專利名稱：一種快速調(diào)控水稻內(nèi)源miRNA活性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及反義核苷酸以及miRNA模擬物技術(shù)。
背景技術(shù)：
Micro RNA (miRNA)是一類 22nt的內(nèi)源非編碼小分子RNA。在真核生物中， miRNA通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，以抑制基因翻譯或剪切mRNA的方式，起到轉(zhuǎn)錄后負(fù)數(shù)調(diào)控的作用。對(duì)擬南芥、水稻等模式植物的研究顯示，植物miRNA不僅調(diào)控根系發(fā)生、開(kāi)花時(shí)序等多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，而且在氧自由基、干旱、鹽分、嚴(yán)寒和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)缺失等脅迫響應(yīng)中也起重要作用。miRNA作為廣泛分布的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，已日益成為功能基因組研究中不可缺少的組分，但絕大部分miRNA的功能尚不清楚。目前，在植物中對(duì)miRNA進(jìn)行功能研究的手段主要有兩種1)通過(guò)靶基因模擬 (target mimics)的策略，利用過(guò)表達(dá)目標(biāo)miRNA靶基因的類似物，間接實(shí)現(xiàn)knockdown目標(biāo)miRNA的活性；2)通過(guò)人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)技術(shù)，利用過(guò)表達(dá)目標(biāo) miRNA的前體，實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)miRNA的活性。上述方法均以構(gòu)建靶基因或miRNA前體的表達(dá)載體為前提，并需要利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株或者利用病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。除此之外，在動(dòng)物中有利用反義miRNA寡核苷酸(Anti-miRNA Oligonucleotide, ΑΜ0) 或miRNA模擬物(miRNA mimics)，通過(guò)將其顯微注射入動(dòng)物胚胎或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)快速抑制或增強(qiáng)miRNA活性的報(bào)道。盡管動(dòng)物中脂質(zhì)體可以有效幫助寡核苷酸跨膜運(yùn)輸，但在植物中脂質(zhì)體卻不容易穿過(guò)細(xì)胞壁。由于寡核苷酸跨膜運(yùn)輸?shù)木窒扌?，反義寡核苷酸技術(shù)在植物中并未得到廣泛應(yīng)用。最近，有報(bào)道在大麥葉片中反義寡脫氧核糖核酸(antisense oligodeoxynucleotides, antisense 0DN)可以通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)運(yùn)輸入植物細(xì)胞從而抑制mRNA的表達(dá)(Sun et al.，2005; Sun et al.，2007)，提示有可能通過(guò)促進(jìn)寡核苷酸跨膜運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)快速調(diào)控植物內(nèi)源miRNA的活性。目前，利用AMO或miRNA mimics在植物活體內(nèi)抑制或增強(qiáng)內(nèi)源miRNA的報(bào)道尚未見(jiàn)報(bào)道；同時(shí)對(duì)多個(gè)植物miRNA活性進(jìn)行調(diào)控，在同一處理中既能抑制部分miRNA活性又能增強(qiáng)另外某些miRNA活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)目前植物miRNA功能研究受限于以人工microRNA或靶基因表達(dá)載體構(gòu)建為基礎(chǔ)的技術(shù)，存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題，提供了一種快速調(diào)控植物內(nèi)源 miRNA活性的方法。該方法按以下步驟實(shí)施一、根據(jù)目標(biāo)miRNA成熟體序列設(shè)計(jì)并合成反義寡核苷酸或模擬物(mimics) ；二、利用蔗糖-核苷酸溶液浸泡水稻組織或植株，將核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)在特異地抑制或增強(qiáng)目標(biāo)miRNA的活性；所述的核苷酸為目標(biāo)miRNA的反義寡核苷酸或miRNA的雙鏈寡核苷酸模擬物。浸泡前，預(yù)先在清水中黑暗處理1214小時(shí)。其中的反義寡核苷酸是采用2’ -Ο-methyl修飾并與miRNA成熟體序列完全互補(bǔ)的反義寡核苷酸。不同miRNA的反義寡核苷酸和模擬物可以混合使用。采用水稻組織時(shí)，可以是離體根、莖、葉、花序或小穗。此時(shí)蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡為一次性浸泡，先在蔗糖濃度為50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飛小時(shí)，再在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小時(shí)。蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的濃度為2. 5 μ μ Μ。采用水稻植株時(shí)，可以是植物活體的幼苗或成體。此時(shí)蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡可采用間歇多次浸泡或一次浸泡。多次浸泡為每次在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡1214小時(shí)，每?jī)纱谓葜g的間隔期為2、天，間歇期間水稻植株正常培養(yǎng)生長(zhǎng)；多次浸泡次數(shù)可以為2次或以上，每次使用的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的濃度為0. 625 μ 5 μ Μ。一次浸泡先在蔗糖濃度為50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飛小時(shí)，再在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小時(shí)。曾有報(bào)道利用蔗糖-寡核苷酸溶液將未加修飾的18-mer反義ODN運(yùn)輸進(jìn)大麥的離體葉片或花序，以抑制目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)(Sun et al. , 2005, 2007)，但即使基于現(xiàn)有的研究，開(kāi)展本發(fā)明的研究工作仍存在著一系列不確定性
首先，文獻(xiàn)中報(bào)道的作用機(jī)理是根據(jù)RNaseH酶切割雜合分子中的RNA鏈的特性，利用反義DNA與目標(biāo)mRNA結(jié)合形成DNA =RNA雜合分子，從而激活RNase H導(dǎo)致目標(biāo)miRNA降解。本發(fā)明中的AMO為與miRNA成熟體完全互補(bǔ)的單鏈RNA ( 21nt)，其抑制miRNA功能的作用機(jī)理主要是根據(jù)空間位阻效應(yīng)，通過(guò)阻止miRNA與其靶基因在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 (RNA Induced Silencing Complex, RISC)中的結(jié)合，達(dá)到抑制miRNA生物學(xué)功能的效果。 兩者的作用機(jī)理有著本質(zhì)區(qū)別。其次，現(xiàn)有文獻(xiàn)中被報(bào)道用于抑制mRNA的ODN未加修飾(naked 0DN)，而本發(fā)明中用于抑制miRNA功能的AMO經(jīng)過(guò)2’-0-methyl修飾。甲基化修飾可以保護(hù)寡核苷酸不被核酸外切酶和內(nèi)切酶的作用，增加其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。對(duì)文獻(xiàn)中利用ODN抑制mRNA的應(yīng)用而言，甲基化修飾的ODN將保護(hù)DNA =RNA分子，抑制RNase-H介導(dǎo)的RNA降解，從而嚴(yán)重影響其抑制mRNA的效果。而由于本發(fā)明的作用機(jī)理是通過(guò)空間位阻效應(yīng)抑制miRNA的生物學(xué)功能，因此甲基化修飾將增加AMO在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性及其與目標(biāo)miRNA的結(jié)合能力，增強(qiáng)對(duì)miRNA活性抑制的效果。 第三，化學(xué)修飾導(dǎo)致本發(fā)明中AMO的分子量相對(duì)較大，沿用文獻(xiàn)中ODN處理的摩爾濃度及時(shí)間，將由于蔗糖-核苷酸溶液的質(zhì)量百分比濃度過(guò)高而形成對(duì)植物細(xì)胞的干旱脅迫，影響植物細(xì)胞的正常功能及寡核苷酸的跨膜運(yùn)輸。而本發(fā)明經(jīng)過(guò)多次摸索試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方案可以在保持植物或組織完整性的同時(shí)將miRNA的反義寡核苷酸或模擬物轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物內(nèi)源miRNA活性的快速調(diào)控，達(dá)到抑制或增強(qiáng)miRNA生物學(xué)功能的顯著效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下
1.本發(fā)明操作簡(jiǎn)便快捷，干擾效果顯著、穩(wěn)定持久，避免了現(xiàn)有方法由于依賴過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化或病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，因而實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)；對(duì)活體植株采用 “少量多次”的實(shí)施方式，減少了高濃度的蔗糖-寡核苷酸溶液可能導(dǎo)致的細(xì)胞干旱脅迫。2.不受品系或物種局限性，即使是轉(zhuǎn)化體系不完善的秈稻品系或其他非模式植物，也可使用本發(fā)明方便快捷地沉默或過(guò)表達(dá)目的miRNA，為研究不同遺傳背景下植物miRNA的生物學(xué)功能提供了新手段；
3.本發(fā)明可以通過(guò)將不同靶miRNA的反義寡核苷酸或模擬物混合使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)miRNA同時(shí)進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，為深入進(jìn)行植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能研究、發(fā)現(xiàn)控制復(fù)雜性狀的關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。


圖1是以O(shè)Sa-MIR820a-C為例，糖溶液及反義寡核苷酸濃度對(duì)水稻葉片中 miRNA沉默的量效關(guān)系。a)不同濃度的糖溶液及anti-OSa-MIR820a-C處理水稻葉片后 osa-MIR820a-c 的表達(dá)量；b) anti-osa-MIR820a_c 處理后 osa_MIR169f，g 的表達(dá)量，用于檢測(cè)反義寡核苷酸的偏靶效應(yīng)。圖2是以O(shè)Sa-MIR820a-C為例，反義寡核苷酸處理水稻葉片對(duì)內(nèi)源miRNA沉默的時(shí)效關(guān)系。a) anti-osa-MIR820a_c處理水稻葉片不同時(shí)間后osa-MIR820a_c的表達(dá)量； b)相同處理?xiàng)l件下對(duì)應(yīng)的osa-MIR820a-c靶基因0s03g02010的表達(dá)量。圖3是以O(shè)Sa-MIR820a-C為例，反義寡核苷酸處理水稻幼苗對(duì)內(nèi)源miRNA沉默的時(shí)效關(guān)系。a) anti-osa-MIR820a-c處理水稻幼苗12小時(shí)或M小時(shí)后osa-MIR820a_c在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量；b)相同處理?xiàng)l件下對(duì)應(yīng)的oSa-MIR820a-C靶基因0s03g02010的表達(dá)量。圖4是miRNA反義寡核苷酸及模擬物的混合物處理水稻幼苗對(duì)內(nèi)源miRNA的調(diào)控效應(yīng)。a) miRNA反義寡核苷酸及模擬物的混合處理后，各個(gè)miRNA表達(dá)量。b) miRNA反義寡核苷酸及模擬物的混合處理后，各個(gè)靶基因的表達(dá)量。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是具體實(shí)施例并不在任何意義上構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例1材料與方法。1.反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)與合成
從miRbase中獲得目標(biāo)miRNA的成熟體序列，根據(jù)序列互補(bǔ)原理設(shè)計(jì)其反義寡核苷酸序列，反義寡核苷酸采用2’ -Ο-methyl修飾；miRNA模擬物為與成熟體序列一致的雙鏈核糖核苷酸，為增強(qiáng)其穩(wěn)定性3’末兩位堿基可為脫氧核糖核苷酸。同時(shí)利用BLAST軟件分析， 確定miRNA反義寡核苷酸和模擬物的隨機(jī)對(duì)照序列。MiRNA反義寡核苷酸及模擬物均由上海吉瑪公司合成。2.植物材料及栽培條件
水稻品系日本晴(Nipponbare)的種子用5%次氯酸鈉溶液浸泡10分鐘，滅菌水沖洗干凈，在室溫下水中浸泡三天，然后在37° C下發(fā)芽一天(保持黑暗)，生長(zhǎng)同步的種子在自然條件下用水稻土培養(yǎng)至一個(gè)月大小。3.糖溶液介導(dǎo)的miRNA沉默
選取健康的生長(zhǎng)狀況一致的一個(gè)月大的水稻，將其連根拔出后用水清洗干凈。培養(yǎng)在清水中黑暗處理M小時(shí)，之后分離帶葉鞘的葉片，葉片用蔗糖-反義寡核苷酸溶液浸泡處理M小時(shí)。每種處理進(jìn)行三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理后的樣品經(jīng)超純水漂洗用于后續(xù)的RNA提取。4.總 RNA 提取
1)用1%。的DEPC溶液浸泡需要使用的離心管、磁珠和石英砂過(guò)夜，然后包裝，并于 121°C高壓蒸汽滅菌50分鐘。所有使用的去離子水均為經(jīng)過(guò)高壓滅菌的1%。DEPC水。2)在2ml的離心管內(nèi)加入適量石英砂和一粒磁珠，以及500 μ 1的抽提緩沖液及 75μ 1的β-巰基乙醇。抽提緩沖液的配方如下
d)Tris · HCl(1M，PH 8. 0) IOml (IOOmM)
e)EDTA (0. 5M, PH 8. 0) 8ml (20mM)
3)在上述管子中加入少于250mg的新鮮組織樣品，然后用！^astft 印儀震蕩粉碎， speed 5. 5級(jí)，time 30秒。粉碎后的樣品從hsterfr印儀上取出后馬上用離心機(jī)高速甩去氣泡，然后立即加入75μ 1的β-巰基乙醇和500 μ 1的抽提緩沖液，混勻后室溫靜置10 分鐘。4)短暫離心后將上清轉(zhuǎn)移到一新管，加入約800 μ 1氯仿異戊醇(24 :1)，混勻。 4°C下，IOOOOrpm 離心 8min。5)小心吸出上層清夜移至新管，再加700 μ 1的氯仿異戊醇(24 :1)，混勻后4°C離心(10000rpm，8min) 1 次。6)小心吸出上層清液倒新管，加入1/3倍體積的8M LiCl，并混勻。_20°C沉淀6小時(shí)或過(guò)夜。7) 4°C，IOOOOrpm 離心 15min,取上清。8)加入 800ul 75% 的乙醇，混勻，4°C，7500rpm 離心 5min。9)吸去乙醇，將沉淀真空抽干。加入30ul DEPC水溶解沉淀，取Iul電泳檢測(cè)，Iul 用Thermo NanoDrop 2000測(cè)濃度，其余樣品_20°C保存。5. miRNA的熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
miRNA的熒光實(shí)時(shí)定量PCR采用Varkonyi-Gasic等(2007)的UPL探針?lè)椒?。首先?根據(jù)成熟體序列設(shè)計(jì)miRNA特異的Stem-loop RT-PCR引物(Chen et al.，2005)，利用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (AB)，在 7. 5ul 體系中加入 200ng 總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)程序?yàn)?6°C 30min, 42°C 30min, 85°C 5min, 4°C 20min。然后，取 Iul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，在含Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)的IOul反應(yīng)體系中力口入 0. Iul 濃度為 IOuM 的 Universal PorbeLibrary Probe #21 (Roche)探針，進(jìn)行 miRNA熒光實(shí)時(shí)定量PCR。使用儀器為Roche LightCycler480，反應(yīng)程序?yàn)?4°C IOmin ； (940C 15sec, 60°C lmin) 45個(gè)循環(huán)，60°C收集信號(hào)。運(yùn)行結(jié)束后利用LightCycler480 Softwarel. 5分析數(shù)據(jù)。每種樣品進(jìn)行三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以5. 8s rRNA作為內(nèi)參基因，miRNA 的相對(duì)表達(dá)水平采用計(jì)算。6. mRNA的熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)
IOOrnl
a)CTAB
b)PEG4000
c)NaCl
2g (2%終濃度) Ig (1%終濃度) 8. 18g (1. 4M )總RNA用TURBO DNA-free kit (Ambion)處理去除殘留的DNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照 SuperScript III First-Stand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)提供的說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)時(shí)定量參照Platinum SYBR Green qPCR SuperMix Gnvitrogen)提供的說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)程序94°C 2min, (94°C 15sec, 60°C 20sec, 72°C 20sec) 45 個(gè)循環(huán)，72°C 收集信號(hào)，使用儀器為Roche LightCyclerfSO。每種樣品進(jìn)行三個(gè)生物學(xué)重復(fù)及兩次技術(shù)重復(fù)，以Actin作為內(nèi)參基因，mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用2 _ΔΔετ計(jì)算。實(shí)施例2 反義寡核苷酸對(duì)水稻葉片中miRNA活性抑制的最佳作用濃度。如實(shí)施例1，其中步驟3的蔗糖-反義寡核苷酸溶液，分別采用4種蔗糖溶液濃度(200mM-IOOmM, IOOmM, 100mM-50mM, 50mM)及兩種 anti-osa-MIR820a_c (SEQ ID NO: 1 :5，-CUGGUCCAUCCACGAGGCCGA-3，)溶液濃度(2. 5 μ M 和 5 μ M)，一共 8 種濃度組合的溶液對(duì)水稻葉片進(jìn)行M小時(shí)處理。對(duì)照組采用anti-mock (SEQ ID NO:2 5‘-GGUUGUCCUACCUAGGGCGCC-3‘)處理，處理?xiàng)l件同上。其中 200mM-100mM及 100mM-50mM 的蔗糖濃度，是指先用高濃度處理3小時(shí)然后降至低濃度處理直至M小時(shí)。圖Ia表明在各種濃度組合下，oSa-MIR820a-C的表達(dá)量均下降到對(duì)照組的約1%左右，miRNA沉默效果非常顯著(Student's t-test, p<0. 001 )。不同的反義寡核苷酸濃度對(duì)miRNA沉默效應(yīng)的影響不顯著；高濃度的蔗糖溶液能在一定程度上促進(jìn)反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，但當(dāng)使用IOOmM或以上濃度的蔗糖溶液處理超過(guò)3小時(shí)后葉片出現(xiàn)萎蔫，隨后降低糖濃度癥狀能得到緩解。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們使用了 100mM-50mM蔗糖溶液濃度與較低的反義寡核苷酸濃度(2. 5μΜ) 的組合進(jìn)行處理。圖Ib表明使用100-50uM蔗糖溶液及2. 5 μ M anti-osa-MIR820a_c處理水稻葉片M小時(shí)后，oSa-MIR-169f，g的表達(dá)量與對(duì)照組并無(wú)顯著差異，因此反義寡核苷酸處理有較好的特異性，對(duì)其他非目的miRNA的影響較小。實(shí)施例3 反義寡核苷酸對(duì)水稻葉片中miRNA活性抑制作用的時(shí)效性。如實(shí)施例1，但步驟三中處理濃度及時(shí)間為先在蔗糖濃度為IOOmM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3小時(shí)，再在蔗糖濃度為50mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至5小時(shí)、 12小時(shí)和M小時(shí)，所有處理的蔗糖-寡核苷酸溶液中反義寡核苷酸的濃度均為2. 5 μ M。如圖2a所示，在不同anti-osa-MIR820a_c的處理時(shí)間下，osa-MIR820a_c的表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組均有顯著下調(diào)(P<0. 001)，且下調(diào)程度隨時(shí)間增加而加強(qiáng)；與之對(duì)應(yīng)， osa-MIR820a-c的靴基因0s03g02010的表達(dá)量在anti-osa-MIR820a_c處理24小時(shí)后上調(diào)至對(duì)照組的約5倍(圖2b)。因此，蔗糖溶液介導(dǎo)的反義寡核苷酸處理可以有效抑制水稻離體葉片中內(nèi)源miRNA的活性，延長(zhǎng)處理時(shí)間能加強(qiáng)miRNA沉默的效果。實(shí)施例4 反義寡核苷酸對(duì)水稻幼苗中miRNA活性抑制作用的時(shí)效性。如實(shí)施例3，但步驟二中的植物材料為2-3天大小的水稻黃化幼苗；步驟三中的處理則是將小苗根部先在蔗糖濃度為IOOmM的蔗糖-反義寡核苷酸溶液中直接浸泡3小時(shí)， 再在蔗糖濃度為50mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至12小時(shí)和M小時(shí)，隨后將幼苗轉(zhuǎn) A^shida培養(yǎng)液進(jìn)行水培。對(duì)處理12小時(shí)的幼苗，分別在12小時(shí)、M小時(shí)、2天、5天和 7天收集材料提取RNA ；對(duì)處理M小時(shí)的幼苗，分別在M小時(shí)、2天、3天、5天和7天收集材料提取RNA。其他步驟與3相同。如圖3a 所示，水稻幼苗經(jīng) anti-osa-MIR820a_c 處理 12 小時(shí)后，osa-MIR820a_c 的表達(dá)量降至對(duì)照組的30%左右，osa-MIR820a-c的表達(dá)量在M小時(shí)降至最低，并可以一直維持在約為對(duì)照組5-8%的水平直至第五天，第七天OSa-MIR820a-C的表達(dá)略有回升但仍能保持在對(duì)照組的24% ；anti-osa-MIR820a-c處理M小時(shí)后，幼苗osa-MIR820a_c 的表達(dá)量降至對(duì)照組的5%，osa-MIR820a-c的表達(dá)量在第二天降至最低，隨后直至第七天OSa-MIR820a-C的表達(dá)量都可以穩(wěn)定保持在對(duì)照組的 10%。如圖北所示，水稻幼苗經(jīng) anti-osa-MIR820a-c處理后，osa-MIR820a_c靶基因的表達(dá)量與對(duì)照組相比略有上調(diào)，最多可上調(diào) 21%左右。蔗糖溶液介導(dǎo)的反義寡核苷酸處理可以有效地在水稻幼苗活體內(nèi)抑制內(nèi)源miRNA的活性，而且作用時(shí)間可以持續(xù)至少7天。實(shí)施例5 反義寡核苷酸與miRNA模擬物的混合物對(duì)水稻幼苗中內(nèi)源miRNA的調(diào)控。如實(shí)施例4，但步驟三中的單個(gè)miRNA的反義寡核苷酸由多個(gè)miRNA的反義寡核苷酸與miRNA模擬物的混合物替代，混合物中含有
0.625 μ M anit-osa-MIR390 (SEQ ID NO:3 5，- GGCGCUAUCCCUCCUGAGCUU-3，)、 0. 625 μ M anit-osa-MIR160a-d (SEQ ID N0:4 5' - UGGCAUACAGGGAGCCAGGCA-3')、 0. 625 μ M anit-osa-MIR167d-h (SEQ ID N0:5 5' - CAGAUCAUGCUGGCAGCUUCA-3')、 0. 625 μ M anit-osa-MIR171g (SEQ ID NO:6 :5，- GAUAUUGGCUCGGCUCACCUC-3，)禾口 2. 5 μ M mimic-osa-MIR164a, b, f (sense: SEQ ID N0:7 5' -UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA-3', antisense: SEQ ID N0:8 :5，_ UGCAC⑶GCCCUGCUUCUCCA-3，);幼苗根系在蔗糖濃度為 50mM、 寡核苷酸混合物濃度如前所述的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡M小時(shí)后，轉(zhuǎn)入^shida營(yíng)養(yǎng)液中水培兩天，然后在同樣濃度的蔗糖-寡核苷酸溶液中進(jìn)行第二次反義寡核苷酸與 miRNA模擬物的混合物處理M小時(shí)，隨后再轉(zhuǎn)入^shida營(yíng)養(yǎng)液中水培兩天后收集幼苗的根系材料提取 RNA。對(duì)照組采用 anti-mock(SEQ ID NO: 2 :5，-GGUU(iUCCUACCUAGGGCGCC-3，) 或 mimic-mock (sense :SEQ ID N0:9 :5’ - GGCGCCCUAGGUAGGACAACC-3’ ； anti-sense SEQ ID NO: 2 :5，-GGUU⑶CCUACCUAGGGCGCC-3，)處理，兩者核苷酸濃度均為2. 5 μ M，處理?xiàng)l件同上。其他步驟與實(shí)施例4相同。如圖如所示，經(jīng)miRNA反義寡核苷酸和模擬物的混合處理后，四種反義寡核苷酸的靶標(biāo)miRNA的表達(dá)量均有不同程度的下調(diào)，除oSa-iOR171g外其他miRNA的表達(dá)下調(diào)非常顯著(P<0. 001)，而miRNA模擬物的靶標(biāo)OSa-iOR16^，b, f的表達(dá)量有顯著上調(diào)(ρ <0. 001 )。如圖4b所示，盡管osa-iOR390和osa-iOR-160的靶基因的表達(dá)與對(duì)照相比變化和不顯著，但osa-MIR167和0s_MIR171的靴基因均有顯著上調(diào)(p< 0. 01)且osa_MIR164 的靶基因表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0. 05)。因此，通過(guò)將不同靶miRNA的反義寡核苷酸或模擬物混合使用，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)抑制或者增強(qiáng)多個(gè)目標(biāo)miRNA的活性。
權(quán)利要求
1.一種快速調(diào)控水稻內(nèi)源miRNA活性的方法，其特征在于通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)利用蔗糖-核苷酸溶液浸泡水稻組織或植株，將核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)特異地抑制或增強(qiáng)目標(biāo)miRNA的活性；所述的核苷酸為目標(biāo)miRNA的反義寡核苷酸或miRNA的雙鏈寡核苷酸模擬物或它們的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水稻組織為離體根、莖、葉、花序或小穗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述水稻植株為植物活體的幼苗或成體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡為一次性浸泡，先在蔗糖濃度為50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飛小時(shí)，再在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的濃度為2. 5 μ M 5 μ M。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的蔗糖-寡核苷酸溶液浸泡為間歇多次浸泡或一次性浸泡；多次浸泡為每次在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡12 24小時(shí)，每?jī)纱谓葜g的間隔期為2 7天，間歇期間水稻植株正常培養(yǎng)生長(zhǎng)；一次浸泡先在蔗糖濃度為50mlT200mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡3飛小時(shí)，再在蔗糖濃度為50mlTl00mM的蔗糖-寡核苷酸溶液中浸泡直至1214小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的多次浸泡次數(shù)為2次或以上，單次使用的蔗糖-寡核苷酸溶液中核苷酸的濃度為0. 625 μ 5 μ Μ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的水稻組織是浸泡前，預(yù)先在清水中黑暗處理12 24小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反義寡核苷酸是采用2’-Ο-methyl修飾并與miRNA成熟體序列完全互補(bǔ)的反義寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述核苷酸是單個(gè)或多個(gè)不同miRNA的反義寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸模擬物的組合。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速調(diào)控水稻內(nèi)源miRNA活性的方法。該方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)一、根據(jù)目標(biāo)miRNA成熟體序列設(shè)計(jì)并合成反義寡核苷酸或模擬物(mimics)；二、利用糖溶液將目標(biāo)miRNA的反義寡核苷酸或模擬物經(jīng)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)運(yùn)輸入植物細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)在植物活體中特異性地抑制或增強(qiáng)目標(biāo)miRNA活性。該方法具有操作簡(jiǎn)便快捷，干擾效果顯著、穩(wěn)定持久的優(yōu)點(diǎn)，避免了現(xiàn)有方法由于依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)因而實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。同時(shí)，該方法可以將不同靶miRNA的反義寡核苷酸或模擬物混合使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)miRNA同時(shí)進(jìn)行正調(diào)控或負(fù)調(diào)控。
文檔編號(hào)C12N15/87GK102181482SQ20111002674
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月25日
發(fā)明者何漣, 吳仲義, 唐恬, 張?zhí)碓? 文海軍, 施蘇華 申請(qǐng)人:中山大學(xué)