。
125ml錐形瓶內(nèi)容物隨后通過無菌Miracloth過濾至30ml科雷克斯離心管中，其上覆蓋6ml 0.6M山梨醇-100mM Tris pH 7.0，并用吊桶式轉(zhuǎn)頭3500×g離心15分鐘以回收原生質(zhì)體。原生質(zhì)體用巴斯德吸管從緩沖液界面回收。隨后用2倍體積的STC(1.2M山梨醇-10mMTris-10mMCaCl2·2H2O pH 7.5)洗滌并在3500×g離心5分鐘。在10ml STC中洗滌原生質(zhì)體兩次并如前所述離心。將原生質(zhì)體重懸于STC至終濃度為1.7×107原生質(zhì)體/毫升。將pJaL448用XhoI線性化并轉(zhuǎn)化入米曲霉JaL250的原生質(zhì)體。進行氯酸鹽抗性篩選的米曲霉JaL250的轉(zhuǎn)化用濃度為1.7×107原生質(zhì)體每毫升的原生質(zhì)體進行。向100μl原生質(zhì)體中加入10μg線性化的pJaL448。隨后加入250μl體積的PEG溶液(60％PEG4000-10mM CaCl2)并將混合物置于37℃30分鐘。隨后加入4ml STC并將混合物涂布基本培養(yǎng)基平板以篩選氯酸鹽抗性。將平板在37℃下孵育5到7天。將氯酸鹽抗性轉(zhuǎn)化子(45個中的9個)分離出來并進一步在含氯酸鹽的基本培養(yǎng)基(利用谷氨酸鹽作為唯一氮源)上純化。評估這9個突變體在硝酸鹽和亞硝酸鹽作為唯一氮源時的生長能力。3個顯示出硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)突變體(niaD)表型，即它們不能利用硝酸鹽生長但可以利用亞硝酸鹽作為唯一氮源生長。
利用來自pJaL410的2kb KpnI片斷或者3.7kb HindIII片斷作為探針，對來自3個突變菌株的BamHI、KpnI和HindIII消化的基因組DNA進行Southern分析，結(jié)果顯示僅有一個轉(zhuǎn)化子在niaD基因座具有期望的基因替換，將其命名為米曲霉JaL294。
實施例9pJaL700的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL700為pToC432的衍生物，其中7到510位的部分NA2啟動子有雙份。用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16進行PCR，從pToC432擴增出534bp的DNA片斷，將其純化并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化，產(chǎn)生516bp的DNA片斷。將516bp的DNA片斷與來自pJaL676的8283 bp的HindIII-EcoRI片斷連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL700(圖1)。
實施例10pJaL701的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL701為pToC432的衍生物，其中7到510位的部分NA2啟動子有雙份。用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO17進行PCR，從pToC432擴增出574bp的DNA片斷，將其純化并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化，產(chǎn)生556bp的DNA片斷。將556bp的DNA片斷與來自pJaL676的8283bp的HindIII-EcoRI片斷連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL701(圖2)。
實施例11pJaL724的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL724為pJaL676的衍生物，其中7到510位的部分NA2啟動子有雙份。用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16進行PCR，從pJaL676擴增出538bp的DNA片斷，將其純化并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII消化，產(chǎn)生514bp的DNA片斷。將514bp的DNA片斷與來自pJaL676的8283bp的HindIII-EcoRI片斷連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL724。
實施例12pJaL729的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL729為pJaL676的衍生物，其中7到510位的部分NA2啟動子有三份。用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16進行PCR，從pJaL676中擴增出538bp的DNA片斷，將其純化并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，并用克列諾聚合酶和dNTP處理使成為鈍末端，這樣產(chǎn)生520bp的DNA片斷。將520bp的DNA片斷與來自pJaL724的8797bp的HindIII DNA片斷連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL729。
實施例13米曲霉JaL294的轉(zhuǎn)化米曲霉JaL294在100ml YEG培養(yǎng)基中34℃培養(yǎng)16-18小時，其間以160轉(zhuǎn)/分鐘搖動。菌絲體利用0.2μm濾器過濾回收直至約10ml留在濾器上，利用約20ml 1M MgSO4·7H2O(已通過0.2μm過濾)洗滌，并隨后利用無菌環(huán)收集并放置于125ml錐形瓶。隨后將菌絲體在溶于15ml 1MMgSO4·7H2O中的75mg NOVOZYM 234TM(來自Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麥)中重懸。將懸液在37℃下以50轉(zhuǎn)/分鐘輕輕搖動孵育約1小時以產(chǎn)生原生質(zhì)體。
125ml錐形瓶內(nèi)容物隨后通過無菌Miracloth過濾至30ml科雷克斯離心管中，其上覆蓋6ml 0.6M山梨醇-100mM Tris pH 7.0，并用吊桶式轉(zhuǎn)頭3500×g離心15分鐘以回收原生質(zhì)體。原生質(zhì)體利用巴斯德吸管從緩沖液界面回收。隨后用2倍體積的STC(1.2M山梨醇-10mMTris-10mMCaCl2·2H2O pH 7.5)洗滌并于3500×g離心5分鐘。在10ml STC中洗滌原生質(zhì)體兩次并如前所述離心。將原生質(zhì)體在STC中重懸至終濃度為1.7×107原生質(zhì)體每毫升。
進行niaD篩選的米曲霉JaL294的轉(zhuǎn)化用濃度為1.7×107原生質(zhì)體每毫升的原生質(zhì)體進行。向100μl的原生質(zhì)體中加入5μg的DNA(pToC432、pJaL676、pJaL700、pJaL701、pJaL724或pJaL729)。隨后加入250μl體積的PEG溶液(60％PEG4000-10mM CaCl2)并將混合物置于37℃30分鐘。隨后加入4ml STC并將混合物涂布基本培養(yǎng)基平板以進行niaD篩選。將平板在37℃下孵育5到7天。轉(zhuǎn)化子通過從在37℃下孵育的基本培養(yǎng)基中劃線孢子和挑取分離的克隆而純化。
實施例14米曲霉JaL294轉(zhuǎn)化子中整合的鑒定根據(jù)下述方法從所有米曲霉JaL294轉(zhuǎn)化子中分離基因組DNA。將每一轉(zhuǎn)化子在25ml試管(NUNC容器)中以10ml YPM培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24小時。隨后將菌絲體從每一培養(yǎng)物中利用Whatman濾紙No.1(Whatman，Spring-field Mill，England)過濾收集并轉(zhuǎn)移至1.7ml離心管。將菌絲體制備物在液氮中冷凍并在Speed-Vac(Savant Instruments公司，F(xiàn)arming-dale，紐約)中干燥1.5小時。利用無菌牙簽將冷凍的菌絲體制備物研成細(xì)的粉末。根據(jù)制造商的說明利用Qiagen DNeasy試劑盒(QIAGEN公司，Valencia，CA)從冷凍的菌絲體中提取基因組DNA。
利用PstI消化基因組DNA并隨后利用Southern雜交確定是否有單拷貝的質(zhì)粒整合進轉(zhuǎn)化子，所述根據(jù)Sambrook等人，1989，前述的方法。另外，從未轉(zhuǎn)化的米曲霉JaL294中提取基因組DNA。消化物的Southern印跡利用獲得自pToC108的1.8kb niaD片斷作為探針。根據(jù)制造商的說明書，使用寶靈曼PCR DIG探針合成試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)用地高辛配基對片斷進行標(biāo)記。將印跡預(yù)雜交2小時并在DIG Easy Hyb中50℃雜交過夜。洗滌印跡并根據(jù)制造商推薦的方法進行。
Southern印跡顯示當(dāng)用niaD片斷作為探針時，pJaL485含有8.5kb帶并且未轉(zhuǎn)化米曲霉JaL294含有3.8kb帶。整合有單拷貝質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子應(yīng)該含有11.7kb和3.8kb帶。整合有多拷貝質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子應(yīng)該含有同樣的11.7kb和3.8kb帶，以及第三條8.5kb的帶。隨后將那些已經(jīng)整合了單拷貝質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子在搖瓶中生長并隨后用于脂肪酶表達(dá)測定。
實施例15搖瓶中的轉(zhuǎn)化子分析實施例13中獲得的米曲霉JaL294轉(zhuǎn)化子用于測定脂肪酶表達(dá)。為進行微量滴定測定，利用49％玻璃蒸餾水和50％2×MY鹽pH6.5溶液將MY25培養(yǎng)基稀釋100倍。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中加入體積為1.25ml的1/100強度的MY25培養(yǎng)基。用10μl來自每一轉(zhuǎn)化子的孢子接種孔，并將培養(yǎng)板在34℃下100轉(zhuǎn)/分鐘搖動培養(yǎng)。每一轉(zhuǎn)化子接種3個孔。未轉(zhuǎn)化的米曲霉JaL294也用于接種3個孔。
第二天和第四天從24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每一孔中移出100μl樣品，用200μl溶于4mM CaCl2-100mM MOPS pH 7.5(MC緩沖液)中的100mMα烯屬磺酸酯(AOS)去污劑稀釋每一樣品，并將20μl小份加至96孔板孔，并緊接著加入200μl稀釋的底物。脂肪酶測定用底物的制備是通過在使用前將丁酸對硝基苯酯貯液底物(21μl丁酸對硝基苯酯/ml DMSO)用MC緩沖液1∶50稀釋。脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)品(LIPOLASETM，Novozymes A/S，Bagsvaerd，Denmark)制備成含有40LU/ml MC緩沖液(含有0.02％AOS去污劑)。該標(biāo)準(zhǔn)品在4℃下貯存直至使用。脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)品在使用前用MC緩沖液1/40稀釋。使用平板讀數(shù)儀記錄405nm處的吸光值，以約1分鐘間隔的差異記錄。脂肪酶單位/ml(LU/ml)相對于脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)品計算。相對于pToC432和pJaL676而得到的脂肪酶活性分別顯示在表1和表2，它們是第四天脂肪酶測定的結(jié)果。
表1-用pToC432、pJaL700和pJaL701轉(zhuǎn)化的米曲霉JaL294轉(zhuǎn)化子的脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒 #篩選的轉(zhuǎn)化子平均脂肪酶活性pToC432 21pJaL700 21.77pJaL701 21.52表2-用pJaL676、pJaL724和pJaL729轉(zhuǎn)化的米曲霉JaL294轉(zhuǎn)化子的脂肪酶表達(dá)質(zhì)粒 #篩選的轉(zhuǎn)化子平均脂肪酶活性pJaL676 21.00pJaL724 21.23pJaL729 21.63正如表1所示，當(dāng)NA2啟動子序列的兩個不同部分有雙份時，與野生型質(zhì)粒(pJaL485)相比，兩個構(gòu)建子脂肪酶的表達(dá)有顯著的增加。
正如表2所示，當(dāng)在pJaL676中的部分NA2啟動子序列有兩份或三份時，與野生型質(zhì)粒(pJaL676)相比，兩個構(gòu)建子脂肪酶的表達(dá)都有顯著的增加，當(dāng)啟動子有三份時具有最高表達(dá)。
實施例16
pJaL719的構(gòu)建曲霉屬表達(dá)質(zhì)粒pCaHj527(WO 0070064)包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒基于融合至構(gòu)巢曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列的黑曲霉中性淀粉酶II啟動子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉糖苷酶終止子(Tamg)。該質(zhì)粒也含有來自構(gòu)巢曲霉的能夠在以乙酰胺為唯一氮源時生長的曲霉屬選擇性標(biāo)志amdS和來自釀酒酵母的能夠使pyrF缺陷型大腸桿菌菌株DB6507(ATCC 35673)生長的URA3標(biāo)志。利用釀酒酵母URA3基因作為選擇性標(biāo)志向大腸桿菌DB6507的轉(zhuǎn)化以下述方式進行用Mandel和Higa的方法(Mandel，M和A.Higa(1970)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)45，154)制備大腸桿菌DB6507的感受態(tài)。轉(zhuǎn)化子在添加了1g/L酪蛋白氨基酸，500μg/L硫胺素和10mg/L卡那霉素的固體M9培養(yǎng)基中篩選(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊(Molecular cloning，a laboratory manual)第二版，冷泉港實驗室出版社)。
以下述方式對pCaHj527進行修飾通過簡單的PCR法對pCaHj527上的Pna2/tpi啟動子進行定點突變。
利用致突變引物141223(SEQ ID NO5)使核苷酸134-144從SEQ IDNO3改變成SEQ ID NO4。
利用致突變引物141222(SEQ ID NO8)使核苷酸423-436從SEQ IDNO6改變成SEQ ID NO7。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pMT2188。
將來自pMT2188的6352bp EcoRI-BamHI片斷與來自pJaL676的617bp的EcoRI-BamHI片斷相連接產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL719。
實施例17pJaL721的構(gòu)建質(zhì)粒pJaL721為pJaL719的衍生物，其中7到510位的部分NA2啟動子有雙份。用引物SEQ ID NO15和SEQ ID NO16進行PCR，從pJaL676中擴增出538bp的DNA片斷，將其純化并利用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化，產(chǎn)生520bp的DNA片斷。將520bp的DNA片斷與來自pJaL719的6355bp的EcoRI片斷相連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pJaL721。
實施例18質(zhì)粒pPME/267的構(gòu)建一株黑曲霉菌株用作PME(果膠甲酯酶)DNA供體的基因組克隆。
黑曲霉基因組DNA的PCR反應(yīng)利用下述2條引物，其分別含有BglII和XhoI限制性酶位點。
BglIIaccPME-> atagatctaccatggttaagtcaattcttgca(SEQ ID NO18)BgIIIXhoPME<- atctcgagaccgcttacaactttcacacaagt(SEQ ID NO19)XhoI反應(yīng)混合物為在含有MgCl2的100μl提供的緩沖液中包含2.6ng/μl基因組DNA，0.25mM dNTP，每一引物100pmol和3.5單位EXPANDTM聚合酶。PCR在下述條件下進行反應(yīng)在94℃2分鐘，其后94℃15秒，60℃30秒和72℃延伸1分鐘，進行30個循環(huán)。從第11到第30循環(huán)，對72℃延伸步驟每一循環(huán)延長20秒。最終的延伸步驟為70℃7分鐘，其后緊接著4℃保持，從而完成步驟。
擴增的1.3kb PME基因用凝膠純化并連接至pT7blue并且將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pt-vPME。測序pt-vPME并證實與EMBLA34997一致。
為合成NA2前導(dǎo)序列，用引物rika1(SEQ ID NO20)和rika2(SEQID NO21)進行PCR擴增，rika2包含BamHI位點rika1(SEQ ID NO20)aaatactggcaagggatgccatgcttggaggatagcaaccgacaacatcacatcaagctctcccttctrika2(SEQ ID NO21)atggatcccttctgtggggtttattgttcagagaagggagagcttgatgtgatgttgtcggttgctatcBamHI反應(yīng)混合物為在含有MgCl2的100μl提供的緩沖液中包含0.25mMdNTP，每一引物100pmol和3.5單位EXPANDTM聚合酶。PCR在下述條件下進行反應(yīng)在94℃2分鐘，其后94℃15秒，60℃30秒和72℃延伸45秒，進行30個循環(huán)。最終的延伸步驟為70℃7分鐘，其后緊接著4℃保持，從而完成步驟。擴增的編碼NA2前導(dǎo)序列的DNA片斷利用凝膠純化并命名為rika3。
為了用NA2前導(dǎo)序列替換pJaL719的TP1前導(dǎo)序列，利用前一個PCR反應(yīng)合成的引物rika3以及rika4(SEQ ID NO22)進行PCR擴增。兩個引物分別含有BamHI和EcoRI限制性位點。
rika4(SEQ ID NO22)atgaattcatggtgttttgatcattttaaatttttatEcoRI反應(yīng)混合物為在含有MgCl2的100μl提供的緩沖液中包含10ngpJaL719作為模板，0.25mM dNTP，每一引物100pmol和3.5單位EXPANDTM聚合酶。PCR在下述條件下進行反應(yīng)在94℃2分鐘，其后94℃15秒，60℃30秒和72℃延伸1分鐘，進行30個循環(huán)。從第11到第30循環(huán)，72℃延伸步驟每一循環(huán)延長20秒。最終的延伸步驟為72℃7分鐘，其后緊接著4℃保持，從而完成步驟。
利用EcoRI和BamHI切割0.6kb擴增的含有NA2啟動區(qū)(具有3個額外的amyR結(jié)合位點)的DNA片斷并將其連接至EcoRI和BamHI切割的pCaHj483，并且轉(zhuǎn)化DH5α。隨后利用EcoRI和BamHI限制性消化提取的質(zhì)粒DNA篩選轉(zhuǎn)化子并隨后通過上述的質(zhì)粒提取和測序驗證正確的序列。將質(zhì)粒命名為pHUda260，其具有包含NA2前導(dǎo)序列和3個額外的amyR結(jié)合位點的黑曲霉NA2啟動子、黑曲霉AMG終止子和構(gòu)巢曲霉amdS基因。
利用SphI消化使該質(zhì)粒線性化。6.8kb線性化pHUda260利用T4DNA聚合酶填平并利用XbaI消化。凝膠純化4.0kb的DNA片斷并與用PmeI和SpeI消化pHUda285產(chǎn)生的具有已修飾Kozac序列的黑曲霉pyrG基因的2.3kb DNA片斷連接。連接混合物轉(zhuǎn)化入JM109。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pHUda263。
利用引物NA2F和NA2R進行PCR，從pJaL721中擴增不含前導(dǎo)序列而具有3個額外amyR結(jié)合位點的串聯(lián)NA2啟動區(qū)，上述引物分別包含MfeI和EcoRI限制酶位點。
NA2F；5′-tttcaattgaagcttatggtgttttgat-3′SEQ ID NO 23)MfeINA2R；5′-tttgaattcatacatcgcatcgacaagg-3′(SEQ ID NO24)EcoRI反應(yīng)混合物為在含有MgCl2的100μl提供的緩沖液中包含10ngpJaL721作為模板，0.25mM dNTP，每一引物100pmol和3.5單位EXPANDTM聚合酶。PCR在下述條件進行反應(yīng)在94℃2分鐘，其后92℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃延伸2分鐘，進行30個循環(huán)。最終的延伸步驟為70℃7分鐘，其后緊接著4℃保持，從而完成步驟。
凝膠純化1.0kb DNA片斷并將其連接至pT7blue載體。連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將產(chǎn)生的質(zhì)粒(pHUda266)測序，驗證擴增的1.0kb片斷在不含前導(dǎo)序列而具有3個額外amyR結(jié)合位點的串聯(lián)NA2啟動區(qū)沒有改變。不含前導(dǎo)序列而具有3個額外amyR結(jié)合位點的串聯(lián)NA2啟動區(qū)的1.0kb DNA片斷通過EcoRI、MfeI消化獲得并且利用Ligationhigh連接至pHUda263的EcoRI位點。連接混合物轉(zhuǎn)化JM109。產(chǎn)生的質(zhì)粒為pHUda267。
利用BglII和XbaI從pt-vPME切下PME基因的1.3kb片斷。將其連接至BamHI和XbaI切割的pHUda267。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pPME/267。
實施例19黑曲霉MBin119的轉(zhuǎn)化黑曲霉MBin119的轉(zhuǎn)化通過常規(guī)原生質(zhì)體方法完成。本發(fā)明優(yōu)選的步驟描述如下將宿主菌株在100ml非選擇YPG培養(yǎng)基中32℃下在旋轉(zhuǎn)振蕩器中120轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)16小時。過濾收集細(xì)胞，用0.6M KCl洗滌并在含有600μl/ml商品化β-葡聚糖酶產(chǎn)物(GLUCANEX，Novozymes A/S)的20ml 0.6M KCl中重懸。將懸液在32℃、80轉(zhuǎn)/分鐘中孵育直至原生質(zhì)體形成，隨后利用STC緩沖液洗滌2次。利用血球計數(shù)板對原生質(zhì)體計數(shù)并在8∶2∶0.1的STC∶STPC∶DMSO的溶液中重懸并調(diào)整至終濃度為2.5×107原生質(zhì)體/ml。向100μl的原生質(zhì)體懸液中加入約3μg的DNA，輕輕混勻并在冰上孵育20分鐘。加入1ml的SPTC并將原生質(zhì)體懸液在37℃孵育30分鐘。向溶液中加入10ml 50℃的Cove頂層瓊脂糖后，將反應(yīng)液倒入Cove-N瓊脂平板并將該平板在32℃下孵育5天。由于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能在Cove-N培養(yǎng)基中生長，轉(zhuǎn)化子可以容易地篩選出。
實施例20轉(zhuǎn)化子的分析用表達(dá)質(zhì)粒pPME/267轉(zhuǎn)化黑曲霉宿主菌MBin119，并在Cove-N瓊脂上分離篩選陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在Cove-N2瓊脂上分離并在30℃生長5天，并且將一小塊連同瓊脂的生長培養(yǎng)物接種于100ml MLC。將其以220轉(zhuǎn)/分鐘30℃旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)2天后，將10ml的每一培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至具100ml GO-50的搖瓶30℃培養(yǎng)5天。將培養(yǎng)肉湯在3500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，并收集上清。上清中的PME活性利用下述方法確定。PME在恒定pH和溫度下水解果膠甲酯。PME活性利用在中和釋放的聚半乳糖醛酸過程中消耗的滴定劑(0.050N NaOH)的量確定。反應(yīng)混合物含有0.48％(W/V)果膠和10mmol Mg2+(pH 4.8)。反應(yīng)條件為pH 4.8和30℃。1PEU(果膠酯酶單位)為在該條件下每分鐘產(chǎn)生1毫酸當(dāng)量的酶活性。轉(zhuǎn)化子顯示高出作為基因組DNA供體的親本黑曲霉菌株約140倍的產(chǎn)量(參見實施例18)。
序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的DNA序列<130>10170<160>24<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>617<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>啟動子<222>(1)..(617)<223>Pna2-tpi啟動子<400>1gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt tttatatggc gggtggtggg caactcgctt 60gcgcgggcaa ctcgcttacc gattacgtta gggctgatat ttacgtaaaa atcgtcaagg120gatgcaagac caaagtacta aaaccccgga gtcaacagca tccaagccca agtccttcac180ggagaaaccc cagcgtccac atcacgagcg aaggaccacc tctaggcatc ggacgcacca240tccaattaga agcagcaaag cgaaacagcc caagaaaaag gtcggcccgt cggccttttc300tgcaacgctg atcacgggca gcgatccaac caacaccctc cagagtgact aggggcggaa360atttatcggg attaatttcc actcaaccac aaatcacagt cgtccccggt attgtcctgc420
agaatgcaat ttaaactctt ctgcgaatcg cttggattcc ccgcccctgg ccgtagagct480taaagtatgt cccttgtcga tgcgatgtat cacaacatat aaatactagc aagggatgcc540atgcttggag gatagcaacc gacaacatca catcaagctc tcccttctct gaacaataaa600ccccacagaa gggatcc 617<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物<400>2ggaacgatgg acccggaagg tttaaaagc 29<210>3<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>135-145位核苷酸<400>3gtactaaaac c 11
<210>4<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(11)<223>135-145位核苷酸<400>4ccgttaaatt t 11<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>引物<400>5ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 45<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>407-422位核苷酸<400>6cggtattgtc ctgcag 16<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>407-422位核苷酸<400>7cggtaattta acggctgcag 20<210>8<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>引物
<400>8ccgtctgcag ccgttaaatt accggggacg actgtg 36<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(14)<223>424-437位核苷酸<400>9atgcaattta aact 14<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(16)<223>424-437位核苷酸<400>10cggcaattta acgg 14<210>11<211>44
<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(44)<223>引物<400>11ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc 44<210>12<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(65)<223>529-617位核苷酸<400>12gatagcaacc gacaacatca catcaagctc tcccttctct gaacaataaa ccccacagaa 60<210>13<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(65)<223>529-617位核苷酸<400>13tttccaactc aatttacctc tatccacact tctcttcctt cctcaatcct ctatatacac 60aactg 65<210>14<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(106)<223>引物<400>14gctcctcatg gtggatcccc agttgtgtat atagaggattgaggaaggaa gagaagtgtg 60gatagaggta aattgagttg gaaactccaa gcatggcatc ccttgc 106<210>15<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(37)<223>引物
<400>15gacgacgaat tcaagcttat ggtgttttga tcatttt 37<210>16<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>引物<400>16gacgacgaat tcatacatcg catcgacaag g31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>引物<400>17gacgacgaat tcatacatcg catcgacaag g31<210>18<211>32<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物BgIIIaccpME<400>18atagatctac catggttaag tcaattcttg ca 32<210>19<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物XhoPME<400>19atctcgagac cgcttacaac tttcacacaa gt 32<210>20<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(68)
<223>引物rikal<400>20aaatactggc aagggatgcc atgcttggag gatagcaacc gacaacatca catcaagctc 60tcccttct 68<210>21<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(69)<223>引物rika2<400>21atggatccct tctgtggggt ttattgttca gagaagggag agcttgatgt gatgttgtcg 60gttgctatc 69<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(37)<223>引物rika4<400>22atgaattcat ggtgttttga tcattttaaa tttttat 37
<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物NA2F<400>23tttcaattga agcttatggt gttttgat28<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>引物NA2R<400>24tttgaattca tacatcgcat cgacaagg28
權(quán)利要求
1.在真核宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，其包含i)RNA聚合酶結(jié)合的第一DNA序列，該DNA序列包含mRNA起始位點；并且還包含ii)RNA聚合酶結(jié)合的具有或不具有mRNA起始位點的一個或多個DNA序列。
2.權(quán)利要求1的DNA序列，其還包含RNA聚合酶識別位點，特別是TATA盒或其它同類序列等。
3.權(quán)利要求1或2的DNA序列，其中RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列為RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子，優(yōu)選地為RNA聚合酶結(jié)合所需的啟動子的一部分。
4.權(quán)利要求1-3中任意一項所述的DNA序列，其中ii)中所定義的第二RNA聚合酶結(jié)合位點位于i)中所定義的包括mRNA起始位點的第一RNA聚合酶結(jié)合位點5’末端的上游，特別是彼此相隔0到100bp，特別是彼此相隔10-50bp，尤其是彼此相隔4-30bp。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項所述的DNA序列，其中真核宿主細(xì)胞為真菌生物體，例如絲狀真菌或酵母。
6.權(quán)利要求5的DNA序列，其中真菌宿主細(xì)胞為絲狀真菌細(xì)胞，特別是選自曲霉屬如黑曲霉或米曲霉、鐮孢屬、青霉屬或木霉屬，尤其是里氏木霉。
7.權(quán)利要求5的DNA序列，其中酵母選自漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬或酵母屬細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1-6中任意一項所述的DNA序列，其中結(jié)構(gòu)基因編碼的酶選自氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或者連接酶，例如選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、α-1，6-葡聚糖酶(dextranase)、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、α-1，3-葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或者木聚糖酶。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項所述的DNA序列，其還包含第三DNA序列，所述第三DNA序列為具有或不具有包含RNA聚合酶識別位點和/或mRNA起始位點區(qū)域的RNA聚合酶結(jié)合位點。
10.權(quán)利要求1-9中任意一項所述的DNA序列，其中RNA聚合酶結(jié)合位點為在SEQ ID NO1中所示的Pna2-tpi啟動子或者為在SEQ IDNO1的1-510位或7-510位所示的NA2啟動子。
11.權(quán)利要求1-10中任意一項所述的DNA序列，其中第二RNA聚合酶結(jié)合位點的3’末端位于第一RNA聚合酶結(jié)合位點5’末端的上游，所述第一RNA聚合酶結(jié)合位點位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游。
12.權(quán)利要求1-11中任意一項所述的DNA序列，其包含2個或者多個重復(fù)的RNA聚合酶結(jié)合位點，特別是2-5個，尤其是以串聯(lián)或RNA聚合酶結(jié)合位點緊密相連的方式存在。
13.權(quán)利要求1-12中任意一項所述的DNA序列，其包含2個或3個RNA聚合酶結(jié)合位點，其中僅與所討論結(jié)構(gòu)基因最近的RNA聚合酶結(jié)合位點具有mRNA起始位點并任選地RNA聚合酶識別位點。
14.權(quán)利要求1-13中任意一項所述的DNA序列，其中在包含RNA聚合酶識別位點和mRNA起始位點區(qū)域上游的區(qū)域還包含1個或多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，特別是曲霉屬amyR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
15.權(quán)利要求1-14中任意一項所述的DNA序列，其中RNA聚合酶結(jié)合位點為這樣的啟動子，其選自米曲霉TAKA淀粉酶、NA2、NA2-tpi和glaA啟動子。
16.DNA構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1-15中的DNA序列在真核宿主細(xì)胞中起作用并且其與編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因以及終止子區(qū)域可操縱地相連。
17.包含權(quán)利要求16中所述DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，其還包含信號肽編碼區(qū)。
18.真核宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1-15所述的DNA序列或者權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體或者權(quán)利要求17所述的表達(dá)載體。
19.產(chǎn)生多肽的方法，其包括(a)在適合于多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求18的宿主細(xì)胞，其中宿主細(xì)胞含有在權(quán)利要求1-15中所述DNA序列或者權(quán)利要求16所述DNA構(gòu)建體調(diào)控下的結(jié)構(gòu)基因；以及(b)回收多肽。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中權(quán)利要求1-15中所述的DNA序列位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游，所述編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因為宿主細(xì)胞內(nèi)源。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中權(quán)利要求1-15中所述的DNA序列位于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因的上游，所述編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因為宿主細(xì)胞異源或外源。
22.增加真核宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)水平的方法，其包含向親本RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子上游引入一個或多個RNA聚合酶結(jié)合位點，或者其中親本RNA聚合酶結(jié)合位點或啟動子用權(quán)利要求1-15中所述的DNA序列替換。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中RNA聚合酶結(jié)合位點為串聯(lián)位點。
24.權(quán)利要求22或23中所述的方法，其中RNA聚合酶結(jié)合位點由一個或多個重復(fù)的可結(jié)合RNA聚合酶的DNA序列組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及在真核宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，其包含i)RNA聚合酶結(jié)合的第一DNA序列，該DNA序列包含mRNA起始位點；并且還包含ii)具有或不具有mRNA起始位點的一個或多個結(jié)合RNA聚合酶的DNA序列。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明DNA序列的DNA構(gòu)建體和表達(dá)載體以及宿主細(xì)胞。
文檔編號C12N9/22GK1533437SQ02814606
公開日2004年9月29日 申請日期2002年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月20日
發(fā)明者J·萊姆貝克, J 萊姆貝克 申請人:諾和酶股份有限公司