專利名稱：一種人工合成的耐草甘膦基因表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成的耐草甘膦基因表達(dá)載體及其應(yīng)用，特別涉及一種根據(jù)玉米偏好密碼子設(shè)計(jì)并合成的耐草 甘膦基因表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前在植物轉(zhuǎn)基因育種中所應(yīng)用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來自原核生物，由于原核生物基因自身的特點(diǎn)，如I) AT含量較高，超過60 %，造成基因表達(dá)的mRNA在植物體內(nèi)極易被降解；2)存在類似真核基因的內(nèi)含子切點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列，造成轉(zhuǎn)錄不完整、mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結(jié)構(gòu)與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的PolyA加尾序列，導(dǎo)致基因在植物體內(nèi)往往表達(dá)水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達(dá)量非常低，其表達(dá)的毒蛋白只占總蛋白的O. 001%或者幾乎檢測(cè)不到。美國(guó) Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A,et al. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol,1997,34 :485-496)在不改變毒蛋白氛基酸序列的前提下，分別對(duì)殺蟲蛋白基因和cryIII基因進(jìn)行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不穩(wěn)定元件序列，使轉(zhuǎn)基因植株中毒蛋白的表達(dá)量增加了 30 100倍，高達(dá)可溶性蛋白的O. 02 1%，獲得了明顯的抗蟲效果。雜草是農(nóng)作物生產(chǎn)的大害，自1942年出現(xiàn)近代雜草防治技術(shù)以來，化學(xué)除草劑有了很大的發(fā)展。草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的一個(gè)重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分裂，對(duì)許多一年生和多年生雜草都具有強(qiáng)烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對(duì)動(dòng)物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來，得到了廣泛的應(yīng)用。但是，由于玉米等禾本科作物對(duì)草甘膦敏感，使其應(yīng)用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉(zhuǎn)入玉米，不但可以擴(kuò)大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產(chǎn)成本，保護(hù)玉米免受藥害，最終達(dá)到增產(chǎn)增收的目的。盡管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被發(fā)現(xiàn)，并在宿主熒光假單胞菌G2及大腸桿菌中都能高效表達(dá),表現(xiàn)高耐草甘膦的特性(Yichen Sun, Min Linand Yiping Wang. Novel AroA with high tolerance to Glyposate, encoded by a geneof Pseudomonas putida 4G—1 isolated from an extremeIypoIluted environment inChina. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物,特別是重要的糧食作物中由于表達(dá)量較低而沒有被利用，因此急需對(duì)其在植物中的應(yīng)用進(jìn)行研究，如進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以加速其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體為表達(dá)人工合成的耐草甘膦基因的表達(dá)載體；所述人工合成的耐草甘膦基因(命名為mG2-aroA)為下述a)或b)的DNA分子a)核苷酸序列為序列表中序列2 ；
b)核苷酸序列與序列表中序列2至少具有98%的同一性，且編碼序列9所示的蛋白質(zhì)(命名為G2-aroA蛋白)?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。如花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S ;西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子PF128，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、nap in, oleosin和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中啟動(dòng)所述人工合成的耐草甘膦基因的啟動(dòng)子具體為Ubi啟動(dòng)子，其核苷酸序列為序列表中序列5，或與序列5至少具有80%的同一性，且具有啟動(dòng)子功能?？捎糜诒景l(fā)明的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中終止所述人工合成的耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列具體如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉(zhuǎn)錄終止功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中還包括OMK序列；所述OMK序列由Q序列和Kozak序列順次連接組成，其序列具體如序列表中序列6所示，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強(qiáng)子功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體中還包括葉綠體導(dǎo)肽(CTP)序列；所述葉綠體導(dǎo)肽(CTP)序列如序列表中序列7所示，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號(hào)肽功能。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述表達(dá)載體(命名為pS3300-UMG2)的序列為序列表中序列10。其中，序列2由1338個(gè)核苷酸組成，其末尾處為兩個(gè)終止密碼子。序列2的第1-1335位為編碼序列，編碼序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010個(gè)和核苷酸組成。序列6由67個(gè)核苷酸組成。序列7由141個(gè)核苷酸組成。序列8由491個(gè)核苷酸組成。序列9由444個(gè)氨基酸組成。序列10由10488個(gè)核苷酸組成，其中第151-2165位為Ubi啟動(dòng)子序列，第2177-2243位為OMK序列，第2244-2384位為CTP序列，第2385-3722位為mG2-aroA序列，第3723-4213位為轉(zhuǎn)錄終止序列。含有所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述重組細(xì)胞系可以為真核細(xì)胞，也可以為原核細(xì)胞，如植物細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物(如玉米)包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)基因微生物為轉(zhuǎn)入所述重組DNA片段的農(nóng)桿菌LBA4404所述表達(dá)載體在培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述轉(zhuǎn)基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。本發(fā)明針對(duì)原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表達(dá)較低的問題，在保持原氨基酸序列不變的前提下，采用玉米偏好性密碼子對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，去除影響RNA穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)(如polyA、重復(fù)序列、AT和GC串聯(lián)重復(fù)、RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)，增加GC含量。同時(shí)在其5’端添加Q序列和Kozak序列序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白質(zhì)基因編碼區(qū)的翻譯增強(qiáng)序列，由67bp組成，富集TTAAC序列，在蛋白質(zhì)合成的翻譯過程中構(gòu)成核糖體和rRNA結(jié)合位點(diǎn)。Kozak序列是促進(jìn)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)翻譯過程的編碼核糖體結(jié)合蛋白質(zhì)的序列)。啟動(dòng)子選用組成性啟動(dòng)子Ubi啟動(dòng)子。再則，在編碼序列的3’端設(shè)計(jì)了 2個(gè)連續(xù)的終止密碼子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS穩(wěn)定終止序列。其中，PolyA具有維持mRNA穩(wěn)定等作用，T-NOS終止序列確保了翻譯的準(zhǔn)確終止。另外，根據(jù)植物耐草甘膦的特殊機(jī)制，在5’起始密碼子ATG前加入葉綠體導(dǎo)肽CTP，使目的基因表達(dá)的蛋白(即G2-aroA蛋白)轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體中，以更好的發(fā)揮mG2-aroA基因的抗性效果。通過上述設(shè)計(jì)，使G2-aroA蛋白在玉米中高效穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與轉(zhuǎn)入原始G2-aroA基因的表達(dá)載體的玉米植株相比，轉(zhuǎn)入本發(fā)明所提供的含有mG2-aroA的表達(dá)載體(序列10)的陽性玉米植株，其G2-aroA蛋白的表達(dá)量明顯提高，每克葉片G2-aroA蛋白的表達(dá)量中可達(dá)15. 057 y g，遠(yuǎn)高于原始G2_aroA基因轉(zhuǎn)基因玉米的3. 735 Ug0同時(shí)，與轉(zhuǎn)入原始G2-aroA基因的表達(dá)載體的玉米植株相比，轉(zhuǎn)入本發(fā)明所提供的含有mG2-aroA的表達(dá)載體(序列10)的T6代植株，在玉米5葉期噴施800ml/畝農(nóng)達(dá)后，無明顯的藥害，表現(xiàn)正常，后期的生長(zhǎng)期內(nèi)均無藥害反應(yīng)；而轉(zhuǎn)入含有G2-aroA基因的表達(dá)載體的T6代植株，在800ml/畝農(nóng)達(dá)處理后，藥害非常嚴(yán)重，植株均表現(xiàn)黃化、畸形，后期植株生長(zhǎng)期內(nèi)大部分表現(xiàn)雄穗不分化、雌穗不吐絲或者植株矮小。


圖I為載體pUC19-UG2的質(zhì)粒圖譜。圖2為載體pCAMBIA3300的質(zhì)粒圖譜。圖3為載體pS3300的質(zhì)粒圖譜。圖4為重組表達(dá)載體pS3300-UG2的質(zhì)粒圖譜。圖5為重組表達(dá)載體pS3300-UMG2的質(zhì)粒圖譜。圖6為重組載體pS3300-UG0的質(zhì)粒圖譜圖7為T6代G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對(duì)照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對(duì)照組；泳道4為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株(陰性對(duì)照2);泳道5-15為11株轉(zhuǎn)入G2-aroA基因的T6代轉(zhuǎn)基因玉米植株。圖8為T6代mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對(duì)照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對(duì)照組；泳道4為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株(陰性對(duì)照2);泳道5-24為20株轉(zhuǎn)入mG2-aroA基因的T6代轉(zhuǎn)基因玉米植株。
圖9為T6代G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株和T6代mG2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株的草甘膦耐性田間鑒定圖。其中，A為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株、空載體轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株；B為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株和G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米為mG2-aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株；2所示一行玉米為G2_aroA轉(zhuǎn)基因玉米植株；3所示一行玉米為空載體轉(zhuǎn)基因玉米植株；4所示一行玉米為未轉(zhuǎn)基因的玉米植株。圖10為雙抗夾心ELISA檢測(cè)G2_ aroA蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖11為純化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖。其中，泳道I為蛋白Marker，自上到下依次為72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均為原核重組表達(dá)載體pET-28a-G2_aroA中表達(dá)后純化所得的G2-aroA蛋白，上樣量分別為5 ill、10 ill、15 ill。圖12為SDS-PAGE檢測(cè)純化后單克隆抗體的純度。其中，泳道I為蛋白Marker ；泳道2為純化后的單克隆抗體，較大的目的條帶為重鏈，較小的目的條帶為輕鏈。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、密碼子優(yōu)化型耐草甘膦基因的獲得本實(shí)施例根據(jù)G2_aroA基因(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?3826892. 2，授權(quán)公告號(hào)CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子對(duì)G2-aroA基因進(jìn)行人工優(yōu)化改造。盡量避免使用玉米稀有密碼子，并調(diào)整了密碼子的使用頻率(表I)，使G2-aroA蛋白的密碼子使用頻率與玉米中的使用頻率接近(表I)。在此基礎(chǔ)上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的富含AT序列，并去除了發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得到的新的核苷酸序列為序列表中序列2。序列2與G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原來的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即為密碼子優(yōu)化型耐草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA。密碼子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用頻率見表I。為方便克隆，發(fā)明人在序列2的5’端引入BamHI酶切位點(diǎn)，在3’端引入KpnI酶切酶切位點(diǎn)，最終序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即為序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均編碼序列，均編碼序列表中序列9所示蛋白，將該蛋白命名為G2-aroA蛋白。表I玉米優(yōu)選密碼子標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為表達(dá)人工合成的耐草甘膦基因的表達(dá)載體；所述人工合成的耐草甘膦基因?yàn)橄率鯽)或b)的DNA分子 a)核苷酸序列為序列表中序列2； b)核昔酸序列與序列表中序列2至少具有98%的同一性，且編碼序列9所不蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體中啟動(dòng)所述人工合成的耐草甘膦基因的啟動(dòng)子為Ubi啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于所述Ubi啟動(dòng)子的序列為序列表中序列5,或與序列5至少具有80%的同一1丨生,且具有啟動(dòng)子功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體中終止所述人工合成的耐草甘膦基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉(zhuǎn)錄終止功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的表達(dá)載體,其特征在于所述表達(dá)載體中還包括OMK序列；所述OMK序列由Ω序列和Kozak序列順次連接組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于所述OMK序列如序列表中序列6所示，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強(qiáng)子功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體中還包括葉綠體導(dǎo)肽序列；所述葉綠體導(dǎo)肽序列如序列表中序列7所示，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號(hào)肽功能。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體的序列為序列表中序列10。
9.含有權(quán)利要求1-8中任一所述表達(dá)載體的重組細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物。
10.權(quán)利要求1-8中任一所述的表達(dá)載體在培育耐草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人工合成的耐草甘膦基因表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的表達(dá)載體為表達(dá)人工合成的耐草甘膦基因的表達(dá)載體；所述人工合成的耐草甘膦基因?yàn)橄率鯽)或b)的DNA分子a)核苷酸序列為序列表中序列2；b)核苷酸序列與序列表中序列2至少具有98％的同一性，且編碼序列10所示蛋白質(zhì)。與轉(zhuǎn)入含有原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因玉米相比，轉(zhuǎn)入本發(fā)明所提供的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因玉米，其G2-aroA蛋白的表達(dá)量明顯提高；同時(shí)對(duì)草甘膦的耐受性也明顯提高。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102643848SQ20121010742
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者劉素霞, 姜付坤, 宋哲, 李雪峰, 鄧德芝, 韓庚辰 申請(qǐng)人:北京奧瑞金種業(yè)股份有限公司