鑒定和分離導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的終止子序列的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于鑒定和分離導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的終止子序列的有效的高通量方法、系統(tǒng)和DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供了用這些方法分離的終止子序列及其用于增強(qiáng)基因表達(dá)的用途。
【專利說明】鑒定和分離導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的終止子序列的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于鑒定和分離導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的終止子序列的有效的高通量方法、系統(tǒng)和DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及用這些方法分離的終止子序列及其用于增強(qiáng)基因表達(dá)的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]植物生物技術(shù)的目的是產(chǎn)生具有有利的新性能，例如害蟲和疾病抗性、對環(huán)境脅迫(例如水浸、干旱、高溫、寒冷、光強(qiáng)度、晝長、化學(xué)品等)的抗性、提高的質(zhì)量(例如高果實(shí)產(chǎn)量、延長的儲(chǔ)存期、一致的果實(shí)形狀和顏色、較高的含糖量、較高的維生素C和A含量、較低的酸度等等)的植物，或產(chǎn)生某些化學(xué)品或藥物(Dunwe 11, 2000)。此外可提高針對非生物脅迫(干旱、鹽)和/或生物脅迫(昆蟲、真菌、線蟲感染)的抗性?？赏ㄟ^開發(fā)具有期望表型的遺傳改造的植物實(shí)現(xiàn)作物產(chǎn)量增加和產(chǎn)量穩(wěn)定性。
[0004]對所有 生物【技術(shù)領(lǐng)域】而言，除了啟動(dòng)子序列之外，位于基因3' UTR的終止子序列是用于特定基因的重組表達(dá)的基本先決條件。在動(dòng)物系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制已被研究得很清楚(Zhao 等人，1999 ；Proudfoot, 1986 ；Kim 等人，2003 ；Yonaha 和 Proudfoot, 2000 ；Cramer 等人，2001 ；Kuerstem 和 Goodwin, 2003)。
[0005]然而，終止子可能具有比簡單的終止轉(zhuǎn)錄更多的作用。例如，Narsai等人報(bào)導(dǎo)，終止子覆蓋mRNA穩(wěn)定或去穩(wěn)定元件(Narsai等人2007)。其中這些元件可為富含AU的元件或miRNA結(jié)合位點(diǎn)。此外，有效的終止可用于釋放轉(zhuǎn)錄聚合酶從而反向循環(huán)制轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。這可導(dǎo)致較高水平的轉(zhuǎn)錄起始(Nagaya等人2010.;Mapendano等人2010)。mRNA的3'端加工也可涉及細(xì)胞核輸出和隨后的翻譯。因此，終止子序列可正面或負(fù)面影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。
[0006]植物終止子的誘變實(shí)驗(yàn)已鑒定了 3種主要元件:遠(yuǎn)端上游元件(FUE)、近端上游元件(NUE ；AAUAAA樣基序)和切割/多腺苷酸化位點(diǎn)(CS)。NUE區(qū)是位于poly (A)位點(diǎn)的30nt以內(nèi)的富含A的元件(Hunt，1994)。FUE區(qū)是增強(qiáng)CS處的加工效率的富含U-或UG的序列(Mogen等人1990，1^111^，1996)，其自身是￥4似或_ 二核苷酸，在富含U的區(qū)域內(nèi)，所述區(qū)域發(fā)生多腺苷酸化(Bassett, 2007).[0007]在植物生物技術(shù)中經(jīng)常需要以高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因以產(chǎn)生期望的效果。在大多數(shù)應(yīng)用中，認(rèn)為啟動(dòng)子的強(qiáng)度主要決定了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。啟動(dòng)子的鑒定和表征是昂貴和費(fèi)時(shí)的，因?yàn)槊恳环N啟動(dòng)子具有其特定的表達(dá)模式和強(qiáng)度。此外，合適的強(qiáng)啟動(dòng)子組是有限的。鑒于現(xiàn)代植物生物技術(shù)傾向于在一個(gè)構(gòu)建體中堆積多個(gè)表達(dá)盒，為了最優(yōu)基因表達(dá)而加倍相同的強(qiáng)啟動(dòng)子元件具有同源重組或轉(zhuǎn)錄基因沉默的風(fēng)險(xiǎn)。然而，使用較弱的啟動(dòng)子作為避免此問題的替換方案可能限制在構(gòu)建體中一種基因的表達(dá)。這進(jìn)而不利于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生期望的表型。
[0008]作為強(qiáng)啟動(dòng)子的替代，終止子序列可用于實(shí)現(xiàn)與其功能連接的基因的增強(qiáng)的表達(dá)水平。這允許在多基因構(gòu)建體中使用可選的較弱的啟動(dòng)子而不損害整體表達(dá)水平。另一個(gè)可能的優(yōu)勢是，如果僅修飾終止子的話，不會(huì)改變啟動(dòng)子的特異性和表達(dá)模式。[0009]因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供鑒定、分離和檢測增強(qiáng)植物中基因表達(dá)的終止子序列的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這樣的增強(qiáng)基因表達(dá)的終止子。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供有效終止轉(zhuǎn)錄的終止子。通過本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了這些目的。
[0010]發(fā)明詳述
[0011]本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案是終止子分子，其包含至少一種在表1中定義的增強(qiáng)終止子元件(ET)或如表2中定義的其組合,或任意這些ET或這些ET組合的互補(bǔ)或反向互補(bǔ)物，其中包含所述ET或其組合的終止子分子導(dǎo)致與終止子分子功能連接的待表達(dá)的異源核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)。
[0012]增強(qiáng)終止子元件是由在ET的正或負(fù)鏈內(nèi)的共多達(dá)26個(gè)核苷酸的保守的矩陣序列包圍的約4-6個(gè)核苷酸的高度保守核心序列定義的序列基序，所述元件能夠與DNA結(jié)合蛋白或DNA結(jié)合核酸分子相互作用。保守的矩陣序列允許在序列中的一定可變性而不損失其被DNA結(jié)合蛋白或核酸結(jié)合的能力。
[0013]描述DNA結(jié)合蛋白或核酸結(jié)合位點(diǎn)的一種方式是通過核苷酸或位置權(quán)重矩陣(NWM或PWM)(有關(guān)綜述見Stormo，2000)。權(quán)重矩陣模式定義比簡單的IUPAC共有序列更好，因?yàn)槠浯砹嗣總€(gè)單獨(dú)位置上的完整的核苷酸分布。其也允許定量在權(quán)重矩陣與在序列中檢測到的潛在DNA結(jié)合蛋白或核酸結(jié)合位點(diǎn)之間的相似性(Cartharius等人2005)。
[0014]矩陣的“核心序列”被定義為矩陣的4、5或6個(gè)連續(xù)的最高保守的位置。
[0015]如在本文和涉及MatInspector的論文中(Cartharius K,等人(2005)Bioinformatics21 ；Cartharius K (2005), DNA Press ；Quandt K,等人(1995)NucleicAcids Res.23)描述的計(jì)算 核心相似性。
[0016]僅當(dāng)矩陣的最高保守的堿基在序列中完全匹配時(shí)達(dá)到1.0的最大核心相似性。比核心相似性更重要的是矩陣相似性，其考慮在整個(gè)矩陣長度上的所有堿基。如本文和在MatInspector 論文(Quandt K，等人(1995) Nucleic Acids Res.23)中描述的計(jì)算矩陣相似性。與矩陣的完全匹配得到1.00的分?jǐn)?shù)(每個(gè)序列位置對應(yīng)在矩陣中的該位置上的最高保守的核苷酸)，與矩陣的“好”匹配具有>0.80的相似性。
[0017]在矩陣的高保守位置中的錯(cuò)配比在低保守區(qū)中的錯(cuò)配更多地減少矩陣相似性。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，ET具有在表1中定義的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ET的序列如表10中描述的定義，其中如在Quandt等人(1995，NAR23 (23) 4878—4884)中的第4879頁右欄的等式2和3中描述的計(jì)算匹配序列的核心和矩陣相似性，其中矩陣相似性為至少0.8，優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.85，更優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.9，甚至更優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.95。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中,矩陣相似性為至少1.0。在一個(gè)實(shí)施方案中核心相似性為至少0.75，優(yōu)選地核心相似性為至少0.8，例如0.85，更優(yōu)選地核心相似性為至少0.9，甚至更優(yōu)選地核心相似性為至少0.95。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中核心相似性為至少1.0。提及任意本發(fā)明的ET的SEQ ID可理解為在表1中定義的或如表10中描述的序列。
[0019]優(yōu)選地終止子分子包含至少一種由SEQ ID N05或SEQ ID N06，或SEQ ID N05和SEQ ID N06的組合定義的增強(qiáng)終止子元件(ET)。
[0020]優(yōu)選地在被定義為表達(dá)增強(qiáng)的終止子中存在一組(即表2中的一行)中的所有ET元件。在基因表達(dá)增強(qiáng)終止子序列中存在一組(即表2中的一行)中的至少2個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè),最優(yōu)選所有ET元件的每種組合。
[0021]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些終止子分子與相對本發(fā)明的終止子分子為異源的另一種核酸分子功能連接。這些核酸分子可為例如任意調(diào)控核酸分子，例如啟動(dòng)子、NEENA或內(nèi)含子。核酸分子也可為任意待表達(dá)的核酸，例如目的基因，編碼區(qū)或非編碼區(qū)，例如5'或
UTR，微小 RNA，RNAi，反義 RNA 等等。
[0022]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是終止子分子，其包含選自下述的序列
[0023]a)核酸分子，其具有如 SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63 和 64 中定義的序列，或
[0024]b)核酸分子，其具有與如 SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63 和 64 定義的任意序列具有至少60%或更高的同一性，優(yōu)選與如SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64定義的任意序列具有至少70%或更高的同一性，例如與如SEQ ID NO:1、2、
3、4、57、58、59、60、61、62、63和64定義的任意序列具有至少80%或更高的同一性的序列，更優(yōu)選地所述同一性為85%或更高，更優(yōu)選地所述同一性為90%或更高，甚至更優(yōu)選地所述同一性為95%或更高，96%或更高，97%或更高，98%或更高，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，與如SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64定義的任意序列的所述同一性為99%或更高，或
[0025]c)a)或b)的核酸分子的100或更多個(gè)連續(xù)的堿基，優(yōu)選150或更多個(gè)連續(xù)的堿基，更優(yōu)選200個(gè)連續(xù)的堿基或更多，甚至更優(yōu)選250或更多個(gè)連續(xù)的堿基的片段，其具有表達(dá)增強(qiáng)活性，例如如同具有SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64定義的任意序列的序列的對應(yīng)核酸分子的65%或更高，優(yōu)選70%或更高，更優(yōu)選75%或更高，甚至更優(yōu)選80%或更高，85%或更高或90%或更高的表達(dá)增強(qiáng)活性，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中其具有95%或更高的表達(dá)增強(qiáng)活性，或
[0026]d)核酸分子，其是任意之前在a)或b)中提及的核酸分子的互補(bǔ)或反向互補(bǔ)物，或
[0027]e)核酸分子，其可使用表5中顯示的SEQ ID NO:67至96描述的寡核苷酸引物從基因組DNA，優(yōu)選植物基因組DNA，更優(yōu)選單子葉植物基因組DNA通過PCR得到，或
[0028]f) 100個(gè)核苷酸或更多、150個(gè)核苷酸或更多、200個(gè)核苷酸或更多或250個(gè)核苷酸或更多的核酸分子，其與包含SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64描述的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)終止子的至少50，優(yōu)選至少100，更優(yōu)選至少150，甚至更優(yōu)選至少200，最優(yōu)選至少250個(gè)連續(xù)的核苷酸或其互補(bǔ)物的核酸分子在等價(jià)于下述的條件下雜交，即在7%的十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaP04, ImM EDTA 中在 50°C下雜交，在 2X SSC,0.1%505中在50°〇或65°C，優(yōu)選65°C下洗滌。優(yōu)選地所述核酸分子與包含SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64描述的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)終止子的至少50，優(yōu)選至少100，更優(yōu)選至少150，甚至更優(yōu)選至少200，最優(yōu)選至少250個(gè)連續(xù)的核苷酸或其互補(bǔ)物的核酸分子在等價(jià)于下述的條件下雜交，即在7%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4, ImM EDTA中在50°C下雜交，在IXSSC、0.1% SDS中在50°C或65°C，優(yōu)選65°C下洗滌，更優(yōu)選地，所述核酸分子與包含SEQ IDNO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64定義的任意序列所描述的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)終止子的至少50，優(yōu)選至少100，更優(yōu)選至少150，甚至更優(yōu)選至少200，最優(yōu)選至少250個(gè)連續(xù)的核苷酸的核酸分子在等價(jià)于下述的條件下雜交，即在7%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaPO4,ImM EDTA中在50°C下雜交，在0.1X SSC, 0.1% SDS中在50°C或65°C，優(yōu)選65°C下洗滌，[0029]其中在a)至f)中定義的終止子分子導(dǎo)致與其功能連接的異源核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)。
[0030]優(yōu)選地在上文b)至f)中定義的核酸分子是功能增強(qiáng)終止子分子，因此終止轉(zhuǎn)錄并具有在上文a)中定義的各自分子的至少50%的表達(dá)增強(qiáng)作用。更優(yōu)選地，在上文b)至
f)中定義的核酸分子包含在上文a)中定義的和在表1中定義的或在表10中定義的核酸分子中包含的增強(qiáng)終止子元件(ET)或在表2中定義的其組合，且是功能增強(qiáng)終止子分子，因此終止轉(zhuǎn)錄并具有在上文a)中定義的分子的至少50%的表達(dá)增強(qiáng)作用。例如，在上文b)至f)中定義的核酸分子包含功能多腺苷酸化信號(hào)和與在上文a)中定義的分子的AT含量相差不超過50 %，優(yōu)選40 %，更優(yōu)選30 %，甚至更優(yōu)選20 %，特別優(yōu)選10 %的AT含量。最優(yōu)選地它們與在上文a)中定義的分子具有相同的AT含量。
[0031]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是鑒定和分離導(dǎo)致與終止子分子功能連接的異源核酸分子表達(dá)增強(qiáng)的終止子分子的方法，其包括以下步驟:鑒定包含下述序列的核酸分子，所述序列在不超過500bp,優(yōu)選400bp,更優(yōu)選300bp,最優(yōu)選250bp中包含在表1中定義的或在表10中定義的至少I個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少4個(gè)ET。最優(yōu)選地其包含在表2的I行中列出的所有ET元件。在本發(fā)明的另一個(gè)步驟中，各個(gè)核酸分子通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法從其天然背景例如基因組DNA中被分離，或被合成。
[0032]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是鑒定和分離導(dǎo)致與終止子分子功能連接的異源核酸分子表達(dá)增強(qiáng)的終止子分子的方法，其包括以下步驟:
[0033]A)鑒定3 ^ UTR和/或轉(zhuǎn)錄區(qū)例如編碼區(qū)，和
[0034]B)鑒定對應(yīng)的基因組DNA
[0035]C)使用任意計(jì)算ET檢測或IUPAC字符串匹配序列分析在B)中鑒定的組中鑒定包含在表1或表10和2中定義的任 意ET或其組合的分子，和
[0036]D)分離至少250bp包含所述ET的基因組DNA。
[0037]可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意方法鑒定3' UTR和對應(yīng)的基因組DNA，所述方法例如全長cDNA的序列測定，基于例如基因組DNA序列中的編碼序列的預(yù)測的計(jì)算預(yù)測或使用例如cDNA或基因組DNA的帶注釋的數(shù)據(jù)庫。
[0038]術(shù)語“對應(yīng)的基因組DNA”應(yīng)理解為包含在步驟A)中被鑒定為3' UTR或轉(zhuǎn)錄區(qū)的序列的基因組DNA，優(yōu)選植物基因組DNA，更優(yōu)選地單子葉植物基因組DNA。對應(yīng)的基因組DNA可包含與在步驟A)中鑒定的:T UTR或轉(zhuǎn)錄區(qū)的任意序列相同的序列，或與其具有至少60 %或優(yōu)選70 %或更高，例如80 %或更高的同一性的序列，更優(yōu)選地所述同一性為85%或更高，更優(yōu)選地所述同一性為90%或更高，甚至更優(yōu)選地所述同一性為95%或更高，96%或更高，97%或更高，98%或更高，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同一性為99%或更聞。
[0039]可例如使用技術(shù)人員公知的工具進(jìn)行在B)中鑒定的組中的包含任意ET或其組合的分子的鑒定，例如 Genomatix Software GmbH 的 Matlnspector, University ofQueensland和Univeristy of Washington的MEME程序組，或相當(dāng)?shù)墓ぞ?。可使用本領(lǐng)域公知的重組方法例如PCR、限制克隆或基因合成進(jìn)行至少250bp，例如300bp，優(yōu)選至少350bp，例如400bp，更優(yōu)選至少450bp，例如500bp的分離。分離的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子可在隨后的步驟中與啟動(dòng)子和/或待表達(dá)的核酸分子功能連接。技術(shù)人員知道功能連接2個(gè)或多個(gè)核酸分子的多種方法。這樣的方法可包括限制/連接、不依賴連接酶的克隆、重組工程化、重組或合成。可應(yīng)用其他方法功能連接2個(gè)或多個(gè)核酸分子。
[0040]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是產(chǎn)生相比對應(yīng)的對照植物或其部分具有一種或多種核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)的植物或其部分的方法，所述方法包括以下步驟:
[0041]a)將一種或多種如上定義的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子引入植物或其部分，和
[0042]b)將所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子整合進(jìn)所述植物細(xì)胞、植物或其部分的基因組中，使得所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子與內(nèi)源核酸功能連接，所述內(nèi)源核酸相對所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子是異源的，和任選地
[0043]c)從所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物或其部分再生包含所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子的植物或其部分。
[0044]可通過粒子轟擊、原生質(zhì)體電穿孔、病毒感染、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域公知的任意其他方法將一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子引入植物或其部分?？蓪⒈磉_(dá)增強(qiáng)終止子分子整合引入例如質(zhì)粒或病毒DNA或病毒RNA。在引入植物或植物部分以前，表達(dá)增強(qiáng)終止子分子也可包含在BAC，YAC或人工染色體上。其也可以作為包含表達(dá)增強(qiáng)終止子序列的線性核酸分子被引入，其中其他序列可存在于核酸分子上的表達(dá)增強(qiáng)終止子序列的附近。在表達(dá)增強(qiáng)終止子序列鄰近的這些序列可為從約20bp，例如20bp至幾百個(gè)堿基對，例如IOObp或更多，并且其可促進(jìn)至基因組的整合，例如通過同源重組?？蓱?yīng)用基因組整合的任意其他方法，例如靶向整合方法,例如同源重組或隨機(jī)整合方法,例如非常規(guī)重組。
[0045]可與表達(dá)增強(qiáng)終止子分子功能連接的內(nèi)源核酸可為任意核酸分子。核酸分子可為蛋白質(zhì)編碼核酸分子或非編碼分子，例如反義RNA，rRNA, tRNA, miRNA, ta-siRNA, siRNA，dsRNA, snRNA，snoRNA或本領(lǐng)域公知的任意其他非編碼RNA。
[0046]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是產(chǎn)生相比對應(yīng)的對照植物或其部分具有一種或多種核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)的植物或其部分的方法，所述方法包括以下步驟:
[0047]1.將一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子與啟動(dòng)子和/或與處于所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子功能連接，和
[0048]2.將所述一種或多種包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的終止子分子引入植物或其部分的基因組中，所述終止子分子與所述異源啟動(dòng)子和/或所述待表達(dá)的異源核酸功能連接，和
[0049]3.從所述轉(zhuǎn)化的植物或其部分再生包含所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子的植物或其部分。
[0050]表達(dá)增強(qiáng)終止子分子相對與所述表達(dá)增強(qiáng)終止子功能連接的所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子可為異源的，或其相對所述啟動(dòng)子和所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子可都是異源的。
[0051]可通過粒子轟擊、原生質(zhì)體電穿孔、病毒感染、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或本領(lǐng)域公知的任意其他方法將一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子引入植物或其部分。可將表達(dá)增強(qiáng)終止子分子整合引入例如質(zhì)?；虿《綝NA或病毒RNA。在引入植物或植物部分以前，表達(dá)增強(qiáng)終止子分子也可包含在BAC，YAC或人工染色體上。其也可以作為包含表達(dá)增強(qiáng)終止子序列的線性核酸分子被引入，其中其他序列可存在于核酸分子上的表達(dá)增強(qiáng)終止子序列的附近。在表達(dá)增強(qiáng)終止子序列鄰近的這些序列可為從約20bp，例如20bp至幾百個(gè)堿基對，例如IOObp或更多，并且其可促進(jìn)至基因組的整合，例如通過同源重組。可應(yīng)用基因組整合的任意其他方法，例如靶向整合方法,例如同源重組或隨機(jī)整合方法,例如非常規(guī)重組。
[0052]在如上定義的本發(fā)明的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0053]i)提供表達(dá)構(gòu)建體，其包含一種或多種包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的終止子分子，所述終止子分子與啟動(dòng)子和一種或多種核酸分子功能連接，后者相對所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子是異源的且處于所述啟動(dòng)子的控制下，和
[0054]ii)將包含所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子的所述表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)所述植物或其部分的基因組中，和任選地
[0055]iii)從所述轉(zhuǎn)化的植物或其部分再生包含所述一種或多種表達(dá)構(gòu)建體的植物或其部分。
[0056]本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何植物，例如裸子植物或被子植物，優(yōu)選被子植物，例如雙子葉或單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物是例如玉米、小麥、稻、大麥、高粱、色蕉(musa)、甘蔗、芒草和短柄草，特別優(yōu)選的單子葉植物是玉米、小麥和稻。優(yōu)選的雙子葉植物是例如大豆(soy)、油菜(rape seed)、卡諾拉(canola)、亞麻(linseed)、棉花(cotton)、馬鈴薯(potato)、甜菜(sugar beet)、萬壽菊(tagetes)和擬南芥(Arabidopsis),特別優(yōu)選的雙子葉植物是大豆、油菜、卡諾拉和馬鈴薯。
[0057]展示核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)的植物在本文中指相比沒有與相應(yīng)核酸分子功能連接的相應(yīng)表達(dá)增強(qiáng)終止子的在相同條件下生長的對照植物具有更高的，優(yōu)選統(tǒng)計(jì)上顯著更高的核酸分子表達(dá)的植物。這樣的`對照植物可為野生型植物或包含與本發(fā)明植物控制相同基因的相同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動(dòng)子和/或待表達(dá)的核酸不與本發(fā)明的表達(dá)增強(qiáng)終止子連接。
[0058]包含一種或多種包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子的重組表達(dá)構(gòu)建體是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。重組表達(dá)構(gòu)建體可還包含一種或多種啟動(dòng)子和任選地一種或多種表達(dá)的核酸分子，所述啟動(dòng)子和核酸分子都與一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子功能連接，至少后者(核酸分子)相對所述一種或多種表達(dá)增強(qiáng)終止子分子是異源的。
[0059]表達(dá)增強(qiáng)終止子分子相對與表達(dá)增強(qiáng)終止子分子功能連接的所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子可為異源的，或其相對啟動(dòng)子和所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子可都為異源的。
[0060]表達(dá)構(gòu)建體可包含I或更多，例如2或更多，例如5或更多，例如10或更多種與表達(dá)增強(qiáng)終止子分子功能連接的啟動(dòng)子和待表達(dá)的核酸分子的組合，所述核酸分子相對相應(yīng)的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子是異源的。表達(dá)構(gòu)建體也可還包含不包含表達(dá)增強(qiáng)終止子分子的表達(dá)構(gòu)建體。
[0061]包含一個(gè)或多個(gè)如上定義的重組表達(dá)構(gòu)建體的重組表達(dá)載體是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案?？捎糜诒景l(fā)明的多種表達(dá)載體是技術(shù)人員公知的。將包含這樣的表達(dá)構(gòu)建體的載體引入植物基因組和從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植物的方法也是本領(lǐng)域熟知的，所述表達(dá)構(gòu)建體包含例如與表達(dá)增強(qiáng)終止子功能連接的啟動(dòng)子和任選地其他元件，例如啟動(dòng)子、UTR、NEENA等等。取決于用于轉(zhuǎn)化植物或其部分的方法，可將整個(gè)載體整合進(jìn)所述植物或其部分的基因組，或?qū)⑤d體的某些組件整合進(jìn)基因組，例如T-DNA。[0062]包含如上定義的重組表達(dá)載體或如上定義的重組表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物或其部分是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或其部分可選自細(xì)菌、真菌、酵母或植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是細(xì)菌、真菌、酵母和植物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌是腸桿菌例如大腸桿菌(E.coli)和農(nóng)桿菌屬細(xì)菌，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。優(yōu)選地植物是單子葉或雙子葉植物，例如單子葉或雙子葉作物，例如玉米、大豆、卡諾拉、棉花、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、芭蕉、甘蔗、芒草等等。優(yōu)選的作物是玉米、稻、小麥、大豆、卡諾拉、棉花或馬鈴薯。特別優(yōu)選的雙子葉作物是大豆、卡諾拉、棉花或馬鈴薯。
[0063]特比優(yōu)選的單子葉作物是玉米、小麥和稻。
[0064]來源于如上定義的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、部分或繁殖材料是本發(fā)明的其他實(shí)施方案，其包含所述異源的包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或如上定義的所述重組表達(dá)構(gòu)建體或所述重組載體。
[0065]本文中所指的轉(zhuǎn)基因部分或繁殖材料包括包含相應(yīng)的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子、重組表達(dá)構(gòu)建體或重組載體的所有組織和器官，例如葉、莖和果，以及用于植物的繁殖和/或再生的材料，例如插條、接穗、壓條、分枝或芽(shoot)。
[0066]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或如上定義的重組構(gòu)建體或重組載體用于增強(qiáng)植物或其部分中的表達(dá)的用途。
[0067]本發(fā)明的另一個(gè) 實(shí)施方案是通過將包含在表1或10或2中定義的ET或其組合的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或在上文a)至f)中定義的表達(dá)增強(qiáng)終止子分子或如上定義的重組構(gòu)建體或重組載體引入植物，培養(yǎng)植物，收獲和加工植物或其部分生產(chǎn)農(nóng)產(chǎn)品的方法。
[0068]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是產(chǎn)生重組終止子分子的方法，所述終止子增強(qiáng)與所述終止子分子功能連接的異源核酸分子的表達(dá)，所述方法包括以下步驟，即在缺乏表達(dá)增強(qiáng)性能的終止子分子中引入至少一種在表1或表10中定義的ET元件或在表2中定義的其組合，或其互補(bǔ)或反向互補(bǔ)物。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中，ET具有在表1中定義的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，ET的序列如表10中描述的定義，其中如在Quandt等人(1995，NAR23 (23) 4878—4884)中的第4879頁右欄的方程2和3中描述的計(jì)算匹配序列的核心和矩陣相似性，其中矩陣相似性為至少0.8，優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.85，更優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.9，甚至更優(yōu)選地矩陣相似性為至少0.95。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，矩陣相似性為至少1.0。在一個(gè)實(shí)施方案中核心相似性為至少0.75，優(yōu)選地核心相似性為至少0.8，例如0.85，更優(yōu)選地核心相似性為至少0.9，甚至更優(yōu)選地核心相似性為至少0.95。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中核心相似性為至少 1.0。
[0070]在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地將至少一個(gè)通過SEQ ID N05或SEQ ID N06，或SEQ IDN05和SEQ ID N06的組合定義的增強(qiáng)終止子元件(ET)引入本發(fā)明的重組終止子分子中。
[0071]在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，將一組(即表2中的一行)中的所有ET元件引入本發(fā)明的重組終止子中。在根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的基因表達(dá)增強(qiáng)終止子序列中存在一組(即表2中的一行)中的至少2種，優(yōu)選至少3種，最優(yōu)選所有ET元件的每種組合。[0072]技術(shù)人員知道產(chǎn)生這樣的重組終止子分子的方法。可使用缺乏增強(qiáng)與終止子分子功能連接的核酸分子的表達(dá)的能力的終止子分子，且可通過克隆方法、重組或合成終止子分子引入本發(fā)明的ET元件。
[0073]定義
[0074]縮寫:NEENA-增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸，GFP-綠色熒光蛋白，⑶S— β -葡糖苷酸酶，ΒΑΡ-6-芐氨基嘌呤，2，4-D-2，4-二氯苯氧乙酸，MS — Murashige-Skoog 培養(yǎng)基，NAA-1-萘乙酸，MES，2-(N-嗎啉代)-乙磺酸，IAA:吲哚乙酸，Kan:硫酸卡那霉素，GA3-赤霉酸，Timentin?:替卡西林二鈉/克拉維酸鉀，microl:微升。
[0075]應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于具體的方法或方案。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖限制本發(fā)明，本發(fā)明將僅受所附權(quán)利要求書限制。必須指出，如本文中和所附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文另外明確地指明并非如此。因此，例如，對“一個(gè)載體”的提及是對一個(gè)或多個(gè)載體的提及并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。術(shù)語“約”在本文中用來指大約、大致、左右和在……范圍內(nèi)。當(dāng)術(shù)語“約”與一個(gè)數(shù)字范圍聯(lián)合使用時(shí)，它通過使界限值擴(kuò)展高于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常而言，術(shù)語“約”在本文中用來通過20%、優(yōu)選10%之上或之下(更高或更低)變化而修飾高于和低于所述值的數(shù)值。如本文中所用，詞匯“或”意指特定列出的任何一成員并且還包括該列出的成員的任意組合。在本說明書中及以下權(quán)利要求中使用時(shí)，詞匯“包含”、“包含著”、“包括”、“包括著”和“包括了”意圖指明一個(gè)或多個(gè)所述特征、整數(shù)、組分或步驟的存在，但是它們不排除一個(gè)或多個(gè)其他特征、整數(shù)、組分、步驟或其組的存在或添加。為清晰起見，將本說明書中使用的某些術(shù)語如下定義并使用:[0076]農(nóng)產(chǎn)品:本申請中使用的術(shù)語“農(nóng)產(chǎn)品”是指來自植物的任何可收獲的產(chǎn)品。植物產(chǎn)品可以是，但不限于，食品、飼料、食物補(bǔ)充物、飼料補(bǔ)充物、纖維、化妝品或藥品。食品可以被視為用于營養(yǎng)或用于補(bǔ)充營養(yǎng)的組合物。特別地，動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料補(bǔ)充物，被認(rèn)為是食品。農(nóng)產(chǎn)品例如可以是植物提取物、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、脂肪、油、聚合物例如淀粉或纖維、微生物、二級(jí)植物產(chǎn)品等等。
[0077]反向平行:“反向平行”在本文中指經(jīng)互補(bǔ)性堿基殘基之間氫鍵配對的兩個(gè)核苷酸序列，其中磷酸二酯鍵在一個(gè)核苷酸序列中以5’-3’方向分布并且在另一個(gè)核苷酸序列中以3’ -5’方向分布。
[0078]反義:術(shù)語“反義”指相對于其轉(zhuǎn)錄或發(fā)揮作用的正常方向?yàn)榉聪虿⑶覐亩磉_(dá)下述RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述的RNA轉(zhuǎn)錄物與宿主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的靶基因mRNA分子互補(bǔ)(例如，它可以借助Watson-Crick堿基配對作用與祀基因mRNA分子或單鏈基因組DNA雜交)或與靶DNA分子(例如宿主細(xì)胞中存在的基因組DNA)互補(bǔ)。
[0079]編碼區(qū):如本文中所用，術(shù)語“編碼區(qū)”在談及結(jié)構(gòu)基因使用時(shí)，指編碼在作為mRNA分子翻譯結(jié)果的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，編碼區(qū)在5’側(cè)以編碼起始物甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”為界并且在3’側(cè)以特定終止密碼子的3種三聯(lián)體(即TAA、TAG、TGA)之一為界。除含有內(nèi)含子之外，基因的基因組形式也可以包含位于RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的序列的5’ -及3’ -端的序列。這些序列稱作“側(cè)翼”序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5’或3’)。5’ -側(cè)翼區(qū)可以含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3’ -側(cè)翼區(qū)可以含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后剪切和聚腺苷酸化的序列。
[0080]互補(bǔ)的:“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指包含反向平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列，其中一旦在反向平行核苷酸序列中的互補(bǔ)性堿基殘基之間形成氫鍵，則所述反向平行核苷酸序列能夠相互配對(通過堿基配對原則)。例如，序列5’ -AGT-3’與序列5’ -ACT-3’互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”或“全部的”?！安糠帧被パa(bǔ)性是其中一個(gè)或多個(gè)核酸堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則未匹配的情況。核酸分子之間的“全部”或“完全”互補(bǔ)性是其中每個(gè)核酸堿基按照堿基配對規(guī)則與另一個(gè)堿基匹配的情況。核酸分子鏈之間互補(bǔ)性的程度對核酸分子鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有明顯影響。如本文中所用的核酸序列“互補(bǔ)物”指這樣的核苷酸序列，其核酸分子顯示與該核酸序列的核酸分子的全部互補(bǔ)性。
[0081]雙鏈RNA 雙鏈RNA”分子或“dsRNA”分子包含核苷酸序列的有義RNA片段和該核苷酸序列的反義RNA片段，二者均包含彼此互補(bǔ)的核苷酸序列，因而允許有義RNA片段和反義RNA片段配對并形成雙鏈RNA分子。
[0082]內(nèi)源的:“內(nèi)源的”核苷酸序列指存在于未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組中的核苷酸序列。
[0083]增強(qiáng)的表達(dá):“增強(qiáng)”或“增加”核酸分子在植物細(xì)胞中的表達(dá)在本文中同等地使用，并且意指該核酸分子在應(yīng)用本發(fā)明方法之后在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)水平比其在應(yīng)用該方法之前在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)更高，或與缺少本發(fā)明重組核酸分子的參照植物相比更高。例如，參照植物包含僅缺少相應(yīng)的本發(fā)明的增強(qiáng)終止子的相同構(gòu)建體。如本文中所用的術(shù)語“增強(qiáng)”或“增加”是同義的，并且在本文中意指待表達(dá)的核酸分子的更高、優(yōu)選顯著更高的表達(dá)。如本文中所用的，“增強(qiáng)”或“增加”某物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、mRNA或RNA)的水平意指相對于基本上相同條件下培育的、缺少本發(fā)明重組核酸分子(例如缺少本發(fā)明的增強(qiáng)終止子分子、本發(fā)明的重組構(gòu)建體或重組載體)的基本上相同植物、植物部分或植物細(xì)胞，該水平增加。如本文中所用的，“增強(qiáng)”或“增加”某物質(zhì)(例如由靶基因表達(dá)的前RNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)的水平意指相對于缺少本發(fā)明重組核酸分子的細(xì)胞或生物，該水平增加20%或更多、例如50%或更多，優(yōu)選100%或更多，更優(yōu)選3倍或更多倍，甚至更優(yōu)選15倍或更多倍，最優(yōu)選10倍或更多倍，例如20倍?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員熟悉的方法測定所述增強(qiáng)或增加。因而，可以例如通過蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測法確定核酸或蛋白質(zhì)量的增強(qiáng)或增加。另外，可以使用技術(shù)如蛋白質(zhì)測定法、熒光法、Northern雜交法、核酸酶保護(hù)測定法、逆轉(zhuǎn)錄法(定量RT-PCR)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定法(RIA)或其他免疫測定法和熒光激活的細(xì)胞分析(FACS)來測量植物或植物細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或RNA。取決于所誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的類型，也可以確定其活性或?qū)ι锘蚣?xì)胞表型的影響。用于確定蛋白質(zhì)數(shù)量的方法是技術(shù)人員已知的?？梢蕴岬降膶?shí)例是:微量Biuret法(Goa J(1953) Scand J ClinLab Invest5:218-222)、Folin-Ciocalteau 法(Lowry OH 等人(1951) J Biol Cheml93:265-275)或測量 CBB G-250 的吸光度(Bradford MM (1976) Analyt Biochem72:248-254)。作為用于量化蛋白質(zhì)的活性的一個(gè)實(shí)例，在下文實(shí)施例中描述螢光素酶活性檢測法。
[0084]增強(qiáng)終止子元件(ET):定義了賦予功能連接基因的增強(qiáng)的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)終止子的長度為5至30個(gè)堿基的短核酸序列。它們可以被定義為核苷酸權(quán)重矩陣。增強(qiáng)終止子元件可以顯示同源終止子序列之間的保守性。如表1和2中所定義的單個(gè)增強(qiáng)終止子元件或其組合的存在足以將終止子序列劃分為表達(dá)增強(qiáng)。
[0085]表達(dá):“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成，優(yōu)選地指細(xì)胞中核苷酸序列例如內(nèi)源基因或異源基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并且任選地隨后mRNA翻譯成一種或多種多肽。在其他情況下，表達(dá)可以僅指攜帶RNA分子的DNA的轉(zhuǎn)錄。
[0086]表達(dá)構(gòu)建體:如本文中所用的“表達(dá)構(gòu)建體”意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適宜植物部分或植物細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列，該DNA序列包含在導(dǎo)入此DNA序列的所述植物部分或植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與任選地有效連接至終止信號(hào)的目的核苷酸序列有效連接。如果需要翻譯，該DNA序列一般還包含為正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。編碼區(qū)可以編碼目的蛋白，但也可以以有義或反義方向編碼功能性目的RNA，例如RNAa, siRNA, snoRNA、snRNA,microRNA, ta-siRNA或任何其他非編碼的調(diào)節(jié)性RNA。包含目的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體可以是嵌合的，這意指該表達(dá)構(gòu)建體的組件中一者或多者相對于該表達(dá)構(gòu)建體的其他組件中一者或多者是異源的。該表達(dá)構(gòu)建體也可以是一種這樣的表達(dá)構(gòu)建體，它天然地存在，但已經(jīng)以用于異源表達(dá)的重組形式獲得。然而，一般而言，該表達(dá)構(gòu)建體相對于宿主是異源，即，該表達(dá)構(gòu)建體的特定DNA序列不天然存在于宿主細(xì)胞中并且必須已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先中。該表達(dá)構(gòu)建體中的核苷酸序列的表達(dá)可以處于種子特異性和/或種子偏好的啟動(dòng)子或處于僅在宿主細(xì)胞暴露于一些特定外部刺激時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在植物的情況下，該啟動(dòng)子也可以是針對特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。 [0087]外來:術(shù)語“外來”指任何核酸分子(例如，基因序列)，所述核酸分子通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中并且可以包括該細(xì)胞中存在的序列，只要導(dǎo)入的序列含有一些修飾(例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)和因此相對于天然存在序列是不同的。
[0088]功能性連接:將術(shù)語“功能性連接”或“功能性連接的”理解為意指例如調(diào)節(jié)性元件(例如啟動(dòng)子)與待表達(dá)的核酸序列并且根據(jù)需要與其他調(diào)節(jié)性元件(例如，終止子或NEENA)以如此方式依次排列，從而每種調(diào)節(jié)性元件可以履行其目的功能以允許、修飾、促進(jìn)或影響所述核酸序列的表達(dá)。作為同義詞，可以使用“有效連接”或“有效連接的”?？梢愿鶕?jù)所述核酸序列相對于有義或反義RNA的排列，產(chǎn)生表達(dá)。為此目的，不是必需要求化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列例如增強(qiáng)子序列也能夠從遠(yuǎn)離的位置或甚至從其它DNA分子對靶序列產(chǎn)生其作用。優(yōu)選的排列是這樣的排列，其中待表達(dá)的核酸序列重組地位于充當(dāng)啟動(dòng)子的序列之后，從而這兩個(gè)序列相互共價(jià)地連接。該啟動(dòng)子序列與待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選地小于200堿基對、特別優(yōu)選地小于100堿基對、非常特別優(yōu)選地小于50堿基對。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以如此方式位于啟動(dòng)子之后，其中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與本發(fā)明嵌合RNA的合乎需要的開端相同。功能性連接和表達(dá)構(gòu)建體可以借助如(例如，在Maniatis T,Fritsch EF和Sambrook J (1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) ；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor (NY) ;Ausubel 等人(1987) Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience ;Gelvin 等人(編著)(1990)PlantMolecular Biology Manual ；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands)所述的慣用重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生。然而，其他序列，例如充當(dāng)帶限制性酶特定切割位點(diǎn)的接頭或充當(dāng)信號(hào)肽的序列，也可以位于這兩個(gè)序列之間。序列的插入也可以導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)。優(yōu)選地，由調(diào)節(jié)性區(qū)域例如啟動(dòng)子和待表達(dá)核酸序列的連接組成的表達(dá)構(gòu)建體可以以載體整合的形式存在并且被插入植物基因組，例如通過轉(zhuǎn)化法。
[0089]基因:術(shù)語“基因”指與能夠以某種方式調(diào)芐基因產(chǎn)物(例如，多肽或功能性RNA)表達(dá)的適宜調(diào)節(jié)序列有效連接的區(qū)域?；虬―NA中位于編碼區(qū)(可讀框，0RF)之前(上游)和之后(下游)的不翻譯的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑物等)，以及在可用的情況下，在各個(gè)編碼區(qū)(例如外顯子)之間的間插序列(例如內(nèi)含子)。如本文中所用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)基因”意圖指轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA隨后翻譯成作為具體多肽的特征的氨基酸序列。
[0090]基因組和基因組DNA:術(shù)語“基因組”或“基因組DNA”指宿主生物的可遺傳信息。所述基因組DNA包括細(xì)胞核的DNA(也稱作染色體DNA)，還包括質(zhì)體(例如，葉綠體)和其他細(xì)胞器(例如，線粒體)的DNA。優(yōu)選地，術(shù)語“基因組”或“基因組DNA”指細(xì)胞核的染色體DNA。 [0091]異源的:就核酸分子或DNA而言，術(shù)語“異源的”指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接于，或受到操作以變得有效連接于自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。包含核酸分子和與之連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)性核酸分子(如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))的異源表達(dá)構(gòu)建體例如是源自實(shí)驗(yàn)操作的構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體中，a)所述核酸分子或b)所述調(diào)節(jié)性核酸分子或c) 二者(即(a)和(b))不位于其天然(原有)遺傳環(huán)境中或已經(jīng)因?qū)嶒?yàn)操作受到修飾，修飾的實(shí)例是一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的置換、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境指源生物中的天然染色體基因座或指存在于基因組文庫中。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選地保留，至少部分地保留該核酸分子的序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境分布在所述核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp，優(yōu)選地至少500bp，特別優(yōu)選地至少1，OOObp,非常特別優(yōu)選地至少5，OOObp序列長度。天然存在的表達(dá)構(gòu)建體例如啟動(dòng)子與相應(yīng)基因的天然存在組合-在通過非天然的合成性“人工”方法例如誘變法修飾時(shí)變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體。已經(jīng)描述了此類方法(US5, 565, 350 ；W000 / 15815)。例如，與啟動(dòng)子有效連接的編碼蛋白質(zhì)的核酸分子相對于該啟動(dòng)子視為異源，其中所述的啟動(dòng)子不是該核酸分子的天然啟動(dòng)子。優(yōu)選地，異源DNA相對于導(dǎo)入該異源DNA的細(xì)胞不是內(nèi)源的或不天然與該細(xì)胞相關(guān),但是已經(jīng)從另一種細(xì)胞獲得或已經(jīng)合成。異源DNA還包括含有一些修飾的內(nèi)源DNA序列、不天然存在的多拷貝內(nèi)源DNA序列或這樣的DNA序列，該DNA序列不與物理連接于所述DNA序列的另一個(gè)DNA序列天然接合。通常地但不是必需地，異源DNA在表達(dá)其的細(xì)胞中編碼RNA或蛋白質(zhì)，而所述RNA或蛋白質(zhì)正常情況下不被所述細(xì)胞產(chǎn)生。
[0092]雜交:如本文中所用，術(shù)語“雜交”包括“核酸分子的鏈通過堿基配對作用與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任意過程”。(J.Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press,New York)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸分子之間結(jié)合的強(qiáng)度)受此類因素影響，如核酸分子之間的互補(bǔ)性程度、所涉及條件的嚴(yán)格性、所形成雜合體的Tm和核酸分子內(nèi)部的G: Ct匕。如本文中所用，術(shù)語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體一半解離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸分子的Tm的等式是本領(lǐng)域熟知的。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所示，當(dāng)核酸分子處于IM NaCl的水溶液中時(shí),可以通過等式:Tm=81.5+0.41 (% G+C)計(jì)算來進(jìn)行Tm 值的簡單估計(jì)[見例如，Anderson 和 Young, Quantitative Filter Hybridization, inNucleic Acid Hybridization (1985)]。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜計(jì)算法,這些算法考慮了結(jié)構(gòu)特征及序列特征以計(jì)算Tm。嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6 中找到。
[0093]“同一性”:在比較兩個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸分子使用時(shí)，“同一性”意指所述分子的序列共有某種程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。
[0094]為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸分子的同一性(同源性在本文可互換地使用)百分?jǐn)?shù)，將所述序列以一個(gè)序列在另一個(gè)序列下的方式書寫以最佳比較(例如，可以將空位插入蛋白質(zhì)的序列或核酸的序列，旨在與另一種蛋白質(zhì)或另一種核酸產(chǎn)生最佳比對)。
[0095]隨后在對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處比較氨基酸殘基或核酸分子。當(dāng)一個(gè)序列中的位置由另一個(gè)序列中對應(yīng)位置處的相同氨基酸殘基或相同核酸分子占據(jù)時(shí)，則所述分子在這個(gè)位置處是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”對應(yīng)于氨基酸或核酸“同一性”。這兩個(gè)序列之間的同源性百分?jǐn)?shù)是所述序列共有的相同位置的數(shù)值的函數(shù)(即同源性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)值/位置總數(shù)X100)。術(shù)語“同源性”和“同一性”因而視為同義詞。
[0096]為確定兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)，已經(jīng)開發(fā)了幾個(gè)計(jì)算機(jī)軟件程序。兩個(gè)或更多序列的同一性可以用例如軟件fasta計(jì)算，其中軟件 fasta 已經(jīng)以 fasta3 版本使用(ff.R.Pearson 和 D.J.Lipman, PNAS85, 2444 (1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymologyl83,63 (1990) ;W.R.Pearson和D.J.Lipman, PNAS85，2444 (1988) ；ff.R.Pearson, Enzymologyl83, 63 (1990))。用于計(jì)算不同序列的同一性的另一種有用程序是標(biāo)準(zhǔn)blast程 序，其中該程序包含于Biomax pedant軟件(聯(lián)邦德國慕尼黑Biomax)中。不幸地，該程序有時(shí)產(chǎn)生次優(yōu)結(jié)果，因?yàn)锽LAST不總是包含主題和查詢對象的完整序列。然而，由于該程序非常高效，因而它可以用于龐大數(shù)目序列的比較。以下設(shè)置通常用于這樣的序列比較:
[0097]-P程序名稱[字符串];-d數(shù)據(jù)庫[字符串];默認(rèn)=nr ;_i查詢文件[FileIn];默認(rèn)=Stdin ；-e其月望值(E) [Real];默認(rèn)=10.0 ；-m比對瀏覽選項(xiàng):0=配對；1=查詢-比上區(qū)域(query-anchored),顯示同一性；2=查詢-比上區(qū)域，不顯示同一性；3=查詢-比上區(qū)域的屏文形式，顯示同一性；4=查詢-比上區(qū)域的屏文形式，不顯示同一性；5=查詢-比上區(qū)域，不顯示同一性和突然結(jié)束；6=查詢-比上區(qū)域的屏文形式，不顯示同一性和突然結(jié)束；7=XML Blast輸出；8=TAB格式輸出；9帶注釋行的TAB格式輸出[整數(shù)];默認(rèn)=O ；-o BLAST報(bào)告輸出文件[File Out]任選；默認(rèn)=Stdout ；-F過濾軟件查詢序列(DUST用blastn，SEG用其他方法)[字符串];默認(rèn)=T ；-G空位開口成本(零激發(fā)默認(rèn)行為)[整數(shù)];默認(rèn)=0;-E開口延伸成本(零激發(fā)默認(rèn)行為)[整數(shù)];默認(rèn)=0;-X X空位比對的下降值(比特)(零激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn30, megablast20, tblastxO,全部其他方法15[整數(shù)];默認(rèn)=0;-1在定義行中顯示GI' [T / F];默認(rèn)=F;_q核苷酸錯(cuò)配罰分(僅blastn)[整數(shù)];默認(rèn)=_3 ；-r核苷酸匹配回報(bào)(僅blastn)[整數(shù)];默認(rèn)=1 ；-v顯示對(V)的單-線描述的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)[整數(shù)];默認(rèn)=500 ；-b顯示對⑶的比對結(jié)果的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)[整數(shù)];默認(rèn)=250 ;_f延伸命中的閾值，若為零，則默認(rèn)；blastpll，blastnO, blastxl2, tblastnl3 ；tblastxl3, megablastO [整數(shù)];默認(rèn)=O ;-g 執(zhí)行空位比對(對tblastx不可用)[T / F];默認(rèn)=T ;_Q查詢使用的遺傳密碼[整數(shù)];默認(rèn)=I ；-DDB遺傳密碼子(僅用于tblast[nx])[整數(shù)];默認(rèn)=1 ;_a使用的處理器數(shù)目[整數(shù)];默認(rèn)=I ；-0 SeqAlign文件[File Out]任選；_J相信查詢定義行[T / F];默認(rèn)=F ;_M矩陣[字符串]J>iHA=BL0SUM62 ;_W字大小，如果為零，則默認(rèn)(blastnll，megablast28，全部其他方法3)[整數(shù)];默認(rèn)=0 ；-z數(shù)據(jù)庫的有效長度(對于真實(shí)大小，使用零)[Real]；默認(rèn)=O ;-K來自保持區(qū)域的最佳命中數(shù)(默認(rèn)關(guān)閉；若使用，則推薦值為100)[整數(shù)];默認(rèn)=0;-Ρ0用于多重命中；I用于單一命中[整數(shù)];默認(rèn)=0;-Υ搜索空間的有效長度(對真實(shí)大小，使用零)[Real];默認(rèn)=0 ;_S針對數(shù)據(jù)庫搜索的查詢鏈(對于blast [nx]和tblastx) ;3用于兩者，I是頂端，2是底部[整數(shù)];默認(rèn)=3 ;-T產(chǎn)生HTML輸出結(jié)果[T /F];默認(rèn)=F ；-1限制數(shù)據(jù)庫搜索至GI' s列表[字符串]任選；-U使用FASTA序列的較低事件過濾作用[T / F]任選；默認(rèn)=F ；-y無空位延伸的X下降值(比特)(0.0激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn20, megablastlO，全部其他方法7 [Real];默認(rèn)=0.0 ;_Z最終空位比對的X下降值(比特)(0.0激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn / megablast50, tblastxO,全部其他方法25[整數(shù)];默認(rèn)=0 ；-R PS1-TBLASTN檢查點(diǎn)文件[File In]任選；-n MegaBlast 搜索[T /F];默認(rèn)=F ;_L查詢序列上的位置[字符串]任選；-A多重命中窗口大小，如果為零，則默認(rèn)(blastn / megablastO,全部其他方法40 [整數(shù)];默認(rèn)=0;_w移碼罰分(00F算法用于blastx)[整數(shù)];默認(rèn)=O ；-t允許tblastn中用于聯(lián)系HSP的最大內(nèi)含子的長度(O取消連接聯(lián)系)[整數(shù)];默認(rèn)=0。
[0098]通過使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法獲得高質(zhì)量的結(jié)果。因而，優(yōu)選基于所述算法的程序。有利地，可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351 (1987)，Higgins 等人，CAB10S5,151 (1989))或優(yōu)選地用均基于 Needleman 和 Wunsch 算法(J.Mol.Biol.48 ；443 (1970))的程序“Gap”與“Needle”和基于 Smith 和 Waterman (Adv.App1.Math.2 ;482 (1981))算法的 “BestFit” 進(jìn)行序列的比較。“Gap” 和 “BestFit”是 GCG 軟件包[Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, Wisconsin,USA53711 (1991) ;Altschul 等人(Nucleic Acids Res.25，3389 (1997))的部分，“Needle”是歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(EMBOSS))的部分(Trends` in Geneticsl6 (6)，276 (2000))。因而，優(yōu)選地，用程序“Gap”或“Needle”在所述序列的整個(gè)范圍內(nèi)進(jìn)行確定序列同源性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算。用于比較核酸序列的以下標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整用于“Needle”:矩陣:EDNAFULL，空位罰分:10.0，延伸罰分:0.5。用于比較核酸序列的以下標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整用于“Gap”:空位權(quán)重:50，長度權(quán)重:3，平均匹配:
10.000，平均錯(cuò)配:0.000。
[0099]例如，將聲稱在核酸水平與序列SEQ ID NO:1具有80 %同一性的序列理解為意指，通過上述程序“Needle”以設(shè)置的上述參數(shù)與序列SEQ ID NO:1所代表的序列比較時(shí)具有80%同一性的序列。優(yōu)選地，在查詢序列例如SEQ ID NO:1的完整長度上計(jì)算同源性。
[0100]內(nèi)含子:指基因內(nèi)部的DNA區(qū)段(間插序列)，該DNA區(qū)段不編碼該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的部分，并且從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中在該mRNA從細(xì)胞核輸出之前剪切下來。內(nèi)含子序列指內(nèi)含子的核酸序列。因而，內(nèi)含子是DNA序列的這些區(qū)域，它們隨編碼序列(外顯子)一起轉(zhuǎn)錄但是在成熟mRNA形成期間被除去。內(nèi)含子可以位于實(shí)際編碼區(qū)內(nèi)部或位于前mRNA(未剪接的mRNA)的5’或3’非翻譯前導(dǎo)序列中。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子被切下并且編碼序列同時(shí)且精確地連接以形成成熟的mRNA。內(nèi)含子和外顯子的交界形成剪接位點(diǎn)。內(nèi)含子的序列始于⑶并止于AG。另外，在植物中，已經(jīng)描述AU-AC內(nèi)含子的兩個(gè)實(shí)例:來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的RecA樣蛋白基因第14內(nèi)含子和G5基因第7內(nèi)含子是AT-AC含子。含有內(nèi)含子的前mRNA具有3種短序列，連同其他序列，這些短序列對于精確剪接內(nèi)含子是必需的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。mRNA剪接是除去初級(jí)mRNA轉(zhuǎn)錄物中存在的間插序列(內(nèi)含子)并接合或連接外顯子序列。這又稱作順式剪接作用，所述順式剪接作用將相同RNA上的兩個(gè)外顯子接合，同時(shí)除去間插序列(內(nèi)含子)。內(nèi)含子的功能性元件包含由剪接體(例如其剪接內(nèi)含子末端處的共有序列)的特定蛋白質(zhì)組分識(shí)別并結(jié)合的序列。功能性元件與剪接體的相互作用導(dǎo)致從不成熟mRNA除去內(nèi)含子序列和外顯子序列的再接合。內(nèi)含子具有3種短序列，這些短序列對于精確剪接內(nèi)含子是必需的，但是并非足夠的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。分支點(diǎn)序列是在植物中剪接過程和剪接位點(diǎn)選擇方面重要的。分支點(diǎn)序列通常位于3’剪接位點(diǎn)上游10-60個(gè)核苷酸處。
[0101]同基因的:除可以因存在或不存在異源DNA序列而不同之外，在遺傳上相同的生物(例如植物)。
[0102]分離的:如本文中所用的術(shù)語“分離的”或“分離”意指材料已經(jīng)通過人工取出并且離開其原來的天然環(huán)境存在并且因此不是自然界的產(chǎn)物。分離的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以純化的形式存在或可以存在于非天然環(huán)境中如例如存在于轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。例如，活植物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離的，然而與該天然系統(tǒng)中一些或全部共存物質(zhì)分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，和是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是其最初環(huán)境的一部分。優(yōu)選地，術(shù)語“分離的”相對于核酸分子使用時(shí)，如在“分離的核酸序列”中，指被鑒定并且與該核酸序列天然來源中通常與其接合的至少一種雜質(zhì)性核酸分子分開的核酸序列。分尚的核酸分子是這樣的核酸分子，其在與自然界中找到該核酸分子的形式或環(huán)境不同的形式或環(huán)境下存在。相反，未分離的核酸分子是以其在自然界中存在的狀態(tài)所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主細(xì)胞染色體上相鄰基因附近找到給定的DNA序列(例如，基因)； 作為與編碼多種蛋白質(zhì)的眾多其他mRNA的混合物，在細(xì)胞中找到的RNA序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO:1的分離的核酸序列包括例如在細(xì)胞中通常含有SEQ ID NO:1的此類核酸序列，其中所述核酸序列位于不同于天然細(xì)胞中其染色體或染色體外位置的染色體或染色體外位置中，或側(cè)翼分布有不同于自然界中存在的核酸序列。分離的核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)分離的核酸序列用來表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，該核酸序列將最少含有有義鏈或編碼鏈的至少一部分(即，該核酸序列可以是單鏈的)。備選地，它可以含有有義鏈和反義鏈(即，該核酸序列可以是雙鏈的)。
[0103]最小啟動(dòng)子:在缺少上游激活情況下無活性或啟動(dòng)子活性大大降低的啟動(dòng)子元件，尤其是TATA元件。在合適的轉(zhuǎn)錄因子存在下，最小啟動(dòng)子發(fā)揮作用以引起轉(zhuǎn)錄。
[0104]NEENA:參見“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”。
[0105]非編碼:術(shù)語“非編碼”指核酸分子中不編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的部分或全部的序列。非編碼序列包括但不限于內(nèi)含子、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子區(qū)、3’非翻譯區(qū)和5’非翻譯區(qū)。
[0106]增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA):術(shù)語“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”指這樣的序列和/或核酸分子，其是具有增強(qiáng)與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的控制下之核酸表達(dá)的內(nèi)在特性的特定序列。不同于啟動(dòng)子序列，NEENA本身不能驅(qū)動(dòng)表達(dá)。為了履行增強(qiáng)與NEENA功能性連接的核酸分子表達(dá)的職能，NEENA本身應(yīng)當(dāng)與啟動(dòng)子功能性連接。與本領(lǐng)域已知的增強(qiáng)子序列的區(qū)別在于，NEENA以順式方式而不以反式方式起作用，并且必需靠近待表達(dá)核酸的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)存在。
[0107]核酸和核苷酸:術(shù)語“核酸”和“核苷酸”指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。術(shù)語“核酸”和“核苷酸”包括處于單鏈或雙鏈、有義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸類似物和聚合物或雜合體。除非另外說明，特定核酸序列也隱含地包括其保守方式修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。術(shù)語“核酸”在本文中與“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互換地使用。核苷酸類似物包括在堿基、糖和/或磷酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有修飾的核苷酸，所述修飾包括但不限于5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾、5-溴-尿嘧啶置換等；和2'-位置糖修飾，包括但不限于糖修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH由選自H、01?、1?、鹵素、5!1、31?、順2、順1?、殿2或0^勺基團(tuán)替換。短發(fā)夾RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然堿基，例如，肌苷和黃嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯鍵，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。
[0108]核酸序列:短語“核酸序列”指從5’ -端至3’ -端讀取的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自我復(fù)制型質(zhì)粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用的DNA或RNA?！昂怂嵝蛄小币仓复砗塑账岬目s寫、字母、字符或字的連續(xù)串。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以是“探針”，所述探針是相對短的核酸，通常長度小于100個(gè)核苷酸。經(jīng)常地，核酸探針具有約50個(gè)核苷酸長度至約10個(gè)核苷酸長度。核酸的“靶區(qū)域”是核酸中被鑒定為目標(biāo)的部分。核酸的“編碼區(qū)”是核酸的部分，其中置于適宜的調(diào)節(jié)性序列控制下時(shí)，所述部分以序列特異性方式轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生特定的多肽或蛋白質(zhì)。稱該編碼區(qū)編碼這種多肽或蛋白質(zhì)。
[0109]寡核苷酸:術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的低聚物或聚合物，以及具有類似發(fā)揮作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的核酸靶親和力和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性而經(jīng)常優(yōu)選地勝過其天然形式。寡核苷酸優(yōu)選地包括通過鍵(例如，磷酸二酯鍵)或取代鍵(substitute linkage)相互共價(jià)偶聯(lián)的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸單體(nucIeomonomer)。
[0110]突出端:“突出端”是雙鏈寡核苷酸分子的5’ -或3’ -羥基端上相對短的單鏈核苷酸序列(也稱作“延伸”、“伸出端”或“粘末端”)。
[0111]植物:通常理解為意指能夠光合作用的任何真核單細(xì)胞或多細(xì)胞生物或其細(xì)胞、組織、器官、部分或繁殖材料(如種子或果實(shí))。為本發(fā)明的目的，包括植物界(PlantKingdom)的全部屬和物種的高等和低等植物。優(yōu)選一年生、多年生、單子葉和雙子葉植物。該術(shù)語包括成熟植物、種子、苗(shoots)和幼苗(seedling)及其衍生部分、繁殖材料(如種子或小孢子)、植物器官、組織、原生質(zhì)體、愈傷組織和其他培養(yǎng)物(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)，和歸并成產(chǎn)生功能單元或結(jié)構(gòu)單元的任何其他類型的植物細(xì)胞。成熟植物指在除幼苗之外的任何目的發(fā)育階段的植物。幼苗指在早期發(fā)育階段的年幼不成熟植物。一年生、二年生、單子葉和雙子葉植物是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選宿主生物。基因的表達(dá)在全部觀賞植物、用材樹或觀賞樹、花、切花、灌木或草坪草中是更進(jìn)一步有利的?？梢杂门e例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔蘚植物例如獐耳細(xì)辛屬(Hepaticae)(地錢類(liverwort))和蘚綱(Musci)(蘚類植物)；蕨類植物如蕨類、木賊類和石松類；裸子植物如松柏類植物、蘇鐵植物、銀杏(ginkgo)和買麻藤科(Gnetaeae)植物；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae)、娃藻綱(Bacillariophyceae)(娃藻類)和裸藻綱(Euglenophyceae)。優(yōu)選地用于食物或飼料目的的植物,如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜猜和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麥、大麥、高粱、粟(millet)、黑麥(rye)、黑小麥(triticale)或燕麥(oat);傘形科(Umbelliferae),具體地是胡蘿卜屬(Daucus)(非常特別地是物種胡蘿卜(carota))和芹屬(Apium)，非常特別地是物種旱芹(Graveolensdulce (celery))及眾多其它植物；爺科(Solanaceae),特別是番爺屬(Lycopersicon),非常特別地是物種番爺(tomato),和爺屬(Solanum),非常特別地是物種馬鈴薯(tuberosum)(tomato)和爺子(eggplant)和眾多其它植物(如煙草(tobacco)),和辣椒屬(Capsicum),非常特別地是物種辣椒(annum(pepper))及眾多其它植物；豆科(Leguminosae),特別地是大豆屬(Glycine)，非常特別地是物種大豆(soybean)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、菜豆或花生及眾多其它植物；和十字花科(Brassicacae),特別地是蕓苔屬(Brassica),非常特別地是物種歐洲油菜(napus, (oilseed rape))、蕓苔(campestris, (beet)、甘藍(lán)(oleracea cvTastie (卷心菜))、花挪菜(oleracea cv Snowball Y(花挪菜))和花莖甘藍(lán)(oleraceacv Emperor (broccoli));和擬南芥屬，非常特別地是物種擬南芥及眾多其它植物；菊科(Compositae),具體地是萵苣屬(Lactuca),非常特別地是物種萵苣(sativa, (lettuce)及眾多其它植物；菊科(Asteraceae)如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花及眾多其它植物；葫蘆科(Cucurbitaceae)如甜瓜、西葫蘆/南瓜或夏南瓜，和亞麻(linseed)。更優(yōu)選地是棉屬植物、甘蔗、大麻、亞麻、辣椒和多種樹、堅(jiān)果和藤本(wine)物種。
[0112]多肽:術(shù)語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達(dá)產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在
文中互換地使用，用來指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物或低聚物。
[0113]前蛋白:正常情況下靶向細(xì)胞器如葉綠體并且仍包含其轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。
[0114]初級(jí)轉(zhuǎn)錄物:如本文中所用的術(shù)語“初級(jí)轉(zhuǎn)錄物”指基因的不成熟RNA轉(zhuǎn)錄物?！俺跫?jí)轉(zhuǎn)錄物”例如仍包含內(nèi)含子和/或仍不包含聚腺苷酸尾或帽結(jié)構(gòu)和/或是缺少對其作為轉(zhuǎn)錄物正常發(fā)揮作用必需的其他修飾，例如修剪或編輯。
[0115]啟動(dòng)子:術(shù)語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”是等同物并且如本文中所用的，指與目的核苷酸序列連接時(shí)能夠控制目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA序列。此類啟動(dòng)子可以例如在以下公共數(shù)據(jù)庫中 http: / / www.grassius.0rg / grasspromdb.html、http: / /mendel.cs.rhul.ac.uk / mendel.php?topic=plantprom> http://ppdb.gene, nagoya-u.ac.jp / cg1-bin / index, cgi找到。其中所列的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的方法并且在此引用而包括。啟動(dòng)子位于由該啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄成mRNA的目的核苷酸序列的5’( 即，上游)，靠近其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)， 并且為RNA聚合酶和用于轉(zhuǎn)錄起始的其他轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合提供位點(diǎn)。所述啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)例如至少IOkb,例如5kb或2kb。它也可以包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少1500bp,優(yōu)選地至少1000bp,更優(yōu)選地至少500bp,甚至更優(yōu)選地至少400bp,至少300bp,至少200bp或至少lOObp。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少50bp，例如至少25bp。啟動(dòng)子不包含外顯子和/或內(nèi)含子區(qū)或5’非翻譯區(qū)。啟動(dòng)子可以例如相對于相應(yīng)植物為異源或同源。如果多核苷酸序列源自外來物種，或如果來自相同物種，但從其原有形式中被修飾，則它相對于某生物或第二多核苷酸序列為“異源”。例如，與異源編碼序列有效連接的啟動(dòng)子指編碼序列來自不同于衍生該啟動(dòng)子的物種中，或，如果來自相同物種，編碼序列與該啟動(dòng)子不天然接合(例如基因修飾的編碼序列或來自不同生態(tài)型或品種的等位基因)。合適的啟動(dòng)子可以源自其中應(yīng)當(dāng)發(fā)生表達(dá)的宿主細(xì)胞的基因或源自該宿主細(xì)胞的病原體(例如，植物或植物病原體如植物病毒)。植物特異性啟動(dòng)子是適于調(diào)節(jié)植物中表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以源自植物，也可以源自植物病原體，或它可以是由人設(shè)計(jì)的合成性啟動(dòng)子。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄的速率應(yīng)答于誘導(dǎo)劑而增加。另外，啟動(dòng)子可以以組織特異性或組織優(yōu)先的方式受到調(diào)節(jié)，從而它僅僅或優(yōu)勢地在特定組織類型如葉、根或分生組織中在轉(zhuǎn)錄所接合的編碼區(qū)方面有活性。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“組織特異性”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的組織(例如，花瓣)中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在不同類型組織(例如，根)中相對缺少的表達(dá)。可以例如通過這樣的方式評價(jià)啟動(dòng)子的組織特異性:將報(bào)道基因與該啟動(dòng)子序列有效連接以產(chǎn)生報(bào)道構(gòu)建體，將報(bào)道構(gòu)建體導(dǎo)入植物的基因組，從而該報(bào)道構(gòu)建體整合至所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的每種組織中，并且檢測報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中的表達(dá)(例如，檢測mRNA、蛋白質(zhì)或由報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。相對于報(bào)道基因在其他組織中的表達(dá)水平，檢測到該報(bào)道基因在一種或多種組織中的更大表達(dá)水平表明該啟動(dòng)子對其中檢測到更大表達(dá)水平的組織是特異性的。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的細(xì)胞中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在相同組織內(nèi)部的不同類型細(xì)胞中相對缺少的表達(dá)。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”還意指能夠促進(jìn)目的核苷酸序列在單一組織內(nèi)部的某區(qū)域中選擇表達(dá)的啟動(dòng)子。使用本領(lǐng)域熟知的方法，例如GUS活性染色法、GFP蛋白法或免疫組織化學(xué)染色法，可以評估啟動(dòng)子的細(xì)胞類型特異性。談及啟動(dòng)子或源自啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)，術(shù)語“組成型”意指能夠指導(dǎo)有效連接的核酸分子在刺激物(例如，熱休克、化學(xué)品、光等)不存在下在大部 分植物組織和細(xì)胞中貫穿植物或植物部分的基本上整個(gè)生活期限轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。一般而言，組成型啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在基本上任何細(xì)胞和任何組織中的表達(dá)。
[0116]啟動(dòng)子特異性:談及啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“特異性”意指由相應(yīng)啟動(dòng)子引起的表達(dá)的樣式。特異性描述了植物或其部分的組織和/或發(fā)育狀態(tài)，在其中該啟動(dòng)子引起處于相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子表達(dá)。啟動(dòng)子的特異性也可以包含環(huán)境條件，在所述環(huán)境條件下可以激活或下調(diào)該啟動(dòng)子，如由生物脅迫或環(huán)境脅迫如寒冷、干旱、受傷或感染誘導(dǎo)或阻遏。
[0117]純化:如本文中所用，術(shù)語“純化的”指從其天然環(huán)境取出、分離或分開的分子，SP核酸序列或氨基酸序列。“基本上純化的”分子至少60%沒有、優(yōu)選地至少75%沒有和更優(yōu)選地至少90%沒有與它們天然結(jié)合在一起的其他組分。純化的核酸序列可以是分離的核酸序列。[0118]重組:就核酸分子而言，術(shù)語“重組”指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的核酸分子。重組核酸分子也可以包括本身不存在于自然界中但是被人修飾、改變、突變或操縱的分子。優(yōu)選地，“重組核酸分子”是在序列方面與天然存在的核酸分子有至少一個(gè)核酸不同的非天然存在的核酸分子?！爸亟M核酸分子”也可以包括“重組構(gòu)建體”，其包含不天然地以這種順序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選地有效地連接。用于產(chǎn)生所述重組核酸分子的優(yōu)選方法可以包括克隆技術(shù)、定向或非定向誘變法、合成或重組技術(shù)。
[0119]“種子特異性啟動(dòng)子”在本發(fā)明的上下文中是指在種子中調(diào)節(jié)相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中在種子的任何組織或細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄賦予在植物任何發(fā)育階段在整株植物中從所述核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量的90%以上，優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選99%以上。術(shù)語“種子特異性表達(dá)”也具有相應(yīng)地理解。
[0120]“種子偏好的啟動(dòng)子”在本發(fā)明的上下文中是指在種子中調(diào)節(jié)相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中在種子的任何組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄賦予在植物任何發(fā)育階段在整株植物中從所述核酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量的50%以上，優(yōu)選70%以上，更優(yōu)選80%以上。術(shù)語“種子偏好地表達(dá)”也具有相應(yīng)地理解。
[0121]有義:術(shù)語“有義”理解為意指核酸分子，其具有與靶序列互補(bǔ)或相同的序列，例如與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和參與給定基因表達(dá)的序列。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸分子包含目的基因和允許表達(dá)該目的基因的元件。
[0122]顯著的增加或減少:大于測量技術(shù)中固有誤差幅度的增加或減少，例如在酶活性或在基因表達(dá)方面，優(yōu)選地是對照酶的活性或?qū)φ占?xì)胞中的表達(dá)增加或減少約2倍或更多，更優(yōu)選地增加或減少約5倍或更多，并且最優(yōu)選地增加或減少約10倍或更多。
[0123]小核酸分子:“小核酸分子”理解為由核酸或其衍生物如RNA或DNA組成的分子。它們可以是雙鏈或單鏈的，并且其長度在約15和約30bp之間，例如在15和30bp之間，更優(yōu)選地在約19和約26bp之間，例如在19和26bp之間，甚至更優(yōu)選地在約20和約25bp之間，例如在20和25bp之間。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸的長度在約21和約24bp之間，例如在21和24bp之間。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，小核酸分子的長度是約2Ibp 和約 24bp,例如 2Ibp 和 `24bp。
[0124]基本上互補(bǔ)的:在最廣意義上，本文中就核苷酸序列相對于參比或靶核苷酸序列而言使用時(shí)，術(shù)語“基本上互補(bǔ)的”意指這樣的核苷酸序列，其具有在基本上互補(bǔ)的核苷酸序列和所述參比或靶核苷酸序列的完全互補(bǔ)序列之間至少60%，更希望地至少70%，更希望地至少80%或85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少93%，仍更優(yōu)選地至少95%或96%，仍舊更優(yōu)選地至少97%或98%，依舊更優(yōu)選地至少99%或最優(yōu)選地100%的同一性百分?jǐn)?shù)(后者等同于本上下文中的術(shù)語“同一的”)。優(yōu)選地，在至少19個(gè)核苷酸長度、優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸長度、更優(yōu)選地核酸序列的全部長度范圍內(nèi)針對所述參比核苷酸序列評估同一性(如果不是，則另外在下文說明)。使用威斯康辛大學(xué)GCG的默認(rèn)GAP分析，GAP 的 SEQffEB 應(yīng)用，基于 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch(1970) J Mol.Biol.48 =443-453 ;如上文定義)實(shí)施序列比較。與參比核苷酸序列“基本上互補(bǔ)的”核苷酸序列與該參比核苷酸序列在低嚴(yán)格性條件、優(yōu)選地中等嚴(yán)格性條件、最優(yōu)選地高嚴(yán)格性條件(如上文定義)下雜交。
[0125]終止子:術(shù)語“終止子”、“轉(zhuǎn)錄終止子”或“轉(zhuǎn)錄終止子序列”在本文中使用時(shí)意指位于基因的3’ UTR的引起聚合酶終止形成磷酸二酯鍵并且釋放新生轉(zhuǎn)錄物的序列。如本文所用的，終止子包含有效生產(chǎn)信使RNA所必需的完整的3’ UTR結(jié)構(gòu)。終止子序列導(dǎo)致或起始自啟動(dòng)子起始的核酸序列的轉(zhuǎn)錄終止。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄終止子序列還包含引起轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化的序列。轉(zhuǎn)錄終止子可以例如，包含一個(gè)或多個(gè)聚腺苷酸化信號(hào)序列，一個(gè)或多個(gè)聚腺苷酸化結(jié)合序列和多個(gè)長度的引起轉(zhuǎn)錄終止的下游序列。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到編碼表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物的3’非翻譯區(qū)的序列下游的序列也是轉(zhuǎn)錄終止子的一部分，盡管序列本身并不作為RNA轉(zhuǎn)錄物的部分被表達(dá)。此外，轉(zhuǎn)錄終止子可以包含可以影響其功能性的額外的序列，例如3’非翻譯序列(即編碼序列的終止密碼子之后的基因的序列)。轉(zhuǎn)錄終止可以涉及多個(gè)機(jī)制，包括但不限于誘導(dǎo)的RNA聚合酶II從其DNA模板的解離。
[0126]轉(zhuǎn)基因:如本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中的任何核酸序列。轉(zhuǎn)基因可以是“內(nèi)源DNA序列”或“異源DNA序列”(即，“外來DNA”)。術(shù)語“內(nèi)源DNA序列”指這樣的核苷酸序列，其天然存在于導(dǎo)入核苷酸序列的細(xì)胞中，只要它相對于天然存在序列不含有一些修飾(例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)。
[0127]轉(zhuǎn)基因的:當(dāng)提及生物時(shí)，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”意指用重組DNA分子轉(zhuǎn)化生物，優(yōu)選地穩(wěn)定轉(zhuǎn)化生物，其中所述重組DNA分子優(yōu)選地包含與目的DNA序列有效連接的合適啟動(dòng)子。
[0128]載體:如本文中所用，術(shù)語“載體”指能夠運(yùn)輸已經(jīng)與之連接的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是基因組整合的載體，或“整合的載體”，所述載體可以整合至宿主細(xì)胞的染色體DNA中。另一個(gè)類型的載體是游離型載體，即，能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸分子。本文中將能夠指導(dǎo)與它們有效連接的基因表達(dá)的載體稱作“表達(dá)載體”。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”互換地使用，除非從上下文顯而易見并非如此。設(shè)計(jì)旨在體外或體內(nèi)產(chǎn)生如本文所述RNA的表達(dá)載體可以含有被任何RNA聚合酶識(shí)別的序列，所述的RNA聚合酶包括線粒體RNA聚合酶、RNA pol 1、RNA pol II和RNA pol III。這些載體可以用來在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄想要的RNA分子。將植物轉(zhuǎn)化載體理解為適用于植物轉(zhuǎn)化過程中的載體。
[0129]野生型:就生物、多 肽或核酸序列而言，術(shù)語“野生型”、“天然”或“天然來源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一種天然存在生物中可獲得的，其沒有被改變、突變或由人類操作。
實(shí)施例
[0130]化學(xué)品和常用方法
[0131]除非另外說明，如(SambiX)Ok等人，1989)所述為本發(fā)明的目的進(jìn)行克隆過程，包括限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳、核酸的純化、核酸的連接、細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、選擇和培養(yǎng)。使用Sanger技術(shù)(Sanger等人，1977),用激光突光DNA測序儀(Applied Biosystems,Foster City, CA, USA)進(jìn)行重組DNA的序列分析。除非另外描述,從Sigma Aldrich (SigmaAldrich, St.Louis, USA)、Promega(Madison, WI, USA)、Duchefa (Haarlem,TheNetherlands)或Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)獲得化學(xué)品和試劑。限制性核酸內(nèi)切酶來自 New England Biolabs(Ipswich, MA, USA)或 Roche Diagnostics GmbH(Penzberg,Germany)。寡核苷酸由 Eurofins MWG Operon(Ebersberg, Germany)合成。
[0132]實(shí)施例1:推定增強(qiáng)基因表達(dá)的稻(Oryza sativa)終止子的鑒定[0133]鑒定了增強(qiáng)功能連接基因的基因表達(dá)的終止子的序列元件。表1提供了 43種增強(qiáng)終止子(ET)元件的綜述。
[0134]表1:表達(dá)增強(qiáng)終止子(ET)序列元件
[0135]
【權(quán)利要求】
1.終止子分子，其包含至少一種下述在表1中定義的增強(qiáng)終止子元件(ET)或如表2中定義的其組合，或任意這些ET或這些ET組合的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物,其中包含所述ET或其組合的終止子分子導(dǎo)致與所述終止子分子功能連接的異源核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)。
2.終止子分子，其包含選自下述的序列 a)核酸分子，其具有如SEQID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64中定義的序列，或 b)核酸分子，其具有與SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63 和 64 具有至少60%同一性的序列，或 c)i)或ii)的核酸分子的100或更多個(gè)連續(xù)堿基的片段，其具有如同具有SEQID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62、63和64的序列的對應(yīng)核酸分子的表達(dá)增強(qiáng)活性，或 d)核酸分子，其是任意之前在i)或ii)中提及的核酸分子的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物，或 e)核酸分子，其可使用表5中顯示的SEQID NO:63至96描述的寡核苷酸引物通過PCR得到，或 f)100個(gè)核苷酸或更多的核酸分子，其與包含SEQ ID NO:1、2、3、4、57、58、59、60、61、62,63和64描述的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)終止子的至少50個(gè)連續(xù)的核苷酸或其互補(bǔ)物的核酸分子在相當(dāng)于下述的條件下雜交，即在7%的十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5M NaP04, ImM EDTA中在50°C下雜交，在2X SSC,0.1% SDS中在50°C下洗滌。 其中所述終止子分子導(dǎo)致與其功能連接的異源核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)。
3.鑒定和分離導(dǎo)致與終止子分子功能連接的異源核酸分子表達(dá)增強(qiáng)的終止子分子的方法，其包括 以下步驟: A)鑒定:VUTRJP B)鑒定對應(yīng)的基因組DNA C)使用任意計(jì)算ET檢測或IUPAC字符串匹配序列分析工具在B)中鑒定的組中鑒定包含在表1或表2中定義的任意ET或其組合的分子，和 D)分離至少250bp包含所述ET的基因組DNA。
4.產(chǎn)生重組終止子分子的方法，所述終止子分子增強(qiáng)與所述終止子分子功能連接的異源核酸分子的表達(dá)，所述方法包括以下步驟，在缺乏表達(dá)增強(qiáng)性能的終止子分子中引入至少一種在表1或表10中定義的ET元件或在表2中定義的其組合，或其互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物。
5.產(chǎn)生相比對應(yīng)的對照植物或其部分具有一種或多種核酸分子的增強(qiáng)的表達(dá)的植物或其部分的方法，所述方法包括以下步驟: a)將一種或多種包含在表1或2中定義的ET或其組合的終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子引入植物或其部分， 和 b)將所述一種或多種終止子分子與啟動(dòng)子和所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子功能連接，其中所述終止子分子相對所述核酸分子和/或啟動(dòng)子是異源的。
6.權(quán)力要求5的方法，其包括以下步驟 a)將一種或多種包含在表1或2中定義的ET或其組合的終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子引入植物或其部分，和b)將所述一種或多種終止子整合進(jìn)所述植物或其部分的基因組中，使得所述一種或多種終止子與內(nèi)源表達(dá)的核酸功能連接，所述內(nèi)源表達(dá)的核酸相對所述一種或多種終止子是異源的，和任選地 c)從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生包含所述一種或多種終止子的植物或其部分。
7.權(quán)利要求5至6的方法，其包括以下步驟: a)提供表達(dá)構(gòu)建體，其包含一種或多種包含在表1或2中定義的ET或其組合的終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子，所述終止子分子與啟動(dòng)子和一種或多種核酸分子功能連接，后者相對所述一種或多種終止子分子是異源的且處于所述啟動(dòng)子的控制下，和 b)將包含所述一種或多種終止子分子的所述表達(dá)構(gòu)建體整合進(jìn)所述植物或其部分的基因組中，和任選地 c)從所述轉(zhuǎn)化的植物或其部分再生包含所述一種或多種表達(dá)構(gòu)建體的植物或其部分。
8.權(quán)利要求5至7的方法，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
9.重組表達(dá)構(gòu)建體，其包含一種或多種包含在表1或2中定義的ET或其組合的終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子。
10.權(quán)利要求9的重組表達(dá)構(gòu)建體，其中所述終止子分子與一種或多種啟動(dòng)子和一種或多種表達(dá)的核酸分子功能連接，至少后者相對所述一種或多種終止子是異源的。
11.重組表達(dá)載體，其包含一種或多種權(quán)利要求9或10的重組表達(dá)構(gòu)建體。
12.轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含一種或多種包含在表1或2中定義的ET或其組合的異源終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的異源終止子分子。
13.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含權(quán)利要求11的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求9或10的重組表達(dá)構(gòu)建體。
14.權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其選自或來自細(xì)菌、真菌、酵母或植物。
15.來自權(quán)利要求12至15的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、部分或繁殖材料，其包含所述包含在表1或2中定義的ET或其組合的異源終止子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的異源終止子分子，權(quán)利要求9或10的重組表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求11的重組載體。
16.包含在表1或2中定義的ET或其組合的終止子分子或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子或在權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)定義的重組構(gòu)建體或重組載體用于增強(qiáng)植物或其部分中的表達(dá)的用途。
17.產(chǎn)生農(nóng)產(chǎn)品的方法，其通過將在表1或2中定義的ET或其組合或在權(quán)利要求2的a)至f)中定義的終止子分子或在權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)定義的重組構(gòu)建體或重組載體引入植物，培養(yǎng)植物，收獲和加工植物或其部分。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103732747SQ201280038154
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月1日
【發(fā)明者】J·V·哈廷格, A·N·伯格梅爾, J·M·庫恩, L·P·洛亞爾, E·杜維尼哥 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司